Radyoaktif Olmayan Demir İzotopları Kullanarak Fare Plasentası In Vivo Boyunca Demir Taşımacılığının Ölçülmesi

Bu protokol önemlidir, çünkü araştırmacıların radyoaktiviteye ihtiyaç duymadan in vivo demir dağılımını izlemelerini ve ölçmelerini sağlar. Aynı numune içinde aynı anda birden fazla kararlı demir izotopu tespit edilebildiğinden, bu teknik farklı kaynaklardan demir alımını, düzenlenmesini ve dağılımını anlamak için kullanılabilir. Başlamak için, satıcı tarafından sağlanan cam şişedeki demir-58'e 12 normal hidroklorik asit ekleyin ve kapağı gevşek bir şekilde değiştirin.

Demiri çözmek için, çözeltiyi bir saat boyunca 60 santigrat derecede ısıtın. Hala çözülmemişse, çözeltiyi çözülmesi için gece boyunca oda sıcaklığında duman davlumbazında bırakın. Daha sonra ferrik klorür çözeltisini üretmek için, oksidasyonu kolaylaştırmak için çözeltiyi kapağı kapalı olarak 60 santigrat dereceye ısıtarak kalan demir klorürü oksitleyin.

Oksidasyonu daha da kolaylaştırmak için çözeltinin 50 mikrolitresi başına bir mikrolitre% 35 hidrojen peroksit ekleyin. Numuneyi buharlaştırmak için ferrik klorür çözeltisini davlumbazda 60 santigrat derecede kapağı kapalı olarak bırakın. Daha sonra ferrik klorürü ultra saf su ile 100 milimol olarak yeniden oluşturun.

İlk metal ağırlığına göre gereken su miktarını hesaplayın. Daha sonra, hazırlanan ferrik klorür çözeltisini, oda sıcaklığında beş dakika boyunca 20 milimolar sodyum bikarbonat varlığında bir ila beş molar oranında nitrilotriasetat ile inkübe ederek bir mililitre ferrik nitrilotriasetat hazırlayın. Daha sonra 500 miligram apotransferrini dört mililitre transfer ve yükleme tamponunda çözün ve bu apotransferrin çözeltisinin dört mililitresini 15 mililitrelik tüpte hazırlanan ferrik nitrilotriasetat çözeltisine ekleyin.

Ferrik nitrilotriasetatın apotransferrin üzerine maksimum yüklenmesine izin vermek için, çözeltinin pH 7.5'te olduğunu kontrol edin ve gerekirse pH'ı sodyum bikarbonat veya hidroklorik asit ile ayarlayın. Karışımı oda sıcaklığında 2 1/2 saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, fazla bağlanmamış ferrik nitrilotriasetat çıkarın ve demir-58 transferrin çözeltisini moleküler ağırlıklı bir kesme kolonuna aktararak ve kolonu santrifüj ederek nitrilotriasetat salın.

Santrifüjlemeden sonra, 10 mililitre transferrin yükleme tamponu ekleyerek ve kolonu santrifüjleyerek kolonu iki kez yıkayın. Daha sonra kolonu 10 mililitre salin ve tekrar santrifüj ile yıkayın. Son olarak, demir-58 transferrin çözeltisini 0.22 mikronluk bir şırınga filtresi kullanarak sterilize edin ve kullanıma hazır olana kadar dört santigrat derecede saklayın.

Tuzlu su içinde mililitre başına 35 miligram demir-58 transferrin çözeltisi hazırlayın. Daha sonra anestezi uygulanmış hamile bir fareyi bir ısıtma yastığına yerleştirin ve demir-58 transferrin çözeltisini retro-orbital sinüse yavaşça ve dikkatlice enjekte edin. Enjeksiyondan altı saat sonra, fareyi ötenazi yapın ve steril forseps ve diseksiyon makası kullanarak uterusu dikkatlice çıkarın.

