Name: İn vivo Kombine İki Foton Floresan ve Stimüle Raman Saçılma Mikroskobu ile Biyolojik Dokuların Görüntülenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Keşfedin canlı fare omuriliğindeki hücresel yapıları görüntülemek için uyarılmış Raman saçılma ve iki foton floresan mikroskobinin birleştirilmiş kullanımını. Bu çift modlu yaklaşım, nörodejeneratif hastalıkları ve omurilik yaralanmalarını incelemek için kritik biyokimyasal ve biyofiziksel bilgiler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Hong Kong Araştırma Hibeleri Konseyi tarafından 16103215, 16148816, 16102518 16102920, T13-607/12R, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6001-19E, N_HKUST603/19, İnovasyon ve Teknoloji Komisyonu (ITCPD/17-9), Üniversite Hibeleri Komitesi Mükemmellik Programı Alanı (AoE/M-604/16, AOE/M-09/12) ve Hong Kong Bilim ve Teknoloji Üniversitesi (HKUST) tarafından RPC10EG33 hibesi yoluyla desteklenmiştir.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur ve rekabet eden finansal çıkarları yoktur.

Bu protokolde, TPEF-SRS mikroskobunun temel kurulumu ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. SRS görüntüleme için, pompa ve Stokes kirişleri OPO'nun içinde geçici ve uzamsal olarak üst üste biner. Bununla birlikte, bu örtüşme mikroskop sisteminden geçtikten sonra bozulabilir. Bu nedenle, pompanın ve Stokes ışınlarının kolokalizasyonunun hem mekansal hem de zamansal optimizasyonu, optimum SRS görüntülemeyi elde etmek için gerekli ve kritiktir. Pompa ve Stokes ışını arasındaki zamansal gecikme, mikroskop sistemindeki optik elema...

