Name: Hipokampus ve Prefrontal Kortekste Dendritik Omurga Görselleştirme için Hızlı Golgi Lekesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 58 s
Description: Öğrenin, hipokampus ve prefrontal kortekste hızlı Golgi boyama yöntemiyle dendritik omurga görselleştirmesini. Bu teknik, nöronal plastisite ve sinaptik sağlık araştırmalarında güvenilir sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Sacred Heart Üniversitesi Lisans Araştırma GirişimiGrants tarafından desteklenmiştir.

Tüm deneysel prosedürler Sacred Heart Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır ve NIH Hayvanların Bakımı ve Kullanımı Kılavuzuna uygundur.
1. Beyin dokusunun izolasyonu ve infiltrasyonu
<ol><li>Golgi boyama kitinin A ve B ön karışım çözeltilerini kullanmadan 24 saat önce koyu renkli şişelerde ve/veya karanlıkta saklayın. 24 saat sonra çözeltiyi değiştirmek için yeterli olan yaklaşık 80 mL çözelti A ve B karışımı yapın. Hava geçirmez şişelerde saklayın. NOT: Salin veya paraformaldehit ile perfüzyon gerekli değildir.</li>
	<li>Sıçanları karbondioksit ötenazisini takiben giyotin ile kurban edin ve saniyeler içinde beyinleri çıkarın. Gerekirse beyinleri tuzlu suda durulayın, ancak gerekli değildir.<ol>
<li>Beyni, korteksi hipotalamusun görünür olması için aşağı yerleştirin, çünkü kesikler gözeneksiz bir yüzeyde ön ve arka kısımda yapılır. Şekil 1'de gösterildiği gibi bir anterior (prefrontal korteks içerir) ve posterior (hipokampus içerir) bloğuna bölünür.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Blokları A ve B'nin önceden karıştırılmış çözeltilerine yerleştirin ve çözeltiye iyice daldırıldıklarından emin olun. A ve B çözeltilerinin hacminin blokları batırmak için yeterli olduğundan emin olun. Blokları kahverengi şişelerde veya folyo kaplı şeffaf şişelerde (ışığı dışarıda tutmak için) oda sıcaklığında karanlıkta saklayın.</li>
	<li>Çözeltiyi 24 saat sonra değiştirin ve oda sıcaklığında 13 gün daha karanlıkta tutun. NOT: Fare beyinleriyle birlikte kullanılırsa, bloke etmeye gerek yoktur ve tüm beyin çözeltiye yerleştirilebilir. Büyüklükleri farklı olan beyin bölgelerinin boyanması durumunda, A ve B çözeltilerindeki sürenin deneme yanılma ile belirlenmesi gerekebilir.</li>
	<li>İki hafta sonra doku, A ve B çözeltileri ile iyice infiltre edilir, blokları kriyoprotektan çözeltiye (Golgi boyama kitindeki C çözeltisi) aktarın ve 4 ° C'de 48-72 saat bekletin. NOT: Kriyoproteksiyondan sonra, bloklar bir sonraki işleme kadar dondurulabilir. Ayrıca, kitten gelen tüm çözeltilerin toplandığını ve tehlikeli atık olarak bertaraf edildiğini unutmayın.</li>
	<li>Beyni dondurun, korteksi aşağı indirin, kuru buz üzerinde bir cam slayt üzerinde. Dondurulduktan sonra kriyostatı kesin veya bir kriyostat kullanarak kesitleyene kadar -80 ° C'de saklayın. NOT: Sıvı azotta dondurmayın, çünkü bu dokuda çatlaklara neden olur.</li>
</ol>2. Beyin dokularının bölümlenmesi
<ol><li>Önceden soğutulmuş bir kriyostat mandren üzerine az miktarda doku ortamı yerleştirin. Bloğun bir tarafını hafifçe elde çözerek (eldivenli) ve doku ortamına yerleştirerek kriyostatat kıkırdamaları üzerine bloklar monte edin. NOT: Dokunun gömülmesi gerekli değildir. Hipokampüsü içeren bloğun kesilmesi, prefrontal korteksli bloktan biraz daha kolaydır, çünkü ikincisi korpus kallozumun önündedir ve iki yarısı ayrıdır.</li>
	<li>Bir kriyostat üzerinde -22 °C'de 100 μm kesitler kesin ve alt yatak kızaklarına monte edin. 150 μm kalınlığa kadar olan bölümler kullanılabilir. Slayt başına 3-4 koronal bölüm monte etmeye çalışın, çünkü bu, işlenmesi gereken slaytların sayısını azaltır. Bölümleri slayta girene kadar donmuş halde tutmak için aşağıdaki tekniklerden birini kullanın. NOT: Bu bölümler her zamanki gibi sabitlenmemiştir ve bu nedenle hızlı bir şekilde erime eğilimindedirler. Bölümlerin slaytta erimesine izin verin. Slayta yerleştirilmeden önce erimeye başlarlarsa, slaytta düz olmalarını sağlamak mümkün değildir. Bunu yapmak için birkaç teknik vardır.<ol>
<li>Bıçağın ve bloğun üzerine dondurucu bir sprey kullanın. Odadaki sıcaklığa ve neme bağlı olarak, bu her bölüm için gerekli olabilir. Kesim sırasında bölümü düz tutmak için antiroll plaka veya fırça kullanın. NOT: Yeterli dondurucu sprey bulunduğundan emin olun. 20 blok kesilirken birkaç kutu kullanılabilir.</li>
		<li>Mümkünse, oda sıcaklığında bir slayt kullanarak dikin ve hızlı bir şekilde bölüme yerleştirin. Uygulamayla, aynı anda birkaç bölüm monte edilebilir. Bu işe yaramazsa, slaytları kriyostatta tutun, böylece çok soğuk olurlar ve bölümü soğuk forseps veya soğuk bir boya fırçası ile aktarın ve ardından montajı çözün.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bıçağı dilimler arasında kağıt mendillerle temizleyin. Bıçak daha fazla temizlik gerektiriyorsa,% 100 etanol (EtOH) kullanın ve bir sonraki dilimi kesmeden önce kurumasını bekleyin.</li>
