Yumuşak Madde Nanoindentasyonu için Deneysel ve Veri Analizi İş Akışı
18 Ocak 2022
Protokol, hidrojeller ve hücreler de dahil olmak üzere yumuşak malzeme nanogirinti deneyleri için eksiksiz bir iş akışı sunar. İlk olarak, kuvvet spektroskopisi verilerini elde etmek için deneysel adımlar detaylandırılmıştır; Daha sonra, bu tür verilerin analizi, GitHub'dan ücretsiz olarak indirilebilen yeni geliştirilen açık kaynaklı bir Python yazılımı aracılığıyla detaylandırılır.
Bu protokol, ticari olarak temin edilebilen bir nanoindenter kullanarak hidrojellerin ve hücrelerin sertliğini ölçmek için adım adım bir kılavuz gösterir ve ayrıca elde edilen verileri yeniden üretilebilir bir şekilde analiz etmek için açık kaynaklı bir yazılım sunar. Protokol, atomik kuvvet mikroskobu benzeri verileri, karmaşıklığın bir kısmında, elde etmemizi sağlar. Bu nedenle, bu protokol, sağlıklı ve hastalıklı örneklerin mekanik özelliklerini incelemek isteyen bilim adamları için yararlı olacaktır, ancak aynı zamanda yumuşak malzemeler için nanogirinti bağlamında daha geniş uygulanabilirliğe sahip olacağına inanıyoruz.
Cihazı açtıktan ve deney için seçilen probu monte ettikten sonra, probu kalibre etmeye başlayın. Ana yazılım penceresinde Başlat'a tıklayın. Görüntülenen Kalibrasyon Menüsü'nde, giriş kutularına prob ayrıntılarını girin.
Daha sonra, kalın, cam bir Petri kabını, numune kabıyla aynı ortama sahip düz bir tabanla doldurun ve ortamın sıcaklığını numuneninkiyle eşleştirin. Ardından, kalibrasyon kabını probun altına yerleştirin. Sıvıda kalibrasyon için, probu, pipetin ucu cam yüksükle hafif temas halinde% 70 etanol veya izopropanol damlasıyla, damla konsol ve küresel uç üzerinde kayacak şekilde önceden ıslatın.
Daha sonra, nanoindenter'ın kolunu, prob tamamen suya batırılana kadar, ancak Petri kabının dibinden hala uzakta olana kadar manuel olarak aşağı doğru kaydırın. Sıvıda denge koşullarına ulaşılabilmesi için beş dakika bekleyin. Ardından, yazılımın Başlat Menüsünde, Dalga Boyunu Tara'ya tıklayın.
İnterferometrenin ekranında bir ilerleme çubuğu gösterilir. İnterferometre kutusundaki Dalga Boyu Taraması paneline giderek optik taramanın başarılı olup olmadığını kontrol edin. Ardından, Başlat Menüsünde, probu aşamalı olarak azaltmak için Yüzeyi Bul'a tıklayın.
Prob, cam Petri kabına temas ettiğinde hareket etmeyi durdurur. Prob yüzeyle temas ettiğinde, ana yazılım penceresindeki y aşağı doğru ok düğmesini kullanarak probu bir mikrometre aşağı doğru hareket ettirin. Her bir mikrometrelik adımda taban çizgisindeki değişiklikler için canlı penceredeki yeşil sinyali gözlemleyin.
Ardından, Başlat Menüsü'nden Kalibre Et'i tıklatın. Kalibrasyon tamamlandığında, görüntülenen açılır pencerede eski ve yeni kalibrasyon faktörlerini kontrol edin. Yeni kalibrasyon faktörü, makalede açıklandığı gibi doğru aralıktaysa, Yeni Faktör Kullan'a tıklayın.
Ardından, piezo'yu 500 mikrometre yukarı doğru hareket ettirin. Ardından, interferometre masaüstündeki Demodülasyon sekmesine giderek demodülasyon çemberinin doğru şekilde kalibre edilip edilmediğini kontrol edin. Yeterli gürültüyü tetiklemek için optik masaya veya nanoindenter'a hafifçe dokunun.
Ayrık veri noktalarından oluşan beyaz bir daire, kırmızı daireyi yaklaşık olarak örtmelidir. Numuneyi içeren Petri kabını mikroskop aşamasına yükleyin ve nanoindenterin probunu numunenin üzerinde istenen bir konuma manuel olarak hareket ettirin. Probu çözelti içinde kaydırın, prob ile numunenin yüzeyi arasında bir ila iki milimetre bırakmaya dikkat edin.
