Yeniden Yapılandırılmış Hücre İskeletinin Dev Unilameller Veziküller İçinde Hızlı Kapsüllenmesi

Son yıllarda, hücre boyutundaki lipit çift katmanlı veziküller içindeki kapsüllemenin, in vitro sulandırma deneyleri için yararlı bir yöntem olduğu kanıtlanmıştır. Sunduğumuz yöntem, sentetik hücre araştırmalarında sitoiskelet resulansına büyük ölçüde yardımcı olacaktır. Bu yöntemle, yüksek verime sahip heterojen boyutlu dev unilamellar veziküller üretebiliriz.

Vezikül oluşturma süresi, geleneksel cDICE tekniğine kıyasla önemli ölçüde azalır. Moleküler yolları incelemek için karmaşık, aynı anda meydana gelen hücresel süreçlerden izole edilmiş hücresiz transkripsiyon-çeviri sistemlerini kapsülleyebiliriz. Bu yöntem, fonksiyonel sentetik hücreler oluşturmak için minimal protohücreleri bir araya getirmek için kullanılabilir.

Diyooil-fosfokolin, kolesterol ve rodamin PE'yi 15 mililitrelik bir cam şişeye aktararak bir yağ-lipit karışımı hazırlamaya başlayın. Ardından, şişeye 0,5 mililitre kloroform ekleyin. Pipet, 15 mililitrelik ayrı bir tüpte 7.2 mililitre silikon yağı ve 1.8 mililitre mineral yağ ve yağları 10 saniye boyunca dakikada 3.200 dönüş hızında vorteks yaparak karıştırın.

Daha sonra, yağ karışımını lipit ve kloroform karışımını içeren şişeye ekleyin ve lipitler yağda tamamen çözünmediğinden, elde edilen yağdaki lipit karışımı hafif bulutlu olana kadar karışımı dakikada 3.200 dönüş hızında 10 ila 15 saniye boyunca vorteksleyin. Daha sonra, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 80 watt ultrasonik güç ve 40 kilohertz çalışma frekansı ile bir banyo sonicator yağ dağılımında lipit sonicate sonicate. Hemen kullanılmazsa, lipit-yağ karışımını 24 saat boyunca dört santigrat derecede saklayın.

Vezikülleri oluşturmak için, montajı dakikada 1.200 dönüş hızında tezgah üstü karıştırma plakasına monte edilmiş siyah reçineden yapılmış 3D baskılı bir şaft ile kullanın. Ardından, siyah reçine mili üzerindeki şeffaf reçineden yapılmış 3D baskılı sürekli damlacık arayüzü çapraz kapsüllemesini veya cDICE odasını monte edin. Küresel aktin tamponunda veya G tamponunda,% 10 ATO 488 aktin dahil olmak üzere 1 ila 10 mikromolar aktin çözeltisi hazırlayın.

Aktin polimerizasyonuna başlamak için, buz üzerindeki aktin çözeltisine filamentli aktin polimerizasyon tamponu veya F tamponu ekleyin ve daha sonra bir çapraz bağlayıcı eklemeden önce aktin polimerizasyonunu yavaşlatmak için çözeltileri buz üzerinde tutun. Aktin bağlayıcı proteinleri veya ABP'leri, mililitre büyüleyici stok başına 1.75 miligramdan hazırlamak için, ayrı bir mikrotüpte 1.57 mikrolitre fasin aliquot. Daha sonra, dış ve iç sulu faz arasında bir yoğunluk gradyanı oluşturmak ve dev unilamellar veziküller veya GUV'lar, çökeltmeyi kolaylaştırmak için aktin çözeltisine% 7.5 yoğunluk gradyanı ortamı ekleyin.

Daha sonra, odaya dış çözelti olarak 700 mikrolitre 200 milimolar glikoz dağıtın. Haznenin% 60 ila% 80'i dolana kadar odaya yeterli lipit-yağ karışımı ekleyin. Lipit-yağ karışımı ile dış çözelti arasında bir arayüz oluşturulacaktır.

ABP'leri aktin çözeltisine aktararak bir aktin-ABP karışımı hazırlayın. Daha sonra, lipit-yağ karışımının 700 mikrolitresini aktin-ABP karışımına aktarmak için düzenli bir 100 ila 1.000 mikrolitrelik pipet kullanın. 7 ila 100 mikron çapında hücre boyutunda lipit tek katmanlı emülsiyon damlacıkları oluşturmak için sekiz kez yukarı ve aşağı pipet.

Tüm emülsiyonu dönen odaya dağıtmak için aynı 100 ila 1.000 mikrolitrelik pipeti kullanın. Damlacıklar, lipit tek tabakasını yağ-dış çözelti arayüzünde geçerek ikinci bir lipit broşürü elde edecek ve böylece GUV'lar oluşturacaktır. İşiniz bittiğinde, odayı karıştırma plakasından çıkarın ve odayı atık kabına eğerek lipit-yağ karışımının çoğunu atın.

Odayı kapağı içeriye bakacak şekilde tutarak, oda kapağını açın ve odayı hafifçe içe doğru eğin. GUV'ları içeren dış çözelti ile lipit-yağ karışımı arasındaki arayüz, kapağın bulunduğu hazne açıklığından görülebilecektir. GUV'ler içeren yeterli dış çözeltiyi toplamak için bir pipet kullanın ve uygun bir GUV yoğunluğu elde etmek için 50 ila 300 mikrolitre dış çözeltiyi 96 delikli bir plakaya dağıtın.

GUV'ları görüntülemek için, 96 delikli plakayı, yağ daldırma 60X objektif lens ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop sahnesine yerleştirin. Bir görüntü işleme yazılımı olan ImageJ Fiji'de ilgilendiğiniz bir görüntü dizisini açın ve görüntüyü en yüksek yoğunlukta tanımlayın. Parlaklık ve kontrast penceresini açmak için Control Shift C tuşunu basılı tutun ve sıfırlama sekmesine tıklayın.

ImageJ Fiji menüsünde, her görüntü pikseli için bilinen fiziksel mesafeyi ve birimi girmek üzere Analiz Et ve Ölçeği Ayarla sekmelerine gidin. İşiniz bittiğinde, Z yığınından bir 3B görüntüyü yeniden oluşturmak için Görüntü, Yığınlar ve ardından 3B Proje düğmelerine gidin. Projeksiyon yöntemini Parlaklık Noktası, Dilimleme aralığını 0,5 mikrometre olarak ayarlayın ve ardından İnterpolat kutusunu işaretleyin.

Ayarların geri kalanı için varsayılan seçenekleri kullanın ve görüntüleri yakalayın. Temsili görüntü, kapsüllenmiş büyüleyici aktin demetleri ile rodamin PE etiketli GUV'ların konfokal bir görüntüsünü göstermektedir. Aktin bağlayıcı proteinlerin aktin çözeltisine aktarılması, daha sonra lipit-yağ karışımının eklenmesi ve kapsüllemeden önce aktin ağlarının oluşmasını önlemek için birkaç saniye içinde lipit tek katmanlı damlacıkların üretilmesi gerekir.

Bu modifiye cDICE tekniğini, aktin ağlarını organize etmede farklı aktin net çapraz bağlayıcıların rollerini incelemek için kullandık. Bu yöntemin diğer araştırmacıların diğer sitoiskelet proteinlerinin düzenlenmesini keşfetmelerine yardımcı olacağını umuyoruz.