	<li>Slayta monte edildikten sonra, slaytı düz bir şekilde karton slayt tepsilerine yerleştirin ve bölümlerin karanlıkta oda sıcaklığında (birkaç saat ila maksimum 48 saat) kurumasını bekleyin. Slayt tepsisini kapatmayın. Golgi emprenye işleminden önce bölümlerin tamamen kuru olduğundan emin olun. Karanlıkta, Golgi emprenye edene kadar düz bir şekilde slayt tepsilerinde saklayın. NOT: Bölümlerin kurutulması herhangi bir hasara neden olmaz.</li>
</ol>3. Beyin dokusunun boyanması ve dehidrasyonu
<ol><li>Cam boyama tabaklarında boyama yapın. D ve E çözeltilerini boyamadan hemen önce karıştırın. Protokole göre, D çözeltisinin bir parçasını, E çözeltisinin bir kısmını ve iki parça damıtılmış suyu ekleyin. Cam vitray tabaklar için, bölümleri tamamen suya batırmak için 200 mL'lik bir çözelti yapın. Koplin kavanozları için bu daha az hacim gerektirir.</li>
	<li>Slaytları, çözümlerin bölümlere erişmesine izin verecek kadar uzağa yerleştirilmiş raflara yerleştirin.</li>
	<li>Bölümleri 10 dakika boyunca Golgi emprenye boyama çözeltisine yerleştirmeden önce 4 dakika (2x) damıtılmış suya yerleştirin. Boyama solüsyonunu her 70 bölümde bir değiştirin. Damıtılmış suyu sarardığında değiştirin. NOT: Boyama adımının zamanlaması kritiktir. Çok kısa boyama yeterli boyamaya izin vermez ve çok uzun boyama nedenleri, analiz yaparken dendritlerin ayrılmasını zorlaştırır. Boyama çözeltisinden çıktıktan sonra zamanlama daha az kritiktir.</li>
	<li>Bölümleri aşağıdaki gibi kurutun:% 70 EtOH (5 dakika),% 95 EtOH (5 dakika; 2x),% 100 EtOH (5 dakika; 2x), temizleme maddesi (5 dakika; 3x). Bölümlerin susuz kalmasını sağlamak için tüm çözeltileri, özellikle %100 EtOH ve temizleme maddesini sık sık değiştirin. NOT: %50 EtOH adımından geçmek gerekli değildir. Hücre görselleştirmesi için karşı boyama gerekli değildir, çünkü Golgi emprenyesi yeterli kontrast sağlar. Diğer takas ajanlarının kullanımı, burada kullanılanlar kadar işe yaramadı (bkz.</li>
	<li>Bol miktarda montaj ortamına sahip 60 mm uzunluğunda cam kapaklı kapaklar. Mümkün olduğunca az hava kabarcığı olduğundan emin olun. Gerekirse, kapak fişini dikkatlice çıkarın ve tekrarlayın (haftalar sonra bile yapılabilir). Bölüme zarar vermemek için bunu çok yavaş yapın (çok miktarda montaj ortamı nedeniyle yapılabilir). NOT: Büyük miktarda montaj ortamı biraz dağınıktır, ancak yine de gereklidir, çünkü kalın 100 μm kesitleri örtmek için yeterli montaj ortamı kullanılmalıdır.</li>
	<li>Bölümlere yalnızca bir kapak fişi yerleştirildiğinden emin olmak için, işlemden önce kapak fişlerini ayırın.</li>
	<li>Kapak kaydıktan sonra, kuru slaytlar gözeneksiz herhangi bir kağıda 3-5 gün boyunca düz bir şekilde kayar ve yapışmayı önlemek için özellikle ilk günden sonra hafifçe hareket ettirir. 3-5 gün sonra slaytları slayt tutuculara aktarın ve ideal olarak slaytları incelemeden önce en az 3 hafta kuru bırakın. Hava kabarcıkları oluşma olasılığını azaltmak için slaytları düz tutun.</li>
</ol>4. Dendritik omurga yoğunluğunun belirlenmesi
<ol><li>Hipokampusun hem mPFC hem de CA1 bölgesinin piramidal nöronlarındaki dendritik omurga yoğunluğunun analizi için, adım 4.1.1'de açıklandığı gibi en lateral sekonder bazal dendritleri ve en lateral üçüncül apikal dendritleri inceleyin (Şekil 2).<ol>
<li>Bir dendrit seçin, bir görüntü analiz programı kullanarak dendritin uzunluğunu ölçün, bir el sayacı kullanarak dendritlerdeki dikenleri sayın ve dikenlerin hem uzunluğunu hem de sayısını kaydedin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beyin başına bölge başına altı hücreyi (mPFC, CA1) inceleyin ve analiz edin. Daha önce tarif edildiği gibi grup başına en az altı beyni sayısallaştırın 7,8. Analiz için aşağıdaki kriterleri karşılayan nöronları seçin: hücre gövdeleri ve dendritler iyi emprenye edilir; Dendritler bitişik hücrelerden ayırt edilebilir ve süreklidir.</li>
	<li>Işık mikroskobu ile elle sayarak dikenleri 1000x'te (yağ daldırma) sayın ve bir görüntü analiz programı kullanarak dendritik uzunluğu ölçün. Omurga sayısını dendritin uzunluğuna bölerek omurga yoğunluğunu hesaplayın ve verileri diken sayısı / 10 μm dendrit olarak ifade edin. NOT: Omurga alt tiplerini ve dendritik mimariyi ayırt etmek için kullanılabilecek çok daha karmaşık yöntemler vardır, ancak 1000x'te bir ışık mikroskobu ile elle sayma, daha sonra daha fazla araştırmanın gerekli olup olmadığını belirleyebilecek hızlı bir sonuç verebilir. Benzer dendritleri tutarlı bir şekilde örneklemek için her türlü çaba gösterilmesine rağmen, sayımı etkileyebilecek kalınlıkta farklılıklar vardır.</li>
</ol>

