İlaca Bağlı Karaciğer Toksisitesini In Vitro Olarak Değerlendirmek için İnsan Karaciğer Mikrofizyolojik Sistemi

Protokol, ilaca bağlı karaciğer hasarının in vitro olarak, dört haftaya kadar yüksek fonksiyonel ve metabolik olarak aktif karaciğer mikro dokularını koruyabilen mikrofizyolojik bir sistem kullanılarak nasıl değerlendirileceğini açıklar. Bu yaklaşım, daha basit 2D kültürlerden veya daha karmaşık 3D kültürlerden daha öngörücü olan yeni bileşikler için ilaca bağlı karaciğer hasarı sorumluluğunu doğru bir şekilde tespit etmek için insana özgü bir hücre kültürü modelidir. Bu teknik, bir bileşiğin klinik gelişime başlamak için güvenli olup olmadığını belirlemek için klinik öncesi güvenlik testleri dizisinin bir parçası olarak kullanılabilir.

Çok çeşitli modaliteler test edilebilir. Kontrol cihazını bir hücre kültürü inkübatöründe yerleştirme istasyonu evine bağlayarak karaciğer mikrofizyolojik sistemini kurmaya başlayın. Kontrol cihazının arkasında bulunan kurutucu kavanozuna taze kurutucu eklendiğinden emin olun.

Tekne rocker anahtarına basarak kontrolörü açtıktan sonra, sistemin dengelenmesi ve basınca ulaşması için beş dakika bekleyin. Her plakayı ambalajdan çıkarın. Daha sonra, rezervuar tarafına 500 mikrolitre önceden ısıtılmış tohumlama gelişmiş DMEM ortamı ekleyerek her bir kuyucuğu astarlayın.

Sürücüyü inkübatördeki yerleştirme istasyonuna yerleştirin. İşiniz bittiğinde, sıvı filtre desteklerinden geçene kadar kontrolör ekranındaki asal programı seçin. Yüzey kanalını kaplamak için, tüm kuyucukları 1.1 mililitre tohumlama gelişmiş DMEM ortamı ile doldurun.

Sürücüleri plakalı olarak 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir inkübatöre yerleştirdikten sonra, yerleştirme istasyonunu bağlayın ve inkübasyon programını çalıştırın. PHH ve HJC şişelerini, şişeleri sadece küçük bir buz şeridi kalana kadar 37 santigrat derecelik bir su banyosunda tutarak çözün. Çözüldükten sonra, en fazla iki şişe PHH'yi doğrudan önceden ısıtılmış kriyokorunmuş hepatosit geri kazanım ortamı olan CHRM ortamından oluşan bir tüpe hafifçe pipetleyin.

Daha sonra kalan hücreleri kriyotüpten yıkamak için bir mililitre CHRM kullanın. HKC'leri kriyotüpten 50 mililitrelik bir santrifüj tüpünde 10 mililitre buz gibi soğuk tohumlama gelişmiş DMEM ortamına yavaşça pipetleyin. Daha sonra, her iki hücre tipini de oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 100 kez G'de ayrı ayrı santrifüj edin.

Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı çıkarın ve tüpe eklenen hücrelerin şişesi başına bir mililitre kullanarak sıcak tohumlama gelişmiş DMEM ortamında PHH'leri ve buz gibi soğuk tohumlama gelişmiş DMEM ortamında HKC'leri yeniden askıya alın. Hücreleri yumuşak bir sallanma hareketiyle tekrar askıya alın ve ardından buzun üzerine yerleştirin. Askıya alındığında, hücreleri sayın ve canlılığı kaydedin.

Hücre canlılığı% 85'in üzerinde olmalıdırSonraki, sürücüyü yerleştirme istasyonundan ayırın ve sürücüyü mikrobiyolojik güvenlik kabinine veya MBSC'ye yerleştirin. Daha sonra medyayı iskelenin üstünden durma noktasına, kanala ve rezervuara aspire edin, kültür kuyusunda 0.2 mililitrelik ölü bir hacim bırakarak iskelenin hemen üstüne ulaşın. Sürücüyü inkübatördeki yerleştirme istasyonuna geri döndürmeden ve ortam değiştirme programını üç dakika boyunca çalıştırmadan önce kuyu haznesine 400 mikrolitre tohumlama gelişmiş DMEM ortamı ekleyin.

Üç dakika sonra, sürücüyü takma biriminden çıkarın ve sürücüyü MBSC'ye geri yerleştirin. Medyayı yukarıdaki iskeleden durma noktasına ve her bir kuyucuğun rezervuar ucuna kadar aspire edin, ardından tüpü hafifçe sallayarak PHH'leri yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonunun gerekli hacmini her kültür kuyusuna ekleyin. Hücre süspansiyonunu dikkatlice pipetleyin, hücrelerin plaka iskelesi boyunca eşit dağılmasını sağlayın.

