Name: Yeniden Yapılandırılmış Hücre İskeletinin Dev Unilameller Veziküller İçinde Hızlı Kapsüllenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Öğrenin, dev unilameller veziküller içinde hücre iskeleti proteinlerinin hızlı kapsüllenmesi yöntemini. Bu teknik, sentetik hücre araştırmalarında sitoskeleton yeniden yapılandırmasını kolaylaştırır ve yüksek verim sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

APL, Deneyimli Araştırmacılar için Humboldt Araştırma Bursu ve Ulusal Bilim Vakfı (1939310 ve 1817909) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 EB030031) tarafından verilen desteği kabul etmektedir.

1. Yağ-lipit-karışımının hazırlanması
NOT: Adımın, kloroformun taşınması için tüm güvenlik kurallarına uygun olarak bir duman davlumbazında gerçekleştirilmesi gerekir.
<ol><li>15 mL'lik bir cam şişede 0,5 mL kloroform alın. 15 ml'lik cam şişeye 88 μL 25 mg/mL dioleoyl-fosfokolin (DOPC), 9.3 μL 50 mg/mL kolesterol ve 5 μL 1 mg/mL dioleoyl-phosphoethanolamine-lissamine rhodamine B ( rodamin PE) ekleyin (bkz. NOT: Silikon yağı / mineral yağdaki DOPC ve kolesterolün son mol fraksiyonları sırasıyla% 69.9 ve% 30'dur. % 20-30 mol kolesterolün, sunulan teknik25,26 kullanılarak üretilen GUV'ların membran akışkanlığı ve stabilitesi için optimize edilmiş bir konsantrasyon olduğu tespit edilmiştir. Fizyolojik olarak, bu değerler memeli hücre plazma membranlarında bulunan kolesterol konsantrasyon aralığındadır6. Lipid stokları kloroformda çözeltiler halinde elde edilir ve -20 °C'de depolanır. Lipid stok şişeleri açılmadan önce oda sıcaklığına alıştırılmalıdır.</li>
	<li>Pipet, ikinci bir 15 mL şişede 7,2 mL silikon yağı ve 1,8 mL mineral yağ (bkz. Genel olarak, bunun düşük nemli bir torpido gözünde, özellikle mineral yağ yeniden kullanılıyorsa yapılması gerekir.</li>
	<li>Yağları 10 s boyunca maksimum dönme hızında (3200 rpm) vorteks yaparak karıştırın, karışımı kloroform içindeki lipit karışımını içeren şişeye ekleyin ve hemen vorteks karıştırıcısına yerleştirin. Maksimum dönme hızında (3200 rpm) 10-15 s için vorteks. Elde edilen lipitler yağ içinde karışım hafif bulutlu olmalıdır, çünkü lipitler yağda tamamen çözünmez, bunun yerine küçük agregalar olarak dağılır24.</li>
	<li>Lipid-in-oil dispersiyonunu 80 W ultrasonik güce ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında 40 kHz çalışma frekansına sahip bir banyo sonikatörüne ( Malzeme Tablosuna bakınız) koyun. Karışımı hemen kullanın veya maksimum 24 saat boyunca 4 ° C'de saklayın.</li>
</ol>2. Vezikül oluşumu
<ol><li>Siyah reçineden yapılmış 3D baskılı şaftı (Ek Dosya 1) tezgah üstü karıştırma plakasına monte edin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve dönme hızını 1200 rpm'ye ayarlayın.</li>
	<li>Şeffaf reçineden yapılmış 3D baskılı cDICE odasını (Ek Dosya 2) şaft üzerine monte edin ( Malzeme Tablosuna bakınız) (Şekil 1A, B).</li>
	<li>Aktin ve aktin bağlayıcı proteinler (ABP) çözeltilerini ayrı ayrı toplam 20 μL hacimde hazırlayın.<ol>
<li>Küresel aktin tamponunda (G-tamponu) %10 ATTO 488 aktin dahil olmak üzere 1-10 μM aktin hazırlayın (bkz. NOT: 1x G-tamponu 5 mM Tris-HCl, pH 8.0 ve 0.2 mM CaCl2'den oluşur.</li>
		<li>Buz üzerinde aktin polimerizasyonuna başlamak için filamentli aktin polimerizasyon tamponu (F-tamponu) ekleyin. Bir çapraz bağlayıcı eklemeden önce aktin polimerizasyonunu yavaşlatmak için çözeltileri buz üzerinde tutun. NOT: 1x F-tamponu, 10 mM Tris, pH 7,5'te 50 mM KCl, 2 mM MgCl2 ve 3 mM ATP içerir.</li>
		<li>İstenilen molar oranda ilgilenilen çapraz bağlayıcıları eklemeden önce buz üzerinde aktin polimerizasyonunun başlatılmasına izin vermek için 15 dakika bekleyin. Kapsüllenene kadar çözeltiyi buz üzerinde tutun.</li>
		<li>Aktin bağlayıcı proteinleri (ABP'ler) bir mikrotüp içinde ayrı ayrı hazırlayın (Şekil 1C). NOT: Bu adım, ABP'lerin bir kombinasyonu (örneğin, miyosin, α-aktinin, fasist, Arp2/3 kompleksi) aktin25,26,27 ile kapsüllendiğinde gerçekleştirilir. Bu gibi durumlarda, her ABP'nin istenen miktarı stoklarından çekilir ve ABP'ler için belirlenen mikrotüpe eklenir. Toplam çözelti 20 μL olacağından, ABP'lerin stok alikotları, toplam ABP karışımının istenen miktarı 5-6 μL'yi geçmeyecek şekilde hazırlanmalıdır. Buradaki temsili sonuçlarda kullanılan tek ABP, hazırlanması aşağıda belirtilen büyüleyicidir.<ol>
<li>1.75 mg/mL'lik bir fasin stoğundan 1.57 μL fasin (bakınız Malzeme Tablosu) ve adım 2.7'de doğrudan aktin çözeltisine eklenir. Bu, çözeltideki 2.5 μM büyüsüne karşılık gelir.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>GUV çökelmesini kolaylaştırmak için dış ve iç sulu faz arasında bir yoğunluk gradyanı oluşturmak için aktin çözeltisine yoğunluk gradyanı ortamının% 7,5'ini ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