Probun çözeltide dengelenmesi için beş dakika bekleyin. Optik mikroskopla proba odaklanın. Young'ın yumuşak malzeme modülünü ölçmek için, Deneyi Yapılandır'a tıklayın.
Daha sonra otomatik matris taraması için kullanılacak deneysel parametreleri belirlemek üzere yer değiştirme kontrolüne bir Yüzeyi Bul adımı ve tek bir girinti ekleyin. Tek girinti başarılı olursa, 10 ila 100 mikrometrede aralıklı 50 ila 100 nokta içeren bir matris taraması yapılandırın. Yüzeyi Otomatik Bul kutusunun işaretli olduğundan emin olduktan sonra, matris taramasını geçerli sahne alanı konumundan başlatmak için Sahne Alanı Konumunu Kullan'a tıklayın.
Yer değiştirme kontrolünde matris tarama profilini ayarlayın. Segment sayısını beşte bırakın ve varsayılan yer değiştirme profilini kullanın. Gerekirse, eğimli her segment için yer değiştirme profilini ve süresini değiştirin.
Saniyede 10 mikrometreden daha yüksek gerinim oranlarını aşmayın. Yapılandırılan denemeyi istenen deneme yoluna kaydedin. Denemeyi Çalıştır'a tıklayın ve tamamlanmasını bekleyin.
Tüm veriler alındığında, probu temizleyin ve cihazda açıklandığı gibi cihazı kapatın. Kuvvet-yer değiştirme eğrilerinin taranması ve temizlenmiş veri setinin JSON formatında üretilmesi için lansman hazırlığı. py, laboratuvar bilgisayarındaki komut satırından.
Açılır listeden Optics11 veri formatını seçin. Veriler doğru yüklenmezse, grafik kullanıcı arabirimini yeniden başlatın ve Optics11 Eski'yi seçin. Ardından, Klasörü Yükle'ye tıklayın ve analiz edilecek verileri içeren bir klasör seçin.
Grafik kullanıcı arabiriminin sağında bulunan sekmeleri kullanarak veri kümesini temizleyin. Ardından, JSON'u Kaydet'e tıklayın ve temizlenen veri kümesi için uygun bir ad girin. JSON dosyasını, geçerli bilgisayardan farklıysa, NanoAnalysis yazılımının yüklü olduğu bilgisayara gönderin.
Nano'yu başlatın. py dosyası komut satırından. Grafik kullanıcı arabiriminin sol üst köşesinde, Denemeyi Yükle'ye tıklayın ve JSON dosyasını seçin.
Bu, dosya listesini ve veri kümesini kuvvet-yer değiştirme eğrileri açısından gösteren ham eğriler grafiğini doldurur. İstatistikler kutusunda, üç parametrenin değerlerini işaretleyin: N etkin, N başarısız ve N hariç. Belirli bir eğriyi daha ayrıntılı olarak görselleştirmek için eğriye tıklayın.
Bu, yeşil renkte vurgulayacak ve geçerli eğri grafiğinde gösterecektir. Tek bir eğri seçildikten sonra, İstatistikler kutusunda R ve k parametreleri doldurulur. Veri kümesi daha fazla temizlendikten sonra, Filtreleme kutusunda uygulanan filtreleri kullanarak eğrilerdeki gürültüyü filtreleyin.
Ardından, geçerli eğri grafiğindeki filtrelenmiş eğrileri inceleyin. Filtrelenmiş eğri siyah, filtrelenmemiş versiyon ise yeşildir. Temas noktasını bulmak için, İletişim Noktası kutusundan, yazılımda uygulanmış olan bir dizi sayısal yordamdan birini seçin.
Algoritmanın parametrelerini, makalede açıklandığı gibi, temas noktasının doğru bir şekilde yerleştirilmesi için veri kümesine uyacak şekilde ayarlayın. Temas noktasının tek bir eğride nerede bulunduğunu görmek için, üzerine tıklayarak eğriyi seçin. Ardından, İncele'yi tıklatın.
İletişim noktasının nerede bulunduğunu belirlemek için görünen açılır pencereyi kontrol edin. Ardından, Hertz Analizi'ne tıklayın. Bu, üç grafik oluşturacaktır.
