Name: FAHD1 Proteininin Domuz Böbreği ve Fare Karaciğerinden Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-18T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Öğrenin FAHD1 proteininin domuz böbreği ve fare karaciğerinden fizyolojik formda ekstraksiyon ve saflaştırma yöntemini. Bu teknik, protein katlanması ve katalitik aktivitenin korunmasını sağlayarak yüksek kaliteli antikor geliştirme çalışmalarına katkıda bulunur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Ayşe Öztürk ve Eva Albertini'nin teknik yardımları için çok müteşekkirdir. Karaciğer dokusunun oluşumu için kullanılan fareler, Univ.-Doz gözetiminde tutuldu. Dr. Pidder Jansen-Dürr (Innsbruck Üniversitesi Biyomedikal Yaşlanma Araştırmaları Enstitüsü, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Avusturya).

<ol><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+FAH+domain-containing+protein+1+%28FAHD1%29+as+oxaloacetate+decarboxylase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (11), 6755-6762 (2015).</li>
<li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+Protein+1+%28FAHD1%29+as+a+novel+mitochondrial+acylpyruvase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36500-36508 (2011).</li>
<li>Kang, T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence+surveillance+of+pre-malignant+hepatocytes+limits+liver+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Senescence surveillance of pre-malignant hepatocytes limits liver cancer development.</a> Nature. 479 (7374), 547-551 (2011).</li>
<li>Hong, H., Seo, H., Park, W., Kim, K. K. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence%2C+structure+and+function-based+classification+of+the+broadly+conserved+FAH+superfamily+reveals+two+distinct+fumarylpyruvate+hydrolase+subfamilies%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Sequence, structure and function-based classification of the broadly conserved FAH superfamily reveals two distinct fumarylpyruvate hydrolase subfamilies.</a> Environmental Microbiology. 22 (1), 270-285 (2020).</li>
<li>Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+and+mechanism+of+a+carbon-carbon+bond+hydrolase%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase.</a> Structure. 7 (9), London, England. 1023-1033 (1999).</li>
<li>Bateman, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+inferences+from+the+crystal+structure+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+with+a+bound+phosphorus-based+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanistic inferences from the crystal structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a bound phosphorus-based inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (18), 15284-15291 (2001).</li>
<li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+bi-functionality+of+human+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1.</a> Biochemical Journal. 475 (22), 3561-3576 (2018).</li>
<li>Etemad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+-+a+new+regulator+of+mitochondrial+function+and+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 - a new regulator of mitochondrial function and senescence.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).</li>
<li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cellular+senescence+by+eukaryotic+members+of+the+FAH+superfamily+-+A+role+in+calcium+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of cellular senescence by eukaryotic members of the FAH superfamily - A role in calcium homeostasis.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 190, 111284(2020).</li>
<li>Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-Dürr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+inhibits+mitochondrial+electron+transport+and+induces+cellular+senescence+in+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells.</a> Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).</li>
<li>Wiley, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+induces+senescence+with+a+distinct+secretory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction induces senescence with a distinct secretory phenotype.</a> Cell Metabolism. 23 (2), 303-314 (2016).</li>
<li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+purification%2C+crystallization%2C+and+enzyme+assays+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Expression, purification, crystallization, and enzyme assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59729(2019).</li>
<li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain+Containing+Protein+1+%28FAHD1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molcules%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain Containing Protein 1 (FAHD1).</a> Molcules. 26 (16), 5009(2021).</li>
<li>Mizutani, H., Kunishima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification%2C+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+the+fumarylacetoacetase+family+member+TTHA0809+from+Thermus+thermophilus+HB8%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F+Structural+Biology+and+Crystallization+Communications%22%5BJournal%5D)">Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (9), 792-794 (2007).</li>
<li>Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+outline+of+methods+for+protein+isolation+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">A simple outline of methods for protein isolation and purification.</a> Endocrinology and Metabolism. 32 (1), Seoul, Korea. 18-22 (2017).</li>
<li>Amer, H. E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+proteins%3A+Between+meaning+and+different+methods%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Technologies+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Purification of proteins: Between meaning and different methods).</a> Proteomics Technologies and Applications. , (2019).</li>
<li>Niu, L., Yuan, H., Gong, F., Wu, X., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+extraction+methods+shape+much+of+the+extracted+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Protein extraction methods shape much of the extracted proteomes.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 802(2018).</li>
<li>Gordon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+vanadate+as+protein-phosphotyrosine+phosphatase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor.</a> Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).</li>
<li>Gallagher, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28SDS-PAGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Essential+Laboratory+Techniques%22%5BJournal%5D)">SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).</a> Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. , (2012).</li>
<li>Ahmed, U., Saunders, G. Effect of pH on Protein Size Exclusion Chromatography. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf</a> (2011).</li>
<li>Sørensen, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+staining+of+proteins+on+electroblotting+membranes+and+intensification+of+silver+staining+of+proteins+separated+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Silver staining of proteins on electroblotting membranes and intensification of silver staining of proteins separated by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Analytical Biochemistry. 304 (1), 33-41 (2002).</li>
<li>Fagerberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+human+tissue-specific+expression+by+genome-wide+integration+of+transcriptomics+and+antibody-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).</li>
<li>Cytiva Life Fundamentals of size exclusion chromatography. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography">https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography</a> (2022).</li>
<li>Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli%3A+advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 172(2014).</li>
<li>Rosano, G. L., Morales, E. S., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+recombinant+protein+production+in+Escherichia+coli%3A+A+5-year+update%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%3A+A+Publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">New tools for recombinant protein production in Escherichia coli: A 5-year update.</a> Protein Science: A Publication of the Protein Society. 28 (8), 1412-1422 (2019).</li>
</ol>

