Name: Açık Kaynak Pipetleme Robotlarını Kullanan Verimli SARS-CoV-2 Kantitatif Ters Transkriptaz PCR Tükürük Teşhis Stratejisi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Öğrenin, açık kaynak pipetleme robotları kullanarak SARS-CoV-2 için RT-qPCR tükürük teşhis yöntemini. Bu otomatik protokol, günlük binlerce test yaparak halk sağlığı izleme kapasitesini artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, SARS-CoV-2 testinin uygulanmasına ve yönetilmesine yardımcı olan Clemson'un yönetimine, tıbbi personeline ve REDDI Laboratuvarı'ndaki klinik laboratuvar çalışanlarına teşekkür ediyor. Güney Carolina Üniversitesi'nden Dr. Phillip Buckhaults ve Dr. Carolyn Bannister'a ekipman tedariki için ilk proje danışmanlığı ve endüstri bağlantıları için teşekkür ederiz. Örnek toplama konusundaki yardımları için birçok öğrenciye, profesöre ve personele teşekkür ederiz. Standart eğri veri toplama için Creative Inquiry öğrencilerine teşekkür ederiz. Bu çalışmanın finansmanı, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi P20GM121342 (DD ve LGP'ye verilir), Clemson Atletik Bölümü, Clemson Üniversitesi Araştırma Başkan Yardımcısı ve Güney Carolina Valisi ve Ortak Tahvil İnceleme Komitesi'nden alınmıştır.

