Caenorhabditis elegans'ta Otomatik Inklüzyon Sayımı Kullanarak Protein Agregasyon Kinetiğinin In Vivo'da İzlenmesi
17 Aralık 2021
Burada, nematod Caenorhabditis elegans'ta protein agregasyon kinetiğinin analizi için bir yöntem sunulmuştur. Yaş senkronize edilmiş bir popülasyondan gelen hayvanlar farklı zaman noktalarında görüntülenir, ardından CellProfiler'da yarı otomatik dahil etme sayımı ve AmyloFit'teki matematiksel bir modele uyar.
Protein agregasyon mekanizmaları şimdiye kadar çoğunlukla in vitro olarak araştırılmıştır. Protokolümüz ile model organizma C.elegans'ta da benzer nicel çalışmalar yapabiliriz. Yöntemimizin temel avantajı, dahil etme sayılarının tarafsız bir şekilde ölçülmesidir.
Ve bu yüksek kaliteli verileri matematiksel modellere uyarlayarak, toplama mekanizması hakkında fikir edinebiliriz. Protein agregasyonu, Alzheimer ve Huntington dahil olmak üzere birçok hastalıkta görülür. İn vivo protein agregasyonunun moleküler mekanizmasını anlamak, yeni tedaviler geliştirmek için çok önemlidir.
Senkronize bir yumurtlama gerçekleştirmek için platin solucanı toplama ile 6 cm'lik tohumlanmış bir NGM plakasına 10 yetişkin nematodu yerleştirerek başlayın. Yetişkinleri plakadan çıkarmadan önce 20 C'de yaklaşık iki saat yumurta bırakmaya bırakın. Yumurtalı plakaları 20 C'de inkübatöre yerleştirin.Yumurtlamadan yaklaşık üçüncü gün sonra yetişkinliğe ulaşana kadar hayvanların gelişimini izleyin.
Gerekli sayıda kuyucuğu anestezik olarak 25 mM sodyum azid ile desteklenmiş 100 L M9 tamponu ile doldurarak 384 delikli plakayı hazırlayın. Görüntülenecek gerinim başına bir kuyucuk doldurun. Her suş için, bir platin solucan toplama kullanarak 20 hayvanı bir kuyuya aktarın.
Buharlaşmayı önlemek için plakayı kapakla örtün ve plakayı hazırlandıktan sonra bir saat içinde görüntüleyin. Cihazı açın ve yazılımı açın. Kuyu Plakalarını Boşalt'ın yanındaki Oynat düğmesine tıklayın ve 384 delikli plakayı mikroskopa yerleştirin.
Eylem Listesi ve 3B Floresan Alma altında, Test'i tıklatın ve solucanlar içeren kuyuyu seçin. Görüntü işleme'yi Hiçbiri olarak ayarlayın. Ve tıklayın Oynat solucanların doğru şekilde ortalandığı en uygun kaydırma mesafesini belirlemek için düğmesine basın.
Z-yığınındaki hayvanların tüm kalınlığını yakalamak için Artan Mesafeyi 50 m'ye, Alçalan Mesafeyi 50 m'ye ve Dilimleme Aralığını 2 m'ye ayarlayın. Görüntü İşleme'yi tekrar Maksimum olarak ayarlayın. Kuyu Plakası Tarama Ayarı altında görüntülenecek kuyucukları seçin.
Ve sonra Karo ve Tüm Kuyuyu Edin'i seçin. Ölçüm ayarını kaydedin. Denemeyi başlatmak için Ölçümü Başlat'ı tıklayın.
CellProfiler'ı açın ve işlem hattını Buraya bir işlem hattı dosyası bırak penceresine sürükleyin. Projeyi yüklemek için Evet'i tıklatın. Ardından, dikişli görüntüleri Dosyaları ve klasörü buraya bırak penceresine sürükleyin.
Meta veri giriş modülüne tıklayın. Dikişli görüntülerin adlarına göre dosya adından ayıklamak için Normal ifade'yi ayarlayın. NamesAndTypes giriş modülünü tıklatın ve Dosya adlarındaki kanallarla eşleşmesi için Kural ölçütlerini seçin'i ayarlayın.
