Müller Glial Hücrelerinde 2′,7′-Diklorofloresein Diasetat Probu ve Akış-Sitometri Kullanılarak Reaktif Oksijen Türlerinin Miktarının Belirlenmesi
13 Mayıs 2022
Burada, Müller glial hücrelerinde (MGC'ler) 2′,7′-diklorofloresein diasetat probu (DCFH-DA) kullanarak hücresel reaktif oksijen türlerini (ROS) tespit etmek için sistematize, erişilebilir ve tekrarlanabilir bir protokol öneriyoruz. Bu yöntem, bir akış sitometresi ile toplam hücresel ROS seviyelerini ölçer. Bu protokolün kullanımı çok kolaydır, uygundur ve yeniden üretilebilir.
ROS üretimini veya hücrelerdeki oksidatif stresi ölçmek için çeşitli yöntemler vardır. Bunlar arasında, 2'7'diklorofloresein diasetat probu, redoks durumunun doğrudan ölçülmesi için en yaygın kullanılan tekniklerden biridir. Bu prob lipofilik ve floresan değildir. Bu probun hücre zarı boyunca difüzyonu, hücre içi esterazların iki ester bağında bölünmesine izin verir ve nispeten polar ve hücre zarı geçirimsiz bir ürün üretir. Bu floresan olmayan moleküller hücre içinde birikir ve daha sonra ROS tarafından oksidasyon, yüksek floresan ürün diklorofloresein verir. Probun oksidasyonu, çoklu ROS tipinin etkisinin ürünüdür. Akış sitometrisi veya konfokal mikroskopi ile tespit edilebilir. Bu yazıda, akış sitometrisi ile ROS'u ölçmek ve ölçmek için bir diklorofloresein diasetat probu kullandık. 6 delikli plakaları inkübatörden laminer bir akış davlumbazına aktarın. Süper natantı aspire edin. Ve hücreleri PBS ile bir kez yıkayın. Kuyu başına 2 mL düşük serum DMEM ekleyin. Ve 6 kuyucuklu plakayı inkübatörde iki saat boyunca inkübe edin. Hücreleri altı saat boyunca antioksidan ile tedavi edin. Hücreleri 30 dakika boyunca ROS indükleyici, A veya B ile tedavi edin. Süper natantı aspire edin. Ve tüm uyaranları gidermek için hücreyi PBS ile üç kez yıkayın. Laminer davlumbazın ışığını kapatın ve karanlıkta çalışın. DMEM'de fenol kırmızısı olmadan 1 mL diklorofloresein diasetat probu ekleyin. Kontrol otofloresan kontrol hücrelerine fenol kırmızısı olmadan 1 mL DMEM ekleyin. 6 kuyucuklu plakayı inkübatörde 30 dakika boyunca inkübe edin. Buz üzerindeki plakaları laboratuvara aktarın. Hücreleri kuyu başına 2 mL soğuk PBS ile üç kez yıkayın. Her bir kuyucuğa 0,5 mL soğuk ayırma tamponu ekleyin. P1000 pipet kullanarak yavaşça yukarı ve aşağı pipetle çekerek hücreleri toplayın. Bunları etiketli 1,5 mL tüpte toplayın. Ve onları 4 C'de beş dakika boyunca 600 x g'de santrifüj edin Süpernatantı dikkatlice atın ve peleti hafifçe kılavuz çekerek ayırın. Hücreleri etiketli her tüpe yıkamak için 1 mL FACS tamponu ekleyin. Gerekirse, peletin tamamen ayrışması için vorteksi en düşük yoğunlukta kullanın. Onları 4 C'de beş dakika boyunca 600 x g'de santrifüj yapın.Bu adımı iki kez daha tekrarlayın. Toplamda üç yıkama. Hücre peletlerini 200 L FACS tamponunda yeniden askıya alın. Vorteks kullanarak her tüpteki peleti yavaşça tamamen ayırın. Ve akış sitometresi tüpleri için etiketli 5 mL'ye aktarın. Akış sitometresinde analiz edilene kadar tüpleri buz üzerinde tutun. Akış