Tüm araştırmalar Clemson Üniversitesi ve Prisma Health Kurumsal İnceleme Kurullarına (Prisma Health IRB # Pro00099491, 1 Temmuz 2020) uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Açık kaynaklı sıvı taşıma robotunun kurulumu
<ol><li>Yüksek verimli partikül hava (HEPA) filtre modüllerini ( Malzeme Tablosuna bakınız) üreticinin talimatlarına göre her sıvı taşıma robotunun üstüne takın.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarına uygun olarak ana karışım plakası hazırlama robotlarının sol montajına 8 kanallı bir P20 pipet takın.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarına uygun olarak numune yükleme robotlarının sağ yuvasına bir P20 pipet takın.</li>
	<li>Özel Python betiklerini (Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2) uygun bilgisayarlara indirin.</li>
	<li>Örnek yükleme robotu bilgisayarlarındaki masaüstü uygulamasında TigerSaliva Full 384 Loading.py açın. Kalibre Et'e tıklayın ve hem pipeti hem de programı yazılım talimatlarına göre ayarlayın.</li>
	<li>Ana karışım robot bilgisayarındaki masaüstü uygulamasında 12 Tam Plates.py açın. Kalibre Et'e tıklayın ve hem pipeti hem de programı yazılım talimatlarına göre ayarlayın.</li>
	<li>Bilgisayar destekli tasarım (CAD) dosyası (https://www.myminifactory.com/object/3d-print-141363) kullanarak sigortalı biriktirme modellemeli üç boyutlu (3B) yazıcıyla özel numune rafları yazdırın. Sekiz raftan oluşan iki set için numune yükleme robotu başına 16 raf yazdırın.</li>
</ol>2. 20x multipleks N1 + P1 prob / astar karışımının hazırlanması
<ol><li>Sentetik SARS-CoV-2 RNA veya hasta örneklerinden uzakta steril bir ortamda 50 mL'lik bir konik tüp içinde 20x multipleks N1 + P1 prob / primer karışımı (toplam hacim 20 mL, Tablo 1) partisini hazırlayın.</li>
	<li>Aliquot 1.6 mL'lik karışımı serolojik bir pipet kullanarak steril 2.0 mL santrifüj tüplerine dönüştürür ve uygun şekilde etiketler.</li>
	<li>Alikotları kullanıma hazır olana kadar -20 °C dondurucuda saklayın.</li>
</ol>3. Pozitif kontrol karışımının hazırlanması
NOT: Pozitif kontrol karışımı, prob/astar karışımı veya diğer ana karışım bileşenleri ile aynı steril ortamda yapılmamalıdır. Ayrı bir nükleaz içermeyen su kabı kullanılmalıdır.
<ol><li>SARS-CoV-2 sentetik RNA'yı (N1) 1.000.000 gen kopyası/μL'den (cpμ) 10.000 cpμ'ye kadar seyreltin ve 990 μL nükleaz içermeyen suya 10 μL stok çözeltisi ekleyin. Aliquot 25 μL 10.000 cpμ steril 0.2 mL tüplere yerleştirin ve uygun şekilde etiketleyin. Kullanılmayan alikotları -80 ° C'de saklayın. NOT: Sentetik RNA, bozulmayı önlemek için -80 ° C'de saklanmalıdır.</li>
	<li>950 μL nükleaz içermeyen suya 50 μL stok çözeltisi ekleyerek Hs_RPP30 sentetik DNA'yı (P1) 200.000 cpμ'den 10.000 cpμ'ye kadar seyreltin. Aliquot 25 μL 10.000 cpμ steril 0.2 mL tüplere yerleştirin ve uygun şekilde etiketleyin. Kullanılmayan alikotları -80 ° C'de saklayın.</li>
	<li>Her bir bileşeni 20 μL SARS-CoV-2 ve Hs_RPP30 10.000 cpμ stoktan 960 μL nükleaz içermeyen suya ekleyerek 200 cpμ'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin, toplam 1000 μL. Aliquot 20 μL karışık 200 cpμ pozitif kontrol 0.2 mL tüplere ve uygun şekilde etiketleyin. Alikotları kullanıma hazır olana kadar -80 ° C'de saklayın.</li>
</ol>4. Ana karışım plakalarının hazırlanması
NOT: Master karışımı sentetik SARS-CoV-2 RNA veya hasta örneklerinden uzakta steril bir ortamda yapın. Karışıma eklenmeden önce tüm bileşenler tamamen çözülmelidir; uygun çözülme olmadan, konsantrasyonlar yanlış olabilir. Yetersiz çözülme, buzun varlığı veya reaktiflerin düzensiz rengi ile gösterilir. Karışımı hazırlarken bir dondurucu bloğunda saklayın.
<ol><li>50 mL'lik bir konik tüp içinde bir grup multipleks ana karışım (toplam hacim 48 mL, Tablo 2) hazırlayın.</li>
	<li>Tüpü 3x'in üzerine çevirerek karışımı homojenize edin. Yukarı ve aşağı pipetleme veya vorteks yaparak karıştırmayın, çünkü bu enzime zarar verecektir.</li>
	<li>Her bir kuyucuğa 1,48 mL ana karışım aktararak steril 96 kuyucuk derinliğindeki kuyu haznesinin 1-4 sütunlarını doldurun. Bir 50 mL konik, 12 plaka için yeterli olan dört sütunu doldurur.</li>
	<li>Derin kuyu haznesini bir folyo conta ile örtün ve özel ana karışım sıvı işleme robotuna yerleştirin. Doldurulmuş derin kuyu haznesini güverte 10'a yerleştirin, 1-6 numaralı güvertelere altı boş 384 delikli plakayı ve P20 uç kutusunu güverte 11'e yerleştirin. Derin kuyu plakasını ve uç kutularını ortaya çıkarın ve robotu kapatın.</li>
	<li>Robot masaüstü uygulamasında Çalıştırmayı Başlat'a tıklayarak özel Python işletim protokolünü başlatın.</li>
	<li>40 dakika sonra koşu duraklatılır. Doldurulmuş 384 kuyu plakasını robotta kalırken folyo contalarla örtün ve yapışmayı sağlamak için silindirle bastırın. Her plakanın kenarını bir parti tanımlayıcısıyla etiketleyin.</li>
	<li>1-6 numaralı güvertelere altı yeni boş 384 delikli plaka yerleştirin ve Çalıştırmayı Sürdür'ü tıklatarak çalışma protokolüne devam edin. Çalıştırma tamamlandıktan sonra, 384 kuyu plakasının son setini folyo contalarla örtün.</li>
	<li>Kalan ana plakanın 2 μL'lik pipeti, parti kalite kontrolü için boş bir 384 delikli plakanın 1-3 ve 22-24 numaralı sütunlarına karışır. Optik olarak şeffaf bir conta ile kapatın ve termosikler üzerinde çalıştırın (bölüm 10.1-10.2). Herhangi bir kuyu N1 eşik döngüsü (Ct) değerlerine sahipse veya 10'dan fazla kuyu P1 Ct değerlerine sahipse, parti kirlenmiştir ve kullanılamaz.</li>
	<li>Hazırlanan ana karışım plakalarını 4 °C'de saklayın ve hazırlandıktan sonraki 7 gün içinde kullanın.</li>
</ol>5. Numune toplama, alma ve ısıl işlem
<ol><li>Katılımcılara tükürük toplanmasından 30 dakika önce yeme, içme, sigara içme veya diş hijyeni uygulamaktan kaçınmalarını söyleyin. Katılımcılara ağızda doğal olarak biriken en az 1 mL tükürük toplamalarını ve koruyucu madde içermeyen steril 50 mL konik bir tüpe biriktirmelerini, ardından tüpü kapatmalarını söyleyin (Ek Dosya 3).</li>
	<li>Tükürük toplama tüplerinin dışını %70 etanol veya dezenfekte edici mendillerle dekontamine edin ve test için laboratuvara aktarın.</li>
	<li>Her numune barkodunu günlük alım elektronik tablosuna tarayarak numune gelişini kaydedin (Ek Dosya 4).</li>
	<li>Taranan numunelere 95 °C'lik bir fırında 30 dakika boyunca ısıl işlem uygulayın. Isıya dayanıklı eldivenler giyerken numuneleri çıkarın. NOT: İşlenmemiş numuneler oda sıcaklığında (23 °C) 72 saate kadar stabildir. Isıl işlemden geçirildikten sonra, numuneler hemen işlenmiyorsa 4 ° C'de saklanmalıdır.</li>
</ol>6. Örnek Atama
<ol><li>Örnek atama istasyonundaki bilgisayarda her örnek yükleme robotu (Ek Dosya 5) için günlük örnek yükleme elektronik tablolarını açın.</li>
	<li>Her 384 kuyucuklu plakaya aşağıdaki gibi 188 numune atayın: 1-48 arası örnekler 1. çeyrek, 49-96 arası örnekler 2. çeyrek, 97-144 örnekleri 3. çeyrek ve 145-188 örnekleri 4. çeyrek olarak kabul edilir. Numune çift olarak analiz edilir.</li>
	<li>Tepsileri plaka adı, tarih ve çeyrek numara ile etiketleyin. Numuneleri, numune yükleme elektronik tablosuna sırayla tarayın. NOT: Önceki plakalardan alınan numunelerin, Şekil 3'te tanımlandığı gibi manuel olarak çalıştırılması gerekebilir. Manuel numune atama ve yükleme talimatları için bölüm 8.1-8.3'e bakın.</li>
</ol>7. Numune yükleme robotlarının çalıştırılması
<ol><li>Numune yükleme istasyonunda, robottaki güverte yerleşimine karşılık gelen sekiz adet 3D baskılı raftan oluşan iki tam set sıralayın.</li>
	<li>Çeyrek 1 tüplerin kapağını açın ve raf 1'deki A1 konumundan başlayarak 3D baskılı raflara yerleştirin. Her rafı soldan sağa ve yukarıdan aşağıya doğru doldurun. Bu yükleme düzenine raf 2'de devam edin, ardından raf 4 ve 5'e geçin ( Şekil 2C'ye bakın). NOT: Robot programı parametreleri nedeniyle raflar ardışık olarak numaralandırılmamaktadır.</li>
	<li>Yüklü çeyrek 1 numune raflarını güverte 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11'e yerleştirin. P20 uçlarını güverte 3 ve 9'a yerleştirin. Kurulum sürecini basitleştirmek için, malzemeleri robota arkadan öne doğru yükleyin.</li>
	<li>4 °C'den önceden hazırlanmış bir ana karışım plakası alın, plaka adıyla etiketleyin ve kontrol kuyularının etrafındaki folyodaki bir çizgiyi kesmek için keskin bir bıçak kullanın (N23/24, O23/24 ve P23/24).</li>
	<li>Ana karışım plakasını güverte 6'ya yerleştirin ve kontrol kuyularını kaplayan küçük dikdörtgeni geride bırakarak folyo kapağını soyun. Uç kutularını ortaya çıkarın ve robotu kapatın.</li>
	<li>Robot masaüstü uygulaması üzerinden Çalıştırmayı Başlat'a tıklayarak özel Python işletim protokolünü başlatın. Her çeyrekte plakaya yüklenmesi 24,5 dakika sürer; hatırlatıcı olarak bir zamanlayıcı ayarlayın.</li>
	<li>Robot çalışırken, bölüm 7.2'de açıklandığı gibi çeyrek 2 numune tüpünün kapağını açın ve ikinci 3D baskılı raf setine yükleyin.</li>
	<li>Robot durakladığında, çeyrek 1 rafları çıkarın ve bunları çeyrek 2 raflarla değiştirin. Masaüstü uygulamasında Çalıştırmayı Sürdür'ü tıklatın.</li>
	<li>Çeyrek 1 numune tüplerini özetleyin ve sonuçları beklerken 4 ° C'lik bir buzdolabında saklayın. Bu yükleme işlemini 3. ve 4. çeyrekler için tekrarlayın.</li>
	<li>Yüklü plakayı bir biyogüvenlik kabinine aktarın. Kirlenmeyi en aza indirmek için, aktarım sırasında plakayı kapalı tutun.</li>
</ol>8. Manuel numune yükleme
NOT: Yetersiz robotik yükleme durumunda tekrarlanan örnekler üzerinde tek bir el ile çalıştırma gerçekleştirin (N1 Yeniden Çalıştırma veya Yeniden Çalıştırma, bkz. Şekil 3).
<ol><li>Tekrarlanan örnekleri toplayın ve bunları 4. çeyrekteki son örnekler olarak atayın (bkz. bölüm 6.2). Numuneleri numaralandırın, barkodları tarayın ve orijinal numune konumunu girin ve numune yükleme elektronik tablosuna sonuç verin.</li>
	<li>Tekrarlanan numuneleri biyogüvenlik kabinine aktarın. Tekrarlanan numune tüplerini robot yükleme raflarına yüklemeyin.</li>
	<li>Her tekrarlanan numunenin 2 μL'lik pipeti, plaka düzen diyagramını izleyerek doğru kuyucuklara gider (Ek Dosya 6). Hasta numuneleri eklemek için belirlenmiş bir pipet kullanın. Kontaminasyonu en aza indirmek için numuneler eklerken kontrol kuyularını folyo ile kapalı tutun.</li>
</ol>9. Test plakalarına kontrollerin eklenmesi
<ol><li>Forseps kullanarak kontrol kuyuları üzerindeki folyo kapağını soyun.</li>
	<li>N23-N24 kuyularına 2 μL nükleaz içermeyen su (şablon kontrolü yok) ve O23-O24 kuyularına 200 cpμ karışık pozitif kontrolden 2 μL (bölüm 3'e bakınız) pipet. Doğrulanmış pozitif hasta numunesinin 2 μL'lik pipeti, ek bir kontrol olarak M23-M24 kuyularına kontrol edilir. Ana karışım parti kalitesini izlemek için P23-P24 kuyularını boş bırakın.</li>
	<li>Plakayı optik olarak şeffaf bir conta ile örtün ve tüm kuyucuklara sızdırmazlık yapıştırmak için aplikatör silindirini kullanın. Plakayı iyice karıştırmak için 30 saniye boyunca 2500 rpm'de vorteks. Plakayı 1 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın.</li>
</ol>10. RT-qPCR Gerçekleştirme
<ol><li>Termosikler yazılımında açıklanan koşullara göre bir protokol programı oluşturun (Tablo 3). Protokolü gelecekteki plakalar için saklayın. Sızdırmaz plakayı termosikler içine yerleştirin ve protokolü çalıştırın.</li>
	<li>Ct değerlerini .xslx dosyası olarak dışa aktarın ve değerleri örnek yükleme elektronik tablosuna kopyalayın (Ek Dosya 5). NOT: Bu sayfalar, üretici yazılımından Ct çıktı dosyaları için özel olarak tasarlanmıştır ve diğer biçimleri kabul etmek için değiştirilmesi gerekebilir.</li>
</ol>11. Plaka geçerliliğinin belirlenmesi
<ol><li>Plaka sonuçlarını geçerli olarak değerlendirmek için hem pozitif kontrolü hem de bilinen pozitif numuneleri ve negatif kontrolü doğrulayın. Kontrol kuyularını aşağıdaki kriterlerle değerlendirin.<ol>
<li>Pozitif kontrol için, en az bir pozitif kontrol kuyusunun (O23 / O24) hem P1 hem de N1 probları için 22-28 arasında Ct değerleri üretip üretmediğini kontrol edin. Alternatif olarak, bilinen pozitif numune kuyuları (M23 / M24), P1 ve N1 problarında P1 ve N1 Ct değerlerini <33 üretir.</li>
		<li>Negatif kontrol için, iki negatif kontrol kuyusundan birinde (N23/N24) N1 veya P1 Ct değeri olmadığını kontrol edin. Plakayı geçersiz kılmadan önce Ct değerlerinin geçerli amplifikasyon eğrilerine sahip olduğunu onaylayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>12. Örnek sonuçların yorumlanması
<ol><li>Diyagramı izleyerek hasta sonucunu belirleyin (Şekil 3) ve çözümlenmiş örnekleri raporlayın.<ol>
<li>P1 sonucunu GEÇERLİ veya GEÇERSİZ olarak değerlendirin. P1, Ct <33'ün bir sonucunu üretirse, kuyuyu GEÇERLİ olarak düşünün ve N1'den elde edilen sonuca geçin. P1, Ct >=33 sonucunu üretirse veya Ct değeri yoksa, kuyuyu GEÇERSİZ olarak düşünün.<ol>
<li>N1 Sonucunu EVET, HAYIR veya HAYIR* olarak değerlendirin. N1, Ct <33'ün bir sonucunu üretirse, kuyu EVET'tir. N1 bir Ct değeri üretmezse, kuyu HAYIR'dır. N1 bir Ct >=33 üretirse, kuyu NO*'dur. Tüm N1 Ct değerlerinin gerçek bir amplifikasyon eğrisi ile ilişkili olduğunu onaylayın. N1 için bir Ct değerinin amplifikasyon eğrisi yoksa, kuyu NO'dur.</li>
			<li>Tekrarlanan numuneleri tanımlayın (N1 Rerun veya Rerun), bunları dahili numune numarası ve numune türü ile etiketleyin ve yükleme iş akışına geri gönderin (bölüm 8.1-8.3).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>13. Laboratuvar temizliği
<ol><li>Sıvı taşıma robotları<ol>
<li>Her tarafı orta seviye dezenfektan ile temizleyin. Plastiği bozacağı için etanol kullanmayın.</li>
		<li>Pipet ucu ucunu ve atık kutusunu alkollü (%70 etanol veya %100 izopropanol) mendille nazikçe silin. Klavyeyi ve fareyi silin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Biyogüvenlik kabini<ol>
<li>Tüm yüzeyleri orta seviye dezenfektan ile temizleyin. UV ışığını 15 dakika boyunca açın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Zhu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+coronavirus+from+patients+with+pneumonia+in+China%2C+2019%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+Medicine%22%5BJournal%5D)">A novel coronavirus from patients with pneumonia in China, 2019.</a> New England Journal Medicine. 382 (8), 727-733 (2020).</li>
<li>Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenicity+and+transmissibility+of+2019-nCoV-A+quick+overview+and+comparison+with+other+emerging+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Pathogenicity and transmissibility of 2019-nCoV-A quick overview and comparison with other emerging viruses.</a> Microbes and Infection. 22 (2), 69-71 (2020).</li>
<li>Petersen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+SARS-CoV-2+with+SARS-CoV+and+influenza+pandemics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet.+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics.</a> The Lancet. Infectious Diseases. 20 (9), 238-244 (2020).</li>
<li>Honein, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Summary+of+Guidance+for+Public+Health+Strategies+to+Address+High+Levels+of+Community+Transmission+of+SARS-CoV-2+and+Related+Deaths%2C+December+2020%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR.+Morbidity+and+Mortality+Weekly+Report%22%5BJournal%5D)">Summary of Guidance for Public Health Strategies to Address High Levels of Community Transmission of SARS-CoV-2 and Related Deaths, December 2020.</a> MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (49), 1860-1867 (2020).</li>
<li>World Health Organization. Surveillance strategies for COVID-19 human infection: interim guidance. World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://apps.who.int/iris/handle/10665/332051">https://apps.who.int/iris/handle/10665/332051</a> (2020).</li>
<li>Screening testing for early detection of SARS-CoV-2 infection. Division of viral diseases. Centers for Disease Control. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/tsting-overview.html#PublicHealthSurveillance">https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/tsting-overview.html#PublicHealthSurveillance</a> (2020).</li>
<li>Larremore, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Test+sensitivity+is+secondary+to+frequency+and+turnaround+time+for+COVID-19+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Test sensitivity is secondary to frequency and turnaround time for COVID-19 screening.</a> Science Advances. 7 (1), 5393(2021).</li>
<li>Sethuraman, N., Jeremiah, S. S., Ryo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+Diagnostic+Tests+for+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Interpreting Diagnostic Tests for SARS-CoV-2.</a> JAMA. 323 (22), 2249-2251 (2020).</li>
<li>Chu, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+simple+nucleic+acid+extraction+methods+for+the+detection+of+SARS-CoV-2+in+nasopharyngeal+and+saliva+specimens+during+global+shortage+of+extraction+kits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+virology%3A+the+official+publication+of+the+Pan+American+Society+for+Clinical+Virology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of simple nucleic acid extraction methods for the detection of SARS-CoV-2 in nasopharyngeal and saliva specimens during global shortage of extraction kits.</a> Journal of clinical virology: the official publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 129, 104519(2020).</li>
<li>Guan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+supply-chain+effects+of+COVID-19+control+measures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Human+Behaviour%22%5BJournal%5D)">Global supply-chain effects of COVID-19 control measures.</a> Nature Human Behaviour. 4 (6), 577-587 (2020).</li>
<li>Bastos, M. L., Perlman-Arrow, S., Menzies, D., Campbell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sensitivity+and+Costs+of+Testing+for+SARS-CoV-2+Infection+With+Saliva+Versus+Nasopharyngeal+Swabs%3A+A+Systematic+Review+and+Meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Sensitivity and Costs of Testing for SARS-CoV-2 Infection With Saliva Versus Nasopharyngeal Swabs: A Systematic Review and Meta-analysis.</a> Annals of Internal Medicine. 174 (4), 501-510 (2021).</li>
<li>Pasomsub, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saliva+sample+as+a+non-invasive+specimen+for+the+diagnosis+of+coronavirus+disease+2019%3A+a+cross-sectional+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+and+Infection%3A+The+Official+Publication+of+The+European+Society+of+Clinical+Microbiology+and+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Saliva sample as a non-invasive specimen for the diagnosis of coronavirus disease 2019: a cross-sectional study.</a> Clinical Microbiology and Infection: The Official Publication of The European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 27 (2), (2021).</li>
<li>To, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consistent+Detection+of+2019+Novel+Coronavirus+in+Saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%3A+An+Official+Publication+of+The+Infectious+Diseases+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Consistent Detection of 2019 Novel Coronavirus in Saliva.</a> Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of The Infectious Diseases Society of America. 71 (15), 841-843 (2020).</li>
<li>Vogels, C. B., et al. SalivaDirect: A simplified and flexible platform to enhance SARS-CoV-2 testing capacity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVogels%2C+CB+%22Med+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Med (New York, N.Y.)</a>. 2 (3), 263-280 (2021).</li>
<li>Griesemer, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Specimen+Types+and+Saliva+Stabilization+Solutions+for+SARS-CoV-2+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Specimen Types and Saliva Stabilization Solutions for SARS-CoV-2 Testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 59 (5), 1418-1420 (2021).</li>
<li>Wehrhahn, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-collection%3A+An+appropriate+alternative+during+the+SARS-CoV-2+pandemic%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Virology%3A+The+Official+Publication+of+The+Pan+American+Society+for+Clinical+Virology%22%5BJournal%5D)">Self-collection: An appropriate alternative during the SARS-CoV-2 pandemic.</a> Journal of Clinical Virology: The Official Publication of The Pan American Society for Clinical Virology. 128, 104417(2020).</li>
<li>Barza, R., Patel, P., Sabatini, L., Singh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+simplified+sample+processing+step+without+RNA+extraction+for+direct+SARS-CoV-2+RT-PCR+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Virology%3A+The+Official+Publication+of+the+Pan+American+Society+for+Clinical+Virology%22%5BJournal%5D)">Use of a simplified sample processing step without RNA extraction for direct SARS-CoV-2 RT-PCR detection.</a> Journal of Clinical Virology: The Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 132, 104587(2020).</li>
<li>Paltiel, A. D., Zheng, A., Walensky, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+SARS-CoV-2+Screening+Strategies+to+Permit+the+Safe+Reopening+of+College+Campuses+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Network+Open%22%5BJournal%5D)">Assessment of SARS-CoV-2 Screening Strategies to Permit the Safe Reopening of College Campuses in the United States.</a> JAMA Network Open. 3 (7), 2016818(2020).</li>
<li>Centers for Disease Control. 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Primers and Probes. U.S. Department of Health and Human Services. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.html">https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.html</a> (2020).</li>
<li>Cresswell, K., Ramalingam, S., Sheikh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+Robots+Improve+Testing+Capacity+for+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Internet+Research%22%5BJournal%5D)">Can Robots Improve Testing Capacity for SARS-CoV-2.</a> Journal of Medical Internet Research. 22 (8), 20169(2020).</li>
<li>Villanueva-Cañas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+an+open-source+robotic+platform+for+SARS-CoV-2+testing+by+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Implementation of an open-source robotic platform for SARS-CoV-2 testing by real-time RT-PCR.</a> PLoS One. 16 (7), 0252509(2021).</li>
<li>Robot Boosts COVID-19 Testing Efficiency. University of South Carolina College of Pharmacy. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://sc.edu/study/colleges_schools/pharmacy/about/news/2020/robot-boosts-testing-effort.php">https://sc.edu/study/colleges_schools/pharmacy/about/news/2020/robot-boosts-testing-effort.php</a> (2020).</li>
<li>Matic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+challenges+to+the+clinical+implementation+of+saliva+for+SARS-CoV-2+detection%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Microbiology+%26+Infectious+Diseases%3A+Official+Publication+of+The+European+Society+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Practical challenges to the clinical implementation of saliva for SARS-CoV-2 detection.</a> European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases: Official Publication of The European Society of Clinical Microbiology. 40 (2), 447-450 (2021).</li>
<li>Sahajpal, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SalivaSTAT%3A+Direct-PCR+and+Pooling+of+Saliva+Samples+Collected+in+Healthcare+and+Community+Setting+for+SARS-CoV-2+Mass+Surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostics%22%5BJournal%5D)">SalivaSTAT: Direct-PCR and Pooling of Saliva Samples Collected in Healthcare and Community Setting for SARS-CoV-2 Mass Surveillance.</a> Diagnostics. 11 (5), Basel, Switzerland. 904(2021).</li>
<li>Genzen, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+Opportunities+in+Implementing+Total+Laboratory+Automation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Challenges and Opportunities in Implementing Total Laboratory Automation.</a> Clinical Chemistry. 64 (2), 259-264 (2018).</li>
<li>Archetti, C., Montanelli, A., Finazzi, D., Caimi, L., Garrafa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Laboratory+Automation%3A+A+Case+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Public+Health+Research%22%5BJournal%5D)">Clinical Laboratory Automation: A Case Study.</a> Journal of Public Health Research. 6 (1), 881(2017).</li>
<li>Hecker, K. H., Roux, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+and+low+annealing+temperatures+increase+both+specificity+and+yield+in+touchdown+and+stepdown+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR.</a> BioTechniques. 20 (3), 478-485 (1996).</li>
<li>Bhat, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+beads-on-a-string+structures+during+break-up+of+viscoelastic+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Formation of beads-on-a-string structures during break-up of viscoelastic filaments.</a> Nature Physics. 6, 625-631 (2010).</li>
<li>Miller, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+developments+in+salivary+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarkers+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Current developments in salivary diagnostics.</a> Biomarkers in Medicine. 4 (1), 171-189 (2010).</li>
<li>Moreno-Contreras, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saliva+Sampling+and+Its+Direct+Lysis%2C+an+Excellent+Option+To+Increase+the+Number+of+SARS-CoV-2+Diagnostic+Tests+in+Settings+with+Supply+Shortages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Saliva Sampling and Its Direct Lysis, an Excellent Option To Increase the Number of SARS-CoV-2 Diagnostic Tests in Settings with Supply Shortages.</a> Journal of Clinical Microbiology. 58 (10), 01659(2020).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+SARS-CoV-2+in+Different+Types+of+Clinical+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Detection of SARS-CoV-2 in Different Types of Clinical Specimens.</a> JAMA. 323 (18), 1843-1844 (2020).</li>
<li>Landry, M. L., Criscuolo, J., Peaper, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+use+of+saliva+for+detection+of+SARS+CoV-2+RNA+in+symptomatic+outpatients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Virology%3A+The+Official+Publication+of+The+Pan+American+Society+for+Clinical+Virology%22%5BJournal%5D)">Challenges in use of saliva for detection of SARS CoV-2 RNA in symptomatic outpatients.</a> Journal of Clinical Virology: The Official Publication of The Pan American Society for Clinical Virology. 130, 104567(2020).</li>
<li>Lista, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resilient+SARS-CoV-2+diagnostics+workflows+including+viral+heat+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Resilient SARS-CoV-2 diagnostics workflows including viral heat inactivation.</a> PLoS One. 16 (9), 0256813(2021).</li>
<li>Brotons, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+and+implementation+of+a+direct+RT-qPCR+method+for+rapid+screening+of+SARS-CoV-2+infection+by+using+non-invasive+saliva+samples%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Infectious+Diseases%3A+IJID%3A+Official+Publication+of+The+International+Society+for+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Validation and implementation of a direct RT-qPCR method for rapid screening of SARS-CoV-2 infection by using non-invasive saliva samples.</a> International Journal of Infectious Diseases: IJID: Official Publication of The International Society for Infectious Diseases. 110, 363-370 (2021).</li>
<li>Batéjat, C., Grassin, Q., Manuguerra, J. C., Leclercr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+inactivation+of+the+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biosafety+and+Biosecurity%22%5BJournal%5D)">Heat inactivation of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2.</a> Journal of Biosafety and Biosecurity. 3 (1), 1-3 (2021).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur. Protokolde açıklanan tahlil, Yale Halk Sağlığı Okulu tarafından dosyalanan SalivaDirect EUA kapsamındadır.