	<li>200 mM glikozun dış çözeltisinin 700 μL'sini odaya dağıtın (Şekil 1D, solda). NOT: İç çözeltinin ozmolaritesi, glikoz konsantrasyonunu belirler. Bu deneyler için, iç çözeltinin ozmolaritesi ~ 200 mOsm'dur, bu nedenle dış çözelti olarak 200 mM'lik bir glikoz çözeltisi kullanılır.</li>
	<li>Odanın% 60-80'i dolana kadar odaya yeterli miktarda lipit-yağ karışımı (oda boyutuna göre >3 mL) ekleyin (Şekil 1D, sağ). Lipit-yağ karışımı ile dış çözelti arasında bir arayüz oluşturulacaktır.</li>
	<li>ABP'leri (adım 2.3.4'te hazırlanan) aktin çözeltisine aktarın. Normal bir 100-1000 μL pipet kullanarak, lipit-yağ karışımının 700 μL'sini derhal aktin-ABP karışımına aktarın (Şekil 1E, sol). Çapı 7-100 μm aralığında olan hücre boyutunda lipid tek katmanlı damlacıklar oluşturmak için 8 kez yukarı ve aşağı pipet alın (Şekil 1E, orta). NOT: Kapsüllemeden önce herhangi bir aktin ağ montajını önlemek için Adım 2.7'nin birkaç saniye içinde tamamlanması gerekir. Bu nedenle, adımı gerçekleştirmeden önce, pipet uçlarının pipetlere zaten takılı olduğundan ve karışımları aktarmaya hazır olduğundan emin olun.</li>
	<li>Aynı 100-1000 μL pipeti kullanarak, tüm emülsiyonu derhal dönen odaya dağıtın. Damlacıklar, lipit tek tabakasını yağ-dış çözelti arayüzünde geçerek ikinci bir lipit broşürü elde edecek ve böylece GUV'lar oluşturacaktır (Şekil 1E, sağda).</li>
	<li>Odayı karıştırma plakasından çıkarın ve odayı atık kabına eğerek lipit-yağ karışımının çoğunu atın, böylece lipit-yağ karışımının büyük bir kısmı odanın ortasındaki büyük açıklıktan boşaltılır. NOT: Bu şekilde, lipit-yağ karışımı haznenin dışına çekilir ve bir sonraki adımda lipit-yağ karışımının dış çözelti ile karıştırılmasını önler.</li>
	<li>Odayı, kapağı kullanıcıya bakacak şekilde tutun. Oda kapağını açın ve odayı kullanıcıya doğru hafifçe eğin. GUV'ları içeren dış çözelti ile lipit-yağ karışımı arasındaki arayüz, hazne açıklığından (kapağın bulunduğu yerden) görülebilir.</li>
	<li>Bir pipet kullanarak, GUV'ler içeren yeterli dış çözeltiyi toplayın ve uygun bir GUV yoğunluğu elde etmek için dış çözeltinin 50-300 μL'sini 96 delikli bir plakaya dağıtın. NOT: Bu protokolü takiben, hazne içindeki dış çözeltide toplam yaklaşık 2 x 105 GUV'ler serbest bırakılır. GUV dağılımı ölçülmedi; Bununla birlikte, GUV'ların yaklaşık% 90'ının çapı 12-30 μm aralığındadır. popülasyonda 7-50 μm aralığında herhangi bir çapa sahip GUV'lar bulunabilir. Kapsüllenmiş yoğunluk gradyanı ortamına, GUV boyutuna ve kuyu plakasındaki çözelti derinliğine bağlı olarak, GUV'ların yüzeye yerleşmesi 2-15 dakika sürer. Yeniden yapılandırılmış aktin demetlerine sahip GUV'ların verimi yaklaşık% 90'dır.</li>
</ol>3. Görüntüleme ve 3D görüntü rekonstrüksiyonu
<ol><li>96 kuyu plakasını, dönen disk (veya lazer tarama) konfokal ünitesi, bir EMCCD veya bir sCMOS kamera ve bir yağ daldırma 60x objektif lens ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop sahnesine yerleştirin (bkz.</li>
	<li>Herhangi bir ilgi alanına (ROI) odaklanın ve 0,5 μm z-adım aralığıyla ROI'den bir z-stack görüntü dizisi alın. NOT: GUV'ler zaman içinde yüzeyde hafifçe yer değiştirebildiğinden, birden fazla florofor görüntüleniyorsa, her z-düzleminde çok dalga boyunda bir görüntü kümesi yakalamanız önerilir, yani ATTO 488 aktin ve Rhod PE görüntülerini yakalamak için her bir z-şeridinde bir seferde 561 nm ve 488 nm görüntü grubu alın.</li>
	<li>Her z-stack görüntü dizisini .tiff formatında kaydedin.</li>
	<li>Bir görüntü işleme yazılımında (ImageJ/Fiji) ilgilendiğiniz bir görüntü dizisini açın. Görüntüyü en yüksek yoğunlukta tanımlayın. Parlaklık ve Kontrast penceresini açmak için "ctrl + shift + c" tuşlarını basılı tutun ve Sıfırla'ya tıklayın.</li>
	<li>ImageJ/Fiji menüsünden, Analiz > Ölçek Ayarla'ya gidin ve her görüntü pikseli için bilinen fiziksel mesafeyi ve birimini girin.</li>
	<li>ImageJ/Fiji menüsünden, z-yığınından bir 3B görüntüyü yeniden oluşturmak için Görüntü > Yığınları > 3B projesine gidin. "Projeksiyon yöntemi"ni Parlaklık Noktası, "Dilim Aralığı (μm)" değerini 0,5 olarak ayarlayın ve İnterpolat onay işaretini işaretleyin. Varsayılan seçenekler, ayarların geri kalanı için kullanılabilir. NOT: Bazı mikroskoplardaki z-aralıkları kalibre edilemeyebilir ve z-yönündeki gerçek hareket girilen z-aralığından (yani 0,5 μm) biraz farklı olabilir. Bu gibi durumlarda, gerçek z-aralığını elde etmek için bilinen bir çapa sahip floresan mikrosferler gibi bir 3D kalibrasyon örneği kullanılabilir. Bu nedenle bu değer, 3B projeksiyon için "Dilim Aralığı (μm)" olarak kullanılacaktır.</li>
</ol>