sitometrisi yazılımını kullanarak yeni bir deney oluşturun. Numuneye tıklayın ve bir tüp listesi açacaktır. Çift tıklayın ve yeniden adlandırın. Otofloresan kontrol tüpünü aspiratör koluna yerleştirin ve tabanı dikkatlice sadece sola doğru hareket ettirin. Veri Al'ı ve ardından Verileri Kaydet'i tıklatın ve istediğiniz durdurma koşulunu seçin. Ölü hücreler ve enkaz hariç, ilgilenilen hücrelerin etrafına bir kapı çizin. Tüpü çıkarın. Sonraki Tüp'e tıklayın ve bazal kontrol örneğini çalıştırın. Veri Al'ı tıklatın ve ardından Record Data.Open içinde yazılımı açın. Örnek Ekle eylem düğmesini kullanarak örnekleri ekleyin. Örnek Ekle.Deneysel Tarih klasörünü seçin ve Seç'i tıklatın.Çalışma alanınızdaki ilk örneği çift tıklatın, bu durumda otomatik floresan denetimi. Ölü hücreler ve döküntüler hariç, ilgilenilen hücreyi izole etmek için bir çokgen kapısı çizin. Grafiği histogram olarak değiştirin. M içinde çift tıklayın
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, Müller glial hücrelerinde (MGC'ler) 2′,7′-diklorofluorescein diasetat (DCFH-DA) probu kullanılarak hücresel reaktif oksijen türleri (ROS) seviyelerinin saptanması için bir protokol sunmaktadır. Yöntem; erişilebilir, tekrarlanabilir olacak şekilde tasarlanmış olup ROS miktarını akış sitometrisi kullanarak belirlemektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücresel Biyoloji
- Oksidatif Stres
- Nörobilim
Arka Plan
- Reaktif oksijen türleri (ROS), çeşitli hücresel süreçlerde kritik bir rol oynar.
- ROS ölçümü, hücrelerdeki oksidatif stresin anlaşılması için temel öneme sahiptir.
- DCFH-DA probu, ROS saptamada yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir.
- Protokol, tekrarlanabilirlik ve kullanım kolaylığına vurgu yapmaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Müller glial hücrelerinde ROS'ların tespit edilmesi için net bir protokol sağlamak.
- Nöronal hücrelerdeki oksidatif stresin miktar tayinini mümkün kılmak.
- Glial fonksiyon ve nörobiyolojide ROS'ların rolü üzerine yapılan araştırmaları kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Biyolojik modeli oluşturmak için Müller glial hücrelerinin hücre kültürü gerçekleştirilmiştir.
- ROS seviyelerini değerlendirmek amacıyla hücreler antioksidanlar ve ROS indükleyicileri ile muamele edilmiştir.
- ROS saptaması için DCFH-DA probu kullanılmış ve akış sitometrisi ile miktar tayini yapılmıştır.
- Kritik adımlar arasında hücrelerin PBS ile yıkanması ve analizler sırasında ışık maruziyetinin kontrol edilmesi yer almıştır.
Ana Sonuçlar
- Protokol, Müller glial hücrelerindeki hücresel ROS seviyelerini etkili bir şekilde ölçmüştür.
- Akış sitometrisi, ROS birikiminin kantitatif bir analizini sağlamıştır.
- Sonuçlar, belirtilen koşullar altında DCFH-DA probunun kullanımının uygulanabilirliğini doğrulamıştır.
Sonuçlar
- Bu çalışma, glial hücrelerdeki oksidatif stresin değerlendirilmesi için güvenilir bir yöntem oluşturmaktadır.
- Protokol, ROS ölçümünü kolaylaştırarak araştırmacılar için erişilebilirliği artırmaktadır.