Yazarların rekabet eden finansal çıkarları yoktur.

Protokoldeki kritik adımlar Proteinlerin işlenmesi için ortak yönergeleri izlemek, buz üzerinde ve ılımlı pH ve tuz koşullarında çalışmak gibi esastır. Proteaz inhibitörlerinin kullanımı yöntem için faydalıdır, proteazom inhibitörlerinin kullanımı şiddetle tavsiye edilir. Numunenin dondurulması ve çözülmesi her zaman protein çökelmesine (en azından kısmen) neden olabilir, bu nedenle ilk protein lizatının çözülmüş herhangi bir alikotu (adım 2) ara vermeden sürekli olarak işlenmelidir. Mikroçökeltiyi gi...

Ökaryotik FAH etki alanı içeren protein 1 (FAHD1), iki fonksiyonlu oksaloasetat (OAA) dekarboksilaz (ODx)1 ve asilpiruvat hidrolaz (ApH)2 olarak işlev görür. Mitokondri2'de lokalizedir ve 1,2,3,4,5,6 enzimlerinin geniş FAH süper ailesine aittir. ApH aktivitesi sadece küçük bir öneme sahip olsa da, FAHD1'in ODx aktivitesi, TCA döngü akısı1,7,8,9'un düzenlenmesinde rol oynar. OAA sadece trikarboksilik asit döngüsündeki merkezi sitrat sentaz reaksiyonu için gerekli değildir, aynı zamanda elektron taşıma sisteminin bir parçası olarak ve bir kataplerotik metabolit olarak süksinat dehidrogenazın rekabetçi bir inhibitörü olarak da işlev görür. İnsan göbek damarı endotel hücrelerinde (HUVEC) FAHD1 gen ekspresyonunun aşağı regülasyonu, hücre proliferasyon hızında10 önemli bir azalmaya ve glikolize eşzamanlı bir geçişle ilişkili mitokondriyal membran potansiyelinin önemli ölçüde inhibisyona neden olmuştur. Çalışma modeli, mitokondriyal OAA seviyelerinin FAHD1 aktivitesi 1,8,9 tarafından sıkı bir şekilde düzenlendiği mitokondriyal disfonksiyon ile ilişkili yaşlanma (MiDAS)11 benzeri fenotip 8'i ifade eder.
Rekombinant proteinin dokudan ziyade bakteri12'den ekspresyon ve saflaştırma yoluyla elde edilmesi daha kolaydır. Bununla birlikte, bakterilerde eksprese edilen bir protein, post-translasyonel modifikasyonların olası eksikliği nedeniyle önyargılı olabilir veya basitçe sorunlu olabilir (yani, plazmid kaybı, bakteriyel stres tepkileri, çarpık / şekilsiz disülfit bağları, hiç veya zayıf sekresyon, protein agregasyonu, proteolitik bölünme, vb. Nedeniyle). Bazı uygulamalar için, bu tür modifikasyonları dahil etmek ve / veya olası eserleri dışlamak için hücre lizatından veya dokudan protein elde edilmesi gerekir. Dokudan saflaştırılmış protein, FAHD113 gibi seçilmiş enzimler için yüksek kaliteli antikorların ve / veya güçlü ve spesifik farmakolojik inhibitörlerin gelişimini destekler.
Bu el yazması, FAHD1'in domuz böbreği ve fare karaciğerinden ekstraksiyonu ve saflaştırılması için bir dizi yöntem sunmaktadır. Tarif edilen yöntemler hızlı protein sıvı kromatografisi (FPLC) gerektirir, ancak aksi takdirde ortak laboratuvar ekipmanı kullanır. Alternatif yöntemler başka yerlerde bulunabilir14,15,16,17. Toplam protein ekstraksiyonundan sonra, önerilen protokol, amonyum sülfat çökeltmesi ve iyonik değişim kromatografisi için alt protokollerin tartışıldığı bir test aşamasını içerir (Şekil 1). Bu alt protokolleri tanımladıktan sonra, ilgilenilen protein, FPLC ile iyonik değişim ve boyut dışlama kromatografisi kullanılarak sıralı bir strateji ile çıkarılır. Bu kılavuzlara dayanarak, nihai protokol diğer ilgili proteinler için ayrı ayrı uyarlanabilir.
