Hipokampus ve Prefrontal Kortekste Dendritik Omurga Görselleştirme için Hızlı Golgi Lekesi
3 Aralık 2021
Protokol, hipokampustaki nöronları ve sıçanın medial prefrontal korteksi boyamak için sinir sisteminin herhangi bir bölümüne uyarlanabilen hızlı Golgi yönteminin bir modifikasyonunu açıklar.
Nispeten basit olmasına rağmen, Golgi emprenye tekniğinin bazı zor adımları vardır ve bunları düzgün bir şekilde yapmamak, analiz için uygun olmayan hücrelerle sonuçlanır. Bu teknik, Golgi emprenye edilmiş nöronların hızlı, tekrarlanabilir etiketlenmesini sağlar. Ek olarak, ortalamanın küçük standart hatası, deneyler arasında karşılaştırmaya izin verir.
Bu tekniğin en zorlu kısmı kriyostat bölümlerini kesmektir, çünkü alışılmadık bir tutarlılık ve sabitleme vardır ve bu nedenle bunları slayt düzlüğüne sokmak biraz zordur. İlk olarak, önceden soğutulmuş bir kriyostat mandren üzerine az miktarda doku ortamı yerleştirin. Beyin bloklarını, bloğun bir tarafını eldivenli bir elde hafifçe çözerek ve doku ortamına yerleştirerek kriyostat kıkırdamalarına monte edin.
Bıçağın ve bloğun üzerine dondurucu bir sprey kullanın. Kesim sırasında bölümü düz tutmak için yuvarlanma önleyici plakayı veya fırçayı kullanın. Bir kriyostat üzerinde eksi 22 santigrat derecede 100 mikrometre kesitleri kesin.
Mümkünse, oda sıcaklığında bir slayt kullanarak montaj yapın ve hızlı bir şekilde bölüme ters koyun. Alternatif olarak, slaytları kriyostatta tutun, böylece donarlar. Bölümü soğuk forseps veya soğuk boya fırçası ile aktarın ve ardından montajı çözün.
Sübvansiyonlara üç ila dört koronal bölüm monte edin. Bıçağı dilimler arasında kağıt mendillerle temizleyin. Bıçak daha fazla temizlik gerektiriyorsa,% 100 etanol kullanın ve bir sonraki dilimi kesmeden önce kurutun.
Slaytları, çözeltinin bölümlere erişmesine izin verecek kadar uzağa yerleştirilmiş raflara yerleştirin. Bölümleri 10 dakika boyunca Golgi emprenye çözeltisine yerleştirmeden önce dört dakika boyunca iki kez damıtılmış suya yerleştirin. Bölümlere yalnızca bir kapak kayması yerleştirildiğinden emin olmak için kapak kaymalarını ayırın.
Slaytın üzerine cam kapak kayması yerleştirmeden önce cam slaytları bol miktarda montaj ortamıyla örtün. Kapak kaydıktan sonra, kuru slaytlar gözeneksiz herhangi bir kağıda üç ila beş gün boyunca işaretlenir, özellikle de yapışmayı önlemek için ilk günden sonra hafifçe hareket ettirilir. Daha sonra slaytları slayt tutuculara aktarın ve ideal olarak, incelemeden önce slaytları en az üç hafta kurutun.
Hem medial prefrontal korteksin hem de hipokampusun CA1 bölgesinin piramidal nöronlarındaki dendritik omurga yoğunluğunu analiz etmek için, görüntü analiz programında kullanarak dendritik uzunluğu ölçün. Bir el sayacı kullanarak dendritlerdeki dikenleri sayın ve hem uzunluk hem de diken sayısını kaydedin. Analiz için, emprenye edilirken hücre gövdeleri ve dendritleri olan nöronları ve sürekli ve bitişik hücrelerden ayırt edilebilen dendritleri seçin.
Şekil, hipokampusun CA1 bölgesindeki Golgi emprenye edilmiş hücrelerin örneklerini göstermektedir ve düşük ve yüksek güçte gösterilmiştir. Şekil, CA1 ve medial prefrontal kortekste çevresel zenginleştirmeden sonra ergen erkek ve dişi sıçanlarda piramidal hücreler üzerinde bazal dendritik omurga yoğunluğunun arttırıldığı bir deneyi göstermektedir. Kesim yaparken bölümleri yeterince soğuk tutmak zordur ve bunu yapmak için çok fazla dondurucu sprey kullanıyoruz.
