Name: Kronik Tek Taraflı Üreter Tıkanıklığının Glomerüler Prosesler Üzerindeki Etkilerini Ölçmek için 2-Foton Mikroskobu Kullanılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Keşfedin, 2-foton mikroskobu kullanarak kronik tek taraflı üreter tıkanıklığının glomerüler dinamikler ve böbrek fonksiyonu üzerindeki etkilerini. Bu yöntem, canlı organizmada hücre-hücre etkileşimlerini ve böbrek fizyolojisini dinamik olarak incelemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü tarafından desteklenmiştir RO1DK091623 ve P30DK079312 (B.A.M.'ye). Michigan State Üniversitesi'ndeki Araştırma Teknolojisi Destek Tesisi'nin (RTSF) Genomik Çekirdek Tesisi'ndeki personele Nanostring analizini gerçekleştirdikleri için teşekkür ederiz.

Tüm deneyler Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nu takip etti ve Indiana Üniversitesi Tıp Fakültesi'ndeki Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı.
1. Münih Wistar Frömter veya SD sıçanının UUO ameliyatı için hazırlanması
<ol><li>Sıçanı izofloran kullanarak (% 5 indüksiyon,% 1.5-2.5 bakım) anestezi altına alın, daha sonra cerrahi bölgeyi hem iyot bazlı hem de klorheksidin bazlı bir ovma ve alkolle dairesel bir hareketle birkaç kez tıraş edin, yıkayın ve dezenfekte edin. Kurumsal IACUC kılavuzlarına göre ağrı yönetimi için uzun etkili / yavaş salınımlı analjezik uygulayın.</li>
	<li>Bir neşter kullanarak orta hat boyunca bir kesi yapın; sol böbreği bulun ve çevredeki periton organlarından kurtarın.</li>
	<li>Renal arter, böbrek damarı ve üreterden oluşan renal pedikülü dikkatlice bulun. Üreteri diğer yapılardan ayırın, hassas yapıya zarar vermemek için önlemler alın.</li>
	<li>İnce forseps kullanarak, üreterin etrafına 3-0'lık bir dikişi dikkatlice ilmek ve yırtmamaya dikkat ederek bağlayın. İkinci bir düğümü bağlamak ve tam tıkanıklığı sağlamak için bu prosedürü ilk düğümün her iki tarafında birkaç milimetre tekrarlayın.</li>
	<li>İşlem tamamlandıktan sonra, ardışık kas katmanlarını dikkatlice kapatın. Son tabakayı kapatmadan önce, tamamen kapatmadan önce karın içine 2 mL ılık, steril% 0.9 salin ekleyin. Dış cildi cerrahi zımbalarla kapatın.</li>
	<li>Ağrı yönetimi için uzun etkili / yavaş salınımlı analjezik uygulayın ve kurumsal IACUC kılavuzlarına göre iyileşmeyi yakından gözlemleyin. Bundan sonra periyodik olarak izleyin ve beşinci haftanın sonunda görüntülemeye hazırlanın.</li>
</ol>2. Texas Red sıçan serum albümini sentezi (TR-RSA)
<ol><li>100 mg Sıçan Serumu Albümini tartın ve 50 mL'lik bir konik tüpte pH 8.4'te 6.67 mL 0.1 M sodyum bikarbonat tamponunda çözün.</li>
	<li>5 mg Texas Red-X-süksinimidil ester şişesine, tüm boya çözülene kadar 100 μL Dimetil Formamid (DMF, yüksek kaliteli) ve vorteks ekleyin.</li>
	<li>Sıçan serum albümin çözeltisini düşük / orta bir ayarda bir girdap üzerine yerleştirin, böylece çözelti hacmi açık tüpün üst kısmının çok altında döner.</li>
	<li>Tüp girdap yapılırken çözünmüş boyayı ekleyin.</li>
	<li>50 mL konik tüpü alın, folyoya sarın, tüpü herhangi bir rocker veya silindir üzerine yerleştirin ve oda sıcaklığında (RT) 1 saat boyunca yavaşça çalkalayın.</li>
	<li>Hafifçe karıştırma altında bir karıştırma çubuğuna sahip% 0,9 NaCl'lik 5 L'lik bir kovada, uygun bir 50 kDa moleküler ağırlıklı kesme diyalizörünün membranlarını ıslatın (klipsli bir membran, kapalı membran tüpleri veya diyaliz kasetlerinin tümü uygundur).</li>
	<li>TR-RSA çözeltisini membran sistemine yükleyin ve tipik olarak sisteme dahil edilen yüzdürme ataşmanlarına takın. 5 L'lik kabı% 0.9 salin çözeltisi / TR-RSA ile gece boyunca 4 ° C'de (soğuk bir odada) bir karıştırma plakasına nazik bir ajitasyonla yerleştirin. Diyaliz solüsyonunu sonraki 36 saat içinde en az üç kez değiştirin.</li>
	<li>Membranın şişmesi, şimdi berrak olan TR-RSA çözeltisinin hacmini artıracaktır. Yaklaşık bir konsantrasyon elde etmek için orijinal 100 mg'ı hacme bölün: boya: protein oranı 1: 1 olacaktır. Aliquot uygun hacimlere ve uzun süreli depolama için liyofilize edin.</li>
</ol>3. Ters mikroskopta 2-foton intravital görüntüleme için hazırlık
<ol><li>50 mm'lik bir kapak kaydırma alt kabının kapağını çıkarın (40 mm kapak kayması çapı ile) ve iç tabana kenarın yanına 8 adet otoklav bant yerleştirin. Piramit şeklinde, boş bir pencere yapın, dış böbreğin bu alana sıkıca oturmasını sağlamak için yan tarafta 4 parça kullanarak, otoklav bant ile periferik olarak teması korur, böylece hareketi en aza indirmeye yardımcı olur. Böbrek ile en iyi teması sağlamak için aralığı sıçanın boyutuna göre ayarlayın.</li>
	<li>50 mm'lik kapak kaydırmalı alt kabın her iki tarafına 1 termal ped yerleştirin. Isıtma pedinin sahneyi kapladığından emin olun.</li>
	<li>Sırasıyla 30x ve 60x görüntüler oluşturmak için 0,75x yakınlaştırma ve 1,5x yakınlaştırmada 40x suya daldırma hedefi kullanın, böylece daha düşük ve daha yüksek büyütmeli görüntüler elde edin. Gerekirse, su damlacığının tüpten aşağı inmesini önlemek için hedefin tepesine aşağı doğru bir açıyla ulaşabilen uzun bir PE-200 boru parçasına sahip 1 mL'lik bir şırınga kullanarak hedefe su ekleyin.</li>
	<li>Çalışmalar arasındaki görüntülerde tutarlılık sağlamak için mavi, yeşil ve kırmızı dedektörler önceden belirlenmiş seviyelere ayarlanmış %2 lazer geçirgenliği kullanın. Uyarma dalga boyunu referans alınan lazerde 800 nm'ye ayarlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız), bu da bu çalışmada kullanılan tüm floroforları verimli bir şekilde uyaracaktır.<ol><li>Bir fotoçarpan tüpü (PMT) (420-490 nm, kazanç 950) kullanarak mavi emisyonları toplamak için harici (taranmamış) dedektörler kullanın.</li>
		<li>Yeşil emisyonları yakalamak için bir Hyd dedektörü kullanın (500-550 nm, kazanç 100).</li>
		<li>Kırmızı emisyonları yakalamak için bir Hyd dedektörü kullanın (590-660 nm, kazanç 200).</li>
		<li>PMT'deki ofseti (mavi emisyonlar) dokunun boş alanlarında yalnızca birkaç piksel sıfır değerine sahip olacak şekilde ayarlayın. NOT: Yeşil ve kırmızı emisyonlar için HyD dedektörleri otomatik ofset ayarına sahiptir; sadece kazanç ayarlanabilir.</li>
		<li>Görüntülere siyah ve beyaz arasında 4.096 yoğunlukta bir ölçek vermek için bit derinliğini 12 bit olarak ayarlayın. NOT: Bowman'ın alanı içindeki düşük yoğunluklu emisyonların toplanmasını sağlamak için bu değerleri hariç tutmamak için dedektörlerin alt sınırlarını (PMT'de ofset) ayarlamak gerekir. Hassasiyet ayarı çok düşükse, görsel uyarı işaretçileri bunu gösterecektir; bu değerlere sıfır yoğunluk değeri verilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Yaklaşık 6 mg Texas-Red-X-Rat Serum Albüminini toplam 1 mL hacme kadar seyreltin, çözeltiyi 1 mL'lik bir şırıngaya yükleyin ve adım 9.1'de Hoechst 33342'nin infüzyonundan sonra adım 4.1'de yerleşik i.v kateterine yerleştirin.</li>
</ol>4. İntravital 2-foton görüntüleme için cerrahi hazırlık
<ol><li>Önceden anestezi uygulanmış sıçanı, tıraş edilmiş sol kanadı düz ve düz bir şekilde masanın üzerine bakacak şekilde yan tarafında yerleşik bir venöz erişim hattı (femoral veya juguler) ile yerleştirin. Arka pençelerin olduğu gibi ön pençelerin birbirine temas ettiğinden emin olun.</li>
	<li>Böbreğin karındaki doğal pozisyonu belirlemesini hissetmek için kaburgaların hemen altındaki sol kanadı yavaşça palpe edin. Gerekirse, tıraş edilen bölge boyunca kalıcı bir işaretleyici kullanarak bir çizgi çizin ve böbrek merkezini burundan kuyruğa yönde ikiye bölün.</li>
	<li>Bir çift dişli forseps kullanarak, cildi kavrayın ve altta yatan vaskülatürü ezmek ve bir çift cerrahi makasla insizyonu yaparken kanamayı önlemek için kalıcı belirteç çizgisinin bir çift hemostatla sıkışmasını kolaylaştırmak için yukarı doğru kaldırın. Kanamayı en aza indirmek için ince dış kas tabakası için bunu tekrarlayın.</li>
	<li>İnce iç karın kası tabakasının son kesisini yapmak için, büyüklüğü ve pozisyonu tahmin etmek için böbreği yeniden püskürtün. İç kas tabakasını bir çift forseps ile dikkatlice kaldırın ve böbreğin üzerindeki cildi ikiye bölen bir çizgiyi, böbreğin tahmini büyüklüğünün yaklaşık 1 /3'ü olan hemostatlarla ezin.</li>
	<li>Forseps ile kas tabakasındaki tutuşu korumak, son kesiyi yapın. NOT: Daha küçük bir kesi yapmak ve gerektiğinde genişletmek, çok büyük yapmaktan daha iyidir, bu da bir dikişle kısmi kapanmayı gerektirecektir.</li>