<ol><li>Groaz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+spatiotemporal+organization+and+dynamics+in+synthetic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+Nanomedicine+and+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineering spatiotemporal organization and dynamics in synthetic cells.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (3), 1685(2021).</li>
<li>Diltemiz, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+artificial+cells+as+drug+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Chemistry+Frontiers%22%5BJournal%5D)">Use of artificial cells as drug carriers.</a> Materials Chemistry Frontiers. 5, 6672-6692 (2021).</li>
<li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+under+construction%3A+In+vitro+reconstitution+of+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).</li>
<li>Ganzinger, K. A., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+from+less+-+bottom-up+reconstitution+of+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">More from less - bottom-up reconstitution of cell biology.</a> Journal of Cell Science. 132 (4), 227488(2019).</li>
<li>Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+the+cytoskeleton%3A+Towards+mimicking+the+mechanics+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of the cytoskeleton: Towards mimicking the mechanics of a cell.</a> Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).</li>
<li>Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., Plastino, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+dynamics%2C+architecture%2C+and+mechanics+in+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+reviews%22%5BJournal%5D)">Actin dynamics, architecture, and mechanics in cell motility.</a> Physiol reviews. 94 (1), 235-263 (2014).</li>
<li>Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+electroformation%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Discussions+of+the+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Liposome electroformation.</a> Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).</li>
<li>Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+formation+of+giant+liposomes+through+the+gentle+hydration+of+phosphatidylcholine+films+doped+with+sugar%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68 (1), 98-105 (2009).</li>
<li>Bailey, A. L., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+fusion+with+cationic+liposomes%3A+Effects+of+target+membrane+lipid+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane fusion with cationic liposomes: Effects of target membrane lipid composition.</a> Biochemistry. 36 (7), 1628-1634 (1997).</li>
<li>Haluska, C. K., Riske, K. A., Marchi-Artzner, V., Lehn, J. M., Lipowsky, R., Dimova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+scales+of+membrane+fusion+revealed+by+direct+imaging+of+vesicle+fusion+with+high+temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Time scales of membrane fusion revealed by direct imaging of vesicle fusion with high temporal resolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (43), 15841-15846 (2006).</li>
<li>Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+control+of+giant+unilamellar+vesicles+prepared+from+inverted+emulsion+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 376 (1), 119-125 (2012).</li>
<li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+unilamellar+vesicles+using+an+inverted+emulsion%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li>
<li>Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Liu, A. P., Parekh, S. H., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unilamellar+vesicle+formation+and+encapsulation+by+microfluidic+jetting%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4697-4702 (2008).</li>
<li>Noireaux, V., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+age+of+cell-free+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">The new age of cell-free biology.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 51-77 (2020).</li>
<li>Ho, K. K. Y., Murray, V. L., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+artificial+cells+by+combining+HeLa-based+cell-free+expression+and+ultrathin+double+emulsion+template%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Engineering artificial cells by combining HeLa-based cell-free expression and ultrathin double emulsion template.</a> Methods in Cell Biology. , 303-318 (2015).</li>
<li>Akashi, K., Miyata, H., Itoh, H., Kinosita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+giant+liposomes+in+physiological+conditions+and+their+characterization+under+an+optical+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Preparation of giant liposomes in physiological conditions and their characterization under an optical microscope.</a> Biophysical Journal. 71 (6), 3242-3250 (1996).</li>
<li>Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+unilamellar+vesicle+electroformation%3A+From+lipid+mixtures+to+native+membranes+under+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Giant unilamellar vesicle electroformation: From lipid mixtures to native membranes under physiological conditions.</a> Methods in Enzymology. 465, 161-176 (2009).</li>
<li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+vesicles%3A+Preparations+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Giant vesicles: Preparations and applications.</a> ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).</li>