Ardından, çıktıyı CellProfiler'dan kaydetmek üzere bir klasör seçmek için Çıktı Ayarları'na tıklayın. İlk görüntüleme veri kümesini kullanarak ardışık düzenin ayarlarını kontrol etmek için Test Modunu Başlat'a tıklayın. İşlem hattında çalıştırmak için Adım'a tıklayın, her seferinde bir modül.
Solucan anahatlarını ayarlamak için, talimatları görmek üzere EditObjectsManually modülünde Yardımı Göster'e tıklayın. Anahatları düzeltin. Ardından işlem hattını çalıştırmaya devam etmek için Bitti'ye tıklayın.
Test Modundan Çık'a tıklayın ve görüntüleri analiz edin. Çıktı dosyalarını görüntülemek için çıktı klasörünü açın. Ayrıca, solucanların ve eklemelerin doğru şekilde üst üste bindirilip bindirilmediğini kontrol etmek için görüntüleri orijinal dosya adıyla ve ardından anahatlarla açın.
AmyloFit'i kullanmaya başlamak için projeyi adlandırın ve Proje oluştur'a tıklayın. Açmak için Aç'a tıklayın. Ve bir ad vererek ve Oturum oluştur ve yükle'ye tıklayarak bir oturum oluşturun.
Veri ekle'yi tıklayın ve sol panelde gösterilen veri biçimi gereksinimlerini izleyerek hayvan başına ortalama ekleme sayısını içeren dosyayı yükleyin. Ardından, Yeni veri yükle'ye tıklayın. Sıfır noktası uzaklığı için puan sayısı'nı 0 olarak ayarlayın ve dahil etme sayısı verileri için gerekli olmayan ön işleme adımlarını atlamak için plato için ortalama puan sayısını 0 olarak ayarlayın.
Ardından, Gönder'e tıklayın. Her protein konsantrasyonu için bu adımı tekrarlayın. Model panelinde Özel'i seçin.
Denklem kutusuna bağımsız çekirdeklenme denklemini girin. Ve Modeli yükle'ye tıklayın. Ncells için, parametre türünü Global Sabit olarak ayarlayın ve Değer'i vücut duvarı kas hücrelerinin sayısına karşılık gelen 95 olarak ayarlayın.
Parametre türlerini Kcell ve n için Global fit olarak ayarlayın. Ve m için Sabit'e. Sol paneldeki farklı gerinimler için m değerlerini girin.
Havza atlama sayısını değiştirmeden bırakın ve Sığdırma panelinde Sığdır'ı tıklatın. Son olarak, Verileri İndir ve Sığdır'ı tıklatarak sığdırmayı ayıklayın. Dahil etme sayıları, farklı Q40 konsantrasyonlarını ifade eden dört C.elegans suşunda izlendi.
Bağımsız çekirdeklenme modeli, toplama kinetiğini iyi tanımlar. Uyum, 2.1'lik bir reaksiyon sırası ve 1 mM'lik bir hücre içi protein konsantrasyonunda hücre başına günde 0.38 moleküllük bir çekirdeklenme hızı verdi. Önceki bir çalışmada iki bağımsız biyolojik replikasyon, reaksiyon sırası ve çekirdeklenme hızı için yakından karşılık gelen değerleri göstermiştir.
Akılda tutulması gereken bir şey, güvenilir uyumlar elde etmek için çoklu protein konsantrasyonları için yüksek kaliteli veri setlerine ihtiyacınız olmasıdır. Bu yöntem, genetik nakavtlar veya küçük molekül tedavileri gibi canlı bir organizmada protein agregasyonuna müdahale etmenin yollarını bulmak için kullanılabilir.
Genel Bakış
Bu makale, Caenorhabditis elegans solucanında protein agregasyon kinetiğini analiz etmek için bir yöntem sunmaktadır. Protokol, görüntüleme ve matematiksel modelleme yoluyla inklüzyon sayılarının tarafsız ölçümünü sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyoloji
- Protein Agregasyonu
Arka Plan
- Protein agregasyonu, Alzheimer ve Huntington gibi çeşitli hastalıklarla ilişkilidir.
- Önceki çalışmalar büyük ölçüde in vitro yöntemlere odaklanmıştır.
- In vivo mekanizmaları anlamak, tedaviler geliştirmek için kritik öneme sahiptir.
- Caenorhabditis elegans, bu tür çalışmalar için bir model organizma olarak hizmet eder.