Raman mikroskobu1,2, biyomoleküllerdeki çeşitli kimyasal bağların karakteristik frekanslarına dayanarak biyolojik dokuları görüntülemek için güçlü bir etiketsiz yöntem olarak ortaya çıkmaktadır. Non-invaziv ve iyi uyarlanabilir görüntüleme kabiliyeti sayesinde Raman mikroskopisi, miyelin kılıfı3,4,5, adipositler6,7 ve lipit damlacıkları gibi biyolojik dokulardaki lipitle zenginleştirilmiş bileşenleri görüntülemek için yaygın olarak kullanılmaktadır8,9,10 . Uyarılmış Raman kazancı (SRG) veya uyarılmış Raman kaybı (SRL) olarak elde edilen uyarılmış Raman saçılması (SRS) sinyali arka plansızdır ve spontan Raman saçılmasına mükemmel spektral benzerlik gösterir11,12. Ek olarak, SRL ve SRG, analit konsantrasyonuna doğrusal olarak bağımlıdır ve biyokimyasal bileşenlerin kantitatif analizine izin verir9,11,13. İki foton uyarılmış floresan mikroskobu (TPEF), doğal optik kesitleme yeteneği, derin penetrasyon derinliği ve düşük fototoksisitesi nedeniyle in vivo biyolojik görüntüleme için yaygın olarak kullanılmaktadır14,15,16. Bununla birlikte, TPEF görüntülemenin performansı floresan etiketlerin özelliklerine bağlıdır ve geniş bant floresan spektrumları nedeniyle çözülebilir renklerin sayısı sınırlıdır8,17,18,19. Etiketsiz SRS görüntüleme ve floresan bazlı TPEF görüntüleme iki tamamlayıcı görüntüleme yöntemidir ve bunların kombinasyonu dokuların bol miktarda biyofiziksel ve biyokimyasal bilgisini sağlayabilir. Bu iki görüntüleme yönteminin her ikisi de, tek bir mikroskop sistemine basit entegrasyona izin veren doğrusal olmayan optik (NLO) işlemlere dayanmaktadır. SRS ve TPEF görüntülemenin kombinasyonu, sözde çift modal görüntüleme, hücrelerin ve dokuların yüksek boyutlu görüntülenmesini ve profillenmesini sağlayarak karmaşık biyolojik sistemlerin kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını kolaylaştırır. Spesifik olarak, pikosaniye (ps) SRS mikroskopisi, femtosaniye (fs) SRS tekniğine11 kıyasla yüksek spektral çözünürlükte kimyasal bağ görüntülemesi elde edebilir ve biyolojik dokuda, özellikle kalabalık parmak izi bölgesinde20,21 çoklu biyokimyasal bileşenleri ayırt etmeyi sağlar. Ek olarak, tutarlı anti-Stokes saçılma (CARS) mikroskobunun entegrasyonu ile yaygın olarak kullanılan bir başka çift modlu NLO mikroskop sistemi ile karşılaştırıldığında, SRS, spektral ve görüntü yorumlamanın yanı sıra algılama hassasiyeti açısından CARS'a üstün performans göstermektedir11. SRS-TPEF mikroskobu, Caenorhabditis elegans9,22, Xenopus laevis kurbağa yavrusu beyni5, fare beyni23,24, omurilik25,26, periferik sinir27 ve yağ dokusu7 gibi çeşitli biyolojik sistemleri incelemek için güçlü bir araç olarak kullanılmıştır.
Omurilik, beyin ile birlikte merkezi sinir sistemini (CNS) oluşturur. Fizyolojik ve patolojik koşullar altında CNS'deki hücresel aktiviteleri in vivo olarak görselleştirmek, CNS bozukluklarının mekanizmalarını anlamak için kritik öneme sahiptir28,29,30 ve buna karşılık gelen tedavilerin geliştirilmesi31,32,33. Yüksek hızlı aksiyon potansiyeli iletimi için aksonları saran ve yalıtan miyelin kılıf, CNS'nin gelişiminde önemli bir rol oynar. Demiyelinasyon, multipl skleroz gibi beyaz cevher bozukluklarında bir ayırt edici özellik olarak düşünülmektedir34. Ek olarak, omurilik yaralanmasından35 sonra, miyelin kalıntıları makrofaj aktivasyonunu modüle ederek kronik inflamasyona ve ikincil yaralanmaya katkıda bulunabilir36. Bu nedenle, canlı fare modellerinde nöronlar ve glial hücrelerle birlikte miyelin kılıfın in vivo görüntülenmesi, CNS bozukluklarındaki dinamik süreçleri anlamada büyük yardımcı olmaktadır.
Bu protokolde, ev yapımı bir TPEF-SRS mikroskobunun temel kurulum prosedürleri tanımlanmış ve fare omuriliği için çift modlu in vivo görüntüleme yöntemleri tanıtılmıştır.