<ol><li>Pannese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Golgi+Stain%3A+invention%2C+diffusion+and+impact+on+neurosciences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+History+of+the+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The Golgi Stain: invention, diffusion and impact on neurosciences.</a> Journal of the History of the Neurosciences. 8 (2), 132-140 (1999).</li>
<li>Bentivoglio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Original+Histological+Slides+of+Camillo+Golgi+and+His+Discoveries+on+Neuronal+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">The Original Histological Slides of Camillo Golgi and His Discoveries on Neuronal Structure.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 13, 3(2019).</li>
<li>Swanson, L. W., Newman, E., Araque, A., Dubinsky, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSwanson%2C+LW+%22The+Beautiful+Brain%3A+The+Drawings+of+Santiago+Ramon+y+Cajal%22">The Beautiful Brain: The Drawings of Santiago Ramon y Cajal</a>. , Abrams. 208(2017).</li>
<li>Dall'Oglio, A., Ferme, D., Brusco, J., Moreira, J. E., Rasia-Filho, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%26%2334%3Bsingle-section%26%2334%3B+Golgi+method+adapted+for+formalin-fixed+human+brain+and+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The &#34;single-section&#34; Golgi method adapted for formalin-fixed human brain and light microscopy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 189 (1), 51-55 (2010).</li>
<li>Gabbott, P. L., Somogyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27single%27+section+Golgi-impregnation+procedure%3A+methodological+description%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The 'single' section Golgi-impregnation procedure: methodological description.</a> Journal of Neuroscience Methods. 11 (4), 221-230 (1984).</li>
<li>Gould, E., Frankfurt, M., Westlind-Danielsson, A., McEwen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+forebrain+astrocytes+are+sensitive+to+thyroid+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Developing forebrain astrocytes are sensitive to thyroid hormone.</a> Glia. 3 (4), 283-292 (1990).</li>
<li>Gould, E., Woolley, C. S., Frankfurt, M., McEwen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadal+steroids+regulate+dendritic+spine+density+in+hippocampal+pyramidal+cells+in+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gonadal steroids regulate dendritic spine density in hippocampal pyramidal cells in adulthood.</a> Journal of Neuroscience. 10 (4), 1286-1291 (1990).</li>
<li>Woolley, C. S., Gould, E., Frankfurt, M., McEwen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+fluctuation+in+dendritic+spine+density+on+adult+hippocampal+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring fluctuation in dendritic spine density on adult hippocampal pyramidal neurons.</a> Journal of Neuroscience. 10 (12), 4035-4039 (1990).</li>
<li>Frankfurt, M., Salas-Ramirez, K., Friedman, E., Luine, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine+alters+dendritic+spine+density+in+cortical+and+subcortical+brain+regions+of+the+postpartum+and+virgin+female+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Cocaine alters dendritic spine density in cortical and subcortical brain regions of the postpartum and virgin female rat.</a> Synapse. 65 (9), 955-961 (2011).</li>
<li>Frankfurt, M., Luine, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+role+of+dendritic+spines+and+memory%3A+Interaction%28s%29+with+estradiol%5BTitle%5D)+AND+%22Hormones+Behavior%22%5BJournal%5D)">The evolving role of dendritic spines and memory: Interaction(s) with estradiol.</a> Hormones Behavior. 74, 28-36 (2015).</li>
<li>Bowman, R. E., Luine, V., Khandaker, H., Villafane, J. J., Frankfurt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adolescent+bisphenol-A+exposure+decreases+dendritic+spine+density%3A+role+of+sex+and+age%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Adolescent bisphenol-A exposure decreases dendritic spine density: role of sex and age.</a> Synapse. 68 (11), 498-507 (2014).</li>
<li>Bowman, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol-A+exposure+during+adolescence+leads+to+enduring+alterations+in+cognition+and+dendritic+spine+density+in+adult+male+and+female+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Hormones+Behavior%22%5BJournal%5D)">Bisphenol-A exposure during adolescence leads to enduring alterations in cognition and dendritic spine density in adult male and female rats.</a> Hormones Behavior. 69, 89-97 (2015).</li>