HKC'leri dikkatlice yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonlarını her kültüre iyice ekleyin. Tüm kuyular her iki hücre tipini de içerdikten sonra, mikrofizyolojik sistemi veya MPS sürücüsünü bir saat boyunca durmak üzere fiziksel olarak bağlanmadan inkübatördeki yerleştirme istasyonuna yerleştirin. Bir saat geçtikten sonra, sürücüyü takma birimine bağlayın ve çekirdek programı çalıştırın.

Program otomatik olarak iki dakikada durakladığında, sürücüyü inkübatörden çıkarın ve toplam 1,4 mililitre hacim elde etmek için kanala 1.000 mikrolitre tohumlama gelişmiş DMEM ortamını yavaşça ekleyin. Daha sonra, plakaları inkübatöre taşıyın ve tohum programının geri kalanını sekiz saat boyunca çalıştırın. Dördüncü günde, denetleyicideki programı duraklatın ve sürücüyü ve plakayı takma biriminden ayırın.

Bunları bir MBSC'ye aktarın. İskeleye dokunarak hücre kültürünü bozmadan çözünür biyobelirteç analizi için her bir kuyucuktan yaklaşık bir mililitre ortamı manuel olarak toplamak için bir pipet kullanın. Toplanan medyayı dördüncü gün numuneleri olarak etiketleyin ve tohumlamanın başarılı olduğundan emin olmak için kalite kontrol kontrolü olarak laktat dehidrogenaz ve üre tahlilleri yapın.

Daha sonra, ortam değişimini gerçekleştirerek her bir kuyucuğu plaka planına göre dozlayın. Tamamlandığında, sürücüyü inkübatördeki yerleştirme istasyonuna geri getirin ve inkübasyon programını çalıştırın. Altıncı günde, sürücüyü ve plakayı yerleştirme istasyonundan ayırın ve bir MBSC'ye aktarın.

Her bir kuyucuktan yaklaşık bir mililitre ortam toplamak için bir pipet kullanın ve doz sonrası 48 saat numune olarak etiketleyin ve daha sonraki testler için numuneleri eksi 80 santigrat derecede saklayın. Sekizinci günde, bir çift cımbız kullanarak iskeleleri plakalardan çıkarın ve iskeleleri, mikro dokuyu rahatsız etmeden her bir kuyucukta kalsiyum ve magnezyum içermeyen 500 mikrolitre DPBS içeren 24 kuyucuklu bir tabağa yerleştirin. Her iskelenin anlık görüntülerini ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu altında 10 kat büyütmede alın.

Dördüncü günde, ilaç dozundan önce, LDH salınımı ve üre sentezi ile oluşan karaciğer mikro dokularının kalite kontrol kontrolü yapıldı. Sekizinci günde, mikrodokularda yüksek düzeyde hepatik işlevsellik ve tekrarlanabilirliği doğrulamak için albümin, üre, CYP üç A dört, ATP gibi çoklu sağlık ve hepatik metrikler değerlendirildi. Kontrast faz mikroskobu ve karaciğer mikrodokularında IF boyaması, HKC'lerin PHH mikrodokularında eşit dağılımını ortaya koymuştur.

Karaciğer mikrodokularının troglitazona akut maruziyeti, alanin aminotransferaz veya ALT ve LDH salınımı ile tespit edilen toksisiteye ve albümin ve üre üretiminde hızlı bir azalmaya neden oldu. ATP içeriği ve CYP üç A dört aktivitesi, troglitazonun neden olduğu toksisiteyi doğruladı ve EC50 değerleri diğer uç noktalarla oldukça karşılaştırılabilirdi. MPS'de sekiz günlük kültürden sonra çekilen parlak alan mikroskobu görüntüleri, araç kontrolündeki iskele boyunca eşit şekilde tohumlanmış sağlıklı bir karaciğer mikrodokusunu ortaya koymaktadır.

Pozitif kontrol ve troglitazon ile tedavi edilen replikalarda doku ölümü veya bozulması görüldü. Ayrıca, pioglitazona maruz kalmayı takiben karaciğer toksisitesi de araştırılmıştır. LDH veya ALT salınımı tespit edilmedi, ancak 48 saat sonra albümin ve üre üretiminde hafif bir azalma gözlendi.

Yüksek pioglitazon konsantrasyonlarında ATP içeriğinde küçük bir azalma gözlendi. EC50 değerleri doz yanıt eğrilerinden oluşturulmuştur. Mikroskopi, test edilen en yüksek iki konsantrasyonda pioglitazona 96 saat maruz kaldıktan sonra hafif mikrodoku değişikliği ortaya çıkardı.

Çalışmada,% 85'in üzerinde kaliteli ve canlılığa sahip hücrelerin kullanımı, mikrofizyolojik sistemde oldukça işlevsel ve sağlıklı 3D mikrodokular üretmek için esastır. Bu prosedürü takiben, alkolik olmayan Delta hepatit veya karaciğer parankimal ve parankimal olmayan hücrelerin üçlü kültürünü kullanan alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı modeli gibi hastalık modellerinde adenin ve ilaç-ilaç etkileşimlerini ve ilaca bağlı karaciğer hasarını değerlendirebiliriz.