<img alt="Doku işleme iş akışı: santrifüjleme, çökeltme, kromatografi; Western Blot analizi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63333/63333fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Şekil 1: Bu protokolün genel stratejisi. Yukarıdan aşağıya: Protein dokulardan çıkarılır. Doku homojenatı hazırlanır, santrifüj edilir ve filtrelenir. Her bir süpernatant ve pelet türevi numune çifti için, optimum koşullar için prob yapmak üzere amonyum sülfat çökeltme ve iyonik değişim kromatografisi (FPLC) testleri yapılmalıdır. Bu alt protokolleri oluşturduktan sonra, protein, değişen pH ve tuz konsantrasyonlarında sıralı bir amonyum sülfat çökeltme, iyonik değişim kromatografisi ve tekrarlayan boyut dışlama kromatografisi (FPLC) prosedürü ile ekstrakte edilebilir. Tüm adımların batı lekesi tarafından kontrol edilmesi gerekir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63333/63333fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table><tbody><tr><td>0.22 ve mikro; m filtre üniteleri</td><td>MERCK</td><td>SLGP033RS</td><td>Millex-HP, 0.22 & mikro; m, PES 33 mm, steril değil</td></tr><tr><td>0.45 ve mikro; m filtre üniteleri</td><td>MERCK</td><td>SLHP033NS</td><td>Millex-HP, 0.45 & mikro; m, PES 33 mm, steril değil</td></tr><tr><td>15 mL Falcon tüpleri</td><td>VWR</td><td>734-0451</td><td>santrifüj tüpler</td></tr><tr><td>50 mL Falcon tüpleri</td><td>VWR</td><td>734-0448</td><td>santrifüj tüpler</td></tr><tr><td>96 Kuyulu UV</td><td>Mikroplaka Thermo-Fischer</td><td>8404</td><td>UV/VIS şeffaf düz tabanlı 96 kuyulu plakalar</td></tr><tr><td>Akrilamid/Bis Çözeltisi (%40, 29:1 oran)</td><td>BIO-RAD</td><td>#1610147</td><td>%40 akrilamid/bis-akrilamid, poliakrilamid jellerin ve Auml'nin dökümü için 29:1 (%3,3 çapraz bağlayıcı) çözelti</td></tr><tr><td>; KTA FPLC sistemi</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri / Cytiva-GE</td><td></td> <td>Healthcare'in FPLC sistemini kullanarak; farklı özel sürümler mevcuttur; Bu çalışmada "&auml; KTA saf "sistem" Amicon</td></tr><tr><td>Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa</td><td>MERCK</td><td>UFC901024</td><td>protein zenginleştirme için santrifüj filtreler; 10 kDa moleküler kütle filtresi; 15 mL</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa</td><td>MERCK</td><td>UFC801024</td><td>protein zenginleştirme için santrifüj filtreler; 10 kDa moleküler kütle filtresi; 4 mL</td></tr><tr><td>Amonyum sülfat tozu</td><td>MERCK</td><td>A4418</td><td>moleküler biyoloji için amonyum sülfat, &GE; % 99.0</td></tr> <tr><td>Amonyumpersülfat reaktif sınıfı,% 98</td> <td>MERCK</td><td>215589</td><td>Akrilamid jel polimerizasyonu için katalizör.</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant blue R 250</td><td>MERCK</td><td>1125530025</td><td>Coomassie Brilliant blue R 250 (C.I. 42660) elektroforez için Imperial Chemical Industries PLC'nin ticari markası. CAS 6104-59-2, pH 6.2 (10 g/l, H2O, 25 derece C)</td></tr> <tr><td>Diyaliz tüpü selüloz membran</td><td>MERCK</td><td>D9277</td><td>Diyaliz yoluyla tampon değişimi için selüloz membranlar.