Veri kümesindeki her eğri için kuvvet girinti verilerini, kırmızı ile gösterilen ortalama Hertz uyumuyla birlikte kontrol edin. Ardından, bir standart sapma gösteren bir hata bandı ve kırmızı ile gösterilen ortalama Hertz uyumu ile birlikte ortalama kuvvet girinti eğrisini kontrol edin. Ardından, Young modülünün Hertz modelinin her bir eğriye uymasından kaynaklanan dağılım grafiğini kontrol edin.
Hesaplanan ortalama Young modülü ve standart sapması için Sonuçlar kutusunu inceleyin ve verilen deney için makul olduklarından emin olun. Ardından, Kaydet kutusunda, Hertz'e tıklayın. Açılır pencerede, dosya adını ve dizini girin ve Kaydet'e tıklayın.
Bir tsv dosyası oluşturulacaktır. İstatistiksel analiz ve daha fazla çizim için tsv dosyasını herhangi bir ek yazılımda açın. Hücre nanogirinti verileri için, Elastikiyet Spektrumu Analizi'ne tıklayın.
Üretilen iki grafiği, yani her eğri için girinti derinliğinin bir fonksiyonu olarak Young modülünü ve iki katmanlı bir modelin taktığı girinti fonksiyonu olarak ortalama Young modülünü inceleyin. Analiz tamamlandığında, Kaydet kutusundaki ES'ye tıklayın. Bu, belirtilen dizinde, tercih edilen başka herhangi bir yazılımda açılabilen ve çizilebilen bir tsv dosyasını dışa aktarır.
Başarılı bir deney, bir kuvvet yer değiştirme eğrisinin yaklaşım segmentinde, net, düz bir taban çizgisine, bir geçiş bölgesine ve eğimli bir bölgeye sahip olmasıyla sonuçlanır. Bu şekildeki değişiklikleri gösteren eğriler, NanoPrepare kullanılarak veri kümesinden kolayca kaldırılır. Yumuşak bir poliakrilamid hidrojel ve sert bir hidrojel için ortalama Hertz modeli ile birlikte ortalama kuvvet-girinti eğrileri burada gösterilmiştir.
Young modülünün bireysel değerleri çizilerek, her iki hidrojel için de beklenen ortalama Young modülü elde edildi. Hücre nanogirinti deneyleri için, ortalama kuvvet-girinti eğrisi ve buna karşılık gelen ortalama Hertz modeli, Hertz modelinin, hücre nanogirinti deneyleri için artan girinti derinliği ile kuvvetin evrimini tam olarak yakalamadığını göstermektedir. 200 nanometrelik bir girintiye kadar takılan ortalama elastikiyet spektrumları burada gösterilmiştir.
Ortalama elastikiyet spektrumları, 200 nanometrelik bir girinti derinliğinde artmaya başlar, bu da bir substratın sondalı görünür Young modülüne katkısını gösterir. Bu nedenle, hem Hertz hem de çift katmanlı model için uygun aralık olarak 200 nanometre seçildi. Çift katmanlı modelin takılması, ana metinde açıklandığı gibi, hücre aktin korteks kalınlığı, hücre aktin korteks modülü ve hücre yığın modülü de dahil olmak üzere hücrenin mekanik durumu hakkında daha fazla bilgi elde edilmesini sağlar.
Hertz modeli ile Young'ın modül dağılımı açısından elastikiyet spektrumu yaklaşımı arasındaki doğrudan bir karşılaştırma, elastisite spektrumu yaklaşımının fizibilitesini gösteren, karşılaştırılabilir araçlarla örtüşen dağılımları ortaya koymaktadır. Temas noktasını doğru bir şekilde konumlandırmak ve seçilen algoritma parametrelerini karşılaştırmak istediği veri kümeleri arasında tutarlı tutmak, numuneler arasında güvenilir karşılaştırmalar elde etmek için çok önemlidir. Yöntem, sferoidler, organoidler, dokular ve genel olarak tüm yumuşak maddeler dahil olmak üzere biyolojik örneklerin yerel elastik özelliklerini ölçmek için genel olarak uygulanabilirliktir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, hidrojeller ve hücreler gibi yumuşak malzemeler üzerinde nanoindentasyon deneyleri yürütmek için kapsamlı bir iş akışı sunar. Kuvvet spektroskopisi verilerini elde etme adımlarını ayrıntılı olarak açıklar ve veri analizi için açık kaynaklı bir Python yazılımını tanıtmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyofizik
- Malzeme Bilimi
Arka Plan
- Nanoindentasyon, malzemelerin mekanik özelliklerini ölçmek için kullanılan bir tekniktir.