Protokolde açıklanan tahlil, bağımsız bir doğrulama çalışması ile değerlendirilmiştir. Aynı anda alınan eşleştirilmiş nazofaringeal sürüntülere karşı değerlendirildiğinde tahlilin %98.9 özgüllük (%1.1 yanlış pozitif) ve %90.0 duyarlılık (%10.0 yanlış negatif) olduğu saptandı (n=837; 817 negatif, 20 pozitif). Önemli olarak, TigerSaliva ile pozitif ve nazofaringeal sürüntü ile negatif test edilen üç katılımcı, 48 saat sonra sürüntülerle tekrar test edildi ve pozitif sonuçlar verdi, bu da TigerSaliva'nın SARS-CoV-2 enfeksiyonlarını hastalık sırasında daha erken tespit edebileceğini gösterdi.
Virüssüz tükürüğü (hem ısıl işlem görmüş hem de ısıl işlem görmemiş) SARS-CoV-2 sentetik RNA'nın bilinen konsantrasyonlarıyla simüle ederek pozitif tükürük örneklerini simüle ettik ve tükürükte Ct sınırını belirlemek için 10 kat seyreltme gerçekleştirdik. N1 geni, simüle edilmiş pozitif örneklerde 10.000 gen kopyasının (yaklaşık Ct = 28) altında tespit edilemedi. Bunun RNase bozulmasından veya diğer kafa karıştırıcı faktörlerden kaynaklandığından şüpheleniyoruz. Bununla birlikte, tükürük RNazlarının çıplak sentetik RNA ile etkileşimi, ısı ile denatüre edildikten sonra bile, viral parçacıklarla etkileşimden farklıdır. Ct >30 ile pozitif tükürük örnekleri tanımlandı ve harici laboratuvarlar bu örneklerden SARS-CoV-2 genetik dizi verilerini elde etti. Viral proteinlerin hasta tükürük örneklerinde RNA bozulmasına karşı koruma sağladığını düşünüyoruz.
Protokoldeki en kritik adım, ana karışım hazırlama ve tükürük numunesi işleme için otomasyonun uygulanmasıdır (sırasıyla bölüm 4 ve 7). Bu, geri dönüş süresini önemli ölçüde azaltan örtüşen görev süreçlerine izin verir. Bir diğer kritik adım klinik sonuç yorumlamasıdır (bölüm 11 ve 12). Ara sonuç kategorilerinin (Yeniden Çalıştır ve N1 Yeniden Çalıştır) oluşturulması, sonuçsuz test sonuçlarının ortaya çıkmasını da en aza indirdi.
Manuel ve otomatik tükürük numunesi yükleme yöntemleri arasındaki varyasyonun ihmal edilebilir olduğunu (Şekil 5A) ve otomasyonun SARS-CoV-2 tespitinin tekrarlanabilirliğini artırabileceğini gösterdik (Şekil 5B). Klinik laboratuvarları tasarlarken ve genişletirken testleri kolaylaştırmak için otomasyon tercih edilmelidir25. Laboratuvar iş akışı, robot otomatik görevlerin uygulanmasıyla iyileştirilmiştir26. Sıvı taşıma robotlarının açık kaynaklı yetenekleri, protokol tasarımı için özel komut dosyalarının uygulanmasına izin verir. Bu, sıvı taşıma robotlarını geleneksel klinik otomasyon yöntemlerine kıyasla ucuz ve oldukça değiştirilebilir bir sistem haline getirir. Aynı zamanda son derece tekrarlayan laboratuvar görevlerini yerine getirmek için ideal bir stratejidir. Sistemin yüksek düzeyde özelleştirilebilirliği, kıtlık durumunda laboratuvar gereçlerini (ör. toplama tüpleri, pipet uçları veya 384 delikli plakalar) değiştirme özgürlüğü anlamına gelir. Bu nedenle, sıvı taşıma robotlarını kullanarak otomasyon, hem büyük ölçekli hem de küçük ölçekli gözetim ve araştırmalar için uygundur.
Bu test stratejisinin en büyük avantajı, diğer klinik laboratuvarlara göre çok daha kısa bir geri dönüş süresidir. Otomatik sıvı taşıma robotlarının kullanımı, geri dönüş süresinin azaltılmasında önemli bir rol oynar, ancak robotların ve termosikleticilerin eşzamanlı kullanımı da test verimliliğini en üst düzeye çıkarmada etkilidir. Bir robot ve termosikler, her iki makinenin de kesintisiz numune yükleme ve numune sonuç analizi için birlikte kullanıldığı bir çift olarak çalıştırılmalıdır. Atanan numunelerin sabit bir akışı sağlandıktan sonra, tüm makine çiftleri aynı anda çalıştırılabilir. Robotların ve termosikletlerin sürekli eşzamanlı kullanımı, yüksek test hacmine uyum sağlamak için çok önemli olan test kapasitesini ve verimliliğini büyük ölçüde artırır.
Diğer yerleşik SARS-CoV-2 RT-qPCR protokollerinin aksine, probun ve astar setlerinin hedef genlere27 tavlanmasını iyileştirmek ve başarısız amplifikasyon riskini azaltmak için termosikler protokolüne bir touchdown adımı ekledik. Sonuçlar, touchdown'ın spesifik astar bağlanma kaybı riski olmadan pozitif numunelerin tespitini iyileştirdiğini göstermiştir (Tablo 4). Hem SARS-CoV-2 RNA kopyalarının (Şekil 4A) hem de Hs_RPP30 DNA kopyalarının (Şekil 4B) geniş bir yelpazesinin RT-qPCR testi ile aynı anda tespit edilebileceğini belirledik.
Sıvı taşıma robotlarının bir sınırlaması, tükürük transferi sırasında pozitif numunelerden çapraz kontaminasyon olasılığıdır. Tükürük viskoelastik bir sıvıdır28 ve pipet ucundan dağıtıldıktan sonra bitişik kuyucuklar boyunca dizilebilir. Ayrıca, tükürüğün heterojenliği29, viral parçacıkların numune boyunca eşit olmayan dağılımına neden olabilir. Bu, hem yanlış pozitiflerin hem de negatiflerin olasılığını artırır ve N1 Rerun ve Rerun örneklerinin atanmasını gerektirir. Bununla birlikte, başlangıçta N1 Rerun olarak belirlenen numunelerin% 14.1'i SARS-CoV-2 için pozitif olarak çözüldü ve yeniden testten sonra Rerun numunelerinin pozitif olarak çözülme olasılığı 30 kat daha fazlaydı. Sonuç olarak, Rerun'u N1 Rerun'dan (Şekil 3) ayırt etmek, potansiyel olarak pozitif numunelerin daha doğru bir şekilde ayrılmasına izin vererek tanısal tahlilimizin duyarlılığını ve özgüllüğünü arttırdı. Tanısal tükürük testi için ortaya çıkan diğer parametreler bu ayrımı yapmamıştır12,14,24,30,31.
Tükürük örneklerinin heterojenlik ve viskozite nedeniyle pipet edilmesi zor olabilir32. Isıl işlem, tükürük biyomatrisindeki proteinleri yeterince denatüre eder, viskoziteyi azaltır ve pandeminin ilk aşamalarında az bulunan RNA ekstraksiyon reaktiflerine9 olan ihtiyacı ortadan kaldırır10. Genişletilmiş ısıl işlem, mevcut virüsleri33 etkisiz hale getirir ve bu da daha düşük biyogüvenlik seviyelerinde laboratuvar işlemesine olanak tanır. Sonuç olarak, protein denatürasyonu yoluyla viskoziteyi azaltmak için ısı bazlı bir RNA ekstraksiyonu (bölüm 5.4'te tanımlanmıştır) uygulanmıştır (Şekil 6). Sonuçlara dayanarak, ısıl işlemin protein biyomatriksinin denatüre edilmesine ek olarak tükürük örneklerini de homojenize edebileceğini varsayıyoruz. Diğer gruplar, homojenliği artırmak için ısıl işlem ve proteinaz K işlemini birleştirdi9,14,34. Bu adımı, virion proteinlerini viral RNA'yı ısı bozulmasına maruz bırakacak bir oranda denatüre edebileceğinden uygulamamayı seçtik35. Ayrıca, proteinaz K ile numune seyreltmesi, daha az viral partikül içeren pozitif numuneleri maskeleyebilir ve böylece duyarlılığı azaltabilir. Ek olarak, tahlil sonuçları, manyetik boncuk RNA ekstraksiyonu kullanan ticari olarak temin edilebilen tükürük bazlı SARS-CoV-2 testi (Logix Smart COVID-19) ile karşılaştırılmıştır (Tablo 5). Mevcut tahlilin, ticari olarak temin edilebilen tahlille karşılaştırıldığında zayıf pozitif numunelerin tespitinde daha uygun olduğu bulunmuştur.
Sadece RT-qPCR kullanarak tükürükteki virüs kopya sayısını ölçmek zordur, çünkü qPCR yarı kantitatiftir. Ct değerleri arasında teknik sınırlamalardan kaynaklanan doğal farklılıklar vardır. Gen kopya sayısı Ct değerlerinden belirlenebilir (Şekil 4) ve kabaca viral kopya sayısına eşdeğerdir. Tükürük örneklerinde viral kopya sayısını belirlemek için olası bir çözüm, reaksiyondaki gen kopyalarının sert bir şekilde ölçülmesini sağlayan ddPCR'dir. Bununla birlikte, klinisyenlere kalitatif sonuçlar vermenin yeterli olduğuna ve göreceli viral içeriğin yöntemlerimizle işlenen örnekler arasında karşılaştırılabileceğine inanıyoruz.
Tükürük kullanırken ortaya çıkan bazı sınırlamalara rağmen, tükürük bazlı RT-qPCR ile SARS-CoV-2 testi, herhangi bir test ölçeğinde hızlı ve güvenilir viral RNA tespiti için etkili bir yöntem olduğunu kanıtlamaktadır. Bu, özellikle açık kaynaklı sıvı taşıma sistemlerinin kullanımı ile birleştiğinde geçerlidir. Bu test yaklaşımı, bulaşıcı hastalık ajanları, hastalık belirteçleri veya diğer virüsler gibi tanı ile ilgili diğer nükleik asit dizilerini tespit etmek için değiştirilebilir. Bu, tahlili hem klinik hem de araştırma teşhis çabaları için uygulanabilir kılar.

