Name: Parazitik bitki-konakçı etkileşimlerini analiz etmek için mikro-BT taramasından yararlanma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: Öğrenin parazitik bitki-konakçı etkileşimlerini analiz etmek için mikro-BT taraması ve vakum perfüzyon yöntemi kullanarak. Bu teknik, dokular arası kontrastı artırarak üç boyutlu yapıların incelenmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Simone Gomes Ferreira'ya (Mikrotomografi Laboratuvarı, Sao Paulo Üniversitesi, Brezilya) ve Dr. Greg Lin'e (Nano Ölçekli Sistemler Merkezi, Harvard Üniversitesi, ABD) farklı mikrotomografi sistemleri ve veri analiz yazılımları için üstün yardımları ve vazgeçilmez kullanıcı eğitimleri için teşekkür ederim. Ayrıca Connecticut Üniversitesi'ndeki (ABD) EEB Sera personeline, özellikle Clinton Morse ve Matthew Opel'e Viscum minimum örneklerini sağladıkları için teşekkür ediyorum. Dr. John Wenzel, Pyrularia pubera'nın örneklenmesi için fırsat ve büyük yardım sağladı. Carolina Bastos, Yasmin Hirao ve Talitha Motta, Scybalium fungiforme'un örneklenmesinde büyük ölçüde yardımcı oldu. Yüksek Lisans Ariadne Furtado ve Dr. Fernanda Oliveira ve Maria Aline Neves, endofitik mantarların analizi için floksin B kullanımı için referans sağlamıştır. Brüksel Vrije Üniversitesi'nde video kaydı, Dr. Philippe Claeys, Dr. Christophe Snoeck, MSc. Jake Griffith, Dr. Barabara Veselka ve Dr. Harry Olde Venterink'in yardımıyla mümkün oldu. Finansman, Yüksek Öğretim Personelinin İyileştirilmesi Koordinasyonu (CAPES, Brezilya) ve Harvard Üniversitesi Herbarisi (ABD) tarafından sağlanmıştır.

1. Paraziter bitki numune seçimi
<ol><li>Ekli konakçı kök / kök ve parazitli konakçı organın hem proksimal hem de distal uçlarının segmentleri dahil olmak üzere tüm parazitik bitki haustoriumunu toplayın; Her segmentin ideal uzunluğu, haustoriumun çapının iki katına eşdeğerdir. NOT: Lateral haustoria için, haustoriumun oluştuğu parazit ana sapının/kökünün bir kısmını ekleyin (Şekil 1A,B,D). Endoparazitler için, parazit belirtilerinin görülebildiği konakçı sapının / kökünün bir segmentini toplayın (Şekil 1B). Terminal bağlantıları söz konusu olduğunda, tüm tesis toplanmalıdır (Şekil 1E).</li>
	<li>Tüm numuneyi fiksatif çözeltiye (örneğin, FAA) 1:10'luk hacimsel bir oranda batırın (numune: fiksatif). Numunenin büyüklüğüne bağlı olarak numuneleri en az 1 gün fiksatif olarak bırakın27. NOT: Numuneler taramadan önce fiksatif olarak saklanabilir veya bir koruyucu çözeltiye aktarılabilir (örneğin, etanol% 70). Yeni numuneler, sonraki anatomik analizin garanti edilmediği durumlarda da kullanılabilir (Tartışma bölümüne bakınız). Taze malzeme ile çalışıyorsanız, kontrast çözeltisinin perfüzyonu için aparatı kurun, ardından numuneyi toplayın. Numunenin kurumasına izin verilmemelidir.</li>
</ol>2. Zıt çözümlerin uygulanması