<table><tbody><tr><td>#2 Forseps</td><td>Dumont</td><td>11223-20</td><td>Laminektomi için</td></tr><tr><td>10X objektif</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo Lambda 10X</td><td></td></tr><tr><td>25X objektif</td><td>Olympus</td><td>XLPLN25XSVMP2</td><td></td></tr><tr><td>Yanık kremi</td><td>Betadine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fotoğraf Makinesi</td><td>Sony</td> <td>& alpha; 6300</td><td></td></tr><tr><td>Akım amplifikatörü</td><td>Stanford araştırması</td><td>SR570</td><td></td></tr><tr><td>Akım fotoçoğaltıcı modüller</td><td>Hamamatsu</td><td>H11461-01</td><td></td></tr><tr><td>D2 665 nm uzun geçişli dikroik ayna</td><td>Semrock</td><td>FF665-Di02-25x36</td><td>Epi-floresan sinyalini algılama modülüne yönlendirmek için</td></tr><tr><td>D3 700 nm kısa geçişli dikroik ayna</td><td>Edmund</td><td>69-206</td><td>SRS'yi ayırmak için TPEF algılama yolu</td></tr><tr><td>Epilasyon kremi</td><td>Veet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FS1 975 nm kısa geçiren filtre</td><td>Edmund</td><td>86-108</td><td>Stokes kirişini engellemek için</td></tr><tr><td>FS1 Bant geçiren filtre</td><td>Semrock</td><td>FF01-850/310</td><td>Stokes kirişini engellemek için</td></tr><tr><td>Fs2 Bant geçiren filtre</td><td>Semrock</td><td>FF01-525/50</td><td>YFP sinyalini seçmek için</td></tr><tr><td>Fs2 Kısa geçiren filtre</td><td>Semrock</td><td>FF01-715/SP-25</td><td>Fs uyarma lazer ışınını engellemek için</td></tr><tr><td>Yarım dalga plakası</td><td>Thorlabs</td><td>SAHWP05M-1700</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek hızlı fotodedektör</td><td>MenloSystems</td><td>FPD 310-F</td><td>Stokes ışın modülasyonunu kontrol etmek için</td></tr><tr><td>İyot</td><td>Betadine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IR Kapsamı</td><td>FJW</td><td>FIND-R-SCOPE Kızılötesi Görüntüleyici 2X Kit Modeli 84499C2X</td><td></td></tr><tr><td>İris</td><td>Thorlabs</td><td>CPA1</td><td></td></tr><tr><td>L1</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-060-B-ML</td><td></td></tr><tr><td>L10</td><td>Thorlabs</td><td>LA4052-A</td><td></td></tr><tr><td>L2</td><td>Thorlabs</td><td>LA1422-B</td><td></td></tr><tr><td>L3</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-050-B</td><td></td></tr><tr><td>L4</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-060-B-ML</td><td></td></tr><tr><td>L7</td><td></td><td></td><td>f=100 mm, AB kaplama</td></tr><tr><td>L8</td><td>Thorlabs</td><td>LA4874-A</td><td></td></tr><tr><td>L9</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-035-B-ML</td><td></td></tr><tr><td>Kilitli amplifikatör</td><td>APE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ayna</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td><td></td></tr><tr><td>Motorlu palet</td><td>Thorlabs</td><td>MFF101/M</td><td></td></tr><tr><td>çok işlevli satın alma kartı</td><td>Ulusal Enstrüman</td><td>PCIe-6363</td><td></td></tr><tr><td>Osiloskop</td><td>Tektronix</td><td>TDS2012C</td><td></td></tr><tr><td>Fotodiyot</td><td>APE</td><td></td><td>SRS sinyalini algılamak için</td></tr><tr><td>Pikosaniye lazer kaynağı</td><td>APE</td><td>picoEmerald</td><td></td></tr><tr><td>Polarize ışın ayırıcı</td><td>Thorlabs</td><td>CCM1-PBS252/M</td><td></td></tr><tr><td>Güç ölçer</td><td>Newport</td><td>843-R Tuzlu</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tarama lensi L5</td><td>Thorlabs</td><td>SL50-CLS2</td><td></td></tr><tr><td>Tarama aynası</td><td>Cambridge Technology</td><td>6215H</td><td></td></tr><tr><td>Silikon jel</td><td>World Precision Inc.</td><td>KWIK-SIL</td><td></td></tr><tr><td>Ti: safir fs lazer</td><td>Tutarlı</td><td>Bukalemun Ultra II</td><td></td></tr><tr><td>Tüp lens L6</td><td>Thorlabs</td><td>TTL200-S8</td><td></td></tr></tbody></table>

İn vivo kombine İki foton floresan ve stimüle raman saçılma mikroskobu ile biyolojik dokuların görüntülenmesi