Yeni bir koronavirüs olan şiddetli akut solunum sendromu ile ilişkili koronavirüs-2 (SARS-CoV-2), 2019'un sonlarında ortaya çıkmış ve küresel popülasyonlara hızla yayılmıştır1. SARS-CoV-2 enfeksiyonu, potansiyel olarak ciddi solunum ve enflamatuar semptomları olan oldukça bulaşıcı bir hastalık olan koronavirüs hastalığı 2019'a (COVID-19) neden olur. Yüksek bulaşıcılık, düşük mortalite ile birleştiğinde, virüsün popülasyonlar arasında hızla yayılacağını ve daha fazla tanı testi gerektireceğini göstermiştir2,3. Halk sağlığı önerileri, vakaları izole etmek ve daha sonra bulaşma oranlarını azaltmak için geniş çaplı nüfus taramasını teşvik etti4,5,6. Ayrıca, nüfus gözetimi modelleri, artan test sıklığının ve azalan raporlama süresinin, iletimi azaltmada, test duyarlılığını artırmaktan daha büyük bir etkiye sahip olduğunu ortaya koymuştur7. Bunun nedeni, enfekte olmuş bireylerin daha erken karantinaya alınabilmesi ve böylece enfeksiyon zincirlerinin kırılmasıdır.
Orijinal nükleik asit amplifikasyon testi (NAAT) standardı, RT-qPCR8 tarafından işlenen nazofaringeal (NP) çubuklardı. Bununla birlikte, çok büyük popülasyonlar için bu test biçimiyle birlikte, artan göreceli maliyet ve şiddetlenen tedarik zinciri baskısı gibi komplikasyonlar ortaya çıkmaktadır9,10. Ayrıca, yaygın NAAT yöntemlerinin (NP çubukları, orofaringeal çubuklar, orta konka çubukları ve burun çubukları dahil) hem numune toplanması hem de işlenmesi, özel ekipmana, reaktiflere ve tıbbi personele9,10 bağımlıdır.
NP sürüntü RT-qPCR testi için yeterli bir alternatif, SARS-CoV-2 tespiti için doğru bir tanı aracı olan tükürük bazlı testtir11,12,13,14. RT-qPCR'nin tükürük numuneleri üzerinde doğrudan gerçekleştirilmesi, NP swabs15 ile benzer duyarlılık ve özgüllük sağlar. Tükürük testinin NP sürüntü testine göre en büyük avantajlarından biri, numunelerin kendi kendine toplanmasına izin vermesidir16. Bu, tıbbi personel ihtiyacını en aza indirir ve NP çubuklarından daha az invaziv olarak hastalar için numune toplama kolaylığını en üst düzeye çıkarır. Ek olarak, tükürük numuneleri numuneyi bir çubuktan çıkarmak için tampon gerektirmediğinden (NP numunelerinde olduğu gibi), tükürük bazlı testler doğrudan ısı bazlı ribonükleik asit (RNA) ekstraksiyonunu kullanabilir, bu da ek tamponlara, taşıma ortamına ve/veya RNA ekstraksiyon reaktiflerine olan ihtiyacı ortadan kaldırarak test maliyetlerini azaltır14,17.
Clemson Üniversitesi Hastalık Teşhis ve Müdahale Araştırma ve Eğitim (REDDI) Laboratuvarı, üniversitenin COVID-19 testi ve gözetimi ihtiyaçlarını karşılamak için kurulmuştur. Üniversiteler de dahil olmak üzere kapalı popülasyonlarda, sosyal mesafe ile birlikte sık sürveyans testleri, hastalık prevalansının epidemiyolojik modellerinde en olumlu sonuçları vermiştir18. Konsolide CDC 2019-nCOV RT-qPCR19 ve SalivaDirect14 protokolleri uyarlandı ve maliyeti düşürmek ve geri dönüş süresini iyileştirmek için klinik iş akışında otomasyon kullanıldı. Önceki gruplar SARS-CoV-2 RNA ekstraksiyon adımları20,21 için açık kaynaklı sıvı taşıma robotları kullanmıştı, ancak test plakaları hazırlamak ve numuneleri yüklemek için robotların kullanımını en üst düzeye çıkardık22. Burada, uyarlanmış protokolün ve açık kaynaklı sıvı taşıma sistemlerinin kullanımının (Şekil 1) hızlı ve doğru tükürük bazlı RT-qPCR'ye izin verdiğini ve büyük ölçekli halk sağlığı gözetimi için etkili bir strateji olduğunu gösteriyoruz.