Ve daha sonra, bölümleri slaytlara almak ve düz bir şekilde kurutmak zordur. Bu teknik nöroanatomik özellikleri incelemek için kullanılır. Tek başına veya diğer nöroanatomik izleme yöntemleriyle birlikte kullanılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, özellikle sıçanların hipokampus ve medial prefrontal korteksindeki nöronları boyamak için modifiye edilmiş hızlı bir Golgi yöntemini detaylandırmaktadır. Bu teknik, nöronların etkili bir şekilde etiketlenmesini sağlayarak nöroanatomik özelliklerin analizine olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Nöroanatomi
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Golgi emprenye tekniği, nöron boyama için yaygın olarak kullanılan yerleşik bir yöntemdir.
- Bu uygulamanın kullanımı, dendritik yapının ve diken yoğunluğunun incelenmesine olanak tanır.
- Yöntem, sinir sistemindeki çeşitli bölgelere uyarlanabilir.
- Doku kıvamı nedeniyle kriyostatlarda kesit alma sırasında zorluklar yaşanabilmektedir.
Çalışmanın Amacı
- Daha iyi nöronal etiketleme için mevcut Golgi yöntemini geliştirmek.
- Belirli beyin bölgelerindeki dendritik diken yoğunluğunu incelemek.
- Çevresel faktörlerin nöronal morfoloji üzerindeki etkilerini araştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Sıçan beyin dokularında hızlı Golgi impregnasyon tekniği.
- 100 mikrometrelik kriyostat kesitlerinin yüksek hassasiyetle alınması.
- Kesitlerin lamlara doğru şekilde yerleştirilmesi için çözdürme teknikleri.
- Etkili nöronal boyama için Golgi solüsyonunda inkübasyon.
- Analiz, görüntü analiz yazılımı kullanılarak dendrit uzunluğunun ölçülmesini ve dikenciklerin sayılmasını içerir.
Ana Sonuçlar
- Teknik, analiz için uygun olan nöronların tekrarlanabilir şekilde etiketlenmesiyle sonuçlanmıştır.
- Kanıtlar, çevresel zenginleştirme üzerine piramidal nöronlarda diken yoğunluğunun arttığını göstermiştir.
- Hem erkek hem de dişi ergen sıçanlarda bazal dendritik diken yoğunluğu değişimlerinin başarıyla tanımlandığı kaydedilmiştir.
Sonuçlar
- Bu çalışma, modifiye Golgi yönteminin nöroanatomik analiz için güvenilir bir yaklaşım olduğunu doğrulamaktadır.
- Dendritik diken yoğunluğuna ilişkin bulgular, nöronal plastisitenin anlaşılmasına katkıda bulunur.
- Gelecekteki uygulamalar, çevresel etkilerin beyin morfolojisi üzerindeki değerlendirmelerini içerebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Alanları
Bu hızlı Golgi boyama yöntemi, nöropsikiyatrik hastalık modelleriyle ilgili temel beyin bölgelerindeki dendritik diken yoğunluğunu görselleştirmek için tekrarlanabilir ve düşük değişkenlikli bir yaklaşım sunar. Hipokampus ve prefrontal korteksteki sinaptik yapıların tutarlı bir şekilde nicelleştirilmesine olanak tanıyan bu teknik, MSS ilaç keşif programlarında hedef doğrulamayı ve mekanistik risk azaltmayı destekler. Dondurulmuş doku saklama ile uyumluluğu ve deneyler arası minimum değişkenliği, boylemsel preklinik çalışmalar için analiz güvenilirliğini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Hastalıkla ilgili nöral devrelerdeki sinaptik plastisite ve dendritik morfolojiyle ilgili terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Deneyler arası güvenilir karşılaştırmalar için 10 µm dendrit başına standartlaştırılmış, kantitatif spine yoğunluğu ölçümleri sağlar.
- Öngörücü Değer: Yapısal nöroanatomiyi, çevresel zenginleştirme ve farmakolojik modellerdeki fonksiyonel sonuçlarla ilişkilendirerek biyolojik risklerin azaltılmasını destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Minimum arka plan kalıntısı ile tutarlı şekilde iyi boyanmış nöronlar üretir; böylece dendritik dikenlerin güvenilir şekilde görselleştirilmesini ve sayılmasını sağlar.