Çalışmanın Amacı
- Canlı bir organizmada protein agregasyonunu incelemek için bir yöntem geliştirmek.
- Inklüzyon sayılarını doğru bir şekilde ölçmek ve agregasyon mekanizmaları hakkında bilgi elde etmek.
- Terapi girişimlerinin araştırılmasını kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Yaş eşleştirilmiş C. elegans, çeşitli zaman noktalarında görüntülenir.
- Inklüzyon sayımı, CellProfiler kullanılarak yapılır.
- Veriler, AmyloFit kullanılarak matematiksel modellere uyarlanır.
- Deneysel koşullar, özel sıcaklık ve tampon preparatlarını içerir.
Ana Sonuçlar
- Bağımsız çekirdeklenme modeli, agregasyon kinetiğini etkili bir şekilde açıklar.
- Reaksiyon düzeni 2.1 ve hücre başına gün başına 0.38 molekül çekirdeklenme hızı belirlenmiştir.
- Yüksek kaliteli veri setleri, güvenilir uyumlar için gereklidir.
- Bu yöntem, genetik veya farmakolojik müdahaleleri araştırmak için uygulanabilir.
Sonuçlar
- Bu yöntem, in vivo protein agregasyonunu incelemek için sağlam bir çerçeve sağlar.
- Elde edilen bilgiler, ilgili hastalıklar için terapötik stratejiler hakkında bilgi sağlayabilir.
- Gelecek çalışmalar, ek protein konsantrasyonları ve koşulları keşfedebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantifying protein aggregation kinetics in vivo addresses a critical gap in neurodegenerative disease research, where in vitro models often fail to capture cellular complexity. This method enables unbiased, time-resolved measurement of inclusion formation in a genetically tractable organism, supporting target validation and mechanistic de-risking. By linking quantitative imaging to mathematical modeling, it provides predictive confidence for evaluating proteostasis modifiers and therapeutic candidates in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying aggregation kinetics in living muscle cells.
- Operational Value: Supports biological de-risking through unbiased inclusion counting across genetic strains.
- Predictive Value: Fitting data to independent nucleation models clarifies mechanism and informs target confidence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, time-resolved inclusion counts suitable for assay standardization.
- Operational Value: Integrates high-throughput imaging with automated image analysis for reproducible outputs.
- Scalability: Uses 384-well plate format to enable screening of genetic or pharmacological modulators.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Models human protein aggregation diseases like Huntington’s via polyQ expression in C. elegans.
- Mechanistic De-risking: Derives nucleation rate and reaction order to distinguish between aggregation mechanisms.
- Risk-Adjusted Advancement: Quantifies effects of interventions on aggregation kinetics to inform go/no-go decisions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification, where quantitative aggregation data informs target selection and compound screening.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about nucleation-dependent aggregation using time-lapse inclusion data.
- Screening: Produces assay-ready, quantitative readouts for compound or genetic library evaluation.
- Analytics: Employs mathematical fitting to extract kinetic parameters (Kcell, n) that enable condition comparison.
- Translational Research: Uses disease-relevant polyQ model to bridge in vivo findings to human pathology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis workflow for chronic proteinopathy studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking inclusion counts to biophysical models of aggregation.
- Operational Value: Standardizes quantification via automated pipelines, minimizing inter-observer variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing kinetic, not just endpoint, aggregation data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on mechanism and modulation potential.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy, image analysis (CellProfiler), and kinetic modeling (AmyloFit).
- Dependent on instrumentation capable of 3D fluorescence z-stacking in multi-well formats.
- Necessitates standardization of worm handling, staining, and imaging timing across operators.
- Adaptation to other tissues or models may require adjustments to segmentation and signal thresholds.
- Relies on high-quality, multi-concentration datasets for reliable model fitting, as noted in the transcript.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:42
Growth of an Age-Synchronized Population of C. elegans
1:12
Sample Preparation of C. elegans in a Multiwell Plate
1:43
Image Acquisition on the High-Throughput Confocal Microscope
2:45
Automated Inclusion Counting Using CellProfiler
4:07
Global Fitting of Inclusion Count Data Using AmyloFit
5:39
Results: Fitting the Data to a Mathematical Model in AmyloFit
6:16
Conclusion