<table><tbody><tr><td>% 100 EtOH</td><td>Fisher scientific</td><td>22-032-601</td><td></td></tr><tr><td>20 uL Filtreli Pipet Uçları</td><td>Opentrons</td><td>20uL uçlar</td><td></td></tr><tr><td>2mL Mikrosantrifüj Tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-666-313</td><td>Alternatif ürün kullanılabilir</td></tr><tr><td>Armadillo PCR Plakası, 384 oyuklu, şeffaf, beyaz kuyular</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB3384</td><td>Alternatif ürün</td></tr><tr><td>Celltreat kullanılabilir 2mL 96 Derin Kuyu Plakaları</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-828-743</td><td>Mastermix hazırlama için</td></tr><tr><td>Şeffaf PCR Sızdırmazlık Levhaları</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0558</td><td>Alternatif ürün kullanılabilir</td></tr><tr><td>DPEC Arıtılmış Su</td><td>Ambion (Thermo Scientific)</td><td>AM9916</td><td></td></tr><tr><td>Flip Cap 50 mL Konik Tüpler</td><td>VWR</td><td>75845-210</td><td>Numune toplama için</td></tr><tr><td>Folyo PCR Sızdırmazlık Levhaları</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0626</td><td>Mastermix plakaların saklanması için,</td></tr><tr><td>Sentetik DNA</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td> HS_RPP30 alternatif ürün kullanılabilir <td>299788131</td><td>P1 pozitif kontrol</td></tr><tr><td>Luna Tampon Probu Tek Adımlı Reaksiyon</td><td>New England Biolabs</td><td>M3006B</td><td></td></tr><tr><td>Luna WarmStart RT Enzim Karışımı</td><td>New England Biolabs</td><td>M3002B</td><td></td></tr><tr><td>nCOV_N1 İleri Astar, 100 nmol</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>10006830</td><td></td></tr><tr><td>nCOV_N1 Probu Aliquot, 50 nmol</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>10006832</td><td>Probe, SYBR veya FAM fluoforları ile diğer satıcılar tarafından sentezlenebilir</td></tr><tr><td>nCOV_N1 Ters Primer, 100 nmol</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>10006831</td><td></td></tr><tr><td>Opentron HEPA Filtre Modülü</td><td>Opentrons</td><td>N/A</td><td>Gerekli değil, ancak azaltmak için yararlı kontaminasyon</td></tr><tr><td>Opentron Çok Kanallı Eki, P20</td><td>Opentrons</td><td>999-00005</td><td>Mastermix hazırlama için</td></tr><tr><td>Opentron OT-2 Sıvı İşleme Robotu</td><td>Opentrons</td><td>OT-2</td><td></td></tr><tr><td>Opentron Pipet Eki, P20</td><td>Opentrons</td><td>999-0000215</td><td>Numune yükleme için</td></tr><tr><td>Fırın</td><td>Memmert</td><td>UF450 PLUS 208V-3PH</td><td></td></tr><tr><td>PCR Tüpleri (rnaz, dnaze içermez)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-230-225</td><td>Pozitif ve negatif kontrollerin sonuçları için</td></tr><tr><td>PolarSafe Alüminyum Soğutma Bloğu, 15 Kuyulu (1.5 / 2.0 mL Tüpler)</td> <td>VWR</td><td>10808-952</td><td></td></tr><tr><td>PolarSaf Alüminyum Soğutma Bloğu, 24 Kuyulu (0.5 mL tüpler)</td> <td>VWR</td><td>10808-956</td><td></td></tr><tr><td>RNAse P (ATTO 647) Probu, 50 nmol</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>10007062</td><td>Probu, Cy5 ile diğer satıcılar tarafından sentezlenebilir. florofor</td></tr><tr><td>RNAse P İleri Astar, 100nmol</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>10006836</td><td></td></tr><tr><td>RNAse P Ters Astar, 100 nmol</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>10006837</td><td></td></tr><tr><td>Sars-CoV-2 Sentetik RNA Kontrolü 2</td><td>Büküm Biosciences</td><td>102024 / 103907 / 103909</td><td>N1 Pozitif Kontrol</td></tr><tr><td>Tarayıcıları</td><td>Kod</td><td>CR1500</td><td>Yalnızca ölçek büyütme sırasında gereklidir</td></tr><tr><td>Küçük HEPA Filtreli Davlumbaz</td><td>Erlab</td><td>Captair Bio 321</td><td>Mastermix hazırlama için</td></tr><tr><td>Thermocycler CFX384 Touch</td><td>Biorad</td><td>CFX384 Touch</td><td>Alternatif modeller kullanılabilir, örneğin CFX384 Opus</td></tr><tr><td>X-acto Bıçak Seti</td><td>Zımba Teli</td><td>N/A</td><td>Kontrol kuyularını kapalı tutmak için folyoyu kesmek için</td></tr></tbody></table>