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Uyarılmış Raman saçılması (SRS) mikroskopisi, biyolojik dokuların doğal mikro ortamında içsel moleküler titreşime dayalı etiketsiz görüntülenmesini sağlar, böylece hücresel altı çözünürlükte biyolojik süreçlerin in vivo çalışması için mükemmel bir araç sağlar. İki foton uyarılmış floresan (TPEF) görüntülemeyi SRS mikroskobuna entegre ederek, dokuların çift modal in vivo görüntülemesi, hücresel metabolizma, bağışıklık tepkisi ve doku yeniden şekillenmesinde yer alan dinamik süreçleri anlamaya yardımcı olan çoklu perspektiflerden kritik biyokimyasal ve biyofiziksel bilgiler elde edebilir. Bu video protokolünde, bir TPEF-SRS mikroskop sisteminin kurulması ve hayvan omuriliğinin in vivo görüntüleme yöntemi tanıtılmaktadır. Omurilik, merkezi sinir sisteminin bir parçası olarak, beyin ve periferik sinir sistemi arasındaki iletişimde kritik bir rol oynar. Fosfolipitlerde bol miktarda bulunan miyelin kılıfı, aksiyon potansiyellerinin tuzlayıcı iletimine izin vermek için aksonu çevreler ve yalıtır. Omurilikteki miyelin kılıfların in vivo görüntülenmesi, nörodejeneratif hastalıkların ve omurilik hasarının ilerlemesini incelemek için önemlidir. Protokol ayrıca hayvan hazırlama ve yüksek çözünürlüklü biyolojik görüntüler elde etmek için in vivo TPEF-SRS görüntüleme yöntemlerini de tanımlamaktadır.

Spinal aksonların ve miyelin kılıflarının in vivo dual-modal görüntülemesi, dorsal kök gangliyon afferent nöronlarında EYFP'yi eksprese eden Thy1-YFPH transgenik fareler kullanılarak gerçekleştirilir (Şekil 3). Bu etiketli afferent nöronlar, duyusal bilgiyi periferik sinirden omuriliğe iletir, merkezi dal omurilik dorsal kolonunda bulunur. TPEF-SRS mikroskobu ile, yoğun olarak dağılmış miyelin kılıfı, etiketsiz SRS görüntüleme kullanılarak net bir şekilde görselleştirilebilir ve TPE...

Uyarılmış Raman saçılması (SRS) mikroskopisi, biyomoleküllerin spesifik kimyasal bağların içsel titreşimine dayanarak etiketsiz görüntülenmesini sağlar. Bu protokolde, canlı farelerin omuriliğindeki hücresel yapıları görselleştirmek için entegre bir SRS ve iki fotonlu floresan mikroskobun enstrümantal kurulumu açıklanmaktadır.

İn vivo Kombine İki Foton Floresan ve Stimüle Raman Saçılma Mikroskobu ile Biyolojik Dokuların Görüntülenmesi

