Açık Kaynak Pipetleme Robotlarını Kullanan Verimli SARS-CoV-2 Kantitatif Ters Transkriptaz PCR Tükürük Teşhis Stratejisi

Büyük ölçekli topluluk tarama uygulamaları için uygulanması ve ölçeklendirilmesi kolay, düşük maliyetli, tükürük tabanlı bir COVID 19 tanı testi ve iş akışı geliştirdik. Burada, doğru teşhis sonuçları sağlamaya devam ederken ekstraksiyon veya stabilizasyon tamponları olmadan tükürüğün doğrudan testini gerçekleştirmek için açık kaynaklı sıvı taşıma robotları, standart termosikletler ve yazılımlar kullanıyoruz. Basit otomatik paralel iş akışları sayesinde sistem, minimum ekipman, alan ve personel gereksinimi ile her gün binlerce test gerçekleştirmek üzere ölçeklendirilebilir.

Kylie King'e ek olarak, klinik laboratuvar süpervizörümüz Rachel Ham ve eğitim koordinatörümüz Austin Smothers, tükürük toplama tüplerinin dışını% 70 etanol ile dekontamine ederek ve test için laboratuvara aktararak prosedürü göstermeye yardımcı olacaktır. Her numune barkodunu günlük alım elektronik tablosuna tarayarak numune gelişini kaydedin. Tarama numunelerini 95 santigrat derece fırında 30 dakika ısıl işlemden geçirin ve ardından ısıya dayanıklı eldivenler kullanarak numuneleri çıkarın.

Numune atama istasyonundaki her numune yükleme robotu için günlük numune yükleme elektronik tablolarını açın. Daha sonra her 384 kuyu plakasına 188 numune atayın. Plaka adı, tarih ve çeyrek numarası ile etiket tepsileri.

Numuneleri, numune yükleme elektronik tablosuna sırayla tarayın. Numune yükleme istasyonunda, robottaki güverte yerleşimine karşılık gelen sekiz adet 3D baskılı raftan oluşan iki tam set sıralayın. Çeyrek bir tüpün kapağını açın ve bunları birinci raftaki A1 konumundan başlayarak 3D baskılı raflara yerleştirin.

Her rafı soldan sağa ve yukarıdan aşağıya doğru doldurun. Bu yükleme düzenine ikinci rafta devam edin, ardından dördüncü ve beşinci raflara geçin. Yüklü çeyrek bir numune raflarını bir, iki, dört, beş, yedi, sekiz, 10, 11 güvertelerine yerleştirin.

P20 uçlarını üçüncü ve dokuz güvertelere yerleştirin. Kurulum işlemini basitleştirmek için, malzemeleri robota arkadan öne doğru yükleyin. Ana karışım plakaları özel bir robot üzerinde üretilir ve dört santigrat derecede saklanır.

Bir seferde bir plaka kullanılır ve plaka adı ile etiketlenir ve kontrol kuyularının etrafındaki folyodaki bir çizgiyi kesmek için keskin bir bıçak kullanılır. Ana karışım plakasını güverte altıya yerleştirin ve kontrol kuyularını kaplayan küçük dikdörtgeni geride bırakarak folyo kapağını soyun. Uç kutularını ortaya çıkarın ve robotu kapatın.

Robot masaüstü uygulaması üzerinden çalıştırmayı başlat'a tıklayarak özel Python işletim protokolünü başlatın. Her çeyrekte plakaya yüklenmesi 24,5 dakika sürer. Hatırlatıcı olarak bir zamanlayıcı ayarlayın.

Robot çalışırken, iki numune tüpünün kapağını açın ve ikinci 3D baskılı raf setine yükleyin. Robot durakladığında, çeyrek bir rafı çıkarın ve bunları çeyrek iki rafla değiştirin, ardından masaüstü uygulamasında çalıştırmayı sürdür'e tıklayın. Çeyrek bir numune tüpünü özetleyin ve sonuçları beklerken dört santigrat derece buzdolabında saklayın.

Bu yükleme işlemini üçüncü ve dördüncü çeyrek boyunca tekrarlayın. Yüklü plakayı bir biyo güvenlik kabinine aktarın. Kirlenmeyi en aza indirmek için, aktarım sırasında plakayı kapalı tutun.

Tekrarlanan örnekleri toplayın ve bunları dördüncü çeyrekteki son örnekler olarak atayın. Numuneleri numaralandırın, barkodları tarayın ve orijinal numune konumunu ve sonucu numune yükleme elektronik tablosuna girin. Tekrarlanan numuneleri biyo güvenlik kabinine aktarın.

Tekrarlanan numune tüplerini robot yükleme raflarına yüklemeyin. Pipet, her bir numuneyi doğru kuyucuklara tekrarlayan iki mikrolitredir. Hasta örnekleri eklemek için belirlenen pipeti kullanın.

Kontaminasyonu en aza indirmek için numuneler eklerken kontrol kuyularını folyo ile kapalı tutun. Forseps kullanarak kontrol kuyuları üzerindeki folyo kapağını soyun. İki mikrolitre doğrulanmış pozitif hasta numunesini M23 ve M24 kuyularına pipetleyin.