<li>Eilam-Stock, T., Serrano, P., Frankfurt, M., Luine, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol-A+impairs+memory+and+reduces+dendritic+spine+density+in+adult+male+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Bisphenol-A impairs memory and reduces dendritic spine density in adult male rats.</a> Behavioral Neuroscience. 126 (1), 175-185 (2012).</li>
<li>Inagaki, T., Frankfurt, M., Luine, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen-induced+memory+enhancements+are+blocked+by+acute+bisphenol+A+in+adult+female+rats%3A+role+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Estrogen-induced memory enhancements are blocked by acute bisphenol A in adult female rats: role of dendritic spines.</a> Endocrinology. 153 (7), 3357-3367 (2012).</li>
<li>Jacome, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadal+Hormones+Rapidly+Enhance+Spatial+Memory+and+Increase+Hippocampal+Spine+Density+in+Male+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Gonadal Hormones Rapidly Enhance Spatial Memory and Increase Hippocampal Spine Density in Male Rats.</a> Endocrinology. 157 (4), 1357-1362 (2016).</li>
<li>Frankfurt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol-A%3A+a+plastic+manufacturing+compound+disrupts+critical+brain+structures+and+impairs+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Research+Features%22%5BJournal%5D)">Bisphenol-A: a plastic manufacturing compound disrupts critical brain structures and impairs memory.</a> Research Features. , https://researchfeatures.com/wp-content/uploads/2021/05/Maya-Frankfurt.pdf (2021).</li>
<li>Wallace, M., Luine, V., Arellanos, A., Frankfurt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovariectomized+rats+show+decreased+recognition+memory+and+spine+density+in+the+hippocampus+and+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Ovariectomized rats show decreased recognition memory and spine density in the hippocampus and prefrontal cortex.</a> Brain Research. 1126 (1), 176-182 (2006).</li>
<li>Wallace, M., Frankfurt, M., Arellanos, A., Inagaki, T., Luine, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+recognition+memory+and+decreased+prefrontal+cortex+spine+density+in+aged+female+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">Impaired recognition memory and decreased prefrontal cortex spine density in aged female rats.</a> Annals of the New York Academy of Science. 1097, 54-57 (2007).</li>
<li>Bowman, R. E., Hagedorn, J., Madden, E., Frankfurt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+adolescent+Bisphenol-A+exposure+on+memory+and+spine+density+in+ovariectomized+female+rats%3A+Adolescence+vs+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Hormones+Behavior%22%5BJournal%5D)">Effects of adolescent Bisphenol-A exposure on memory and spine density in ovariectomized female rats: Adolescence vs adulthood.</a> Hormones Behavior. 107, 26-34 (2019).</li>
<li>Novaes, L. S., Dos Santos, N. B., Perfetto, J. G., Goosens, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+enrichment+prevents+acute+restraint+stress-induced+anxiety-related+behavior+but+not+changes+in+basolateral+amygdala+spine+density%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Environmental enrichment prevents acute restraint stress-induced anxiety-related behavior but not changes in basolateral amygdala spine density.</a> Psychoneuroendocrinology. 98, 6-10 (2018).</li>
<li>Trzesniewski, J., Altmann, S., Jäger, L., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+Purkinje+cell+size+is+compatible+with+near+normal+morphology+and+function+of+the+cerebellar+cortex+in+a+mouse+model+of+spinocerebellar+ataxia%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Reduced Purkinje cell size is compatible with near normal morphology and function of the cerebellar cortex in a mouse model of spinocerebellar ataxia.</a> Experimental Neurology. 311, 205-212 (2019).</li>
<li>Zemmar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte-+and+Neuron-Specific+Nogo-A+Restrict+Dendritic+Branching+and+Spine+Density+in+the+Adult+Mouse+Motor+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte- and Neuron-Specific Nogo-A Restrict Dendritic Branching and Spine Density in the Adult Mouse Motor Cortex.</a> Cerebral Cortex. 28 (6), 2109-2117 (2018).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Mevcut protokol, birçok bölümün hızlı bir şekilde eşzamanlı olarak işlenmesini sağlayan bir Golgi emprenye yöntemini açıklamaktadır. Daha önce tarif edilen5 daha fazla emek yoğun yönteme göre bir gelişmedir ve analiz için sürekli olarak emprenye edilmiş nöronlar verir. Ek olarak, Golgi emprenyesinde kullanılan toksik kimyasallara daha az maruz kalınır. Sürecin en zorlu kısmı, bölümlerin slaytlarda düz olmasını sağlamaktır, bu da önemli bir uygulama gerektirir. Dondurucu sprey kullanımı ile her şey...