</td></tr><tr><td>Eppendof tüpleri 1.5 mL</td><td>VWR</td><td>525-1042</td><td>mikrosantrifüj tüpler; otoklavlanmış</td></tr><tr><td>HiLoad 26/600 Superdex 75 sayfa</td><td>GE Sağlık Yaşam Bilimleri / Cytiva</td><td>28989334</td><td>HiLoad Superdex 75 pg önceden paketlenmiş kolonlar, rekombinant proteinlerin yüksek çözünürlüklü boyut dışlama kromatografisi içindir</td></tr><tr><td>İmmün-Blot PVDF Membran</td><td>BIO-RAD</td><td>#1620177</td><td>PVDF membranları, floresan ve multipleks floresan uygulamaları için optimize edilmiş protein lekeleme membranlarıdır.</td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Elektroforetik Transfer Hücresi</td><td>BIO-RAD</td><td>#1703930</td><td>Mini-PROTEAN prekast ve el döküm jellerin hızlı bir şekilde lekelenmesi için Mini Trans-Blot Hücresini kullanın.</td></tr><tr><td>Mini Prekast Jeller için Mini-PROTEAN Tetra Dikey Elektroforez Hücresi</td><td>BIO-RAD</td><td>#1658004</td><td>4 jelli dikey elektroforez sistemi, elektrot düzeneği, yardımcı çalıştırma modülü, tank, güç kablolu kapak, mini hücre tampon barajı içerir.</td></tr><tr><td>Mono Q 10/100 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td><td>17516701</td><td>Mono Q kolonları, protein analizi veya proteinlerin küçük ölçekli, yüksek çözünürlüklü parlatılması için güçlü anyon değişim kromatografisi kolonlarıdır.</td></tr><tr><td>Mono S 10/100 GL</td><td>GE Sağlık Yaşam Bilimleri / Cytiva</td><td>17516901</td><td>Mono S kolonları, protein analizi veya proteinlerin küçük ölçekli yüksek çözünürlüklü parlatılması için güçlü katyon değişim kromatografi kolonlarıdır.</td></tr><tr><td>PageRuler Prestained Protein Merdiveni, 10 ila 180 kDa</td><td>Thermo-Fischer</td><td>26616</td><td>Protein elektroforezinde (SDS-PAGE) boyut standartları olarak kullanılmak üzere 10 mavi, turuncu ve yeşil lekeli proteinin (10 ila 180 kDa) bir karışımı.</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Test Kiti</td><td>Thermo-Fischer</td><td>23225</td><td>Protein konsantrasyonunun belirlenmesi için iki bileşenli, yüksek hassasiyetli, deterjanla uyumlu bir protein testi.</td></tr><tr><td>Sonifier 250; Dönüştürücü ile Ultrasonik Hücre Bozucu</td><td>Branson-https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf</td><td></td> Domuz Anti-Tavşan İmmünoglobulinleri / <td>HRP'de yeni modeller</td></tr><tr><td>(afinite izole)</td><td>Agilent Dako</td><td>P0399</td><td>Yaban turpu peroksidaz konjugasyonu için kullanılan antikor, tüm sınıflardaki tavşan immünoglobulinleri ile reaksiyona girer.</td></tr><tr><td>TEMED, 1,2-Bis (dimetilamino) etan, TMEDA</td><td>MERCK</td><td>T9281</td><td>TEMED (N, N, N & prime ;, N & prime; -Tetrametiletilendiamin), poliakrilamid jellerin hızlı polimerizasyonuna izin veren moleküldür.</td></tr><tr><td>Tüp Silindiri</td> <td>-</td><td></td> <td>Genel bir boru döndürücü silindir; örneğin, https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71 Tüp Döndürücüde yeni bir model</td></tr> <tr><td></td><td>-</td><td></td> <td>Genel bir tüp döndürücü tekerlek; örneğin, https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123 ULTRA-TURRAX'ta yeni bir model</td></tr><tr><td>; T 25 digital</td><td>IKA</td><td>0003725000</td><td>Yeni modeller https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/'da</td></tr></tbody></table>