açık kaynak pipetleme robotlarını kullanan verimli sars-cov-2 kantitatif ters transkriptaz pcr tükürük teşhis stratejisi

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

Son SARS-CoV-2 küresel sağlık krizinin ortaya çıkışı, epidemiyolojik araştırmalar ve klinik testler için önemli zorluklar getirmiştir. Yüksek bulaşma oranı ve düşük mortalite ile karakterize edilen COVID-19 pandemisi, özellikle konut üniversiteleri gibi kapalı popülasyonlarda doğru ve etkili tanı testleri gerektirmiştir. Nazofarengeal sürüntüler gibi nükleik asit testlerinin ilk kullanılabilirliği, test sonuçlarının raporlanmasını da geciktiren tedarik zinciri baskısı nedeniyle sınırlıydı. Tükürük bazlı ters transkriptaz kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) testi, diğer test yöntemlerine duyarlılık ve özgüllük açısından karşılaştırılabilir olduğunu göstermiştir ve tükürük toplanması katılımcılar için fiziksel olarak daha az invazivdir. Sonuç olarak, Clemson Üniversitesi ve çevresindeki topluluğun nüfus sürveyansı için multipleks RT-qPCR tanısal bir test geliştirdik. Tahlilde, iş akışını ve sistem esnekliğini optimize etmek için karmaşık klinik otomasyon sistemleri yerine açık kaynaklı sıvı taşıma robotları ve termosikletler kullanıldı. Tükürük bazlı RT-qPCR'nin otomasyonu, hem büyük hem de küçük ölçekli test talepleri için çok çeşitli viral RNA konsantrasyonlarının hızlı ve doğru bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Otomatik sistem için ortalama geri dönüş, numunelerin %95'i için < 9 saat ve numunelerin %99'u için < 24 saat idi. Tek bir testin maliyeti, tüm reaktifler toplu miktarlarda satın alındığında 2,80 dolardı.