Nöronları etiketlemek için potasyum dikromat ve gümüş nitrat kullanma yöntemi ilk olarak Camillo Golgi 1,2 tarafından tanımlanmış ve daha sonra Santiago Ramon y Cajal tarafından nöronal ve glial alt tipleri farklılaştıran muazzam bir çalışma gövdesi üretmek için kullanılmıştır. İllüstrasyonlarıyla yakın zamanda yayınlanmış bir kitap şimdi mevcuttur3. Ramon y Cajal'ın 100 yıldan daha uzun bir süre önce yayınlanan çalışmalarını takiben, çok az Golgi emprenye kullanıldı. Golgi emprenyesi, nöronların ışık mikroskobu ile üç boyutlu olarak görselleştirilmesini sağlayan zahmetli bir süreçtir. Yöntemi daha kolay ve boyama işlemini daha tutarlı hale getirmek için yıllar içinde Golgi yönteminde çok sayıda değişiklikyapılmıştır 4. 1984 yılında Gabbott ve Somogyi5, daha hızlı işlemeye izin veren tek bölümlü Golgi emprenye prosedürünü tanımladı. Bu Golgi emprenye yöntemi,% 4 paraformaldehit ve% 1.5 pikrik asit ile perfüzyon, fiksasyon sonrası,% 3 potasyum dikromat banyosuna vibratom kesiti gerektirir. Bölümler cam slaytlara monte edilir, kapakların dört köşesi yapıştırılır, böylece gümüş nitrata daldırıldığında difüzyon kademeli olur. Kapaklar daha sonra atılır, bölümler kurutulur ve sonunda kapak montaj ortamı ile kalıcı olarak kaydırılır. Bu teknik, hipokampustaki nöronları ve glia 6,7,8'i etiketlemek için başarıyla kullanıldı. Burada açıklanan hızlı Golgi yöntemi bir gelişmedir, çünkü hem potasyum dikromat hem de gümüş nitrata çok daha az maruz kalınır ve paraformaldehit ve pikrik asit kullanılmaz. Ek olarak, Gabbott ve Somogyi5 yönteminin modifikasyonları kullanılarak emprenye edilen hücreler analiz edilebilse de, çoğu zaman bölümler dehidrasyon adımı sırasında slaytlardan aşırı veya az maruz kaldı veya düştü ve genel olarak, analiz için yeterli hücreye sahip olmak için birkaç deneyin bir araya getirilmesi gerekiyordu.
Mevcut protokol, hipokampustaki dendritleri ve dendritik dikenleri etiketlemek için Golgi boyama kitinin (bkz. malzeme tablosu) ve sıçanın medial prefrontal korteksinin (mPFC) kullanımını açıklamaktadır. Bu yöntemin öncekilere göre avantajları, hızlı olması, araştırmacı için zararlı kimyasallara daha az maruz kalması ve nöronların tutarlı bir şekilde boyanmasıdır. Aşağıda açıklanan protokol, 9,10,11,12,13,14,15 sayılı çalışmada sıçanın hipokampüsündeki ve mPFC'sindeki dendritik omurga yoğunluğunu değerlendirmek için küçük modifikasyonlarla kullanılmıştır.