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

Hücre altı çözünürlük ve kimyasal özgüllük ile biyolojik dokuların in Vivo görüntülenmesi, hücresel metabolizma, bağışıklık tepkisi ve doku yeniden şekillenmesinde yer alan dinamik süreçleri anlamak için güçlü bir araçtır. Kombine iki foton floresansı ve uyarılmış Raman saçılma mikroskobu ile, biyolojik dokuların kritik biyokimyasal ve biyofiziksel bilgileri, hücre altı çözünürlükle çoklu perspektiflerden elde edilebilir. Spesifik olarak, bu çift modlu mikroskopi, nörodejeneratif hastalıkların ve omurilik yaralanmasının ilerlemesini incelemek için fare omuriliğindeki hücresel dinamikleri ve etkileşimleri görüntülemek için kullanılabilir.Başlamak için, tuş düğmesini bekleme modundan açık konuma getirerek titanyum safir lazeri açın ve lazerin ısınması için 30 dakika bekleyin. Ardından, OPO kontrol panelindeki başlat düğmesine tıklayarak OPO'yu açın ve lazerin ısınması için 20 dakika bekleyin. Pikosaniye lazer ısındıktan sonra, Stokes ışınının gücünü yaklaşık 20 miliwatt'a düşürerek, Stokes ışını için lazer deklanşörünü açarak ve ışını algılamak için OPO çıkışına yüksek hızlı bir fotoğraf dedektörü yerleştirerek Stokes ışınının modülasyon derinliğini kontrol edin.Ardından, lazer darbesini izlemek için BNC konektörlü bir koaksiyel kablo kullanarak fotodetektörün çıkış portunu bir osiloskopun giriş portuna bağlayın. Ardından OPO kontrol yazılımında EOM kontrol penceresini açın ve 20 megahertz'de maksimum modülasyon derinliği elde etmek için EOM gücünü ve fazını osiloskopta gösterilen darbe yoğunluğu diyagramına göre ayarlayın. OPO kontrol yazılımında, Stokes çıkışını durdururken pompa lazer deklanşörünü açın.Ardından, pompa ışınının dalga boyunu 796 nanometreye ayarlamak için sinyal kutusunu ayarlayın, ardından OPO güç kutusunu ayarlayın ve gücünü optik hizalama için minimuma ayarlamak üzere 20 girin. Daha sonra, P1 hizalama plakasını polarize edici ışın ayırıcının arkasına yaklaşık 10 santimetreye yerleştirin ve P2 plakasını optik yolda yaklaşık 30 santimetrede P1'in arkasına yerleştirin. Pikosaniye lazer ışını için mikroskop deklanşörünü açtıktan sonra, P1'in içinden geçen delikteki pikosaniye lazer ışını merkezini bulmak için ayna M1'i ayarlayın. M1 aynasını ayarlarken P1'deki ışın noktasının konumunu gözlemlemek için kızılötesi bir kapsam kullanın. Benzer şekilde, P2'nin geçiş deliğindeki pikosaniye lazer ışını merkezini bulmak için ayna M2'yi ayarlayın. M2 aynasını ayarlarken P2'deki ışın noktasının konumunu gözlemlemek için kızılötesi kapsamı kullanın. Pikosaniye ışın merkezi her iki hizalama plakasının içinden geçen deliğe yerleşene kadar aynaları ayarladıktan sonra, mikroskop kontrol yazılımındaki pikosaniye ışınının deklanşörünü kapatın.Ardından, femtosaniye lazer ışını için mikroskop deklanşörünü açın. P1'in geçiş deliğindeki femtosaniye lazer ışını nokta merkezini bulmak için ayna M3'ü ayarlayın, ardından P2'nin geçiş deliğindeki femtosaniye lazer ışını nokta merkezini bulmak için ayna M4'ü ayarlayın. Femtosaniye lazer ışını merkezi iki hizalama plakasının içinden deliklere yerleşene kadar aynaları ayarladıktan sonra, femtosaniye ışını için mikroskop deklanşörünü kapatın. Ardından, iki ışın noktasının konumunu görselleştirmek ve pompa ışınının kamera ekranındaki konumunu referans olarak işaretlemek için hedefin konumuna bir kamera yerleştirin.Ardından, L3 lensinin önüne bir P0 hizalama plakası yerleştirin ve optik aynayı bir altıgen anahtar kullanarak ayarlayın, böylece Stokes ışın merkezi, lazer çıkış portundaki hizalama plakasının içinden geçen delikten geçer. Ayarlama sırasında P0'daki ışın noktasının konumunu onaylamak için kızılötesi kapsamı kullanın. Ardından, P0 hizalama plakasını çıkarın ve optik aynayı iki olarak ayarlamak için altıgen tuşunu kullanın, böylece Stokes ışınının merkezi, kamera üzerindeki pompa ışınının referans işaretiyle birlikte