<li>Pécheur, E. I., Martin, I., Ruysschaert, J. M., Bienvenüe, A., Hoekstra, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+fusion+induced+by+11-mer+anionic+and+cationic+peptides%3A+A+structure%E2%88%92+function+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane fusion induced by 11-mer anionic and cationic peptides: A structure− function study.</a> Biochemistry. 37 (8), 2361-2371 (1998).</li>
<li>Morigaki, K., Walde, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+vesicle+formation+from+oleic+acid%2Fsodium+oleate+on+glass+surfaces+induced+by+adsorbed+hydrocarbon+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Giant vesicle formation from oleic acid/sodium oleate on glass surfaces induced by adsorbed hydrocarbon molecules.</a> Langmuir. 18 (26), 10509-10511 (2002).</li>
<li>Majumder, S., Wubshet, N., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+complex+solutions+using+droplet+microfluidics+towards+the+synthesis+of+artificial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of complex solutions using droplet microfluidics towards the synthesis of artificial cells.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 29 (8), 83001(2019).</li>
<li>Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+droplet+interface+crossing+encapsulation+%28cDICE%29+for+high+throughput+monodisperse+vesicle+design%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design.</a> Soft Matter. 7 (10), 4610-4614 (2011).</li>
<li>Van de Cauter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+cDICE+for+efficient+reconstitution+of+biological+systems+in+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Optimized cDICE for efficient reconstitution of biological systems in giant unilamellar vesicles.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1690-1702 (2021).</li>
<li>Claudet, C., In, M., Massiera, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+to+disperse+lipids+as+aggregates+in+oil+for+bilayers+production%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Physical+Journal+E%22%5BJournal%5D)">Method to disperse lipids as aggregates in oil for bilayers production.</a> The European Physical Journal E. 39 (1), 1-6 (2016).</li>
<li>Bashirzadeh, Y., Wubshet, N. H., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confinement+Geometry+tunes+fascin-actin+bundle+structures+and+consequently+the+shape+of+a+lipid+bilayer+vesicle%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Confinement Geometry tunes fascin-actin bundle structures and consequently the shape of a lipid bilayer vesicle.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 610277(2020).</li>
<li>Bashirzadeh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+crosslinker+competition+and+sorting+drive+emergent+GUV+size-dependent+actin+network+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin crosslinker competition and sorting drive emergent GUV size-dependent actin network architecture.</a> Communications Biology. 4, 1136(2021).</li>
<li>Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulated+actomyosin+patterns+drive+cell-like+membrane+shape+changes%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Litschel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+contractile+actomyosin+rings+in+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of contractile actomyosin rings in vesicles.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-10 (2021).</li>
<li>Vitale, S. A., Katz, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+droplet+dispersions+formed+by+homogeneous+liquid%E2%88%92+liquid+nucleation%3A%26%2334%3BThe+Ouzo+effect.%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Liquid droplet dispersions formed by homogeneous liquid− liquid nucleation:&#34;The Ouzo effect.&#34.</a> Langmuir. 19 (10), 4105-4110 (2003).</li>
<li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+asymmetric+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Engineering asymmetric vesicles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (19), 10718-10721 (2003).</li>
<li>Deshpande, S., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-chip+microfluidic+production+of+cell-sized+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">On-chip microfluidic production of cell-sized liposomes.</a> Nature Protocols. 13 (5), 856-874 (2018).</li>
<li>Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E. C., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Octanol-assisted+liposome+assembly+on+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Octanol-assisted liposome assembly on chip.</a> Nature Communications. 7, 10447(2016).</li>
<li>Wubshet, N. H., Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fascin-induced+actin+protrusions+are+suppressed+by+dendritic+networks+in+GUVs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Fascin-induced actin protrusions are suppressed by dendritic networks in GUVs.</a> Molecular Biology of the Cell. 32 (18), 1634-1640 (2021).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Bununla birlikte, sentetik hücrelerin oluşturulması için GUV'ler üretmenin farklı yöntemleri araştırılmıştır Bununla birlikte, prosedürlerin karmaşıklığı, kapsüllemeye ulaşmak için uzatılmış süre, kapsüllemenin lipit tiplerinin ve kapsülleyicinin moleküler bileşiminin kısıtlanması, kapsüllemeyi kolaylaştırmak için fizyolojik olmayan kimyasallara duyulan ihtiyaç, düşük GUV verimi ve kapsülleme verimliliğindeki tutarsızlıklar bu alandaki araştırmacıları zorlamaya devam etmiştir. Aşağıdan yukarıya sentetik biyolojide başlat...