<table><tbody><tr><td>Karton slayt tepsileri</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-587-10</td><td></td></tr><tr><td>Lameller 24 x 60mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-M</td><td></td></tr><tr><td>FD Rapid GolgiStain kiti</td><td>FD Neurotechnologies</td><td>PK 401</td><td>RT'de karanlıkta aylarca kararlı; Golgi boyama kiti</td></tr><tr><td>Dondurucu Sprey</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-022524</td><td></td></tr><tr><td>HISTO-CLEAR</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-899-90147</td><td>takas maddesi</td></tr><tr><td>NCSS Yazılımı</td><td>Kaysville, UT, ABD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP-15-100</td><td>montaj ortamı</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Mikroskop slaytları</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Doku Tek CTYO OCT Bileşik</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-65</td><td>Beyinleri kriyostat aynasına monte etmek için kullanılır</td></tr></tbody></table>

hipokampus ve prefrontal kortekste dendritik omurga görselleştirme için hızlı golgi lekesi

Rapid Golgi Stain for Dendritic Spine Visualization in Hippocampus and Prefrontal Cortex

Golgi emprenyesi, küçük adaptasyonlarla Golgi boyama kitini kullanarak, sıçan hipokampüsü ve medial prefrontal korteksteki dendritik dikenleri emprenye etmek için kullanılır. Bu teknik, önceki Golgi emprenye yöntemlerine göre belirgin bir gelişmedir, çünkü önceden karıştırılmış kimyasalların kullanımı daha güvenlidir, nöronlar sürekli olarak iyi emprenye edilir, çok daha az arka plan enkazı vardır ve belirli bir bölge için, deneyler arasında omurga yoğunluğunda son derece küçük sapmalar vardır. Dahası, beyinler belirli bir noktadan sonra biriktirilebilir ve bir sonraki işleme kadar dondurulmuş halde tutulabilir. Bu yöntemi kullanarak, ilgilenilen herhangi bir beyin bölgesi incelenebilir. Lekelendikten ve örtü kaydıktan sonra, dendritik omurga yoğunluğu, bir dendrit uzunluğu için diken sayısının sayılmasıyla belirlenir ve 10 μm dendrit başına omurga yoğunluğu olarak ifade edilir.

Hızlı Golgi yöntemini kullanarak, hücreler sürekli olarak iyi emprenye edilir, böylece analiz edilecek çok sayıda hücre vardır. Bu, deneylerin analiz için yeterli veriye sahip olması için bir araya getirilmesi gereken önceki yöntemlere göre belirgin bir gelişmedir. Bu nedenle, aynı anda daha fazla örnek işlenebilir ve beyinler işlenene kadar dondurulmuş olarak saklanabilir. Hipokampusun CA1 bölgesindeki Golgi emprenye edilmiş hücrelerin örnekleri Şekil 3'te düşük ve yüksek güçte gösterilmişt...

Protokol, hipokampustaki nöronları ve sıçanın medial prefrontal korteksi boyamak için sinir sisteminin herhangi bir bölümüne uyarlanabilen hızlı Golgi yönteminin bir modifikasyonunu açıklar.

Hipokampus ve Prefrontal Kortekste Dendritik Omurga Görselleştirme için Hızlı Golgi Lekesi

Golgi impregnation, using the Golgi staining kit with minor adaptations, is used to impregnate dendritic spines in the rat hippocampus and medial ...