lokalize olur.Stokes ışını hem P0 hem de kamera düzlemlerindeki pompa ışını ile kesinlikle örtüşene kadar aynaları ayarlamaya devam edin. Kilitli amplifikatör kontrol yazılımını açın ve pompa lazerinin dalga boyunu 796 nanometreye ve pompanın ve Stokes ışınının gücünü, numune üzerinde sırasıyla 15 ve 25 miliwatt'a karşılık gelen 50 ve 70 miliwatt'a ayarlayın. Daha sonra kilitleme amplifikatörü faz optimizasyonu için zeytinyağı kullanın.Zeytinyağı, sinyal geri saçılımını veya EPI-SRS tespitini arttırmak için tabana tutturulmuş kağıt mendil ile bir slaytta kapatılır. Zeytinyağı örneğini sahneye yerleştirin ve 25X hedefinin odağını numuneye ayarlayın. Mikroskop kontrol yazılımını kullanarak, görüntüleme parametrelerini metin yazısında belirtildiği gibi ayarlayın.Ardından, kilitli amplifikatör kontrol yazılımını kullanarak, zaman sabiti değerini 10 mikrosaniyeye ayarlayın. Daha sonra, lazer ışınını numune üzerinde tarayın ve SRS sinyal yoğunluğu maksimuma ulaşana kadar fazı 22,5 derecelik bir adım boyutuyla ayarlayın. Ardından, lazer deklanşörü kapalıyken numuneyi tarayın ve ortalama SRS sinyali sıfıra yakın olana kadar ofset değerini bir milivoltluk bir adım boyutuyla ayarlayın.Ardından, OPO kontrol yazılımında gecikme yöneticisi iletişim kutusunu açın ve zeytinyağını tarayın, zeytinyağı SRS sinyali maksimuma ulaşana kadar gecikme aşamasını ayarlayın. Ardından taramayı durdurun ve geçerli gecikme verilerini kaydetmek için gecikme yöneticisi iletişim kutusundaki veri ekle düğmesine tıklayın. Çeşitli kimyasal örnekleri görüntüleyerek farklı Raman kaymalarında benzer şekilde gecikme verilerini elde ettikten sonra, mevcut veri noktalarını beşinci dereceden polinom fonksiyonuna uydurmak için gecikme yöneticisi iletişim kutusunda beşinci sıraya uygun verileri seçin.Ardından, özel olarak kullan düğmesine tıklayarak ve onay kutusunu işaretleyerek takılan verileri uygulayın. Gecikme aşaması, takılan gecikme eğrisine göre farklı dalga boylarında otomatik olarak ayarlanır. İn vivo görüntüleme için, fareyi omuriliği açıkta ve saline batırılmış halde stabilizasyon aşamasına sabitleyin.Şimdi stabilizasyon aşamasını TPEF-SRS mikroskobunun altındaki beş eksenli bir aşamaya monte edin. Ardından fare kafasını iki kafa çubuğuyla sabitleyin ve nefes alma sırasında göğüs hareketi için yeterli alan sağlamak için tutma plakasını indirin ve hareket artefaktlarını hafifletin. Daha sonra, omurilik vaskülatürünün Brightfield görüntüsü 10X hedefi altında gözlemlenene kadar odağı ayarlamak için Z-translasyonel aşamasını ayarlayın.Beş eksenli aşamanın iki eksenli translasyonel aşamasını ayarlayarak omurilik dorsal venini görüş alanının merkezine yerleştirin. Ardından, omurilik dorsal yüzeyini Brightfield görüntüsüne göre objektif eksene dik olarak ayarlamak için beş eksenli aşamanın rulo ve perde açılarını ayarlayın. Ardından TPEF-SRS görüntüleme için 10X'i 25X suya daldırma hedefiyle değiştirin.SRS görüntüleme için, motorlu palete bağlı anahtar düğmesine basarak hedefin üzerindeki polarize edici ışın ayırıcıyı seçin. TPEF görüntüleme için, motorlu palete bağlı anahtar düğmesine basarak hedefin üzerindeki dikroik ayna D2'yi seçin. Son olarak, görüntüleme parametrelerini metin makalesinde açıklandığı gibi ayarlayın ve örneği taramaya başlayın.Fare omuriliğindeki seyrek etiketli YFP aksonlarının ve miyelin kılıflarının in vivo dual-modal görüntülenmesi, aksonların kalın bir miyelin kılıf tabakası ile yakından sarıldığını ortaya koymuştur. TPEF-SRS omurilik görüntüsünde görülebileceği gibi, Ranvier'in düğümleri aksonal çapı azalmıştır ve aksilemma doğrudan hücre dışı matrise maruz kalmıştır. Floresan ve SRS görüntüleme için yeni problar ile birleştirildiğinde, iki foton uyarılmış floresan SRS mikroskobu, çeşitli biyomoleküllerin eşzamanlı yapısal ve fonksiyonel görüntülemesini sağlayarak karmaşık biyolojik süreçleri anlamamızı kolaylaştırabilir.