Protokol, tükürük örneklerinin RT-qPCR moleküler testini gerçekleştirmek için açık kaynaklı otomasyon kullanan bir SARS-CoV-2 tanı yöntemini açıklamaktadır. Bu ölçeklenebilir yaklaşım, klinik halk sağlığı gözetimine ve daha küçük üniversite laboratuvarlarının kapasitesini artırmaya uygulanabilir.

Açık Kaynak Pipetleme Robotlarını Kullanan Verimli SARS-CoV-2 Kantitatif Ters Transkriptaz PCR Tükürük Teşhis Stratejisi

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Büyük ölçekli topluluk tarama uygulamaları için uygulanması ve ölçeklendirilmesi kolay, düşük maliyetli, tükürük tabanlı bir COVID 19 tanı testi ve iş akışı geliştirdik. Burada, doğru teşhis sonuçları sağlamaya devam ederken ekstraksiyon veya stabilizasyon tamponları olmadan tükürüğün doğrudan testini gerçekleştirmek için açık kaynaklı sıvı taşıma robotları, standart termosikletler ve yazılımlar kullanıyoruz. Basit otomatik paralel iş akışları sayesinde sistem, minimum ekipman, alan ve personel gereksinimi ile her gün binlerce test gerçekleştirmek üzere ölçeklendirilebilir.Kylie King'e ek olarak, klinik laboratuvar süpervizörümüz Rachel Ham ve eğitim koordinatörümüz Austin Smothers, tükürük toplama tüplerinin dışını% 70 etanol ile dekontamine ederek ve test için laboratuvara aktararak prosedürü göstermeye yardımcı olacaktır. Her numune barkodunu günlük alım elektronik tablosuna tarayarak numune gelişini kaydedin. Tarama numunelerini 95 santigrat derece fırında 30 dakika ısıl işlemden geçirin ve ardından ısıya dayanıklı eldivenler kullanarak numuneleri çıkarın.Numune atama istasyonundaki her numune yükleme robotu için günlük numune yükleme elektronik tablolarını açın. Daha sonra her 384 kuyu plakasına 188 numune atayın. Plaka adı, tarih ve çeyrek numarası ile etiket tepsileri.Numuneleri, numune yükleme elektronik tablosuna sırayla tarayın. Numune yükleme istasyonunda, robottaki güverte yerleşimine karşılık gelen sekiz adet 3D baskılı raftan oluşan iki tam set sıralayın. Çeyrek bir tüpün kapağını açın ve bunları birinci raftaki A1 konumundan başlayarak 3D baskılı raflara yerleştirin.Her rafı soldan sağa ve yukarıdan aşağıya doğru doldurun. Bu yükleme düzenine ikinci rafta devam edin, ardından dördüncü ve beşinci raflara geçin. Yüklü çeyrek bir numune raflarını bir, iki, dört, beş, yedi, sekiz, 10, 11 güvertelerine yerleştirin.P20 uçlarını üçüncü ve dokuz güvertelere yerleştirin. Kurulum işlemini basitleştirmek için, malzemeleri robota arkadan öne doğru yükleyin. Ana karışım plakaları özel bir robot üzerinde üretilir ve dört santigrat derecede saklanır.Bir seferde bir plaka kullanılır ve plaka adı ile etiketlenir ve kontrol kuyularının etrafındaki folyodaki bir çizgiyi kesmek için keskin bir bıçak kullanılır. Ana karışım plakasını güverte altıya yerleştirin ve kontrol kuyularını kaplayan küçük dikdörtgeni geride bırakarak folyo kapağını soyun. Uç kutularını ortaya çıkarın ve robotu kapatın.Robot masaüstü uygulaması üzerinden çalıştırmayı başlat'a tıklayarak özel Python işletim protokolünü başlatın. Her çeyrekte plakaya yüklenmesi 24,5 dakika sürer. Hatırlatıcı olarak bir zamanlayıcı ayarlayın.Robot çalışırken, iki numune tüpünün kapağını açın ve ikinci 3D baskılı raf setine yükleyin. Robot durakladığında, çeyrek bir rafı çıkarın ve bunları çeyrek iki rafla değiştirin, ardından masaüstü uygulamasında çalıştırmayı sürdür'e tıklayın. Çeyrek bir numune tüpünü özetleyin ve sonuçları beklerken dört santigrat derece buzdolabında saklayın.Bu yükleme işlemini üçüncü ve dördüncü çeyrek boyunca tekrarlayın. Yüklü plakayı bir biyo güvenlik kabinine aktarın. Kirlenmeyi en aza indirmek için, aktarım sırasında plakayı kapalı tutun.Tekrarlanan örnekleri toplayın ve bunları dördüncü çeyrekteki son örnekler olarak atayın. Numuneleri numaralandırın, barkodları tarayın ve orijinal numune konumunu ve sonucu numune yükleme elektronik tablosuna girin. Tekrarlanan numuneleri biyo güvenlik kabinine aktarın.Tekrarlanan numune tüplerini robot yükleme raflarına yüklemeyin. Pipet, her bir numuneyi doğru kuyucuklara tekrarlayan iki mikrolitredir. Hasta örnekleri eklemek için belirlenen pipeti kullanın.Kontaminasyonu en aza indirmek için numuneler eklerken kontrol kuyularını folyo ile kapalı tutun. Forseps kullanarak kontrol kuyuları üzerindeki folyo kapağını soyun. İki mikrolitre doğrulanmış pozitif hasta numunesini M23 ve M24 kuyularına pipetleyin.N23 ila N24 kuyularına iki mikrolitre nükleaz içermeyen su pipeti ve mikrolitre başına iki mikrolitre 200 kopya, kuyu O23 ila O24'e pozitif kontrolü karıştırdı. Ana karışım parti kalitesini izlemek için P23 - P24 kuyularını boş bırakın. Plakayı optik olarak şeffaf bir conta ile örtün ve tüm kuyucuklara sızdırmazlık yapıştırmak için aplikatör silindirini kullanın.İyice karıştırmak için plakayı 2.500 RPM'de 30 saniye boyunca vorteksleyin, ardından plakayı bir dakika boyunca 500 kez G'de santrifüj yapın. Termosikler yazılımında protokol programını seçin ve protokolü gelecekteki plakalar için kaydedin. Sızdırmaz plakayı termosikler içine yerleştirin ve protokolü çalıştırın.CT değerlerini dışa aktarın ve değerleri örnek yükleme e-tablosuna kopyalayın. Pozitif kontrol için, en az bir pozitif kontrol kuyusunun hem P1 hem de N1 probları için 22 ila 28 arasında BT değerleri üretip üretmediğini kontrol edin. Alternatif olarak, bilinen pozitif numune kuyuları, P1 ve N1 problarında 33'ten daha az P1 ve N1 BT değerleri üretir.Negatif kontrol için, iki negatif kontrol kuyusundan birinde N1 veya P1 BT değeri olmadığını kontrol edin. Plakayı geçersiz kılmadan önce CT değerlerinin geçerli amplifikasyon eğrilerine sahip olduğunu onaylayın. P1, BT'nin 33'ten daha düşük bir sonucunu üretirse, kuyuyu geçerli olarak düşünün ve N1'den sonuç almaya devam edin. P1, BT değerinin 33'ten büyük veya eşit olduğu veya hiç BT değeri olmadığı bir sonuç üretiyorsa, geçersiz olduğunu düşünün.N1, BT'nin 33'ten daha az bir sonucunu üretirse, evet olarak değerlendirin. N1 bir BT değeri üretmezse, kuyuyu hayır olarak değerlendirin. N1, 33'ten büyük veya 33'e eşit bir BT değeri üretiyorsa, kuyuyu yıldızsız olarak değerlendirin.Tüm N1 CT değerlerinin gerçek bir amplifikasyon eğrisi ile ilişkili olduğunu onaylayın. N1 için bir BT değerinin amplifikasyon eğrisi yoksa, kuyu hayırdır. Tekrarlanan numuneleri tanımlayın, dahili bir numune numarası ve numune türü ile etiketleyin ve yükleme iş akışına geri gönderin.Temsili görüntüler, N1 veya SARS CoV-2 sentetik RNA ve P1 veya HSRPP30 sentetik DNA'nın RTQ PCR tespitini göstermektedir. Standart eğriler, bu prob astar kombinasyonunu kullanarak doğru algılama aralığını belirlemek için standart sapmalarla çizilmiştir. İlgili dilüsyonlarda elde edilen ortalama BT değerleri, tahmini sentetik RNA ve sentetik DNA miktarına karşı çizildi.Her iki durumda da, doğrusal eğriler çok çeşitli gen kopya konsantrasyonları arasında iyi korelasyon katsayıları göstermiştir. Hem robot hem de manuel numune yüklemesi kullanılarak benzersiz numunelerden elde edilen N1 CT değerleri, manuel ve robot yüklemesi arasındaki tahliller arası değişkenliği belirlemek için aktarıldı. Manuel ve otomatik yöntemler arasındaki doğrusal ilişki, her iki yöntemin de işlevsel olarak eşdeğer olduğunu gösteren yüksek bir korelasyon katsayısı üretti.Tahlil içi değişkenlik, hem robottan hem de manuel numune yüklemesinden elde edilen transpoze replikatif N1 BT değerleri kullanılarak da belirlendi. Tükürükte viskozitenin azaltılması için ısıl işlem yöntemlerinin değerlendirilmesi burada gösterilmiştir. SARS CoV-2 negatif tükürüğü tek bir kaynaktan toplandı ve alikotlar 95 santigrat derecede sıfır dakika, 30 dakika veya 60 dakika ısıl işlem gördü.Tedavi yöntemleri arasındaki değişkenliği belirlemek için her bir durumun teknik replikalarından elde edilen P1 BT değerleri çizildi. Hem 30 dakika hem de 60 dakikalık ısıl işlem yöntemleri, hiçbir arıtma kontrolüne kıyasla numune değişkenliğini önemli ölçüde azaltmıştır. 30 dakika ile 60 dakikalık tedaviler arasında anlamlı fark yoktu.Bu nedenle, işlem süresini azaltmak için 30 dakikalık ısıl işlem yöntemi uygulanmıştır. Özellikle manuel numuneleri ve kontrolleri yüklerken test plakalarının kontaminasyonunu en aza indirmek için uygun aseptik tekniği kullanın. Plakanın üzerinden ellerinizle veya kollarınızla geçmekten kaçının.Klinik sonuçlar üretildikten sonra, numuneler biyolojik tehlike atıklarına atılabilir veya spesifik suşları belirlemek için tüm genom dizilimi gibi daha ileri analizler için saklanabilir. Bu teknik, test kapsamının etkilerini ve Covid 19'un semptomatik olmayan yayılımını araştırmamıza olanak tanıyan geniş ölçekli topluluk testine izin verir.