	<li>Böbreği çevreleyen yağ tarafından nazikçe tutun. Her iki elinizi de forseps ile kullanarak, böbrek yağını kavramak ve tutmak için elden ele bir teknik kullanarak böbreğin alt kutbundaki yağı kavramak için çalışın, aşağıya doğru çalışın.</li>
	<li>Böbreğin alt kutbundaki yağa bir elinizle sıkıca tutun, yağı yavaşça çekin ve gerekirse böbreği kesiden çok nazikçe sıkın. Böbrek kolayca geçmezse, insizyonu genişletin.</li>
</ol>5. Sıçanı görüntüleme için konumlandırma
<ol><li>Açıkta kalan böbreği çanağın kenarına dikkatlice yerleştirin, hafif bir rotasyonla, böbreğin karın tarafı kapak kaymasına temas eder ve sırt tarafı kenardan uzağa bakar.</li>
	<li>Hareketi daha da azaltmak için, iki steril 2 x 2 gazlı bez pedi alın, tuzlu suyla nemlendirin ve böbreğin karın tarafının kenara temasını güçlendirerek böbreğin sırt tarafına doğru paketleyin.</li>
	<li>Çift geçişli bir Rhodamine/FITC küpü kullanarak epifloresan aydınlatma altında mikroskop göz merceğinden bakın. Hareket algılanırsa, pozisyonda küçük ayarlamalar yapın ve gazlı bezi dikkatlice ayarlayarak böbreğin altına itmediğinden emin olun. Hareketi daha da azaltmak için, sıçanı hafifçe yuvarlayın, böylece göğüs kafesi çanaktan daha uzakta olur.</li>
</ol>6. Kantitatif analiz için görüntü toplama
<ol><li>Epifloresan aydınlatmayı kullanarak böbrek yüzeyini tarayın (adım 5.3) ve motorlu aşama kontrolörü ile ilişkili yazılımı kullanarak glomerül pozisyonlarını işaretleyin (modern sistemlerin bir özelliği).</li>
	<li>2-foton aydınlatma altındaki her renk kanalı için, her işaretli glomerulusun üst kısmının sığ bir 3D hacmini alın ve bu da arka plan görüntüleri olarak işlev görür. Glomerüler kılcal halkaların arka plan floresansının soluk yoğunluklarını daha iyi görselleştirmek için görüntüleme yazılımının görüntüleme seçeneğinde bir sahte renk paleti kullanın.</li>
	<li>Odak noktası olarak yüzeysel bir kan damarı kullanarak, floresan albümini yavaşça infüze edin, sistemik dağılım nedeniyle floresanın yükselişini ve düşüşünü gözlemlemek için zaman tanıyın. Peritübüler vaskülatür ve kılcal halkalarda doygunluğun hemen altında bir yoğunluk elde etmek için yeterli TR-RSA infüze edin. NOT: Renal perfüzyon normal olduğunda materyalin infüzyonu ile kan dolaşımındaki görünümü arasında tipik olarak 5 sn'lik bir gecikme vardır.</li>
	<li>Adım 6.2'den itibaren işaretlenmiş ve görüntülenen tüm glomerüller için 3B hacimler (1 μm aralıklarla) almadan önce yaklaşık 10 dakika bekleyin. NOT: Simonsen'in Münih Wistar sıçanları daha az yüzey glomerülüne sahiptir. Bununla birlikte, MW sıçanlarının Frömter suşu daha fazla sayıda yüzey glomerülüne sahip olduğundan, 10 glomerüle kadar sıklıkla görüntülenebilir.</li>
	<li>Çalışmanın sonunda aşırı dozda izofluran yoluyla sıçanı ötenazileştirin. Ötanazi sağlamak için çift pnömotororakotami uygulayın.</li>
</ol>7. Glomerüler geçirgenliğin hesaplanması
<ol><li>Mikroskop sistemiyle ilişkili görüntü görüntüleme yazılımını kullanarak, görüntüleri işleme ve analiz için 12 bit ham görüntülere aktarın.</li>
	<li>Arka plan 3B birimlerini ve dolaşımdaki floresan albümini içeren ham 3B birimi yükleyin. Odak düzlemini, çevreleyen Bowman'ın kapsülünün kenarına kadar yeterli alana sahip glomerüllerdeki en parlak yüzeysel kılcal döngü ile 3D ses seviyesinde bulun.</li>
	<li>Görsel yer işaretlerini kullanarak, arka plan ses seviyesinde bulunan aynı odak düzlemini bulun. Kılcal döngüde bir bölge ve her birinin ortalama yoğunluk değerlerini not ederek Bowman'ın alanı içinde bir bölge seçin. Bu yoğunluk değerlerini arka plan değerleri olarak kullanın.</li>
	<li>Albümin içeren görüntüde Bowman'ın alanı içindeki bir bölgeyi (alanda en az 20 x 20 piksel) ana hatlarıyla belirtin ve yoğunluk okumasını not edin (Bowman'ın alan yoğunluklarının en temiz ölçümünü sağlamak için kılcal bir döngüye veya Bowman'ın kapsülüne bitişik olmayan bir alan seçin). Bowman's Space içindeki ortalama yoğunluk için ortalama bir değer elde etmek için çizilen bölgeyi diğer iki bölgenin üzerine taşıyın.</li>
	<li>Kılcal döngü bölümündeki en parlak plazma floresan yoğunluğunu seçin ve bu bölgeyi daire içine alın. Eşik işlevini kullanarak, parlak değerleri vurgulayın (genellikle kılcal döngü duvarlarının kenarlarında bulunur), RBC gölgelerinin dolaşmasını önleyin ve değeri kaydedin. NOT: Kandaki faktörler plazma floresan seviyelerinin hafife alınmasına neden olacağından, en parlak alanların seçilmesi önemlidir.</li>
	<li>GSC'yi Eq (1) kullanarak hesaplamak için değerleri bir e-tabloya girin: GSC = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63329/63329eq01.jpg"> (1)</li>
</ol>8. Yüzey glomerüler kılcal halkalarında ve renal vaskülatürde kırmızı kan hücresi akışının bir linecan fonksiyonu kullanılarak hesaplanması
<ol><li>Uygun bir damar bulun (kılcal bir döngü veya peritübüler bir damar). Referans alınan görüntü yakalama yazılımında çizgiler işleyebileceğinden ( Malzeme Tablosuna bakınız) kabın dik olmasını gerektirdiğinden, döndürme işlevini kullanarak görüntüyü döndürün .</li>
	<li>Gemi döndürüldükten ve düz bir şekilde yattıktan sonra, edinme menüsünde XT işlevini seçin. 4.000 satırı tarayacak şekilde ayarlayın. Çizgiyi incelenecek geminin karşısına yerleştirin; odak düzleminin görüntülenecek segmentin maksimum çapında olduğundan emin olun.</li>
	<li>Renkli bileşik görüntüye sol tıklayın ve çizgilerin çekildiği alanın referans görüntüsünü oluşturmak için Anlık Görüntü Al'ı seçin. Geminin hatlarını yakalamak için hemen Başlat düğmesine tıklayın.</li>
	<li>RBC akış hızını belirlemek için, linecan'ları görüntü işleme yazılımına aktarın (bkz. Ölçü açılır menüsünün altındaki Bölge İstatistiklerini Göster iletişim kutusunu açın. Tek çizgili çizim aracını seçin ve RBC gölgelerinin eğimiyle eşleşen bir çizgi çizin. Genişlik ve yükseklik değerlerini not alın. NOT: Genişlik için elde edilen piksel değerleri mesafeye karşılık gelir; yükseklik için pikseller zamana karşılık gelir.</li>
	<li>Hızı hesaplamak için aşağıdaki formülü (Eq (2)) kullanın. μm/s cinsinden RBC akış hızı = <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63329/63329eq02.jpg"> (2) NOT: Bu, 60x büyütmede elde etme parametrelerine ve referans alınan mikroskopla 400 Hz tarama hızına karşılık gelir (bkz.<ol><li>En az beş hesaplama yapın ve her satırın hızını bildirmek için bunların ortalamasını alın. NOT: Bu parametreler mikroskop sisteminin piksel boyutuna ve elde etme hızına bağlı olacaktır.</li>
	</ol></li>
</ol>9. Glomerüler kılcal döngülerde WBC tıkanıklığının hesaplanması
<ol><li>Hoechst 33342 nükleer boyasını (~ 8 μg / kg sıçan ağırlığında) kılcal halkalara yerleştirilmiş WBC'leri tanımlamak için yerleşik bir venöz erişim hattı üzerinden uygulayın. NOT: Foton saçılması ve hemoglobin tarafından emilimi nedeniyle, özellikle daha kısa dalga boylu mavi emisyonlar için kullanılabilir derinlik sınırlı olacaktır.</li>
	<li>Görüntüleme alanında bir glomerulusu ortalayın ve glomerüler yüzeyden başlayarak bir 3D veri seti alın ve verileri en az 30 ila 35 μm arasında sonlandırın. Z yönünde 1 μm adım boyutu kullanın.</li>
	<li>Mavi Hoechst kanalını Texas Red albümin kanalıyla karşılaştırarak WBC'leri tanımlayın; WBC'leri pozitif olarak tanımlamak için kılcal döngüde kırmızı boyanın ve buna karşılık gelen bir nükleer lekenin dışlanmasını arayın. 3 optik bölüm üzerinde statik görünüyorlarsa, beyaz kan hücrelerini "yapışmış" olarak tanımlayın. Değerleri, glomerulusun tepesinden 1 μm aralıklarla alınan oluşum/10 optik kesit olarak raporlayın.</li>
</ol>10. Yüzey glomerüllerinde Rouleaux oluşumlarının varlığının puanlanması
<ol><li>Adım 9.3 için aynı yönergeleri izleyin ve bir 3B veri kümesi edinin. Kılcal döngüler boyunca hareket ederken ayrışmaya direnen paketler halinde yığılmış RBC'ler olarak görünen Rouleaux oluşumlarını arayın. Daha uzun dalga boylu kırmızı emisyonlar için daha az foton saçılması nedeniyle daha büyük derinliklerde yapının daha iyi görselleştirilmesi için kırmızı bir florofor kullanın. Değerleri, glomerulusun tepesinden 1 μm aralıklarla alınan oluşum/25 optik kesit olarak raporlayın.</li>
</ol>11. Glomerüllerin izolasyonu
<ol><li><ol><li><li> </li><li><li> </li></ol></li></ol><ol><li></li><li><li></li><li> </li></ol><ol><li> </li><li><li> &amp;</li></ol>