in-vivo-imaging-biological-tissues-with-combined-two-photon

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Source: Espinoza, R., et al. Doku teşhisi için fare beyninin gerçek zamanlı, iki renkli uyarılmış Raman saçılma görüntülemesi. J. Vis. Exp. (2022). Video, fare beyin dokusu bölümlerinin iki renkli uyarılmış Raman saçılması (SRS) görüntülemesini gösterir. İki senkronize lazer ışını, moleküler titreşimleri uyarmak için doku bölümüne yönlendirilir ve bu da ışınlarda nispi bir yoğunluk değişikliğine neden olur. Dokudaki lipitler ve proteinler, lazer ışınlarının farklı frekans çiftleri kullanılarak...

Fare Beyin Dokusunun İki Renkli Uyarılmış Raman Saçılması Görüntülemesi

molekül bağlarının doğasında titreşim dayalı Tutarlı bir anti-Stokes Raman saçılması (CARS) mikroskopi etiket ücretsiz kimyasal seçici canlı hücre görüntüleme izin verir. safir lazer ve bir OPO lazer: Bu çalışma femtosaniye Ti dayalı standart bir multiphoton lazer tarama mikroskobu tamamlayıcı mikroskopi tekniği uygulanmasını sunar.

Sapphire ve OPO Lazer Bazlı Standart Lazer Tarama Mikroskobu: Bir Ti bir Tutarlı Anti-Stokes Raman saçılması (CARS) Sisteminin Uygulanması

Bu yazıda, SRS deneysel kurma işleminin lazer tarama mikroskobu ile entegrasyonu ile elde edilen, stimüle edilen Raman saçılma (SRS) mikroskobu uygulaması açıklanmıştır. SRS mikroskobu iki femtosaniye (FS) lazer kaynakları, bir TI-safir (TI: sa) ve senkronize optik parametrik osilör (OPO) dayanmaktadır.

Stimululated Raman saçılma dayalı doğrusal olmayan mikroskop uygulanması

Morfolojik değişiklikler, aktivasyon sonrasında bağışıklık duyarlı fibroblast hücrelerinde ortaya çıkar ve hücresel işe alma değişiklikleri teşvik. Genetik olarak tasarlanan fibroblast spesifik protein 1 (FSP1)-CRE ile birlikte 2-foton görüntülemenin kullanılması; tdtomato floxed-dur-floxed (TB/TB) fare hattı ve yeşil floresan etiketlenmiş lipopolisakkarid-fitc, biz dermal fibroblastlar ve morfolojik değişiklikler içinde lipopolisakkarid son derece spesifik alımı göstermek olabilir vivo.

İn vivo Iki renkli 2-foton görüntüleme genetiği etiketlenmiş Reporter hücrelerinin cilt içinde

Uyarılmış Raman saçılma (SRS) mikroskopisi, spesifik kimyasal moieties'in seçici, etiketsiz görüntülenmesini sağlar ve lipit moleküllerini in vivo olarak görüntülemek için etkili bir şekilde sunulmuştır. Burada, SRS mikroskopi prensibine kısa bir giriş sağlıyoruz ve Caenorhabditis elegans'talipid depolama görüntülemede kullanımı için yöntemleri açıklıyoruz.