Nispeten basit olmasına rağmen, Golgi emprenye tekniğinin bazı zor adımları vardır ve bunları düzgün bir şekilde yapmamak, analiz için uygun olmayan hücrelerle sonuçlanır. Bu teknik, Golgi emprenye edilmiş nöronların hızlı, tekrarlanabilir etiketlenmesini sağlar. Ek olarak, ortalamanın küçük standart hatası, deneyler arasında karşılaştırmaya izin verir.Bu tekniğin en zorlu kısmı kriyostat bölümlerini kesmektir, çünkü alışılmadık bir tutarlılık ve sabitleme vardır ve bu nedenle bunları slayt düzlüğüne sokmak biraz zordur. İlk olarak, önceden soğutulmuş bir kriyostat mandren üzerine az miktarda doku ortamı yerleştirin. Beyin bloklarını, bloğun bir tarafını eldivenli bir elde hafifçe çözerek ve doku ortamına yerleştirerek kriyostat kıkırdamalarına monte edin.Bıçağın ve bloğun üzerine dondurucu bir sprey kullanın. Kesim sırasında bölümü düz tutmak için yuvarlanma önleyici plakayı veya fırçayı kullanın. Bir kriyostat üzerinde eksi 22 santigrat derecede 100 mikrometre kesitleri kesin.Mümkünse, oda sıcaklığında bir slayt kullanarak montaj yapın ve hızlı bir şekilde bölüme ters koyun. Alternatif olarak, slaytları kriyostatta tutun, böylece donarlar. Bölümü soğuk forseps veya soğuk boya fırçası ile aktarın ve ardından montajı çözün.Sübvansiyonlara üç ila dört koronal bölüm monte edin. Bıçağı dilimler arasında kağıt mendillerle temizleyin. Bıçak daha fazla temizlik gerektiriyorsa,% 100 etanol kullanın ve bir sonraki dilimi kesmeden önce kurutun.Slaytları, çözeltinin bölümlere erişmesine izin verecek kadar uzağa yerleştirilmiş raflara yerleştirin. Bölümleri 10 dakika boyunca Golgi emprenye çözeltisine yerleştirmeden önce dört dakika boyunca iki kez damıtılmış suya yerleştirin. Bölümlere yalnızca bir kapak kayması yerleştirildiğinden emin olmak için kapak kaymalarını ayırın.Slaytın üzerine cam kapak kayması yerleştirmeden önce cam slaytları bol miktarda montaj ortamıyla örtün. Kapak kaydıktan sonra, kuru slaytlar gözeneksiz herhangi bir kağıda üç ila beş gün boyunca işaretlenir, özellikle de yapışmayı önlemek için ilk günden sonra hafifçe hareket ettirilir. Daha sonra slaytları slayt tutuculara aktarın ve ideal olarak, incelemeden önce slaytları en az üç hafta kurutun.Hem medial prefrontal korteksin hem de hipokampusun CA1 bölgesinin piramidal nöronlarındaki dendritik omurga yoğunluğunu analiz etmek için, görüntü analiz programında kullanarak dendritik uzunluğu ölçün. Bir el sayacı kullanarak dendritlerdeki dikenleri sayın ve hem uzunluk hem de diken sayısını kaydedin. Analiz için, emprenye edilirken hücre gövdeleri ve dendritleri olan nöronları ve sürekli ve bitişik hücrelerden ayırt edilebilen dendritleri seçin.Şekil, hipokampusun CA1 bölgesindeki Golgi emprenye edilmiş hücrelerin örneklerini göstermektedir ve düşük ve yüksek güçte gösterilmiştir. Şekil, CA1 ve medial prefrontal kortekste çevresel zenginleştirmeden sonra ergen erkek ve dişi sıçanlarda piramidal hücreler üzerinde bazal dendritik omurga yoğunluğunun arttırıldığı bir deneyi göstermektedir. Kesim yaparken bölümleri yeterince soğuk tutmak zordur ve bunu yapmak için çok fazla dondurucu sprey kullanıyoruz.Ve daha sonra, bölümleri slaytlara almak ve düz bir şekilde kurutmak zordur. Bu teknik nöroanatomik özellikleri incelemek için kullanılır. Tek başına veya diğer nöroanatomik izleme yöntemleriyle birlikte kullanılabilir.

rapid-golgi-stain-for-dendritic-spine-visualization-hippocampus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Sıkı bağlamak, Yeşil Floresan Protein (GFP) etiketli kültür hücreleri proteinlerin hareketliliği ölçmek için kullanılır olmuştur. Biz photobleaching sonra floresan kurtarma yüzdesi analiz ederek, GFP mobil / hareketsiz kesirler inceledi. Bu çalışmada, sıkı bağlamak hipokampal nöronlar, dikenler yapıldı.

Kültür Hipokampal Nöronlar Dendritik Spine Floresan Takip edilen Proteinler Photobleaching sonra Floresan Kurtarma (sıkı bağlamak)

Çok sayıda yeni çalışmalar sinaptik proteinlerin beyin patolojileri ile ilişkili mutasyonlar belirledik. Primer kültür kortikal nöronların dendritik omurga morfoloji ve motilite bu hastalıkla ilişkili proteinlerin etkilerini inceleyen büyük esneklik sunar.