<ol><li>Kullanılacak uygulama yöntemini seçin. Küçük (Şekil 1A) veya odunsu olmayan (Şekil 1B) numuneler için vakum yöntemini (adım 2.3) kullanın. Konakçı sapının/kökünün bir segmentini içermesi koşuluyla daha büyük numuneler için perfüzyon yöntemini kullanın (Şekil 1A, C-E).</li>
	<li>Aşağıdaki adımlarda seçilen yaklaşımdan bağımsız olarak numuneyi manipüle ederken lastik eldiven ve diğer uygun kişisel koruma ekipmanlarını (ör. laboratuvar önlüğü) giyin. DİKKAT: Tüm zıt çözeltiler, bileşimlerinde ağır metal tuzları içerir ve bu nedenle yeterli kişisel koruma ekipmanı olmadan ve bir duman davlumbazının altında kullanılmamalıdır.</li>
	<li>Vakum yöntemi için aşağıda belirtilen adımları izleyin.<ol><li>Uygun bir şişe seçin ve etiketleyin. Flakon, numuneyi ve zıt çözeltiyi barındıracak kadar büyük olmalı, genellikle 1:10 oranında olmalıdır. Şişenin düşük ila orta vakuma dayanabileceğinden emin olmak için üreticinin talimatlarını kontrol edin. NOT: Negatif basınç (vakum) sıvının dökülmesine neden olabileceğinden, şişeyi ağzına kadar doldurmayın.</li>
		<li>Numuneyi zıt çözelti ile şişeye yerleştirin (% 1 iyot veya% 3 fosfotungstat, bakınız Malzeme Tablosu). Daha sonra şişeyi bir vakum pompasına bağlı bir vakum odasına veya kurutucuya yerleştirin. Kapağı şişeden çıkarın, ardından vakum odasını veya kurutucuyu kapatın.</li>
		<li>Vakum odasında/kurutucuda çatlak olmadığından ve vakum pompasında yeterli yağ bulunduğundan emin olun.</li>
		<li>Havanın dışarı akmasını önlemek için pompanın egzozyon valfini kapatın ve havayı dışarı çıkmaya zorlamak için haznenin/kurutucunun egzozyon valfini açın.</li>
		<li>Pompayı açın ve basınç yaklaşık 20" Hg'ye ulaşana kadar bekleyin. DİKKAT: Bu işlem genellikle hızlıdır, bu nedenle vakum sistemini gözetimsiz bırakmayın. NOT: Basınç için metrik sistem birimi Pascal (Pa) olsa da, çoğu laboratuvar vakum pompasındaki basınç göstergeleri basıncı inç cıva ("Hg"), inç kare başına pound (psi) veya çubuk cinsinden görüntüler. 20" Hg, yaklaşık 67,7 Pa, 10 psi veya 0,7 bar'a eşittir.</li>
		<li>Havanın tekrar girmesini önlemek için hazne/kurutucu egzoz valfini kapatın, ardından pompayı hızla kapatın.</li>
		<li>Numuneyi en az 2 saat vakum altında bırakın; Daha büyük numuneler, zıt çözeltinin nüfuz etmesi için daha uzun süre gerektirir.</li>
		<li>İstenilen süreden sonra, taramaya hazırlamak için numuneyi zıt çözeltiden çıkarın.</li>
		<li>Havanın içeri girmesine izin vermek için hazne/kurutucu egzoz valfini yavaşça açın.</li>
		<li>Odadaki/kurutucudaki basıncın tamamen tükenmesini bekleyin (yani, basınç göstergesi 0'a yaklaşır), ardından numuneyi almak için dikkatlice açın.</li>
		<li>Zıt çözeltiyi uygun şekilde atın ve numuneyi tarama için hazırlıkta tutun.</li>
	</ol></li>
	<li>Perfüzyon yöntemi için aşağıda belirtilen adımları izleyin.<ol><li>Numunenin boyutuna göre zıt çözelti için bir besleme tankı seçin. Küçük numuneler için 50 mL'lik bir şırınga (iğne veya piston olmadan) veya büyük numuneler için 1 L intravenöz tıbbi kit kullanın (Şekil 2B).</li>