- Bulgular, nörobiyolojide oksidatif stresin anlaşılması ve potansiyel terapötik hedefler açısından önem taşımaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Yürütücü Endüstriyel İlgililik
DCFH-DA ve akış sitometrisi kullanılarak Müller glial hücrelerindeki reaktif oksijen türlerinin (ROS) kantitatif ölçümü, nörodejeneratif ve retinal hastalık modelleriyle ilgili oksidatif stres mekanizmalarının güvenilir bir şekilde değerlendirilmesine olanak tanır. Bu yetenek, antioksidan yolak modülasyonu için erken aşama hedef doğrulamayı ve mekanistik risk azaltmayı destekler. Güvenilir ROS kantifikasyonu, hastalıkla ilgili sistemlerde redoks homeostazını hedefleyen aday moleküllere yönelik portföy kararlarına veri sağlar.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Glial hücre modellerinde antioksidan yolak aktivasyonunun ve redoks modülasyonunun sorgulanmasına olanak tanır.
- Oksidatif stres ve hücresel savunma mekanizmalarında yer alan hedeflerin fonksiyonel validasyonunu destekler.
- ROS seviyelerini etkileyen aday müdahaleler için mekanistik risk azaltma sağlar.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Oksidatif stres son noktalarına karşı bileşik taraması için valide edilmiş hücresel sistemlerin hazırlanmasını kolaylaştırır.
- Deney tekrarlanabilirliği ve çalışmalar arası karşılaştırma için uygun, standartlaştırılmış, kantitatif ROS okumaları sağlar.
- Antioksidan veya pro-oksidan bileşik etkilerinin ölçeklenebilir bir formatta güvenilir şekilde değerlendirilmesine olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Diyabetik retinopati gibi oksidatif stres içeren retinal patolojiler için hastalıkla ilgili modellerle uyumludur.
- İn vitro ROS modülasyonunu preklinik biyobelirteç stratejileriyle ilişkilendirerek translasyonel sürekliliği destekler.
- Kantitatif hücresel sonuçlara dayanarak antioksidan adaylarının riskle uyumlu şekilde ilerletilmesine temel oluşturur.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu ROS kantifikasyon iş akışı, hipotez testlerini ve downstream tarama entegrasyonunu destekleyerek, erken keşiften öncü bileşik tanımlamaya kadar olan sürece konumlanmaktadır.
- Keşif Biyolojisi: Redoks yolak katılımı ve oksidatif hasarlara karşı hücresel yanıt için kantitatif kanıtlar sağlar.
- Tarama: Bileşik ön elemesi için tekrarlanabilir, akış sitometrisi tabanlı ROS ölçümleri sunar.
- Analizler: Geometrik ortalama floresans yoğunluğunu kullanarak deneysel koşullar genelinde ROS seviyelerinin istatistiksel karşılaştırmasına olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: İn vitro oksidatif stres modülasyonunu, retinal modellerdeki hastalıkla ilgili son noktalarla ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çeşitli hücre tiplerine ve redoks modüle eden ajanlara uyarlanabilir, standardize edilmiş bir ROS analiz platformu oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Redoks hedefli keşiflerde öngörü güvenini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Ekipler arası iş akışları için standartlaştırılmış, ölçeklenebilir ve tekrarlanabilir ROS miktar tayini sağlar.
- Stratejik Değer: Antioksidan yolak modülatörleri için git/gitme kararlarını iyileştirir ve sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Oksidatif stres mekanizmalarını hedefleyen adayların riskten arındırılmış önceliklendirmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Akış sitometrisi işletimi ve veri analizi konusunda uzmanlık gerektirir.
- Akış sitometrisi cihazlarına ve uyumlu analiz yazılımlarına erişim gereklidir.
- Gating ve floresan miktar belirleme protokollerinin ekipler arası standartizasyonunu gerektirir.
- Prob yüklemesi ve kontroller için protokol optimizasyonu yapılarak diğer hücre modellerine uyarlanabilir.
- Analiz değişkenliğini ve ışık kaynaklı artefaktları en aza indirmek için sağlam örnekleme işlemlerine bağımlıdır.