Kültür MSS Nöronlar Dendritik Omurga Morfoloji Analizi

Kaynak: McLeod, F.,  et al. Hipokampal Kemirgen Beyin Dilimlerinde Sinaps Yoğunluğunun Değerlendirilmesi. J. Vis. Uzm. (2017). Bu video, konfokal immünofloresan analizi kullanarak hipokampal beyin dilimlerinde sinaptik belirteçleri görselleştirmek için bir yöntemi göstermektedir. Dilimler, presinaptik ve postsinaptik belirteçleri hedef alan primer antikorlarla immün boyanır, ardından florofor konjuge sekonder antikorlar gelir. Etiketli belirteçler daha sonra sinaptik mimariyi kolokalizasyonları...

İmmünofloresan Kullanılarak Fare Hipokampal Dilimlerinde Sinapsların Mikroskobik Analizi

Proteinlerin lokalizasyonu ve dağıtım onların hücresel fonksiyonları anlamak için önemli bilgiler sağlar. Elektron mikroskobu üstün çözünürlük uzaysal (EM), belirli bir antijen aşağıdaki immünohistokimya hücre içi lokalizasyonu belirlemek için kullanılabilir. Sürdürmek antijenite EM araştırmalarda özellikle zor olmuştur süre yapısal bütünlüğünü koruyarak merkezi sinir sistemi (MSS), dokular için. Burada, çalışma MSS yapılar ve antijenleri korumak ve sıçan hipokampal CA1 piramidal nöronlarda...

Hipokampal Dilim Kültürleri Synaptic Proteinler Post-gömme immunogold Etiketleme

Bu kağıt sıçan yavrularının dokunsal uyarım ve nöronal morfoloji sonraki Golgi-Cox boyama işlemleri anlatılmaktadır. Dokunsal uyarım bir ev silgi ile yavrular okşayarak tarafından perinatal dönemde uygulanır olumlu bir deneyim olduğunu. Golgi-cox boyama tüm nöronların görüntülenmesine olanak güvenilir bir işlemdir.

Golgi-Cox Boyama ile dendritik morfoloji ve sinaptik bağlantı üzerinde olumlu bir Erken Deneyimi, Tactile uyarılması Etkileri, görselleştirme

Bu makale Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskobu (SIM) kullanılarak in vitro hipokampalinden görüntü dendritik dikenler bir çalışma protokolünü açıklar. SIM kullanarak süper çözünürlüklü mikroskopi geliştirilmiş detaylar bireysel dendritik dikenler görüntüleme sağlayan, önemli ölçüde her üç boyutta ışık kırınım sınırı aşan görüntü çözünürlüğü sağlar.

Yapısal Aydınlatma Mikroskobu kullanılarak Rat İlköğretim hipokampalinden Dentritik Spine görüntüleme

Fare modellerinin hipokampusunda dendritik arborizasyonun görselleştirilmesi ve ölçülmesi için iki yöntem açıklıyoruz: gerçek zamanlı ve genişletilmiş alan derinliği görüntüleme. İlk yöntem, karmaşık topografik izlemeye ve dallanma derecesinin ölçülmesine izin verirken, ikincisi dendritik ağacın hızlı bir şekilde görselleştirilmesine izin verir.

Farelerde Hipokampal Bölgesi Dentate Gyrus dendritik arborization Değerlendirilmesi

Biz bir doku örnekleri içinde bulunan uzun dendritik ağaçlar nöronlar görselleştirmek amacıyla, kalın beyin bölümlerinde, Golgi-Cox boyama yöntemi kullanılarak bir protokol mevcut. Bu protokolün iki varyantları da cresyl menekşe karşıtboyama ve uzun süreli depolama için işlenmemiş beyinleri dondurulmasını içerdiğini sunulmaktadır.

Golgi-Cox Yöntemiyle Kalın Beyin Bölümler içinde Görüntüleme Nöronlar

Burada ayrıntılı bir Golgi-Cox protokolünü sunuyoruz. Bu güvenilir doku lekesi metodu, minimal sorun giderme ile hipokampustaki ve tüm beyindeki sitolojik mimarinin yüksek kaliteli bir değerlendirmesini sağlar.

Yaşlı Bir Farede Hipokampal Dendritik Karmaşıklığın Golgi-Cox Yöntemi ile Değerlendirilmesi

Murine hipokampustaki dendritik dikenleri görüntülemek ve analiz etmek için Seri Blok-Yüz Tarama Elektron Mikroskopisi (SBEM) uygulanır.

Dendritik Dikenlerin Çalışması için Seri Blok-Yüz Tarama Elektron Mikroskopisi (SBEM)

Öğrenin, hipokampus ve prefrontal kortekste hızlı Golgi boyama yöntemiyle dendritik omurga görselleştirmesini. Bu teknik, nöronal plastisite ve sinaptik sağlık araştırmalarında güvenilir sonuçlar sağlar.

Hipokampus ve Prefrontal Kortekste Dendritik Omurga Görselleştirme için Hızlı Golgi Lekesi

Daha fazla video keşfet