N23 ila N24 kuyularına iki mikrolitre nükleaz içermeyen su pipeti ve mikrolitre başına iki mikrolitre 200 kopya, kuyu O23 ila O24'e pozitif kontrolü karıştırdı. Ana karışım parti kalitesini izlemek için P23 - P24 kuyularını boş bırakın. Plakayı optik olarak şeffaf bir conta ile örtün ve tüm kuyucuklara sızdırmazlık yapıştırmak için aplikatör silindirini kullanın.

İyice karıştırmak için plakayı 2.500 RPM'de 30 saniye boyunca vorteksleyin, ardından plakayı bir dakika boyunca 500 kez G'de santrifüj yapın. Termosikler yazılımında protokol programını seçin ve protokolü gelecekteki plakalar için kaydedin. Sızdırmaz plakayı termosikler içine yerleştirin ve protokolü çalıştırın.

CT değerlerini dışa aktarın ve değerleri örnek yükleme e-tablosuna kopyalayın. Pozitif kontrol için, en az bir pozitif kontrol kuyusunun hem P1 hem de N1 probları için 22 ila 28 arasında BT değerleri üretip üretmediğini kontrol edin. Alternatif olarak, bilinen pozitif numune kuyuları, P1 ve N1 problarında 33'ten daha az P1 ve N1 BT değerleri üretir.

Negatif kontrol için, iki negatif kontrol kuyusundan birinde N1 veya P1 BT değeri olmadığını kontrol edin. Plakayı geçersiz kılmadan önce CT değerlerinin geçerli amplifikasyon eğrilerine sahip olduğunu onaylayın. P1, BT'nin 33'ten daha düşük bir sonucunu üretirse, kuyuyu geçerli olarak düşünün ve N1'den sonuç almaya devam edin. P1, BT değerinin 33'ten büyük veya eşit olduğu veya hiç BT değeri olmadığı bir sonuç üretiyorsa, geçersiz olduğunu düşünün.

N1, BT'nin 33'ten daha az bir sonucunu üretirse, evet olarak değerlendirin. N1 bir BT değeri üretmezse, kuyuyu hayır olarak değerlendirin. N1, 33'ten büyük veya 33'e eşit bir BT değeri üretiyorsa, kuyuyu yıldızsız olarak değerlendirin.

Tüm N1 CT değerlerinin gerçek bir amplifikasyon eğrisi ile ilişkili olduğunu onaylayın. N1 için bir BT değerinin amplifikasyon eğrisi yoksa, kuyu hayırdır. Tekrarlanan numuneleri tanımlayın, dahili bir numune numarası ve numune türü ile etiketleyin ve yükleme iş akışına geri gönderin.

Temsili görüntüler, N1 veya SARS CoV-2 sentetik RNA ve P1 veya HSRPP30 sentetik DNA'nın RTQ PCR tespitini göstermektedir. Standart eğriler, bu prob astar kombinasyonunu kullanarak doğru algılama aralığını belirlemek için standart sapmalarla çizilmiştir. İlgili dilüsyonlarda elde edilen ortalama BT değerleri, tahmini sentetik RNA ve sentetik DNA miktarına karşı çizildi.

Her iki durumda da, doğrusal eğriler çok çeşitli gen kopya konsantrasyonları arasında iyi korelasyon katsayıları göstermiştir. Hem robot hem de manuel numune yüklemesi kullanılarak benzersiz numunelerden elde edilen N1 CT değerleri, manuel ve robot yüklemesi arasındaki tahliller arası değişkenliği belirlemek için aktarıldı. Manuel ve otomatik yöntemler arasındaki doğrusal ilişki, her iki yöntemin de işlevsel olarak eşdeğer olduğunu gösteren yüksek bir korelasyon katsayısı üretti.

Tahlil içi değişkenlik, hem robottan hem de manuel numune yüklemesinden elde edilen transpoze replikatif N1 BT değerleri kullanılarak da belirlendi. Tükürükte viskozitenin azaltılması için ısıl işlem yöntemlerinin değerlendirilmesi burada gösterilmiştir. SARS CoV-2 negatif tükürüğü tek bir kaynaktan toplandı ve alikotlar 95 santigrat derecede sıfır dakika, 30 dakika veya 60 dakika ısıl işlem gördü.

Tedavi yöntemleri arasındaki değişkenliği belirlemek için her bir durumun teknik replikalarından elde edilen P1 BT değerleri çizildi. Hem 30 dakika hem de 60 dakikalık ısıl işlem yöntemleri, hiçbir arıtma kontrolüne kıyasla numune değişkenliğini önemli ölçüde azaltmıştır. 30 dakika ile 60 dakikalık tedaviler arasında anlamlı fark yoktu.

Bu nedenle, işlem süresini azaltmak için 30 dakikalık ısıl işlem yöntemi uygulanmıştır. Özellikle manuel numuneleri ve kontrolleri yüklerken test plakalarının kontaminasyonunu en aza indirmek için uygun aseptik tekniği kullanın. Plakanın üzerinden ellerinizle veya kollarınızla geçmekten kaçının.

Klinik sonuçlar üretildikten sonra, numuneler biyolojik tehlike atıklarına atılabilir veya spesifik suşları belirlemek için tüm genom dizilimi gibi daha ileri analizler için saklanabilir. Bu teknik, test kapsamının etkilerini ve Covid 19'un semptomatik olmayan yayılımını araştırmamıza olanak tanıyan geniş ölçekli topluluk testine izin verir.