Uyarılmış Raman Saçılma Mikroskopisi Kullanılarak Caenorhabditis elegans Lipid Depolama Dinamiklerinin Etiketsiz Görüntülenmesi

Uyarılmış Raman saçılması (SRS) mikroskobu güçlü, tahribatsız ve etiketsiz bir görüntüleme tekniğidir. Ortaya çıkan bir uygulama, protein ve lipit Raman geçişlerinde iki renkli SRS görüntülemenin psödo-hematoksilin ve eozin görüntüleri üretmek için kullanıldığı uyarılmış Raman histolojisidir. Burada, doku teşhisi için gerçek zamanlı, iki renkli SRS görüntüleme için bir protokol gösteriyoruz.

Doku Teşhisi için Fare Beyninin Gerçek Zamanlı, İki Renkli Uyarılmış Raman Saçılma Görüntülemesi

Gökkuşağı benzeri Raman boyalarının elektronik pre-rezonans uyarılmış Raman saçılması (epr-SRS) görüntülemesi, yüksek oranda çoklanmış epitop bazlı protein görüntüleme için yeni bir platformdur. Burada, antikor hazırlama, doku örneği boyama, SRS mikroskop montajı ve epr-SRS doku görüntülemeyi içeren pratik bir kılavuz sunuyoruz.

Raman Boyaları ile Yüksek Oranda Çoklanmış Doku Görüntüleme

Bu makale, aynı mikroskop platformuna entegre edilmiş uyarılmış Raman saçılmasının (SRS) ve tutarlı anti-Stokes Raman saçılmasının (CARS) çözünürlüğünü, hassasiyetini ve görüntüleme kontrastlarını doğrudan karşılaştırmaktadır. Sonuçlar, CARS'ın daha iyi bir uzamsal çözünürlüğe sahip olduğunu, SRS'nin daha iyi kontrastlar ve spektral çözünürlük sağladığını ve her iki yöntemin de benzer hassasiyete sahip olduğunu göstermektedir.

Kimyasal Görüntüleme için Hiperspektral Uyarılmış Raman Saçılması ve Tutarlı Anti-Stokes Raman Saçılma Mikroskobunun Doğrudan Karşılaştırılması

Geniş bant uyarılmış Raman saçılma (SRS) mikroskobu ile kimyasal görüntüler elde etmek için bir protokol sunuyoruz. Diferansiyel çok kanallı kilitleme tespiti ile çalışan bir SRS mikroskobuna dayanan protokol, numune hazırlamayı, SRS cihazının ayarlanmasını ve kimyasal olarak heterojen numunelerin farklı bileşenlerini çözmek için kemometriyi açıklar.

Geniş Bant Uyarılmış Raman Saçılma Mikroskobuna Dayalı Multipleks Kimyasal Görüntüleme

Etiketsiz optik görüntüleme modalitelerini birleştiren çok modlu bir platform kullanarak, hücresel dinamikleri ve metabolizmayı görselleştirmek ve ölçmek için bir protokol geliştirdik. Çoklu foton floresansı, ikinci harmonik üretimi ve uyarılmış Raman saçılma mikroskobu yoluyla görüntüleme yoluyla, hücresel ve moleküler çevreye bütünsel bir genel bakış oluşturabiliriz.

Hücresel metabolizmayı incelemek için multimodal optik görüntüleme platformu

Keşfedin canlı fare omuriliğindeki hücresel yapıları görüntülemek için uyarılmış Raman saçılma ve iki foton floresan mikroskobinin birleştirilmiş kullanımını. Bu çift modlu yaklaşım, nörodejeneratif hastalıkları ve omurilik yaralanmalarını incelemek için kritik biyokimyasal ve biyofiziksel bilgiler sağlar.

İn vivo Kombine İki Foton Floresan ve Stimüle Raman Saçılma Mikroskobu ile Biyolojik Dokuların Görüntülenmesi

Daha fazla video keşfet