<ol><li>Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Indiana+O%27Brien+center+for+advanced+renal+microscopic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Indiana O'Brien center for advanced renal microscopic analysis.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 320 (5), 671-682 (2021).</li>
<li>Dunn, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+studies+of+the+kidney+of+living+animals+using+multicolor+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (3), 905-916 (2002).</li>
<li>Eisenbach, G., Liew, J., Boylan, J., Manz, N., Muir, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+angiotensin+on+the+filtration+of+protein+in+the+rat+kidney%3A+a+micropuncture+study%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Effect of angiotensin on the filtration of protein in the rat kidney: a micropuncture study.</a> Kidney International. 8 (2), 80-87 (1975).</li>
<li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+microscopy+as+a+tool+for+studying+renal+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology.</a> Methods. 128, 20-32 (2017).</li>
<li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A., Palygin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+imaging+and+microscopy+for+dynamic+processes+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent imaging and microscopy for dynamic processes in rats.</a> Methods in Molecular Biology. 2018, 151-175 (2019).</li>
<li>Huber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+the+functional+podocin-nephrin+complex%3A+mutations+in+the+NPHS2+gene+disrupt+nephrin+targeting+to+lipid+raft+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of the functional podocin-nephrin complex: mutations in the NPHS2 gene disrupt nephrin targeting to lipid raft microdomains.</a> Human Molecular Genetics. 12 (24), 3397-3405 (2003).</li>
<li>Kawachi, H., Koike, H., Kurihara, H., Sakai, T., Shimizu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+rat+homologue+of+podocin%3A+expression+in+proteinuric+states+and+in+developing+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology+JASN%22%5BJournal%5D)">Cloning of rat homologue of podocin: expression in proteinuric states and in developing glomeruli.</a> Journal of the American Society of Nephrology JASN. 14 (1), 46-56 (2003).</li>
<li>Roselli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+glomerular+filtration+defect+and+severe+renal+disease+in+podocin-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Early glomerular filtration defect and severe renal disease in podocin-deficient mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 24 (2), 550-560 (2004).</li>
<li>Schießl, I., Bardehle, S., Castrop, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superficial+nephrons+in+BALB%2Fc+and+C57BL%2F6+mice+facilitate+in+vivo+multiphoton+microscopy+of+the+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Superficial nephrons in BALB/c and C57BL/6 mice facilitate in vivo multiphoton microscopy of the kidney.</a> PloS One. 8 (1), 52499(2013).</li>
<li>Chevalier, R., Forbes, M., Thornhill, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ureteral+obstruction+as+a+model+of+renal+interstitial+fibrosis+and+obstructive+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy.</a> Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).</li>
<li>Forbes, M., Thornhill, B., Chevalier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximal+tubular+injury+and+rapid+formation+of+atubular+glomeruli+in+mice+with+unilateral+ureteral+obstruction%3A+a+new+look+at+an+old+model%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+physiology%22%5BJournal%5D)">Proximal tubular injury and rapid formation of atubular glomeruli in mice with unilateral ureteral obstruction: a new look at an old model.</a> American Journal of Physiology. Renal physiology. 301 (1), 110-117 (2011).</li>
<li>Yang, H. -C., Zuo, Y., Fogo, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today.+Disease+Models%22%5BJournal%5D)">Models of chronic kidney disease.</a> Drug Discovery Today. Disease Models. 7 (1-2), 13-19 (2010).</li>
<li>Hackl, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+fate+of+glomerular+epithelial+cells+in+vivo+using+serial+multiphoton+imaging+in+new+mouse+models+with+fluorescent+lineage+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tracking the fate of glomerular epithelial cells in vivo using serial multiphoton imaging in new mouse models with fluorescent lineage tags.</a> Nature Medicine. 19 (12), 1661-1666 (2013).</li>
<li>Kitching, A., Kuligowski, M., Hickey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+leukocyte+recruitment+to+glomeruli+in+mice+using+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of leukocyte recruitment to glomeruli in mice using intravital microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 109-117 (2009).</li>
<li>Savin, V. J., Terreros, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filtration+in+single+isolated+mammalian+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Filtration in single isolated mammalian glomeruli.</a> Kidney International. 20 (2), 188-197 (1981).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%3A+twenty-something+years+on%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on.</a> Nature Protocols. 1 (2), 581-585 (2006).</li>
<li>El Karoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+stress+drives+proteinuria-induced+kidney+lesions+via+Lipocalin+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum stress drives proteinuria-induced kidney lesions via Lipocalin 2.</a> Nature Communications. 7, 10330(2016).</li>
<li>VA, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+measurements+of+gene+signatures+in+different+analytes+using+the+Nanostring+nCounter+Assay+System%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System.</a> BMC Research Notes. 2, 80(2009).</li>
<li>Springer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+transcriptome+and+bioinformatics+approach+to+unilateral+ureteral+obstructive+uropathy+in+the+fetal+sheep+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">A combined transcriptome and bioinformatics approach to unilateral ureteral obstructive uropathy in the fetal sheep model.</a> The Journal of Urology. 187 (2), 751-756 (2012).</li>
<li>Braun, F., Becker, J., Brinkkoetter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+or+let+die%3A+Is+there+any+cell+death+in+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Live or let die: Is there any cell death in podocytes.</a> Seminars in Nephrology. 36 (3), 208-219 (2016).</li>
<li>Kim, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+angiopoietin-1+in+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Electrolyte+%26+Blood+Pressure+E+%26+BP%22%5BJournal%5D)">The role of angiopoietin-1 in kidney disease.</a> Electrolyte & Blood Pressure E & BP. 6 (1), 22-26 (2008).</li>
<li>Liu, F., Zhuang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+receptor+tyrosine+kinase+signaling+in+renal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Role of receptor tyrosine kinase signaling in renal fibrosis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (5), 972(2016).</li>
<li>Martini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+biology+identifies+shared+transcriptional+networks+in+CKD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Integrative biology identifies shared transcriptional networks in CKD.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 25 (11), 2559-2572 (2014).</li>
<li>Mühlberger, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+bioinformatics+analysis+of+proteins+associated+with+the+cardiorenal+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Integrative bioinformatics analysis of proteins associated with the cardiorenal syndrome.</a> International Journal of Nephrology. 2011, 809378(2010).</li>
<li>Satirapoj, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periostin%3A+novel+tissue+and+urinary+biomarker+of+progressive+renal+injury+induces+a+coordinated+mesenchymal+phenotype+in+tubular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrology%2C+Dialysis%2C+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Periostin: novel tissue and urinary biomarker of progressive renal injury induces a coordinated mesenchymal phenotype in tubular cells.</a> Nephrology, Dialysis, Transplantation. 27 (7), 2702-2711 (2012).</li>
<li>Fengxin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numb+contributes+to+renal+fibrosis+by+promoting+tubular+epithelial+cell+cycle+arrest+at+G2%2FM%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Numb contributes to renal fibrosis by promoting tubular epithelial cell cycle arrest at G2/M.</a> Oncotarget. 7 (18), 25604-25619 (2016).</li>
<li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+glomerular+permeability+of+fluorescent+macromolecules+using+2-photon+microscopy+in+Munich+Wistar+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in Munich Wistar rats.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (74), e50052(2013).</li>
<li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+tubular+uptake+explains+albuminuria+in+early+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (3), 489-494 (2009).</li>
<li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+normal+kidney+filters+nephrotic+levels+of+albumin+retrieved+by+proximal+tubule+cells%3A+retrieval+is+disrupted+in+nephrotic+states%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The normal kidney filters nephrotic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells: retrieval is disrupted in nephrotic states.</a> Kidney International. 71 (6), 504-513 (2007).</li>
<li>Sandoval, R. M., Wang, E., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+the+bottom+and+using+it%3A+Offsets+and+sensitivity+in+the+detection+of+low+intensity+values+in+vivo+with+2-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Intravital%22%5BJournal%5D)">Finding the bottom and using it: Offsets and sensitivity in the detection of low intensity values in vivo with 2-photon microscopy.</a> Intravital. 2 (1), 23674(2014).</li>
<li>Kuligowski, M. P., Kitching, A. R., Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+recruitment+to+the+inflamed+glomerulus%3A+a+critical+role+for+platelet-derived+P-selectin+in+the+absence+of+rolling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Leukocyte recruitment to the inflamed glomerulus: a critical role for platelet-derived P-selectin in the absence of rolling.</a> Journal of Immunology. 176 (11), 6991-6999 (2006).</li>
<li>Devi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+imaging+reveals+a+new+leukocyte+recruitment+paradigm+in+the+glomerulus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multiphoton imaging reveals a new leukocyte recruitment paradigm in the glomerulus.</a> Nature Medicine. 19 (1), 107-112 (2013).</li>
<li>Finsterbusch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patrolling+monocytes+promote+intravascular+neutrophil+activation+and+glomerular+injury+in+the+acutely+inflamed+glomerulus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Patrolling monocytes promote intravascular neutrophil activation and glomerular injury in the acutely inflamed glomerulus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 5172-5181 (2016).</li>
<li>Shroff, U. N., Gyarmati, G., Izuhara, A., Deepak, S., Peti-Peterdi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+view+of+macula+densa+cell+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">A new view of macula densa cell protein synthesis.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 321 (6), 689-704 (2021).</li>
</ol>