- Hidrojeller ve hücreler biyolojik mekaniğin incelenmesi için önemlidir.
- Kuvvet spektroskopisi malzeme sertliği hakkında bilgiler sağlar.
- Açık kaynaklı yazılım veri analizinde tekrarlanabilirliği artırır.
Çalışmanın Amacı
- Hidrojellerin ve hücrelerin sertliğini doğru bir şekilde ölçmek.
- Kuvvet spektroskopisi verilerini elde etmek için basitleştirilmiş bir yöntem sunmak.
- Veri analizini açık kaynaklı araçlarla erişilebilir hale getirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Nanoindenter probunun kalibrasyonu.
- Malzeme sertliğinin adım adım ölçümü.
- Ticari olarak temin edilebilen bir nanoindenter kullanımı.
- Açık kaynaklı Python yazılımı kullanılarak veri analizi.
Ana Sonuçlar
- Yumuşak malzemelerin mekanik özelliklerinin başarılı ölçümü.
- Atomik kuvvet mikroskobisine benzer veri alımı.
- Geleneksel yöntemlere kıyasla karmaşıklığın azaltılması.
- Sağlıklı ve hastalıklı örneklerin incelenmesinde geniş uygulanabilirlik.
Sonuçlar
- Protokol, yumuşak malzemeler için nanoindentasyon sürecini basitleştirir.
- Açık kaynaklı yazılım, tekrarlanabilir veri analizini kolaylaştırır.
- Bu yöntem çeşitli alanlardaki araştırmacılar için faydalıdır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Nanoindentation enables quantitative assessment of local mechanical properties in hydrogels and cells, supporting target validation in mechanobiology and biomaterials design. The method provides predictive confidence by reducing ambiguity in material stiffness measurements, which is critical for preclinical model selection and lead identification. Its compatibility with soft matter systems facilitates translational biomarker discovery and disease-relevant system modeling.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through quantification of elastic modulus in disease-relevant hydrogels and cellular systems.
- Operational Value: Supports biological de-risking by providing reproducible, quantitative readouts of material stiffness for target validation workflows.
- Predictive Value: Enhances lead identification by enabling mechanical phenotyping of biomaterials and cells to prioritize candidates with desired biophysical profiles.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological and biomaterial systems for downstream screening by establishing baseline mechanical phenotypes.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through automated data filtering, contact point detection, and Hertz model fitting.
- Scalability: Enables high-throughput-like screening readiness via matrix scan configurations (50–100 points) and open-source software for batch analysis.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports progression from discovery to preclinical validation by enabling consistent mechanical phenotyping across hydrogels, cells, spheroids, and organoids.
- Risk-Adjusted Advancement: Facilitates go/no-go decisions by quantifying mechanical biomarkers that correlate with functional outcomes in disease models.
- Mechanistic De-risking: Elasticity spectra analysis extracts actin cortex and bulk modulus parameters, reducing uncertainty in cellular mechanical state interpretation.
Pipeline & Workflow Integration
The workflow integrates into early discovery for target validation, proceeds through screening for assay development, and supports translational research by enabling mechanical phenotyping across disease-relevant systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying stiffness changes in response to genetic or pharmacological perturbations.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized force-displacement curve acquisition, automated screening of invalid curves, and JSON-based data export for interoperability.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (Young’s modulus, elasticity spectra) enabling statistical comparison of conditions and lead ranking.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by enabling mechanical profiling of 3D models (spheroids, organoids) and tissue analogs.
- Enterprise Reuse: The open-source Python software (NanoPrepare, NanoAnalysis) establishes a reusable analytics platform across projects, reducing redundant tool development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduction of mechanistic ambiguity in mechanical property measurements.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via calibrated probe operation, automated data cleaning, and open-source analysis pipelines.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by enabling early mechanical de-risking of biomaterials and cellular models.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative mechanical phenotypes aligned with disease relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biomechanics, probe calibration, and force spectroscopy principles.
- Depends on commercially available nanoindenter hardware and compatible computing infrastructure for Python-based analysis.
- Necessitates cross-team standardization of calibration protocols, indentation parameters, and data filtering thresholds.
- Requires adaptation of probe geometry and indentation depth limits when transitioning between hydrogels, cells, and 3D models.
- Practical limitation: Hertz model assumptions may not fully capture cell mechanics, necessitating bilayer or elasticity spectra analysis for accurate interpretation.