fahd1 proteininin domuz böbreği ve fare karaciğerinden ekstraksiyonu ve saflaştırılması

Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver

Fumarilasetotat hidrolaz alan içeren protein 1 (FAHD1), ökaryotlarda FAH süper ailesinin ilk tanımlanmış üyesidir ve mitokondride oksaloasetat dekarboksilaz olarak işlev görür. Bu makalede, FAHD1'in domuz böbreği ve fare karaciğerinden ekstraksiyonu ve saflaştırılması için bir dizi yöntem sunulmaktadır. Kapsanan yöntemler hızlı protein sıvı kromatografisi (FPLC) ile iyonik değişim kromatografisi, FPLC ile preparatif ve analitik jel filtrasyonu ve proteomik yaklaşımlardır. Toplam protein ekstraksiyonundan sonra, amonyum sülfat çökeltmesi ve iyonik değişim kromatografisi araştırıldı ve FAHD1, iyonik değişim ve boyut dışlama kromatografisi kullanılarak sıralı bir strateji ile ekstrakte edildi. Bu temsili yaklaşım, ilgilenilen diğer proteinlere (önemli seviyelerde ifade edilir) uyarlanabilir ve diğer dokular için modifiye edilebilir. Dokudan saflaştırılmış protein, yüksek kaliteli antikorların ve / veya güçlü ve spesifik farmakolojik inhibitörlerin gelişimini destekleyebilir.

FAHD1 proteini, sunulan protokol kullanılarak domuz böbreği ve fare karaciğerinden ekstrakte edildi. Fare dokusu için, son saflaştırma adımından sonra birkaç μg elde etmek için birden fazla organ gereklidir. Bu nedenle, bu makale FAHD1'in domuz böbreklerinden ekstraksiyonuna odaklanmaktadır, bu da çok daha örnek bir deneydir. FAHD1'in fare karaciğerinden çıkarılması, bu protokolün zorluklarını ve olası tuzaklarını sunmak için gerçekleştirilir. Genellikle arındırmak istediği proteinin yüksek ekspresyon seviyesini gösteren...

Bu protokol, domuz böbreği ve fare karaciğerinden fumarilasetotat hidrolaz alan içeren protein 1'in (FAHD1) nasıl çıkarılacağını açıklar. Listelenen yöntemler ilgilenilen diğer proteinlere uyarlanabilir ve diğer dokular için modifiye edilebilir.

FAHD1 Proteininin Domuz Böbreği ve Fare Karaciğerinden Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması

Fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing protein 1 (FAHD1) is the first identified member of the FAH superfamily in eukaryotes, acting as ...