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Glomerüler fizyolojinin incelenmesi, özellikle mikroponktur kullanımı, izole glomerüllerin perfüzyonu ve mikroskopi gibi birçok farklı yaklaşım görmüştür. Münih Wistar sıçanlarında, Fromter ve Simonsen suşlarında yüzey glomerüllerinin mevcudiyeti, in vivo dinamik çalışmalara izin vermiştir. Bu teknolojiyi benimseyen araştırmacılara önemli bir not, çalışmalar arasında tutarlı görüntüleri korumak için edinme parametrelerini ayarlama ihtiyacıdır, böylece dokudaki otofloresan tutarlı kalır. Çift geçişli bir floresein/rodamin epifloresan küpü kullanmak ve bilgisayar ekranında göz merceklerinden görülenleri taklit etmek için kazanç ayarlarını yeşil ve kırmızı emisyon kanallarına ayarlamak, farklı mikroskop sistemleri arasında bile otofloresanda tutarlı bir renk imzası sağlayacaktır.
Fromter suşu, toplam glomerül sayısının azalması, ~% 75'i normal olduğu için yaygın olarak kullanılmıştır ve erkekler yaklaşık 12 haftalıkken kendiliğinden hipertansiyon geliştirir, ilerleyici proteinüri ve ardından fokal glomerüler skleroz ile sonunda böbrek yetmezliğinden ölürler12. Bu sıçanların kullanımı ve azaltılmış fototoksisitesi, gelişmiş penetrasyon derinliği ve aynı anda birden fazla floresan probu görüntüleme yeteneği ile 2-foton mikroskobunun eklenmesi, yeni keşiflerin yolunu açtı 1,4,5. Bilgisayar donanımı ve yazılımının gelişmesiyle birlikte, nicel veriler artık tüm 2-foton laboratuvarları için standarttır. Fizyolojik ve hastalık koşulları altında glomerüler, proksimal tübül, vasküler ve interstisyel süreçlere çoklu kantitatif teknikler geliştirilmiş ve uygulanmıştır 1,4,5,27,28,29,30.
Transgenik fare üretim tesisleri, böbrek fizyolojisi ve patolojisi çalışmalarına yeni bir boyut ekledi ve bu, spesifik gen ürünlerinin böbrek yapısı ve fonksiyonundaki önemini daha da tanımlamak için 2-foton mikroskobu ile birleştirilmesi sadece bir zaman meselesiydi. Bununla birlikte, fare glomerülleri, çok genç fareler hariç, böbrekyüzeyinden 100 μm'nin üzerinde bulunur 9. İki foton mikroskobu en iyi çözünürlük olarak 20 ila 50 μm arasında bir derinlikte gerçekleştirilir ve floresan yoğunluğu, yayılan ışığın ışık saçılması ve hemoglobin ile etkileşimden emilim nedeniyle hızla azalır. Bu nedenle, yüzey glomerüllerini indüklemek gerekliydi. Yaygın olarak kullanılan yaklaşım, 12 hafta boyunca uzatılmış tek taraflı bir obstrüksiyon modelidir. Bu modeller temel belirlemelere izin vermediğinden, UUO'nun etkilerinin çalışılan süreçten ayrılması mümkün değildir.
MWF sıçanlarını kullanarak, temel glomerüler fonksiyonu takip eden UUO ile karşılaştırabilirsiniz. Bu UUO modelinin inflamasyonu ve hızlı bir fibroz oranını indüklediği bilinmektedir ve KBH ve fibroz10,11,12'yi incelemek için kullanılmıştır. Beklendiği gibi, hem MWF hem de SD sıçanlarında yüzey glomerüllerinde bir artış oldu. Ayrıca, MWF ve SD sıçanları için UUO'yu takiben elde edilen nicel sonuçlar çok karşılaştırılabilirdi. Burada kaydedilen kan akışındaki azalma daha önce UUO'yu takip eden mikroskobik verileri mikroponktur verileriyle karşılaştırarak bildirilmişti3. Ayrıca, tübüler ve interstisyel histolojinin belirgin bir şekilde değiştiği ve PT'lerin burada bildirildiği gibi, albümin endositozu eksikliği ile çoğunlukla işlevsiz olduğu iyi bilinmektedir. Şekil 2 ve Şekil 3'teki çalışmalar, glomerüler ve peritübüler kılcal damarlarda RBC akış hızında dramatik bir azalma ve artmış WBC adezyonu göstermektedir. Akıştaki azalmalar muhtemelen WBC adezyonu ve rouleaux oluşumlarından kaynaklanan kılcal tıkanmalardan kaynaklanmaktadır.
Enflamasyonu daha iyi değerlendirmek için, albümin geçirgenliğini ölçtük ve on kat arttığını gösterdik. Ek olarak, izole glomerüller, daha önce çeşitli böbrek hastalığı durumlarında böbrek iltihabında arttığı bilinen birçok gen için mRNA ekspresyonunun arttığını göstermiştir 17,19,20,21,22,23,24,25,26 . Glomerüler yüzey yoğunluğundaki ve albümin geçirgenliğindeki artışlar, 12 haftalık UUO verilerinde gösterildiği gibi progresifti. Mevcut veriler, glomerüllerin UUO modelinde önemli yapısal hasar, inflamasyon ve moleküler değişikliklere uğradığını doğrudan gösteren ilk verilerdir. Sonuçlar, UUO'yu takiben koyun böbrek biyopsilerini analiz eden ve19'u yükselten çoklu inflamasyon belirteçleri bulan tüm böbrek dokusunun daha önceki bir çalışmasıyla tutarlıdır. Mevcut sonuçlar, daha önce sadece kortikal doku için bilinen glomerüllerde belirgin inflamasyon olduğunu göstermektedir.
Mevcut veriler, 12 haftalık posthidronefrotik ve normal glomerüller31 arasında adezyon molekülü ekspresyonu, kompleman birikimi ve nötrofil infiltrasyonunda herhangi bir değişiklik bulunmayan farelerde yapılan önceki çalışmalardan farklıdır. Ek olarak, Hickey laboratuvarı, farelerin glomerüllerinde bağışıklık reaksiyonlarını incelemek için 12 haftalık UUO modelini kullandı. Dört haftalık fare glomerülleri ile postobstrüktif glomerüller arasında nötrofil infiltrasyonunda fark bulamadılar32,33. Bu daha sonraki çalışmalar, tıkanmış böbreğin pelvisi idrardan boşaltıldıktan sonra yapıldı. Bunu, UUO'nun glomerüler fonksiyon üzerindeki etkisini, obstrüksiyona neden olan sıvıyı yapay olarak çıkarmadan, in vivo olacağı gibi belirlemek istediğimiz için yapmadık. Son olarak, farelerde UUO kullanımı, yüzeyin altında 100 μm'den daha büyük görüntüleme glomerülleri ile değiştirilmektedir. Mümkün olsa da, çözünürlük ve yoğunlukta bir denge vardır, her ikisi de 50 μm34'ün ötesine geçtikçe önemli ölçüde azalır.
Histolojik değişiklikler, tübüler glomerül oluşumu, inflamasyon, fibrozis, hemodinamik10,11,12 ile ilgili mevcut literatürdeki verilerin bir araya getirilmesi şaşırtıcı değildir. WBC adezyonu, rouleaux oluşumları, glomerüler moleküler inflamasyon belirteçleri ve artmış albümin geçirgenliği dahil olmak üzere sunulan veriler, bu UUO modelinde beş haftada bile devam eden ve on iki haftada bile mevcut olan kapsamlı inflamasyonu göstermektedir. Açıkçası, kronik UUO fizyolojik bir durum değildir ve yüzey glomerüllerini indüklemek için UUO'nun kullanılması bir yaralanma modelini temsil eder. Fizyolojik koşullar altında yüzey glomerüllerine sahip olan MWF sıçanları, yaralanma meydana geldikçe uzunlamasına incelenebilir. Transgenik sıçanlar üretmek mümkündür ve çok sayıda araştırmacı bunları belirli sorular sormak için biyosensörlerle yaratmaktadır. Özellikle, Wisconsin Tıp Fakültesi şimdi MWF sıçanlarının bir kolonisine sahiptir ve fizyolojik ve patolojik koşullar altında glomerüler süreçleri incelemek amacıyla transgenik sıçanlar yapmıştır. Bu MWF sıçanları, normal, hastalıklı ve genetiği değiştirilmiş sıçanlarda glomerüler süreçleri incelemek için harika bir fırsat sunmaktadır.