Tek bir fetüsten oluşan bir fetal plasenta ünitesini ve uterusun bir kısmı ile çevrili amniyotik çuvaldaki plasentayı kesin. Daha sonra, fetüsü ve plasentayı rahatsız etmeden uterus ve amniyotik keseyi dikkatlice kesin. Sonra amniyotik kesesi geri soyun ve fetüsü ve plasentayı çıkarın.

Göbek kordonunu kestikten sonra, fazla amniyotik sıvıyı çıkarmak için fetüsü ve plasentayı temiz bir görev silmesiyle lekeleyin ve tüm plasentanın ağırlığını kaydedin. Her plasentayı bir tıraş bıçağı ile ikiye bölün. Her yarısını iki mililitrelik bir tüpe yerleştirin ve sıvı azotta dondurun.

Embriyo karaciğerlerini toplamak için, embriyoyu feda edin ve karnı açıkta bırakarak stabilizasyon için embriyoyu sabitleyin. Diseksiyon makası kullanmak, göbek kordonunun takılı olduğu yerde küçük bir kesi yapar. Diseksiyon makasının bir ucunu insizyona yerleştirin ve koronal düzleme doğru 1/4 inçlik bir medyan düzlem kesimi gerçekleştirin.

Daha sonra fetal karaciğeri açığa çıkarmak için enine düzlem kesimleri yapın. Forseps kullanarak, fetal karaciğeri çıkarın ve tüm embriyo karaciğerinin ağırlığını kaydedin. Tüm embriyo karaciğerini iki mililitrelik bir tüpe yerleştirin ve sıvı azot içinde dondurun.

Dokuları süresiz olarak eksi 80 santigrat derecede saklayın. Plasenta ve fetal karaciğerlerdeki heme olmayan demiri ölçmek için, plasenta yarılarını ve tüm fetal karaciğerleri çözün. Sonra plasenta yarısını tartın.

Doku örneklerine 400 mikrolitre protein çökeltme çözeltisi ekleyin ve elektrikli homojenizatör kullanarak dokuyu homojenize edin. Örnekleri bir saat boyunca 100 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra oda sıcaklığında iki dakika boyunca suda soğutun.

Basıncı serbest bırakmak için kapakları açın. Sonra tüpleri tekrar kapatın. Doku kalıntılarını peletlemek için numuneyi santrifüj ettikten sonra, süpernatantı ICP-MS analizi için dikkatlice yeni etiketli bir tüpe aktarın.

Heme demirini ölçmenin yanı sıra, santrifüjlemeden sonra elde edilen peletin ağırlığını kaydedin. Daha sonra peletleri 10 mililitre konsantre% 70 nitrik asit içinde sindirin, bir mililitre% 30 hidrojen peroksit ile desteklenin. ICP-MS analizi için göndermeden önce numuneleri 15 dakika boyunca 200 santigrat dereceye ısıtın.

ICP-MS ölçümü iki farklı demir izotopunun tespit edilmesini sağladı. En bol demir izotopu olan demir-56, dokulardaki kronik iyon değişikliklerini yansıtır. Başka bir izotop olan demir-58, enjekte edilen demirin dağılımındaki akut değişiklikleri yansıtır.

Demir-56 ölçümü, demir eksikliği olan gebeliklerden elde edilen embriyo karaciğerlerinin, demir dolu gebeliklerdekilere kıyasla demir depolarını azalttığını doğruladı. Demir-58 ölçümü, demir eksikliği olan gebeliklerde, embriyo karaciğerine altı saat boyunca demir dolu gebeliklere göre daha az demir aktarıldığını doğruladı. Prosedürü uygularken, dokuların ağırlığını kaydetmeyi unutmayın.

Bu ağırlıklar demir konsantrasyonlarını hesaplamak için gereklidir. Demir-58 özel elleçleme önlemleri ve bertaraf gerektirmediğinden, işlenmemiş doku, batı lekelenmesi veya qPCR dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere diğer analizler için kullanılabilir.