Rekombinant proteinin bakterilerden saflaştırılması köklü bir yöntemdir. Ancak, bu teknikleri kullanırken çeşitli sorunlar ortaya çıkabilir. Dokudan protein çıkarmak için yöntemlere sahip olmak kesinlikle çekicidir.Bu yöntemin temel avantajı, katlanma ve katalitik aktivitesini etkileyebilecek tüm karşılıklı etkiler de dahil olmak üzere proteini fizyolojik formunda çıkarabilmesidir. Bu yaklaşım, ilgilenilen diğer proteinlere uyarlanabilir ve diğer dokular için modifiye edilebilir. Dokudan saflaştırılmış protein, yüksek kaliteli antikorların ve farmakolojik inhibitörlerin gelişimini destekleyebilir.Başlamak için, 250 mililitre PBS'yi 50 milimolar sodyum florür, bir milimolar fenilmetilsülfonil florür, mililitre aprotinin başına iki mikrogram ve bir milimolar aktif ortovanadat ile karıştırarak protein lizis tamponu hazırlayın. 0.22 mikrometrelik bir şırınga filtre ünitesi kullanarak çözeltiyi filtreleyin. Gram doku başına iki mililitre lizis tamponu içeren tüpler hazırlayın ve buz üzerine yerleştirin.Doku örneğini hazırlamak için, her biri yaklaşık 100 miligramlık dokuyu, bir polistiren köpük kutuda buz üzerine yerleştirilmiş önceden temizlenmiş bir cam plaka üzerinde disseke edin. Doku parçalarını sonraki lizis için hazırlanan tüplere aktarın. Doymuş bir amonyum sülfat çözeltisi hazırlamak için, 500 mililitre çift damıtılmış suyu 70 santigrat dereceye ısıtın.Karıştırırken, daha fazla amonyum sülfat çözülmeyene kadar yavaş yavaş amonyum sülfat tozu ekleyin. Bu doymuş çözeltiyi oda sıcaklığına soğutun ve gece boyunca dört santigrat derecede saklayın. Domuz böbrek dokularını homojenize etmek için, numuneyi buz üzerinde tutarken süspansiyonu tercihen ultrasonik bir prob ile sonikleştirin.Fare karaciğer dokuları söz konusu olduğunda, bir elektrikli homojenizatör kullanın ve numuneleri buz üzerinde tutarken tıkanmayı önlemek için PBS'de düzenli olarak yıkayın. Numunelerden 20 mikrolitre alın ve homojenize edilmiş dokunun hücrelerinin uygun şekilde tahrip edilip edilmediğini mikroskop altında kontrol edin. Aksi takdirde, homojenizasyonu tekrarlayın.Tüpleri dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 10.000 kez G'de santrifüj yapın. Süpernatantı taze bir tüpte toplayın ve buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra süpernatantı 0.45 mikrometre ve 0.22 mikrometre şırınga filtre üniteleri kullanarak filtreleyin.Süpernatantı 10 mililitrelik partilere ayırın ve kısa süreli depolama için eksi 20 santigrat derecede veya daha uzun süre depolama için eksi 80 santigrat derecede dondurun. SDS-PAGE veya Western leke analizi için 40 mikrolitre süpernatantın 40 mikrolitresine SDS numune tamponunun beş katı 10 mikrolitre ekleyerek ve ardından 10 dakika boyunca 95 santigrat derecede kaynatarak 50 mikrolitrelik bir numune hazırlayın. Üreticinin talimatlarına göre% 12.5'lik süreksiz bir poliakrilamid SDS-PAGE jeli hazırlayın.SDS-PAGE analizi yapmak için, jelin kuyucuklarını daha sonra bir protein işaretleyici merdiveni, pozitif kontrol olarak beş nanogram insan FAHD1 rekombinant proteini, analiz edilecek numunenin 20 mikrolitresi ve kalan kuyucukları 20 mikrolitre hazırlanmış SDS-PAGE numune tamponu ile yükleyin. SDS çalışma arabelleğini kullanarak SDS-PAGE jellerini 125 voltta çalıştırın. SDS-PAGE tamamlandıktan sonra, bir Western leke analizi yapın, FAHD1'e karşı yükseltilmiş mevcut antikoru kullanarak membranları araştırın.Daha önce tarif edildiği gibi süpernatant alikotları hazırladıktan sonra, ya çözüldükten sonra ya da numuneyi dondurmadan doğrudan protein ekstraksiyonundan sonra işlem. Çözüldükten sonra olası çökelmeleri dışlamak için numuneyi 0,22 mikrometrelik bir filtre ünitesi kullanarak filtreleyin. Buz üzerinde altı adet 1,5 mililitrelik tüp hazırlayın, ardından her tüpe 250 mikrolitre numune aktarın.Hazırlanan tüplerde bir seyreltme serisi amonyum sülfat hazırlayın ve protein lizis tamponu ile son hacmi 1.000 mikrolitreye kadar yapın. Numuneleri bir tüp rotatör üzerinde gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Bir masa üstü santrifüj kullanarak, dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 10.000 kez G'de santrifüj yapın ve tüm süpernatantları dikkatlice ayrı tüplere aktarın.Elde edilen peletleri hava ile kurutun ve her birini 1.000 mikrolitre çift damıtılmış suda yeniden askıya alın. Önceki adımdaki her bir yeniden