- Tekrarlanabilirlik: Deneyler arasında diken yoğunluğunda oldukça küçük sapmalar göstererek analiz hassasiyetini ve istatistiksel gücü destekler.
- Ölçeklenebilirlik: İşleme aşamasına kadar beyin dokusunun biriktirilmesine ve dondurularak saklanmasına olanak tanıyarak, keşif hatlarında toplu işlemeyi ve iş akışı verimliliğini kolaylaştırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlişkisi: Biliş, depresyon ve şizofreni modellerinde rol oynayan hipokampal ve prefrontal korteks bölgeleri için uygulanabilir.
- Translasyonel Süreklilik: Bileşiklerin nöronal yapı üzerindeki etkilerini değerlendirmek için biyobelirteç uyumlu bir okuma olan diken yoğunluğu analizine olanak tanır.
- Mekanistik Riskten Arındırma: Yapısal değişiklikleri (örneğin, zenginleştirme sonrası diken yoğunluğu artışları) fonksiyonel plastisite ile ilişlendirerek, MSS programlarındaki hedef güvenini destekler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, özellikle nöroplastisiteyi ve sinaptik bütünlüğü değerlendiren MSS odaklı programlar için, erken hedef doğrulamadan preklinik fenotipik taramaya kadar uzanan keşif sürekliliğine uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Sinaptik sağlık ve nöronal bağlantı için vekil göstergeler olan dendritik yapı ve diken yoğunluğu üzerine hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Yüksek içerikli analizler ve bileşik etkisi karşılaştırmaları için uygun, kantitatif ve tekrarlanabilir çıktılar (10 µm dendrit başına diken sayısı) sağlar.
- Analitik: Görüntü analizi ve manuel sayım kullanılarak farklı koşullar arasında diken yoğunluğunun istatistiksel olarak karşılaştırılmasına olanak tanır; düşük ortalama standart hatası veri güvenilirliğini artırır.
- Translasyonel Araştırma: Öğrenme ve bellek modellerindeki fonksiyonel sonuçlarla ilişkili yapısal okumalar sağlayarak preklinik doğrulama ile uyum sağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla beyin bölgesi ve hastalık modelinde uygulanabilen, standardize edilmiş ve yeniden kullanılabilir bir nöroanatomik platform teşkil eder.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Sinaptik plastisite değerlendirmelerindeki mekanistik belirsizliği azaltarak, hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Tutarlı empregnasyon, düşük arka plan ve minimum deneyler arası varyans sayesinde tekrarlanabilirliği ve standardizasyonu geliştirir.
- Stratejik Değer: Dendritik yapı üzerinde kanıtlanabilir etkilere sahip bileşiklere öncelik vermek için güvenilir nöroanatomik veriler sağlayarak, devam/dur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Bilişsel ve davranışsal uç noktalarla bağlantılı yapısal MSS biyobelirteçlerini nicelleştirerek, riske göre ayarlanmış ilerlemeyi mümkün kılar.
Uygulama Hususları
- -22°C'de kesim sırasında kesit düzlüğü ve bütünlüğünü korumak için kriyostat kesitleme ve doku işleme konusunda uzmanlık gerektirir.
- Lam transferi sırasında kesit hasarını önlemek için uygun çözdürme-montaj tekniklerine ve anti-roll plaka veya fırça kullanımına bağımlıdır.
- Tutarlı nöronal etiketleme sağlamak için standardize edilmiş boyama süresini (Golgi solüsyonunda 10 dk) ve montaj ortamı uygulamasını gerektirir.
- Görüntüleme öncesinde uzun kurutma süreleri (başlangıçta 3–5 gün, ardından ≥3 hafta) içerir ve planlı bir iş akışı çizelgesi gerektirir.
- Görüntü analiz araçları ve manuel sayıcılar kullanılarak doğru dendritik diken sayımı ve uzunluk ölçümü yapılması için eğitimli personele dayanır.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:48
Sectioning of Brain Tissues and Mounting
2:04
Staining and Dehydration of Brain Tissue
3:06
Determination of Dendritic Spine Density
3:48
Results: Observation of Hippocampus and Effect of Environmental Enrichment on CA1 and mPFC
4:23
Conclusion