Lipid çift katmanlı bölmeler, kapalı organik reaksiyonları ve membran bazlı süreçleri incelemek için model sentetik hücreler olarak veya ilaç dağıtım uygulamalarında taşıyıcı modüller olarak kullanılır 1,2. Saflaştırılmış bileşenlere sahip aşağıdan yukarıya biyoloji, proteinler ve lipitler gibi biyomoleküller arasındaki özellikleri ve etkileşimleri araştırmak için minimum deneysel sistemler gerektirir 3,4. Bununla birlikte, alanın ilerlemesiyle birlikte, biyolojik hücrelerdeki koşulları daha iyi taklit eden daha karmaşık deneysel sistemlere olan ihtiyaç artmaktadır. GUV'larda kapsülleme, deforme edilebilir ve seçici olarak geçirgen bir lipit çift katmanı ve sınırlı bir reaksiyon alanı sağlayarak bu hücre benzeri özelliklerin bazılarını sunabilen pratik bir yaklaşımdır. Özellikle, sentetik hücrelerin modelleri olarak sitoiskelet sistemlerinin in vitro resusyonu, membran bölmelerinde kapsüllemeden yararlanabilir5. Birçok sitoiskelet proteini hücre zarına bağlanır ve etkileşime girer. Çoğu sitoiskelet düzeneği, hücrenin tamamını kapsayan yapılar oluşturduğundan, şekilleri doğal olarak hücre büyüklüğünde hapsetme6 ile belirlenir.
Şişlik7,8, küçük vezikül füzyonu9,10, emülsiyon transferi 11,12, darbeli püskürtme 13 ve diğer mikroakışkan yaklaşımlar 14,15 gibi GUV'ları üretmek için farklı yöntemler kullanılır. Bu yöntemler hala kullanılsa da, her birinin sınırlamaları vardır. Bu nedenle, yüksek GUV kapsülleme verimine sahip sağlam ve basit bir yaklaşım oldukça arzu edilir. GUV'ların oluşumu için spontan şişlik ve elektroşişme gibi teknikler yaygın olarak benimsenmesine rağmen, bu yöntemler öncelikle spesifik lipit bileşimleri16, düşük tuz konsantrasyonlu tamponlar 17, daha küçük kapsülleyici moleküler boyut18 ile uyumludur ve yüksek miktarda kapsülleyici gerektirir. Birden fazla küçük vezikülün bir GUV'ye kaynaştırılması doğal olarak enerjisel olarak elverişsizdir, bu nedenle yüklü lipit bileşimleri9 ve / veya peptidler19 veya diğer kimyasallar gibi harici füzyon indükleyici ajanlarda özgüllük gerektirir. Emülsiyon transferi ve mikroakışkan yöntemler ise çift katmanlı oluşumdan sonra yüzey aktif madde ve çözücü giderimi yoluyla damlacık stabilizasyonu gerektirebilir, sırasıyla18,20. Darbeli püskürtme gibi mikroakışkan tekniklerdeki deneysel düzeneğin ve cihazın karmaşıklığı ek bir zorluk getirmektedir21. cDICE, emülsiyon transferi22,23'ü yöneten benzer ilkelerden türetilen emülsiyon bazlı bir yöntemdir. Sulu bir çözelti (dış çözelti) ve bir lipit-yağ karışımı, lipit doymuş bir arayüz oluşturan dönen silindirik bir odada (cDICE odası) santrifüj kuvvetleri ile tabakalandırılır. Lipid tek katmanlı sulu damlacıkların dönen cDICE odasına sokulması, damlacıklar lipit doymuş arayüzü geçerek dış sulu çözelti 22,24'e geçerken bir çift katmanın sıkıştırılmasına neden olur. cDICE yaklaşımı, GUV kapsüllemesi için sağlam bir tekniktir. Sunulan modifiye yöntemle, sadece önemli ölçüde daha kısa bir kapsülleme süresine (birkaç saniye) sahip cDICE için tipik olan yüksek vezikül verimi elde edilmekle kalmaz, aynı zamanda zamana bağlı süreçlerin (örneğin, aktin sitoiskelet ağı oluşumu) gözlemlenmesine izin veren GUV üretim süresi de önemli ölçüde azalır. Protokol başlangıçtan GUV toplama ve görüntülemeye kadar yaklaşık 15-20 dakika sürer. Burada, GUV üretimi, aktin ve aktin bağlayıcı proteinleri (ABP'ler) kapsüllemek için modifiye cDICE yöntemi kullanılarak tanımlanmıştır. Bununla birlikte, sunulan teknik, biyopolimerlerin montajından hücresiz protein ekspresyonuna, membran füzyon bazlı kargo transferine kadar çok çeşitli biyolojik reaksiyonları ve membran etkileşimlerini kapsüllemek için uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>18:1 Liss Rhod Kloroform içinde PE lipid</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>810150C</td><td></td></tr><tr><td>96 Kuyu Optik Btm Çukuru Polimer Tabanı</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan iskelet kasından aktin</td><td>Hücre iskeleti</td><td>AKL99-A</td><td></td></tr><tr><td>ATTO 488-aktin tavşan iskelet kasından</td><td>Hypermol</td><td>8153-01</td><td></td></tr><tr><td>Axygen mikrotüpleri (200 & mikro; L)</td> <td>ABP'leri işlemek için</td> <td>Fisher Scientific</td><td>14-222-262</td></tr><tr><td>Siyah reçine</td><td>Formlabs</td><td>RS-F2-GPBK-04</td><td></td></tr><tr><td>Kolesterol (toz)</td> <td>Avanti Polar Lipids</td><td>700100P</td><td></td></tr><tr><td>Choloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>67-66-3</td><td></td></tr><tr><td>Şeffaf reçine</td><td>Formlabs</td><td>RS-F2-GPCL-04</td><td></td></tr><tr><td>CSU-X1 Konfokal Tarayıcı Ünitesi</td><td>YOKOGAWA</td><td>CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>Yoğunluk gradyan ortamı (Optiprep)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr>Kloroform <td>Avanti Polar Lipids</td><td>içinde DOPC lipid</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>Fascin</td><td>ev yapımı</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>F-tamponu</td><td>ev yapımı</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand mikrotüpler (1.5 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>FS02 Sonikatör</td><td>Fischer Scientific</td><td>FS20</td><td></td></tr><tr><td>G-tamponu</td><td>ev yapımı</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158968</td><td></td></tr><tr><td>iXon X3 kamera</td><td>Andor</td><td>DU-897E-CS0</td><td></td></tr><tr><td>Mineral yağ</td><td>Acros Organics</td><td>8042-47-5</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX81 Ters Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX21</td><td></td></tr><tr><td>Olympus PlanApo N 60x Yağ Mikroskobu Objektif</td><td>Olumpus</td><td>1-U2B933</td><td></td></tr><tr><td>Silikon yağı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>317667</td><td></td></tr></tbody></table>

