Respirometrik Testler için Fare İskelet Kasından Mitokondri İzolasyonu

Bu kelime, fare iskelet kasından mitokondri işlenmesinde solunum analizini açıklar. Bu protokol saflaştırma süresini önemli ölçüde azaltır ve aynı anda birden fazla numunenin işlenmesine izin verir. Birleşik arka plana sahip herhangi sekiz cinsiyetteki hayvanlardan elde edilen mitokondri, çok çeşitli deneysel koşullarda solunum çalışmasını sağlayan bu protokol kullanılarak parçalanabilir.

Bu yöntem, yaşlanma, ilaç testi, kanser veya gelişme dahil olmak üzere mitokondri fonksiyonunun ilgili olduğu tüm araştırma alanları için uygundur. Diğer dokulara ve organizmalara da uyarlanabilir. Mitokondrileri hasardan korumak için prosedür sırasında her şeyi buzun üzerine yerleştirerek tüm malzemelerin soğuk olduğundan emin olun.

Buz üzerine numune başına üç adet 50 mililitrelik beher yerleştirin ve bir beherde 10 mililitre PBS, ikinci beherde 10 mililitre 10 milimolar EDTA PBS ve üçüncü beherde dört mililitre IB1 ekleyin. Kürkün dökülmesini önlemek için ötenazi yapılmış bir farenin sağ arka bacağına% 70 etanol püskürtün ve uzuvları mantar diseksiyon panosuna bantlayın, ardından sol ön ekstremiteyi bantlayın. Steril tek kullanımlık neşter ile dizden ayak parmağına kadar deriden bir kesi yapın.

Cildi ayak bileği seviyesinde dişli forseps ile tutun ve ayak bileği çevresinde ince makasla kesin. Bir elinizde ince uçlu cımbızla cildi altta yatan kas yapısından uzaklaştırırken, diğer yandan dişli forseps ile yukarı çekin. Ayak bileğinden dize kadar tüm iskelet kaslarını disseke edin ve ince cımbız ve makas kullanarak tibialis ön kası üzerindeki tüm bağ dokusunu çıkarın.

Ekstansör digitorum longus kasının dört distal tendonunu bulun ve ayak parmaklarındaki yerleştirmelerine yakın bir şekilde kesitleyin. Tibialis anterior distal tendonunu bulun ve ayak bileğinin altına yerleştirilmesine yakın bir yerde kesin. Gevşek uçları serbest bırakmak için tibialis anterior ve extensor digitorum longus tendonlarını ayak bileğinin üzerine çekin.

Tendonların gevşek uçlarını tutun ve kasları yukarı çekerek kemiklerdeki kas sisteminin geri kalanından uzaklaştırın. Bu kasların proksimal tendonlarını diz kapağına mümkün olduğunca yakın kesin. Gastroknemius ve soleus kas ekstraksiyonuna devam etmek için fareyi baş aşağı çevirin.

Pazılar, femoris ve gastroknemius arasında oluşan cebi tutun ve proksimal gastroknemius tendonunu görselleştirmek için ince makas kullanarak bu kasları ayırın. Distal Aşil tendonunu ince makasla tutun ve dikkatlice kesin. Proksimal gastroknemius tendonunu altta yatan soleus ile serbest bırakarak kesin.

Kalan kasları dikkatlice inceleyin ve kuadriseps kasını diseke etmek için fareyi ilk pozisyonda yeniden sabitleyin. Yağ dokusunu atın, ardından kası kemikten ayırmak için kuadriseps ve femur arasına ince cımbız yerleştirin. Distal kuadriseps kas tendonlarını tutun ve tendonu diz kapağına mümkün olduğunca yakın kesin.

Kuadrisepsleri yukarı çekin ve proksimal yerleştirmede ince makasla serbest bırakın. Sol arka bacak için de aynısını tekrarlayın. Tüm kasları beherde bir, sonra iki, ardından beher üçünde durulayın.

Son olarak, beherdeki tüm kasları buz üzerinde keskin makasla üç kez doğrayın. Süspansiyonu bir C tüpüne aktarın, sıkıca kapatın ve homojenizatörün manşonuna baş aşağı takın. Homojenatı iki adet 2 mililitrelik önceden soğutulmuş mikro santrifüj tüpüne bölün ve 10 dakika boyunca santrifüj yapın.