Glomerüler süreçleri, özellikle podosit biyolojisini anlamak, 50 yılı aşkın bir süredir bir hedef olmuştur. Yüzey glomerüllü Münih Wistar sıçanları, fizyolojik ve patolojik süreçlerin birçok yönünü anlamak için mikroponktur çalışmaları da dahil olmak üzere bu çalışmalarda merkezi bir rol oynamıştır 1,2,3. Glomerüler bileşenleri intravital olarak incelemek için mikroskopinin kullanımı, bu toksik maruziyeti en aza indiren ve penetrasyon derinliğini artıran 2-foton mikroskobunun ortaya çıkmasına kadar fototoksisitenin etkileri nedeniyle sınırlıydı 1,2. Bilgisayar donanım ve yazılımındaki hızlı gelişmelerin yanı sıra, bu, tek bir ayarda saatlerce üç boyutlu (3B) ve dört boyutlu (zaman) çalışmalara izin vermiştir 1,4,5.
Glomerüler kılcal kan akımının miktarı, ilaçlara yanıt olarak vazokonstriksiyon ve dilatasyon, geçirgenlik ve yükün geçirgenlik ve inflamasyon üzerindeki etkileri, incelenen glomerüler süreçlerden sadece birkaçıdır. Ek olarak, proksimal tübülün S1 segmenti tanımlanabilir ve S1 ve S2 tübüler epitelinin davranışındaki farklılıklar 1,4 olarak ölçülebilir. Farelerde yapılan çalışmalar, özellikle fare transgenik tesislerinin evrensel mevcudiyeti ile, glomerüler hastalık süreçlerinin moleküler biyolojisinin anlaşılmasında hızlı ilerlemelere yol açmıştır. Bireysel proteinler, özellikle proteinüri 6,7,8 ile ilgili olarak, nakavt çalışmalarında glomerüler disfonksiyondan sorumludur. Bununla birlikte, glomerüler görüntüleme çalışmaları için fare modellerinin kullanımı, glomerüller incelenen çok sayıda suşta yüzeyin 100 μm'den daha az olduğu için sınırlandırılmıştır9.
Bu, araştırmacıların incelenebilecek yüzey glomerülleri ile sonuçlanan fare modellerini geliştirmelerine ve kullanmalarına neden olmuştur. En yaygın model, tam UUO10,11,12'nin kullanılmasıdır. Uzatılmış UUO periyodunun sonunda, farelerin böbreklerinde13,14 olabilen ve çalışılan çok sayıda yüzey glomerül vardır. Bu fare çalışmalarında, uzamış UUO'nun glomerüler biyoloji üzerindeki etkilerini belirlemek için herhangi bir temel veya kontrol çalışması yapılmamıştır. Bu, hızlı fibroz ve kortikal yıkımla sonuçlanan ciddi ve uzun süreli bir yaralanma modeli olduğu için10,11,12, glomerüler süreçler ve fonksiyon üzerinde etkiler olacağını varsaydık. Bu soruyu cevaplamak için, kontrol / taban çizgisi parametrelerini incelemek için yüzey glomerüllü Münih Wistar Fromter (MWF) sıçanları kullanıldı ve temel bulgu, beş haftalık UUO'yu takiben MWF sıçanlarında yapılan glomerüler çalışmalarla karşılaştırıldı. Ayrıca UUO'yu takiben yüzey glomerülleri olmayan Sprague Dawley (SD) sıçanlarını da inceledik. Bulgular, MWF ve SD sıçanlarda 5 haftalık UUO'nun yüzey glomerüllerinin sayısını gerçekten artırdığını göstermektedir. Bununla birlikte, bunlar glomerüler kan akışında, inflamasyonda ve makromolekül geçirgenliğinde ve boyutunda belirgin değişiklikler olan anormal glomerüllerdi.