yeniden yapılandırılmış hücre İskeletinin dev unilameller veziküller İçinde hızlı kapsüllenmesi

Rapid Encapsulation of Reconstituted Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

Dev unilamellar veziküller (GUV'ler) sıklıkla biyolojik membran modelleri olarak kullanılır ve bu nedenle membranla ilişkili hücresel süreçleri in vitro olarak incelemek için harika bir araçtır. Son yıllarda, GUV'lar içindeki kapsüllemenin, hücre biyolojisi ve ilgili alanlarda sulandırma deneyleri için yararlı bir yaklaşım olduğu kanıtlanmıştır. Geleneksel biyokimyasal sulandırmanın aksine, canlı hücrelerin içindeki hapsedilme koşullarını daha iyi taklit eder. GUV'lar içinde kapsülleme yöntemlerinin uygulanması genellikle kolay değildir ve başarı oranları laboratuvardan laboratuvara önemli ölçüde farklılık gösterebilir. Daha karmaşık protein sistemlerini kapsüllemek için başarılı olduğu kanıtlanmış bir teknik, sürekli damlacık arayüzü çapraz kapsüllemesi (cDICE) olarak adlandırılır. Burada, GUV'larda sitoiskelet proteinlerinin yüksek kapsülleme verimliliğine sahip hızlı bir şekilde kapsüllenmesi için cDICE tabanlı bir yöntem sunulmaktadır. Bu yöntemde, ilk olarak, bir lipit / yağ karışımında ilgilenilen bir protein çözeltisinin emülsifiye edilmesiyle lipit-tek katmanlı damlacıklar üretilir. Dönen bir 3D baskılı odaya eklendikten sonra, bu lipit tek katmanlı damlacıklar daha sonra protein sistemini içeren GUV'lar oluşturmak için odanın içindeki bir su / yağ arayüzünde ikinci bir lipit tek katmanından geçer. Bu yöntem, GUV'lar içindeki genel kapsülleme prosedürünü basitleştirir ve süreci hızlandırır ve böylece lipit çift katmanlı veziküller içindeki ağ montajının dinamik evrimini sınırlamamıza ve gözlemlememize olanak tanır. Bu platform, hapsedilmede sitoiskelet-membran etkileşimlerinin mekaniğini incelemek için kullanışlıdır.

Mevcut protokol kullanılarak sitoiskelet GUV'larının başarılı bir şekilde üretildiğini göstermek için, GUV'lardaki fasin-aktin demet yapıları yeniden oluşturulmuştur. Fascin, sert paralel hizalanmış aktin demetleri oluşturan ve E. coli'den Glutatyon-S-Transferaz (GST) füzyon proteini26 olarak saflaştırılan aktin filamentlerinin kısa bir çapraz bağlayıcısıdır. Aktin polimerizasyon tamponunda 0.53 μM ATTO488 aktin ve yoğunluk gradyan ortamının% 7.5'i dahil olmak üzere 5 μM aktin ilk olarak ...

Bu makalede, kapsüllenmiş sitoiskelet proteinleri ile dev unilamellar veziküllerin hızlı üretimi için basit bir yöntem tanıtılmaktadır. Yöntemin, hapsetmede ve sitoiskelet-membran etkileşimlerinde sitoiskelet yapılarının aşağıdan yukarıya doğru resulaştırılmasında yararlı olduğu kanıtlanmıştır.

Yeniden Yapılandırılmış Hücre İskeletinin Dev Unilameller Veziküller İçinde Hızlı Kapsüllenmesi

Giant unilamellar vesicles (GUVs) are frequently used as models of biological membranes and thus are a great tool to study membrane-related cellular ...