Daha sonra süpernatantı yeni önceden soğutulmuş tüplere aktarın ve 10 dakika daha santrifüj yapın. Peleti 500 mikrolitre IB2'de birleştirin Süpernatantı yeni bir 2 mililitrelik önceden soğutulmuş mikro santrifüj tüpüne aktarın ve iki numaralı süpernatant veya SN2 olarak etiketleyin. Son mitokondriyal peleti 200 mikrolitre re süspansiyon tamponunda yeniden askıya alın.

Protein miktarı için hızlı bir şekilde 10 mikrolitre ayırın ve hasarı önlemek için kalan mitokondriyal süspansiyona derhal 10 mikrolitre% 10 FFA BSA ekleyin. Konsantre mitokondriyal süspansiyonu dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 10.500 kez G'de santrifüj yapın. Mitokondriyal peleti, gerçekleştirilecek protokole bağlı olarak, BSA ile 100 mikrolitre 1X kuplaj tahlil ortamı, BSA ile 1X elektron akış testi ortamı veya BSA ile 1X beta oksidasyon ortamı içinde yeniden askıya alın.

Bu konsantre mitokondriyal numuneyi, karşılık gelen tahlil ortamını kullanarak mikrolitre başına 0.2 mikrograma seyreltin. Buz üzerinde önceden soğutulmuş 24 kuyucuklu mikro plakada kuyu başına süspansiyonun 50 mikrolitresini tohumlayın. Arka plan düzeltme kuyularında, yalnızca ilgili tahlil ortamını ekleyin.

Parçalanma saflığının belirlenmesi için kalan mitokondriyal süspansiyonu eksi 80 santigrat derecede saklayın. Mikro plakayı önceden soğutulmuş hazırlık santrifüjünde 20 dakika boyunca döndürün. Bu arada, kalan tahlil ortamını 37 santigrat dereceye ısıtın.

Santrifüjlemeden sonra, dengelemek için mikro plakayı tezgahta beş dakika bekletin. Mitokondrinin ayrılmasını önlemek için kuyu başına 450 mikrolitre ılık tahlil ortamını yavaşça ve dikkatlice ekleyin. Mikro plakayı hemen oksijen tüketimi ölçüm cihazına kapaksız olarak yerleştirin ve ölçüm programını başlatın.

Mikro plakanın ısınmasına izin vermek için ilk adımın 10 dakikalık bir inkübasyon olduğundan emin olun. Deney bittiğinde, kartuşu ve mikro plakayı çıkarın, cihazı kapatın ve analize başlayın. Seri santrifüjlemelerle elde edilen farklı fraksiyonlardan elde edilen genel protein profilleri, izole fraksiyonlarda farklı protein popülasyonları göstermiştir.

Tüm mitokondriyal içeriğin varlığı, dış ve iç mitokondriyal membranın belirteçleri ve nükleoid ile ilişkili proteinler için güçlü sinyallerle belirgindir. Fraksiyon N, çekirdekleri ve bozulmamış materyali temsil eder. SN1 veya SN2 fraksiyonlarındaki endoplazmik retikulum, plazma membranı veya sitoplazma belirteçlerinin çoğu, izolasyon sırasında elde edilen yüksek saflığı vurgulamaktadır.

Kaplin ve beta oksidasyon testlerinde ADP ilavesinden sonra oksijen tüketiminde bir artış gözlenmiştir. Karbonil siyanür-p-triflorometoksi fenilhidrazon ilavesinden sonra oksijen tüketimi en yüksek seviyeye ulaşmıştır. Düşük solunum kontrol oranı, izole mitokondrinin bütünlüğünü sağlar.

Elektron akış testi, elektron taşıma zinciri komplekslerinin aktivitesini ayrı ayrı veya spesifik substratların ve inhibitörlerin enjeksiyonu yoluyla kombinasyon halinde inceledi. İzole edici mitokondri son derece hassastır. Bu nedenle, doku azaltma işleminden sonraki tüm adımların, canlılıklarını korumak için özenle ve dikkatle uygulanması gerekir.

Deneysel tahliller, anahtar mitokondri moleküllerinin deterministik bir sematik analizi veya mavi doğal poliakrilamid jel elektroforezi kullanılarak respirometrik komplekslerin montajının incelenmesi ile tamamlanabilir.