<table><tbody><tr><td>70 ve mikro; m steril hücre süzgeci</td><td>Corning</td> <td># 421751</td><td></td></tr><tr><td>100 & mikro; m steril hücre süzgeci</td><td>Corning</td><td>#421752</td><td></td></tr><tr><td>CA Mikro makas Model 1C300</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>Cat# 72930</td><td></td></tr><tr><td>Elektrikli ısıtma yastığı</td><td>Sunbeam</td><td>Kroger</td><td></td></tr><tr><td>Taşıma Forseps Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>Cat# 72962</td><td></td></tr><tr><td>Kelly Hemostatik Forseps (düz)</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>Cat#72930</td><td></td></tr><tr><td>Leica Dive SP-8 Çoklu Foton Ters Mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>Not: Sürüm 7.1r1</td><td></td></tr><tr><td>MaiTai DeepSee titanyum-safir lazer</td><td>Spectra-Physics</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Mayo Diseksiyon Makası Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>Cat# 78180-1C3</td><td></td></tr><tr><td>Metamorf Görüntü İşleme Yazılımı</td><td>Moleküler Dinamik</td><td>Cat# 78266-04</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft Corportation</td><td>2007 sürümü</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT RNA Test Kiti</td><td>Invitrogen/ThermoFisher</td><td>Q33140</td><td></td></tr><tr><td>Reptitherm Tank Altı Isıtıcı</td><td>Yakınlaştırılmış</td><td>Amazon</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MinElute Temizleme Kiti (Döndürme sütunları)</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>RPE tamponu</td><td>Qiagen</td><td>1018013</td><td></td></tr><tr><td>Strate-Line Otoklav Bandı</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat # 11-889-1</td><td></td></tr><tr><td>TRI</td><td>Reaktif Sigma</td><td>T9424</td><td></td></tr><tr><td>Willco-dish Lamel Alt Tabaklar (50 mm / 40 mm lamel )</td> <td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>Kedi # 70665-07</td><td></td></tr></tbody></table>

kronik tek taraflı Üreter tıkanıklığının glomerüler prosesler Üzerindeki etkilerini Ölçmek için 2-foton mikroskobu kullanılması

Using 2-Photon Microscopy to Quantify the Effects of Chronic Unilateral Ureteral Obstruction on Glomerular Processes

Böbreğin dinamik fizyolojisini keşfetmek için uygun hayvan hastalığı modellerine yeni mikroskopi yöntemleri uygulamak zor olmaya devam etmektedir. Yüzey glomerüllü sıçanlar, intravital 2-foton mikroskopisi kullanarak fizyolojik ve patofizyolojik süreçleri araştırmak için eşsiz bir fırsat sağlar. Glomerüler kılcal kan akımının nicelleştirilmesi ve ilaçlara, geçirgenliğe ve inflamasyona yanıt olarak vazokonstriksiyon ve dilatasyon, çalışılabilecek süreçlerden sadece birkaçıdır. Ek olarak, transgenik sıçanlar, yani floresan boyalar ve diğer moleküler biyobelirteç yaklaşımları ile etiketlenmiş podositler, protein-protein etkileşimlerini ve spesifik moleküler değişikliklerin etkilerini doğrudan izlemek ve ölçmek için artan çözünürlük sağlar.
Dört haftalıktan sonra yüzey glomerüllerinden yoksun olan farelerde, yüzey glomerüllerini indüklemek için birkaç hafta boyunca tek taraflı üreter tıkanıklığı (UUO) kullanılmıştır. Bu indüksiyon modeli temel çalışmalara izin vermediğinden, fizyolojik koşullar altında yüzey glomerüllerine sahip Münih Wistar Frömter (MWF) sıçanlarındaki UUO modelinde UUO'nun glomerüler süreçler üzerindeki etkilerini ölçtük. Beş hafta veya daha uzun süreli UUO modeli, brüt böbrek morfolojisinde, peritübüler ve glomerüler mikrovaskülatürde ve ayrıca tübüler epitelin yapısında ve fonksiyonunda önemli değişikliklere neden oldu. Glomerüler ve peritübüler kırmızı kan hücresi (RBC) akımı, muhtemelen glomerüler ve peritübüler kılcal damarlar içindeki beyaz kan hücrelerinin (WBC'ler) aderansındaki anlamlı artışa bağlı olarak anlamlı olarak azalmıştır (p < 0.01). Albüminin glomerüler eleme katsayısı, tedavi edilmemiş MWF'lerde 0.015 ± 0.002'den 5 haftalık UUO MWF sıçanlarında 0.045 ± 0.05'e yükselmiştir. On iki haftalık UUO, albümin için yüzey glomerüler yoğunluğunda ve glomerüler eleme katsayısında (GSC) daha fazla artışa neden oldu. Glomerüller boyunca filtrelenen floresan albümin, proksimal tübüller tarafından yeniden emilmedi. Bu veriler, yüzey glomerüllerini indüklemek için UUO kullanmanın normal glomerüler süreçleri ve hastalık değişikliklerini inceleme ve yorumlama yeteneğini sınırladığını göstermektedir.

Burada, uzun süreli üreter tıkanıklığının glomerüler dinamikler ve fonksiyon üzerindeki etkilerini ölçmek için Münih Wistar Fromter sıçanlarında yüzey glomerüllü 2-foton mikroskobu kullanan bir protokol sunuyoruz.