Son yıllarda, hücre boyutundaki lipit çift katmanlı veziküller içindeki kapsüllemenin, in vitro sulandırma deneyleri için yararlı bir yöntem olduğu kanıtlanmıştır. Sunduğumuz yöntem, sentetik hücre araştırmalarında sitoiskelet resulansına büyük ölçüde yardımcı olacaktır. Bu yöntemle, yüksek verime sahip heterojen boyutlu dev unilamellar veziküller üretebiliriz.Vezikül oluşturma süresi, geleneksel cDICE tekniğine kıyasla önemli ölçüde azalır. Moleküler yolları incelemek için karmaşık, aynı anda meydana gelen hücresel süreçlerden izole edilmiş hücresiz transkripsiyon-çeviri sistemlerini kapsülleyebiliriz. Bu yöntem, fonksiyonel sentetik hücreler oluşturmak için minimal protohücreleri bir araya getirmek için kullanılabilir.Diyooil-fosfokolin, kolesterol ve rodamin PE'yi 15 mililitrelik bir cam şişeye aktararak bir yağ-lipit karışımı hazırlamaya başlayın. Ardından, şişeye 0,5 mililitre kloroform ekleyin. Pipet, 15 mililitrelik ayrı bir tüpte 7.2 mililitre silikon yağı ve 1.8 mililitre mineral yağ ve yağları 10 saniye boyunca dakikada 3.200 dönüş hızında vorteks yaparak karıştırın.Daha sonra, yağ karışımını lipit ve kloroform karışımını içeren şişeye ekleyin ve lipitler yağda tamamen çözünmediğinden, elde edilen yağdaki lipit karışımı hafif bulutlu olana kadar karışımı dakikada 3.200 dönüş hızında 10 ila 15 saniye boyunca vorteksleyin. Daha sonra, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 80 watt ultrasonik güç ve 40 kilohertz çalışma frekansı ile bir banyo sonicator yağ dağılımında lipit sonicate sonicate. Hemen kullanılmazsa, lipit-yağ karışımını 24 saat boyunca dört santigrat derecede saklayın.Vezikülleri oluşturmak için, montajı dakikada 1.200 dönüş hızında tezgah üstü karıştırma plakasına monte edilmiş siyah reçineden yapılmış 3D baskılı bir şaft ile kullanın. Ardından, siyah reçine mili üzerindeki şeffaf reçineden yapılmış 3D baskılı sürekli damlacık arayüzü çapraz kapsüllemesini veya cDICE odasını monte edin. Küresel aktin tamponunda veya G tamponunda,% 10 ATO 488 aktin dahil olmak üzere 1 ila 10 mikromolar aktin çözeltisi hazırlayın.Aktin polimerizasyonuna başlamak için, buz üzerindeki aktin çözeltisine filamentli aktin polimerizasyon tamponu veya F tamponu ekleyin ve daha sonra bir çapraz bağlayıcı eklemeden önce aktin polimerizasyonunu yavaşlatmak için çözeltileri buz üzerinde tutun. Aktin bağlayıcı proteinleri veya ABP'leri, mililitre büyüleyici stok başına 1.75 miligramdan hazırlamak için, ayrı bir mikrotüpte 1.57 mikrolitre fasin aliquot. Daha sonra, dış ve iç sulu faz arasında bir yoğunluk gradyanı oluşturmak ve dev unilamellar veziküller veya GUV'lar, çökeltmeyi kolaylaştırmak için aktin çözeltisine% 7.5 yoğunluk gradyanı ortamı ekleyin.Daha sonra, odaya dış çözelti olarak 700 mikrolitre 200 milimolar glikoz dağıtın. Haznenin% 60 ila% 80'i dolana kadar odaya yeterli lipit-yağ karışımı ekleyin. Lipit-yağ karışımı ile dış çözelti arasında bir arayüz oluşturulacaktır.ABP'leri aktin çözeltisine aktararak bir aktin-ABP karışımı hazırlayın. Daha sonra, lipit-yağ karışımının 700 mikrolitresini aktin-ABP karışımına aktarmak için düzenli bir 100 ila 1.000 mikrolitrelik pipet kullanın. 7 ila 100 mikron çapında hücre boyutunda lipit tek katmanlı emülsiyon damlacıkları oluşturmak için sekiz kez yukarı ve aşağı pipet.Tüm emülsiyonu dönen odaya dağıtmak için aynı 100 ila 1.000 mikrolitrelik pipeti kullanın. Damlacıklar, lipit tek tabakasını yağ-dış çözelti arayüzünde geçerek ikinci bir lipit broşürü elde edecek ve böylece GUV'lar oluşturacaktır. İşiniz bittiğinde, odayı karıştırma plakasından çıkarın ve odayı atık kabına eğerek lipit-yağ karışımının çoğunu atın.Odayı kapağı içeriye bakacak şekilde tutarak, oda kapağını açın ve odayı hafifçe içe doğru eğin. GUV'ları içeren dış çözelti ile lipit-yağ karışımı arasındaki arayüz, kapağın bulunduğu hazne açıklığından görülebilecektir. GUV'ler içeren yeterli dış çözeltiyi toplamak için bir pipet kullanın ve uygun bir GUV yoğunluğu elde etmek için 50 ila 300 mikrolitre dış çözeltiyi 96 delikli bir plakaya dağıtın.GUV'ları görüntülemek için, 96 delikli plakayı, yağ daldırma 60X objektif lens ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop sahnesine yerleştirin. Bir görüntü işleme yazılımı olan ImageJ Fiji'de ilgilendiğiniz bir görüntü dizisini açın ve görüntüyü en yüksek yoğunlukta tanımlayın. Parlaklık ve kontrast penceresini açmak için Control Shift C tuşunu basılı tutun ve sıfırlama sekmesine tıklayın.ImageJ Fiji menüsünde, her görüntü pikseli için bilinen fiziksel mesafeyi ve birimi girmek üzere Analiz Et ve Ölçeği Ayarla sekmelerine gidin. İşiniz bittiğinde, Z yığınından bir 3B görüntüyü yeniden oluşturmak için Görüntü, Yığınlar ve ardından 3B Proje düğmelerine gidin. Projeksiyon yöntemini Parlaklık Noktası, Dilimleme aralığını 0,5 mikrometre olarak ayarlayın ve ardından İnterpolat kutusunu işaretleyin.Ayarların geri kalanı için varsayılan seçenekleri kullanın ve görüntüleri yakalayın. Temsili görüntü, kapsüllenmiş büyüleyici aktin demetleri ile rodamin PE etiketli GUV'ların konfokal bir görüntüsünü göstermektedir. Aktin bağlayıcı proteinlerin aktin çözeltisine aktarılması, daha sonra lipit-yağ karışımının eklenmesi ve kapsüllemeden önce aktin ağlarının oluşmasını önlemek için birkaç saniye içinde lipit tek katmanlı damlacıkların üretilmesi gerekir.Bu modifiye cDICE tekniğini, aktin ağlarını organize etmede farklı aktin net çapraz bağlayıcıların rollerini incelemek için kullandık. Bu yöntemin diğer araştırmacıların diğer sitoiskelet proteinlerinin düzenlenmesini keşfetmelerine yardımcı olacağını umuyoruz.

rapid-encapsulation-reconstituted-cytoskeleton-inside-giant

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu yazıda veziküller, transkripsiyon ve çeviri makine kapsülleme ve protein üretiminin izlenmesi hazırlanması için basit bir yöntem tarif eder. Elde edilen hücre-içermeyen sistemler gittikçe daha karmaşık hücresel taklit oluşturmak için bir başlangıç ​​noktası olarak kullanılabilir.

