Kronik Tek Taraflı Üreter Tıkanıklığının Glomerüler Prosesler Üzerindeki Etkilerini Ölçmek için 2-Foton Mikroskobu Kullanılması

Bu çalışmada sunulan verilerde tek taraflı üreter tıkanıklığının böbrek fonksiyonu, inflamasyon ve fibroz üzerine dramatik etkileri gösterilmiştir. Tek taraflı üreter obstrüksiyonunun patofizyolojik mekanizmalarını anlamamıza yardımcı olur. Bu tekniğin temel avantajı, hücre-hücre etkileşimlerini, hücre altı olayları inceleme ve işleyen bir böbrek içinde yapı ve işlevi dinamik bir şekilde ilişkilendirme yeteneğidir.

Üreter prosedürünün gösterilmesi, laboratuvarımızda cerrah olan Dr. Silvia Campos-Bilderback tarafından yapılacaktır. Başlamak için, sıçanı uyuşturun, daha sonra orta hat boyunca bir kesi yapın ve sol böbreği çevreleyen periton organlarından ayırmak için bulun. Renal arter, böbrek damarı ve üreteri içeren renal pedikülü bulduktan sonra, hassas yapıya zarar vermeden üreteri ayırın.

Üreterin etrafına 3-0'lık bir dikiş ilmek ve bağlamak için forseps kullanın, ardından tam tıkanıklığı sağlamak için ilk düğümün her iki tarafına birkaç milimetre düğüm bağlayın. Üreter bağlandıktan sonra, ardışık kas katmanlarını dikkatlice kapatın, ardından karnı tamamen kapatın. Dış cildi cerrahi zımbalarla kapatın.

Cerrahi hazırlık için, anestezi uygulanan sıçanı, tıraşlı sol kanadı düz ve düz bir şekilde masanın üzerine bakacak şekilde yan tarafa yerleşik bir venöz erişim çizgisi ile yerleştirin. Sıçanın ön pençelerinin, arka pençelerin olması gerektiği gibi birbirine temas ettiğinden emin olun. Sıçan yerleştirildikten sonra, böbreği hissetmek ve karındaki doğal pozisyonu belirlemek için kaburgaların hemen altındaki sol kanadı palpe edin, daha sonra tıraş edilen bölge boyunca kalıcı bir belirteç kullanarak bir çizgi çizin ve böbrek merkezini burundan kuyruğa doğru ikiye bölün.

Cildi yukarı doğru kavramak ve kaldırmak için bir çift dişli forseps kullanın ve altta yatan vaskülatürü ezmek ve kanamayı önlemek için kalıcı belirteç çizgisini bir çift hemostatla sıkıştırın. Kanamayı en aza indirmek için ince dış kas tabakası için prosedürü tekrarlayın. İnce iç karın kası tabakasının son kesisini yapmak için, büyüklüğü ve pozisyonu tahmin etmek için böbreği palpe edin ve iç kas tabakasını bir çift forseps ile kaldırın, ardından böbreğin üzerindeki cildi böbreğin tahmini büyüklüğünün yaklaşık 1 / 3'ü olan hemostatlarla ikiye bölen bir çizgiyi ezin.

Forseps ile kas tabakası üzerindeki tutuşu korurken, son kesiyi yapın. Daha sonra, böbrek yağını böbreğin alt kutbunda tutmak ve tutmak için her elinizde forseps kullanın ve aşağı doğru çalışan bir el ele tekniği kullanın. Bir elinizle yağ üzerinde sıkı bir tutuşa sahip olarak, yağı çekin ve böbreği kesiden çok nazikçe sıkın.

Böbrek geçmezse, insizyonu kolayca genişletin. Kılcal halkalara yerleştirilen beyaz kan hücrelerini veya WBC'leri tanımlamak için, Hoechst 33342 nükleer boyasını, yerleşik bir venöz erişim hattı aracılığıyla sıçan ağırlığının kilogramı başına 8 mikrogramda uygulayın. Mikroskopta, maruz kalan böbreği hafif bir rotasyonla çanağın kenarına yerleştirin, böylece böbreğin karın tarafı kapak kaymasına temas eder ve sırt tarafı kenardan uzağa bakar.

Hareketi daha da azaltmak için, böbreğin karın tarafının kenara temasını güçlendiren böbreğin dorsal tarafına salin ile nemlendirilmiş iki steril 2'ye 2 gazlı bez pedi paketleyin. Örnek konumlandırıldığında, çift geçişli bir rodamin FITC küpü kullanarak epifloresan aydınlatma altında mikroskop göz merceğinden bakın. Numune pozisyonunda bir hareket tespit edilirse, gazlı bezi böbreğin altına itmediğinden emin olacak şekilde ayarlayarak küçük ayarlamalar yapın.

Sıçanı hafifçe yuvarlayın, böylece toraks çanaktan daha uzakta olur. Epifloresan aydınlatmayı kullanarak böbreğin yüzeyini tarayın ve motorlu aşama kontrolörü ile ilişkili yazılımı kullanarak glomerül konumlarını işaretleyin. 2 foton aydınlatması altındaki her renk kanalı için, arka plan görüntüsü olarak hizmet etmek üzere işaretlenmiş her glomerulusun üst kısmının sığ bir 3D hacmini alın.