askıya alınmış pelet ve süpernatant çifti için, 40 mikrolitreyi SDS numune tamponunun beş katı 10 mikrolitre ile karıştırın ve sıvının çoğu buharlaşana kadar açık kapaklarla 95 santigrat derecede kaynatın. Daha sonra peleti, çift damıtılmış sudamıtılmış suda% 50 dimetil sülfoksit karışımında yeniden askıya alın.SDS-PAGE'i, yeniden askıya alınmış peletlerden ve süpernatanttan elde edilen numuneleri çiftler halinde yükleyerek ve ardından bir Western leke analizi yaparak gerçekleştirin. Bununla birlikte, jelleri üç saat boyunca 80 voltta çalıştırın. FPLC sistemini anyonik veya katyonik değişim sütunu ile kurun.Kolonu beş sütun haciminde% 20 etanol ile çift damıtılmış sudamıtılmış suda, ardından beş sütun hacminde çift damıtılmış su ile yıkayın. Numuneyi enjeksiyonla veya bir numune pompası kullanarak kolona uygulayın ve akışı toplayın. Kolonu düşük tuz tamponunun bir sütun hacmi ile yıkayın.Üç sütun hacmi içinde %100 düşük tuz tamponundan %100 yüksek tuz tamponuna doğrusal bir gradyan elüsyonu ayarlayın. Sürekli olarak bir mililitre fraksiyon toplayın. Gradyan bittikten sonra, kromatogramda bir sütun hacmi aralığında proteinle ilişkili pikler tespit edilmeyene kadar yüksek bir tuz tamponu ile çalışmaya devam edin.Kolonu temizlemek için 0.5 molar sodyum hidroksit ve çift damıtılmış su içinde çözünmüş bir mililitre% 25 SDS uygulayın. Kolonu art arda üç kolon hacminde çift damıtılmış su ve üç kolon haciminde% 20 etanol ile çift damıtılmış suda yıkayın. Tüm tepe fraksiyonlarının ve akış akışının SDS-PAGE örneklerini toplayın.Toplanan fraksiyonları sıvı azotta çırpın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Onları Western blot yoluyla araştırdıktan sonra, ilgilenilen proteinleri içeren fraksiyonları çözün ve bir araya getirin ve diğerlerini atın. Saflaştırma adımını gerçekleştirmek için, ultra santrifüjleme filtre üniteleri kullanarak protein çözeltisinin hacmini iki mililitreye düşürün.Herhangi bir mikro çökeltiyi gidermek için çözeltiyi 0,45 mikrometre ve 0,22 mikrometre şırınga filtre üniteleri ile sırayla filtreleyin. Boyut dışlama kromatografisi sütununu, bir milimolar ditiyotreitol içeren bir sütun hacminde çalışan tamponla dengeleyin. Numuneyi kolona yükleyin ve tüm proteinler daha önce tarif edildiği gibi salınana kadar kromatografi ünitesini çalıştırın.Daha önce açıklanan SDS-PAGE ve Western blot analizi için 50 mikrolitrelik numuneler hazırlayın. Kolonu art arda çift damıtılmış su hacminde ve bir sütun hacminde% 20 etanol ile çift damıtılmış suda yıkayın. Western blot analizini yaptıktan sonra, fraksiyonları içeren tüm FAHD1'leri bir araya getirin.Ultra santrifüjleme filtre üniteleri kullanarak protein çözeltisinin hacmini iki mililitreye düşürün. Batı leke taraması, süpernatantta domuz FAHD1'in varlığını 25 kilodaltonda bir bantla gösterirken, etiketli pozitif kontrol 34 kilodaltonda çalışır. Lisattan elde edilen domuz FAHD1, anyonik değişim kromatografisi ile saflaştırıldı ve bağlayıcı proteinler elüsyon ile uzaklaştırıldı.Domuz FAHD1 içeren fraksiyonlar Batı leke analizi ile tanımlanmış, havuzlanmış ve konsantre edilmiştir. Protein örnekleri SEC tarafından saflaştırıldı ve Western blot analizi ile tanımlandı. Domuz FAHD1 proteininin verimi,% 80 saflık seviyesine sahip yaklaşık bir miligram idi.Batı leke analizi, diğer proteinlerle birlikte akışta fare FAHD1 proteinini tespit etti. Akış, boyut dışlama kromatografisi için uygulandı. FAHD1 içeren fraksiyonlar bir araya getirildi, konsantre edildi ve SDS-PAGE analizine uygulandı.Bununla birlikte, protein verimi çok yüksek değildi. Domuz FAHD1'in spesifik enzimatik aktivitesi, toplam protein başına göreceli FAHD1 miktarını arttırdıktan sonra saflık seviyesi ile artar. Daha yüksek amonyum sülfat konsantrasyonları, daha düşük voltajda çözülebilen gülümseme etkisine neden olur.Lizat ve süpernatantta% 15 konsantrasyonda daha fazla protein bulundu. Bununla birlikte, daha yüksek konsantrasyonlarda, numuneler çökelebilir ve tespit edilemez. Burada sunulan protokol, proteinin çözülebilir olmasını gerektirir.Yağış ve pH için en uygun koşullar veya kromatografi için boyut ayarı test edilmeli ve tanımlanmalıdır. Enzimatik fonksiyonun incelenmesi, protein yapısının araştırılması ve antikorun gelişimi, proteinin bakterilerden ekstrakte edilmek yerine dokudan ekstrakte edilmesiyle büyük ölçüde desteklenir.