Kronik Tek Taraflı Üreter Tıkanıklığının Glomerüler Prosesler Üzerindeki Etkilerini Ölçmek için 2-Foton Mikroskobu Kullanılması

Applying novel microscopy methods to suitable animal disease models to explore the dynamic physiology of the kidney remains a challenge. Rats with surface ...

Bu çalışmada sunulan verilerde tek taraflı üreter tıkanıklığının böbrek fonksiyonu, inflamasyon ve fibroz üzerine dramatik etkileri gösterilmiştir. Tek taraflı üreter obstrüksiyonunun patofizyolojik mekanizmalarını anlamamıza yardımcı olur. Bu tekniğin temel avantajı, hücre-hücre etkileşimlerini, hücre altı olayları inceleme ve işleyen bir böbrek içinde yapı ve işlevi dinamik bir şekilde ilişkilendirme yeteneğidir.Üreter prosedürünün gösterilmesi, laboratuvarımızda cerrah olan Dr. Silvia Campos-Bilderback tarafından yapılacaktır. Başlamak için, sıçanı uyuşturun, daha sonra orta hat boyunca bir kesi yapın ve sol böbreği çevreleyen periton organlarından ayırmak için bulun. Renal arter, böbrek damarı ve üreteri içeren renal pedikülü bulduktan sonra, hassas yapıya zarar vermeden üreteri ayırın.Üreterin etrafına 3-0'lık bir dikiş ilmek ve bağlamak için forseps kullanın, ardından tam tıkanıklığı sağlamak için ilk düğümün her iki tarafına birkaç milimetre düğüm bağlayın. Üreter bağlandıktan sonra, ardışık kas katmanlarını dikkatlice kapatın, ardından karnı tamamen kapatın. Dış cildi cerrahi zımbalarla kapatın.Cerrahi hazırlık için, anestezi uygulanan sıçanı, tıraşlı sol kanadı düz ve düz bir şekilde masanın üzerine bakacak şekilde yan tarafa yerleşik bir venöz erişim çizgisi ile yerleştirin. Sıçanın ön pençelerinin, arka pençelerin olması gerektiği gibi birbirine temas ettiğinden emin olun. Sıçan yerleştirildikten sonra, böbreği hissetmek ve karındaki doğal pozisyonu belirlemek için kaburgaların hemen altındaki sol kanadı palpe edin, daha sonra tıraş edilen bölge boyunca kalıcı bir belirteç kullanarak bir çizgi çizin ve böbrek merkezini burundan kuyruğa doğru ikiye bölün.Cildi yukarı doğru kavramak ve kaldırmak için bir çift dişli forseps kullanın ve altta yatan vaskülatürü ezmek ve kanamayı önlemek için kalıcı belirteç çizgisini bir çift hemostatla sıkıştırın. Kanamayı en aza indirmek için ince dış kas tabakası için prosedürü tekrarlayın. İnce iç karın kası tabakasının son kesisini yapmak için, büyüklüğü ve pozisyonu tahmin etmek için böbreği palpe edin ve iç kas tabakasını bir çift forseps ile kaldırın, ardından böbreğin üzerindeki cildi böbreğin tahmini büyüklüğünün yaklaşık 1 / 3'ü olan hemostatlarla ikiye bölen bir çizgiyi ezin.Forseps ile kas tabakası üzerindeki tutuşu korurken, son kesiyi yapın. Daha sonra, böbrek yağını böbreğin alt kutbunda tutmak ve tutmak için her elinizde forseps kullanın ve aşağı doğru çalışan bir el ele tekniği kullanın. Bir elinizle yağ üzerinde sıkı bir tutuşa sahip olarak, yağı çekin ve böbreği kesiden çok nazikçe sıkın.Böbrek geçmezse, insizyonu kolayca genişletin. Kılcal halkalara yerleştirilen beyaz kan hücrelerini veya WBC'leri tanımlamak için, Hoechst 33342 nükleer boyasını, yerleşik bir venöz erişim hattı aracılığıyla sıçan ağırlığının kilogramı başına 8 mikrogramda uygulayın. Mikroskopta, maruz kalan böbreği hafif bir rotasyonla çanağın kenarına yerleştirin, böylece böbreğin karın tarafı kapak kaymasına temas eder ve sırt tarafı kenardan uzağa bakar.Hareketi daha da azaltmak için, böbreğin karın tarafının kenara temasını güçlendiren böbreğin dorsal tarafına salin ile nemlendirilmiş iki steril 2'ye 2 gazlı bez pedi paketleyin. Örnek konumlandırıldığında, çift geçişli bir rodamin FITC küpü kullanarak epifloresan aydınlatma altında mikroskop göz merceğinden bakın. Numune pozisyonunda bir hareket tespit edilirse, gazlı bezi böbreğin altına itmediğinden emin olacak şekilde ayarlayarak küçük ayarlamalar yapın.Sıçanı hafifçe yuvarlayın, böylece toraks çanaktan daha uzakta olur. Epifloresan aydınlatmayı kullanarak böbreğin yüzeyini tarayın ve motorlu aşama kontrolörü ile ilişkili yazılımı kullanarak glomerül konumlarını işaretleyin. 2 foton aydınlatması altındaki her renk kanalı için, arka plan görüntüsü olarak hizmet etmek üzere işaretlenmiş her glomerulusun üst kısmının sığ bir 3D hacmini alın.Görüntüleme yazılımının görüntüleme seçeneğinde, glomerüler kılcal halkaların arka plan floresansının soluk yoğunluklarını görselleştirmek için sahte bir renk paleti kullanın. Odak noktası olarak yüzeysel bir kan damarı kullanarak, peritübüler vaskülatür ve kılcal halkalardaki bir yoğunluk doygunluğun hemen altına gelene kadar sistemik dağılım nedeniyle floresanın yükselişini ve düşüşünü gözlemlerken floresan Texas Red RAP serum albüminini veya TRRSA'yı yavaşça infüze edin. 10 dakika sonra, 1 mikrometre aralıklarla işaretlenmiş ve görüntülenen tüm glomerüller için 3D hacimler elde edin.Kılcal bir döngü veya peritübüler bir kap olan uygun bir kap bulun, ardından görüntü alma yazılımındaki Çizgi Tarama işlevi kabın dik olmasını gerektirdiğinden Döndür işlevini kullanarak görüntüyü döndürün. Gemi döndürüldükten ve düz bir şekilde yattıktan sonra, Edinme menüsünde XT işlevini seçin ve 4.000 satırı tarayacak şekilde ayarlayın. Çizgiyi, segmentin maksimum çapında, odak düzlemi ile incelenecek kap boyunca yerleştirin.Ardından, renkli bileşik görüntüye sol tıklayın ve çizgi taramasının yapıldığı alanın referans görüntüsünü oluşturmak için Anlık Görüntü Al sekmesini seçin. Geminin hat taramasını yakalamak için hemen Başlat düğmesine tıklayın. Daha sonra, RBC akış hızını belirlemek için hat taramalarını görüntü işleme yazılımına aktarın.Ölçü açılır menüsünün altında, Bölge İstatistiklerini Göster iletişim kutusunu açın ve RBC gölgelerinin eğimiyle eşleşen bir çizgi çizmek için Tek Çizgi Çizimi aracını seçin. Çizginin genişliğini ve yüksekliğini not ettikten sonra, hızı hesaplamak için bir denklem kullanın, ardından her çizgi taramasının hızını raporlamak için ortalama beş hesaplama elde edin. Görüntüleme alanında bir glomerulusu ortalayın ve glomerüler yüzeyden başlayıp 30 ila 35 mikrometrede biten bir 3D veri seti alın.Z yönünde 1 mikrometrelik bir adım boyutu kullanın. Mavi Hoechst kanalını Texas Red albümin kanalı ile karşılaştırarak, kılcal döngüde kırmızı boyanın dışlanmasını ve buna karşılık gelen bir nükleer lekeyi arayarak WBC'leri tanımlayın. WBC'ler üç optik bölüm üzerinde statik görünüyorsa, hücreleri yapışmış olarak tanımlayın, ardından değerleri, 1 mikrometre aralıklarla alınan glomerulusun tepesinden 10 optik bölüm başına oluşum olarak rapor edin.Münih Wistar Fromter veya MWF sıçanlarında alan başına glomerüler sayı, 5 haftalık UUO grubunda, tedavi edilmemiş sıçanlara göre artmıştır. Sprague-Dawley sıçanları veya SD sıçanları, tek taraflı üreter tıkanıklığının beş haftasını takiben yüzey glomerülleri olmamasından alan başına 2.02'ye çıktı. Böbrek yüzeyini görmek için üç boyutlu yeniden yapılandırılmış görüntüler gözlendi.SD sıçanlarda 5 haftalık tek taraflı üretal obstrüksiyon, MWF'de görüldüğü gibi normal tübüler epiteliye benzeyen alanlarda, tedavi edilmemiş ve kısmen 5 haftalık UUO MWF sıçanlarında sonuçlanmadı. Renal vasküler dinamiklerin incelenmesinde, 5 haftalık UUO MWF ve SD gruplarında böbrek kan akışı, tedavi edilmeyen sıçanlara kıyasla anlamlı derecede azalmıştır. Glomerüler kılcal döngülerdeki RBC hızı, 5 haftalık UUO MWF'de ve SD sıçanlarında, tedavi edilmemiş MWF sıçanlarına kıyasla önemli ölçüde azalmıştır.Ek olarak, tedavi edilmemiş MWF sıçanları, üstten 10 optik bölüm başına daha az WBC'ye sahipken, sayı 5 haftalık UUO MWF ve 5 haftalık UUO SD sıçanlarında artmıştır. Tek taraflı üretal obstrüksiyon ile albümin geçirgenliğinde artış görüldü. Tek taraflı üretal obstrüksiyondan sonra Bowman boşluğunda albümin birikimi yoğundu.S1 segmenti endositoz, tedavi edilmemiş MWF sıçanlarında fizyolojik koşullarla gözlendiği gibi büyük miktarlarda albümin içerir. Aynı alım, 5 haftalık tek taraflı üretal obstrüksiyonu takiben MWF veya SD sıçanlarda görülemedi. Zaman içinde bir süreci incelemek için tekrar görüntüleme, görüntüleme için belirli bir alanın sabitlenmesi ve daha sonra daha yüksek çözünürlüklü mikroskopi gerçekleştirmek için sabit dokunun kullanılması gibi birçok farklı yöntem bu teknikle birlikte yapılabilir.Bu teknik yıkıcı teknoloji olarak kabul edilir. Araştırmacıların birçok yeni soruyu cevaplaması sağlanır. Bunu yaparken, yeni içgörüler sağlanmış ve paradigma değiştiren veriler elde edilmiştir.