efficient-sars-cov-2-quantitative-reverse-transcriptase-pcr-saliva

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

TruTip bir gözenekli, monolitik bağlayıcı bir matris bir pipet sokulur sayede basit bir nükleik asit çıkarma teknolojidir. Sonuç olarak, örnek hazırlama biçimi pek çok sıvı taşıma araçları ile uyumlu ve yüksek verimli klinik uygulama ve örnek tipleri için birçok orta için kullanılabilir.

Ortak Liquid Handling Robotlar TruTip Teknoloji kullanarak Klinik Örneklerden DNA ve RNA yüksek verimlilik, Otomatik Ekstraksiyon

Bu çalışma, iki renkli bir ddPCR sistemi kullanarak SARS-CoV-2 tespiti için farklı tahliller geliştirme adımlarını özetlemektedir. Adımlar ayrıntılıdır ve tahlillerin ve deney performansının nasıl geliştirileceğine dair notlar eklenmiştir. Bu testler birden fazla SARS-CoV-2 RT-ddPCR uygulaması için kullanılabilir.

SARS-CoV-2 Tespiti ve Ölçümü için İki Adımlı Ters Transkripsiyon Damlacığı Dijital PCR Protokolleri

Sars-CoV-2 için çevre örnekleri toplamak üzere San Diego sakinlerini işe almak için bir vatandaş bilimi projesi tasarlandı. Kullanıcı dostu bir mobil cihaz arayüzü kullanılarak veri gönderimi için çok dilli bir web tabanlı platform oluşturuldu. Laboratuvar bilgi yönetim sistemi, gerçek zamanlı sonuç takibi ile binlerce coğrafi çeşitlilikte numunenin toplanmasını kolaylaştıran bir sistemdir.

Kentsel Çevrenin Taranması - Çevre Rezervuarlarından SARS-CoV-2'nin Örneklemesi ve Tespiti için Bir Boru Hattı

Bu protokol, atık su bazlı epidemiyoloji çalışmaları için kullanılacak atık su ve hava örneklerinde SARS-CoV-2 RNA'sının miktarını belirlemeyi ve iç ve dış aerosollerde SARS-CoV-2'ye maruz kalma riskini değerlendirmeyi amaçlamaktadır. Bu protokol aynı zamanda SARS-CoV-2 tüm genom karakterizasyonu için kiremitli amplikon uzun şablon dizileme yaklaşımını da açıklar.

Atık Su ve Hava Örneklerinde SARS-CoV-2 RNA'sının Miktar Tayini ve Tüm Genom Karakterizasyonu

Burada, ters transkripsiyon döngü aracılı izotermal amplifikasyon (RT-LAMP) ile insan örneklerinde SARS-CoV-2 virüsünü tespit etme yöntemini standartlaştırmak ve uygulamak için eksiksiz bir protokol sunuyoruz. 60 dakika içinde yapılan bu yöntem, düşük maliyetle ve ucuz ekipman kullanılarak herhangi bir laboratuvara veya bakım noktasına uyarlanabilir.

SARS-CoV-2 Virüsünü Ters Transkripsiyon Döngü Aracılı İzotermal Amplifikasyon ile Tespit Etme

Yaygın solunum yolu virüsleri için iki prob tabanlı kurum içi tek adımlı RT-qPCR kiti sunuyoruz. İlk test SARS-CoV-2 (N), İnfluenza A (H1N1 ve H3N2) ve İnfluenza B içindir. İkincisi SARS-Cov-2 (N) ve MERS (UpE ve ORF1a) içindir. Bu testler herhangi bir özel laboratuvarda başarıyla uygulanabilir.

SARS-CoV-2, Influenza A/B ve MERS-CoV'nin Tespiti için Multipleks Gerçek Zamanlı RT-qPCR Testlerinin Geliştirilmesi

Burada tarif ve hücresel sitotoksisitesi bileşiklerin hızlı ve doğru tarama için izin tek tur enfekte edebilirlik analizleri, kendi hücresel sitotoksisiteye (CC 50) tespit etmek ve WT ve ilaç dirençli HIV-1 karşı IC50 değerleri.

HIV ters transkriptaz ve integraz inhibitörleri hızlı taranması

Burada, bir proof-of-prensibi iki değerlikli adenovirüs tip 5 (Ad5) vektörü oluşturmak için bir protokol mevcut Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 Antijen Kapsid-Ortaklık stratejisi kullanılarak. Bu vektör nitel uygunluk arzettiği gösterilmiştir, yetenek dahil antijenlere Ad5-pozitif in vitro sera'yı ve antijenikliği yanı sıra immünojenitesini kaçmak için.

Adenovirüs Serotipinin 5-vektörlü Aşı Yaklaşımlar Geliştirme Antijen Kapsid-Ortaklık Stratejisi kullanmak

Burada, at solunum sıvılarında EHV-2 DNA'sının tespiti ve miktarının belirlenmesi için kullanılan kantitatif bir PCR yönteminin geliştirilmesi ve doğrulanması için bir protokol sunuyoruz. EHV-2 qRT-PCR doğrulama protokolü üç bölümden oluşan bir prosedür içerir: geliştirme, tek başına qRT-PCR testinin karakterizasyonu ve tüm analitik yöntemin karakterizasyonu.

Solunum Sıvılarda equid Herpes-2 Teşhis için bir Nicel PCR Yöntemi Geliştirilmesi ve Validasyonu

Nano ölçekli PCR ile DNA ve RNA bazlı patojenlerin yüksek verimlilik testi bir sendromik köpek ve at solunum PCR panelini kullanarak tarif edilir.

Nano PCR ile Hayvan Örnekler Solunum Patojenler yüksek verimlilik Algılama

Öğrenin, açık kaynak pipetleme robotları kullanarak SARS-CoV-2 için RT-qPCR tükürük teşhis yöntemini. Bu otomatik protokol, günlük binlerce test yaparak halk sağlığı izleme kapasitesini artırır.

Açık Kaynak Pipetleme Robotlarını Kullanan Verimli SARS-CoV-2 Kantitatif Ters Transkriptaz PCR Tükürük Teşhis Stratejisi

Daha fazla video keşfet