extraction-purification-fahd1-protein-from-swine-kidney-mouse

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu iletişim kuralının amacı yüksek canlılık ve yüksek verim tetkikine ve sinüsoidal endotel hücreleri karaciğer elde etmektir. Bu bir tür IV collagenase eriyik yolu ile portal ven, hepatositlerin ve sinüsoidal endotel hücreleri elde etmek için farklı aralıklarla tarafından takip ile karaciğer Ventriküler tarafından gerçekleştirilir.

Arıtma tetkikine ve fare karaciğer sinüsoidal endotel hücrelerinden perfüzyon

İyon kanalları arıtma kez, zorlu ama bir kez elde, potansiyel olarak vitro araştırmalar fonksiyonları ve yapıları kanallarının izin verebilirsiniz. Burada, biz ifade ve arıtma memeli bestrophin protein, bir ailenin Ca2 +için kademeli yordamlar açıklar-Cl- kanalları aktif.

İfade ve arıtma memeli Bestrophin iyon kanalları

Burada, sağlıklı ve fonksiyonel birincil fare tetkikine yalıtım için bir iletişim kuralı mevcut. Hepatik doğmakta olan protein sentezi tarafından radyoaktif olmayan etiketleme substrat algılamak için yönergeler protein sentezi karaciğer homeostazı enerji metabolizması bağlamında temel mekanizmaları anlamanıza yardımcı olmak için sağlanmıştır.

Birincil fare tetkikine yalıtım doğmakta olan Protein sentez analiz radyoaktif L-azidohomoalanine etiketleme yöntemi tarafından için

Bu iletişim kuralı modelleri otolog hücre transplantasyonu ile metabolik hastalıkların tedavisi için domuz hepatosit yalıtım ve ex vivo gen teslim açıklamak için tasarlanmıştır. Her ne kadar bu modelle başarılı terapi lehine benzersiz avantajlar sahiptir, uygulama ek hastalıklar ve göstergeler yönelik olarak ilgili bir temelidir.

Lentiviral vektör-aracılı gen terapisi tetkikine Ex Vivo domuz otolog nakli için

Fumarilasetoasetik hidrolaz etki alanı içeren proteinlerin ifade ve arıtma örnekleri ( E. coli, FPLC ifadesi) ile açıklanmıştır. Arıtılmış proteinler kristalizasyon ve antikor üretimi için kullanılır ve enzim asdında istihdam edilir. Seçilen fotometrik asdalar, oxaloasetat dekarboksilaz ve acylpyruvate hydrolase olarak FAHD1 Multi-functionality görüntülemek için sunulmaktadır.

Fumarylacetoasetat Hydrolase etki alanı Içeren proteinleri ifade, arıtma, kristalizasyon ve enzim Asdimleri

Ribozom afinite saflaştırmanın (TRAP) çevirisi hücre tipine özgü translating mRNA'nın hızlı ve etkin bir şekilde izole edilmesini sağlar. Burada, karaciğer repopülasyonu ve TRAP bir fare modelinde hidrodinamik kuyruk-ven enjeksiyonu birleştiren bir yöntem göstermek hepatositlerin ifade profilini incelemek için.

Fare Karaciğerinde Hücre Tipine Özgü Gen Ekspresyonu Profiloluşturma

Membran protein saflaştırma ve peptidiskler içine reconstitution birleştiren bir yöntem tek bir kromatografik adımda salıyoruz. Biyotinylated iskeleler biyolayer interferometri ile protein-ligand etkileşimlerinin doğrudan yüzey eki ve ölçümü için kullanılır.

PeptiQuick, Aerodinamik Protein Bağlayıcı Tahliller için Biyotinylated Peptidiskler içine Membran Proteinlerin Bir Adım Dahil

Burada, Sipunculus nudus'tan fibrinolitik bir enzimin basit, ucuz ve verimli bir afinite saflaştırma yöntemi sunuyoruz.

Sipunculus nudus'tan Bir Fibrinolitik Enzimin Afinite Saflaştırılması

Bu makale, bir 6X-histidin etiketi ile etiketlenmiş bir insan rekombinant proteini olan flep endonükleaz 1'in (FEN1) afinite saflaştırılması için bir prosedür sağlar. Protokol, etiketli proteinin saflaştırılması için iki farklı hareketsizleştirilmiş metal iyon kolonunun kullanılmasını içerir.

Hızlı Protein Sıvı Kromatografi Sistemi Kullanılarak 6X His Etiketli Bir Proteinin Afinite Saflaştırılması 

Bu protokol, iskelet ve kalp kası fibro-adipojenik progenitörlerinin (FAP'ler) dikenli fareden (Acomys) enzimatik ayrışma ve floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması yoluyla izolasyonunu ana hatlarıyla belirtir. Bu protokolden elde edilen FAP'lar etkili bir şekilde genişletilebilir ve miyofibroblastlara ve adipositlere farklılaştırılabilir.

Dikenli Fare Modelinden Fibro-Adipojenik Progenitör İzolasyonu, Genişlemesi ve Farklılaşması

Öğrenin FAHD1 proteininin domuz böbreği ve fare karaciğerinden fizyolojik formda ekstraksiyon ve saflaştırma yöntemini. Bu teknik, protein katlanması ve katalitik aktivitenin korunmasını sağlayarak yüksek kaliteli antikor geliştirme çalışmalarına katkıda bulunur.

FAHD1 Proteininin Domuz Böbreği ve Fare Karaciğerinden Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması

Daha fazla video keşfet