using-2-photon-microscopy-to-quantify-effects-chronic-unilateral

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu videoda, tek taraflı üreter tıkanıklığı fare modeli oluşturma prosedürü gösterilmektedir. Prosedür, idrar akışını engellemek için farenin üreterlerinden birinin kesilmesini içerir.

Tek Taraflı Üreter Tıkanıklığı Murin Modeli: Fare Modellerinde Böbrekten İdrar Akışını Engellemek İçin Cerrahi Bir İşlem

2-foton mikroskopi yüksek çözünürlüklü intavital kullanan bir teknik doğrudan görselleştirmek ve yüzey glomerüllerde gloemrular filtrasyon ölçmek için. Bu yöntem, normal ve hastalıklı hem Devletler makromoleküllerin geçirgenlik özelliklerinin doğrudan belirlenmesi için olanak sağlar.

Münih Wistar Sıçanlarda 2-Foton Mikroskopi kullanarak Floresan Makromoleküllerin Glomerüler geçirgenliği miktarının

Geri dönüşümsüz tek taraflı üreter tıkanıklığının (UUO) murin modeli, kopmuş üreterin mesaneye anastomozu ile üreter tıkanıklığının giderildiği geri dönüşümlü UUO modeli ile birlikte sunulmuştur. Bu modeller, böbrek iltihabı ve yara izinin yanı sıra doku yeniden şekillenmesinin incelenmesini sağlar.

Geri dönüşümsüz ve Tersinir Tek taraflı Üreterik Obstrüksiyon bir fare modeli

Bu iletişim kuralı bir tam böbrek iş-up glomerular hastalığı fare modellerinde yürütülmesi gereken açıklar. Yöntemler glomerular hastalığı tüm fare modelleri uygulanabilir glomerular işlevinin ayrıntılı işlevsel, yapısal ve mekanik analiz için olanak sağlar.

Fare modelleri Glomerular hastalığı böbrek fonksiyonlarının değerlendirilmesi

Biz böbrek fizyolojisi 2 temel teknikleri birleştirerek farelerde, Bowman'ın idrar alanındaki bir micropipette yerleştirmek için 2-foton mikroskobu kullanımı mevcut. 2-foton mikroskobu kullanılması geleneksel mikroskopi micropuncture böbrek fizyolojisi çalışmaları için kritik sınırlamalar üstesinden gelir.

Micropuncture tarafından 2 foton mikroskobu kolaylaştırdı farelerde Bowman'ın alanı

Antikor etiketleme, optik temizleme ve gelişmiş ışık mikroskobu kombinasyonu, tam yapıların veya organların üç boyutlu analizini sağlar. Burada açıklanan, kalın böbrek dilimleri immünolabeling birleştirmek için basit bir yöntemdir, etil cinnamate ile optik Temizleme, ve üç boyutlu böbrek yapıların görselleştirme ve kantifikasyon sağlayan konfoköz görüntüleme.

Optik temizleme ve Immünolabeled böbrek dokusu görüntüleme

Tek taraflı üreteral obstrüksiyonu (UUO) olan farelerin böbreklerinde mikroRNA ekspresyonunu kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu ile değerlendirmek için bir yöntem tanımladık. Bu protokol UUO ile farelerde ve diğer patolojik durumlar bağlamında böbrek mikroRNA ekspresyon profillerinin incelenmesi için uygundur.

Fare Böbreğinde Tek Taraflı Üreteral Obstrüksiyonile MikroRNA Ekspresyonlarının Kantitatif Gerçek Zamanlı PCR Değerlendirilmesi

Bu protokol, tek taraflı üreter tıkanıklığının adım adım, tekrarlanabilir bir modelini tanımlamaktadır.

Geri Dönüşümlü Tek Taraflı Üreter Tıkanıklığının Olgunlaşmamış Bir Murin Modeli

Bu protokol, obstrüktif nefropatide doku fibrozunun ilerlemesini incelemek için farelerde tek taraflı üreter tıkanıklığını (UUO) indüklemek için bir yöntemi tanımlar. Cerrahi prosedürleri, ameliyat sonrası bakımı ve fibroz değerlendirmesi için yöntemleri içerir.

Böbrek İnterstisyel Fibrozisinin Araştırılmasında Tek Taraflı Üreter Obstrüksiyon Modeli

Bu makale, araştırmacıların, uzun süreli üreter tıkanıklığının tersine çevrilmesinden sonra uzun vadeli yapısal ve fonksiyonel sonuçların analizine izin veren standart bir model kullanarak farelerde geri dönüşümlü tek taraflı üreter tıkanıklığı gerçekleştirmelerini sağlamak için ayrıntılı talimatlar sağlar.

Uzun Süreli Tek Taraflı Üreter Tıkanıklığının Tersine Çevrilmesinden Sonra Uzun Vadeli Yapısal ve Fonksiyonel Sonuçları Değerlendirmek İçin Bir Fare Modeli

Keşfedin, 2-foton mikroskobu kullanarak kronik tek taraflı üreter tıkanıklığının glomerüler dinamikler ve böbrek fonksiyonu üzerindeki etkilerini. Bu yöntem, canlı organizmada hücre-hücre etkileşimlerini ve böbrek fizyolojisini dinamik olarak incelemeyi sağlar.

Kronik Tek Taraflı Üreter Tıkanıklığının Glomerüler Prosesler Üzerindeki Etkilerini Ölçmek için 2-Foton Mikroskobu Kullanılması

Daha fazla video keşfet