Hücresel Mimics İnşası için Veziküller Hücre-ücretsiz Transkripsiyon ve Çeviri Makine Sarma

electroformation ve jel destekli şişme - dev tek tabakalı veziküller (GUVs) içine transmembran protein, KvAP, şifreden iki dehidrasyon-rehidrasyon yöntemleri için gösterilmiştir. Her iki yöntemde de, protein içeren küçük tek lamelli kesecikler, sonra, flüoresans mikroskopisi ve yama klempi elektrofizyoloji ile incelenebilir GUVs oluşturmak üzere bir araya birleştirilir.

Bir transmembran proteinin yeniden oluşturulması, Mikroskop ve yama kelepçe Çalışmaları Dev tek-katmanlı keseler içine Voltaj kapılı iyon kanalı, KvAP,

Yüksek oranda paketlenmiş mikrometre boyutunda bileşenler içeren dev kesecikler kullanışlı hücre modelleridir. Yağda su emülsiyonu santrifüjleme yöntemi, kapsüllenmiş malzemelerle dev veziküllerin hazırlanması için basit ve güçlü bir araçtır.

bir su-içinde-yağ emülsiyonu santrifüj Dev veziküller Kapsüllenen Mikrokürelerin hazırlanması

Biz dev veziküller (GVs) içinde bakteri tek hücreli kültürü göstermektedir. Bakteriyel hücreler içeren GVs damlacık transfer yöntemi ile hazırlanmıştır ve bakteriyel büyüme doğrudan gözlem için bir cam substrat üzerinde desteklenen bir membran immobilize edildi. Bu yaklaşım, diğer hücrelere de uyarlanabilir.

Dev veziküller Içinde tek hücreli seviyede bakteriyel hücre kültürü

Organik ve sulu çözücülerin arayüzünde, özel ampifilik elastin benzeri proteinler veziküller, lifler ve çevresel parametrelertarafından tetiklenen koaksivatlar gibi karmaşık supramoleküler yapılarda bir araya getirilir. Açıklanan montaj protokolleri, çeşitli kargoların kapsüllemesini sağlayan, tunable özelliklere sahip Protein Membran Tabanlı Bölmeler (PMBCs) verir.

Elastin benzeri Proteinlerin tanımlanmış Supramoleküler Yapılara Yönlendirilmiş Montajı ve Tüp Bebek Tespülasyonu

Bu yazıda, F-aktin sitoiskeletini dev unilamellar lipid veziküllerine (lipozomlar olarak da adlandırılır) kapsüllemek için deneysel teknikleri ve lipozom zarının iç broşüründe korteks-biyomimik yapan bir F-aktin tabakası oluşturma yöntemini göstereceğiz.

İn Vitro Aktin Hücre İskeletinin Dev Unilameller Veziküller İçinde Yeniden Sulandırılması

Bu protokol, bir model membran proteininin lipid çift tabakasına sentezinin ve dahil edilmesinin araştırılması için dev bir unilamellar vezikül (GUV) içinde bir hücresiz ekspresyon (CFE) sistemini kapsüllemek için kullanılan ters emülsiyon yöntemini tanımlar.

Bakteriyel Glutamat Reseptör Kanalının, Hücresiz Bir Ekspresyon Sisteminin Kapsüllenmesi ile Sulandırılması

Membran proteinlerinin yeniden yapılandırılması ve enzimlerin ve diğer suda çözünür bileşenlerin mikrometre altı ve mikrometre boyutundaki lipid veziküllerinde kapsüllenmesi için bir protokol sunuyoruz.

Nano ve Mikrometre Boyutlu Veziküllerde Denge Dışı Metabolik Ağların İnşası

Bu makale, iç, halka ve dış bölgelerde özelleştirilmiş elektriksel iletkenliğe sahip, vezikül içinde vezikül yapısına sahip bileşik Dev Unilamellar Veziküllerin (cGUV'ler) hazırlanması için bir yöntem sunar. Elektroformasyon, ozmotik şok yoluyla stomatositlere ve cGUV'lara dönüştürülen basit GUV'leri sentezler ve çekirdekli hücrelerin biyofiziğini incelemek için değerli bir model sağlar.

Bileşik Dev Unilamellar Veziküllerin Sentezi: Çekirdek Hücrelerin Biyomimetik Bir Modeli

Bu makale, fazla ayrılmış dev veziküller içindeki hücre iskeleti ağlarının basit bir tek kap sulandırmasını tanıtmaktadır. Yöntem genelleştirilebilir ve çok çeşitli biyomoleküllerin kapsüllenmesi veya hapsedilmesi için uygulanabilir.

Laboratuvar ortamında Fazla Ayrılmış Dev Unilamellar Veziküller (GUV'ler) İçindeki Hücre İskeleti Ağlarının Sulandırılması

Öğrenin, dev unilameller veziküller içinde hücre iskeleti proteinlerinin hızlı kapsüllenmesi yöntemini. Bu teknik, sentetik hücre araştırmalarında sitoskeleton yeniden yapılandırmasını kolaylaştırır ve yüksek verim sağlar.

Yeniden Yapılandırılmış Hücre İskeletinin Dev Unilameller Veziküller İçinde Hızlı Kapsüllenmesi

Daha fazla video keşfet