Görüntüleme yazılımının görüntüleme seçeneğinde, glomerüler kılcal halkaların arka plan floresansının soluk yoğunluklarını görselleştirmek için sahte bir renk paleti kullanın. Odak noktası olarak yüzeysel bir kan damarı kullanarak, peritübüler vaskülatür ve kılcal halkalardaki bir yoğunluk doygunluğun hemen altına gelene kadar sistemik dağılım nedeniyle floresanın yükselişini ve düşüşünü gözlemlerken floresan Texas Red RAP serum albüminini veya TRRSA'yı yavaşça infüze edin. 10 dakika sonra, 1 mikrometre aralıklarla işaretlenmiş ve görüntülenen tüm glomerüller için 3D hacimler elde edin.

Kılcal bir döngü veya peritübüler bir kap olan uygun bir kap bulun, ardından görüntü alma yazılımındaki Çizgi Tarama işlevi kabın dik olmasını gerektirdiğinden Döndür işlevini kullanarak görüntüyü döndürün. Gemi döndürüldükten ve düz bir şekilde yattıktan sonra, Edinme menüsünde XT işlevini seçin ve 4.000 satırı tarayacak şekilde ayarlayın. Çizgiyi, segmentin maksimum çapında, odak düzlemi ile incelenecek kap boyunca yerleştirin.

Ardından, renkli bileşik görüntüye sol tıklayın ve çizgi taramasının yapıldığı alanın referans görüntüsünü oluşturmak için Anlık Görüntü Al sekmesini seçin. Geminin hat taramasını yakalamak için hemen Başlat düğmesine tıklayın. Daha sonra, RBC akış hızını belirlemek için hat taramalarını görüntü işleme yazılımına aktarın.

Ölçü açılır menüsünün altında, Bölge İstatistiklerini Göster iletişim kutusunu açın ve RBC gölgelerinin eğimiyle eşleşen bir çizgi çizmek için Tek Çizgi Çizimi aracını seçin. Çizginin genişliğini ve yüksekliğini not ettikten sonra, hızı hesaplamak için bir denklem kullanın, ardından her çizgi taramasının hızını raporlamak için ortalama beş hesaplama elde edin. Görüntüleme alanında bir glomerulusu ortalayın ve glomerüler yüzeyden başlayıp 30 ila 35 mikrometrede biten bir 3D veri seti alın.

Z yönünde 1 mikrometrelik bir adım boyutu kullanın. Mavi Hoechst kanalını Texas Red albümin kanalı ile karşılaştırarak, kılcal döngüde kırmızı boyanın dışlanmasını ve buna karşılık gelen bir nükleer lekeyi arayarak WBC'leri tanımlayın. WBC'ler üç optik bölüm üzerinde statik görünüyorsa, hücreleri yapışmış olarak tanımlayın, ardından değerleri, 1 mikrometre aralıklarla alınan glomerulusun tepesinden 10 optik bölüm başına oluşum olarak rapor edin.

Münih Wistar Fromter veya MWF sıçanlarında alan başına glomerüler sayı, 5 haftalık UUO grubunda, tedavi edilmemiş sıçanlara göre artmıştır. Sprague-Dawley sıçanları veya SD sıçanları, tek taraflı üreter tıkanıklığının beş haftasını takiben yüzey glomerülleri olmamasından alan başına 2.02'ye çıktı. Böbrek yüzeyini görmek için üç boyutlu yeniden yapılandırılmış görüntüler gözlendi.

SD sıçanlarda 5 haftalık tek taraflı üretal obstrüksiyon, MWF'de görüldüğü gibi normal tübüler epiteliye benzeyen alanlarda, tedavi edilmemiş ve kısmen 5 haftalık UUO MWF sıçanlarında sonuçlanmadı. Renal vasküler dinamiklerin incelenmesinde, 5 haftalık UUO MWF ve SD gruplarında böbrek kan akışı, tedavi edilmeyen sıçanlara kıyasla anlamlı derecede azalmıştır. Glomerüler kılcal döngülerdeki RBC hızı, 5 haftalık UUO MWF'de ve SD sıçanlarında, tedavi edilmemiş MWF sıçanlarına kıyasla önemli ölçüde azalmıştır.

Ek olarak, tedavi edilmemiş MWF sıçanları, üstten 10 optik bölüm başına daha az WBC'ye sahipken, sayı 5 haftalık UUO MWF ve 5 haftalık UUO SD sıçanlarında artmıştır. Tek taraflı üretal obstrüksiyon ile albümin geçirgenliğinde artış görüldü. Tek taraflı üretal obstrüksiyondan sonra Bowman boşluğunda albümin birikimi yoğundu.

S1 segmenti endositoz, tedavi edilmemiş MWF sıçanlarında fizyolojik koşullarla gözlendiği gibi büyük miktarlarda albümin içerir. Aynı alım, 5 haftalık tek taraflı üretal obstrüksiyonu takiben MWF veya SD sıçanlarda görülemedi. Zaman içinde bir süreci incelemek için tekrar görüntüleme, görüntüleme için belirli bir alanın sabitlenmesi ve daha sonra daha yüksek çözünürlüklü mikroskopi gerçekleştirmek için sabit dokunun kullanılması gibi birçok farklı yöntem bu teknikle birlikte yapılabilir.

Bu teknik yıkıcı teknoloji olarak kabul edilir. Araştırmacıların birçok yeni soruyu cevaplaması sağlanır. Bunu yaparken, yeni içgörüler sağlanmış ve paradigma değiştiren veriler elde edilmiştir.