		<li>Şeffaf bir plastik borunun bir ucunu (bakınız Malzeme Tablosu) besleme tankına bağlayın, ardından diğer ucunu iki yönlü veya üç bir vanaya bağlayın. İkinci bir boruyu valfteki farklı bir prize bağlayın (Şekil 2A,B).</li>
		<li>Önceki adımda kurulan aparatı sökmeden besleme tankını yüksek bir konumda sabitleyin. NOT: Tank ile numune arasındaki dikey mesafe, çözelti perfüzyon basıncını belirleyecektir (Şekil 2B). Küçük numuneler için 20-50 cm'lik bir mesafe yeterlidir. Büyük numuneler için 1 m'lik bir mesafe daha yeterlidir.</li>
		<li>Sıvının boru sisteminden çıkmasını önlemek için üç (Şekil 2C) veya iki yönlü (Şekil 2D) valfi kapatın, ardından kontrast çözeltisini besleme tankına dökün. İntravenöz bir tıbbi kit kullanıyorsanız, torbayı çözelti ile doldurun ve aparatı yüksek bir konuma sabitlemeden önce valfi kapatın.</li>
		<li>Boru sistemi boyunca büyük hava kabarcıkları oluşmadığından emin olun (Şekil 2E). Gerekirse, kontrast çözeltisinin kabarcık çıkarılana kadar borudan akmasına izin verin. Vanayı tekrar kapatın ve aparatı yerinde bırakın.</li>
		<li>Numuneyi kontrast çözeltisinin perfüzyonuna hazırlamak için, sıvıya (su, etanol veya fiksatif) batırılmış halde tutun ve numunedeki konakçı sapının/kökün proksimal ucunun ucunu kesin (Şekil 2F).</li>
		<li>Numuneyi depolandığı sıvıdan çıkarın ve kurumasını önlemek için bir parafin filme sarın. Numuneyi yakınlarda tutun ve cihaza bağlanmaya hazır tutun.</li>
		<li>Zıt çözeltinin yavaşça akmasına izin vermek için vanayı dikkatlice açın ve zıt çözeltinin dökülmesini önlemek için sistemin açık ucunu hafifçe yükseltilmiş bir konumda tutarken tanka bağlı plastik boruyu doldurun. Yine, tüp boyunca büyük hava kabarcıkları oluşmadığından emin olun.</li>
		<li>Numunedeki konakçı gövdenin/kökün proksimal ucunu boru sisteminin açık ucuna bağlayın (Şekil 2B, büyütülmüş bölge). Bu adım sırasında sisteme hava kabarcıkları sokmaktan kaçının. Gerekirse, numuneyi aparattan ayırın ve çözeltinin akmasına izin vererek hava kabarcıklarını sistemden çıkarın.</li>
		<li>Numuneyi cihaza bağlı tutarken, zıt çözeltinin deneyin kurulduğu alana sızmasını önlemek için bir kabın içine yerleştirin. Cihazdaki tüm bağlantıların iyi oturduğundan, çeşitli boyutlardaki ana dalları barındırdığından ve çözeltinin boru sisteminden sızmadığından emin olmak için farklı çaplarda tüpler, plastik fermuarlı bağlar ve valf adaptörleri kullanın (Şekil 2B, büyütülmüş bölge).</li>
		<li>Çözeltinin numuneyi en az 2 saat boyunca veya çözelti kabın içinde birikinceye kadar perfüze etmesine izin verin.</li>
		<li>Vanayı kapatın ve numuneyi cihazdan dikkatlice ayırın. Çözeltinin geri kalanını kabın içine boşaltın ve uygun şekilde atın.</li>
		<li>Taramaya hazırlanırken parafin filmi numuneden çıkarın.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63423/63423fig02.jpg"> Şekil 2: Kontrast uygulaması için perfüzyon yaklaşımı. Perfüzyon cihazının küçük (A) ve büyük (B) versiyonları, bir besleme tankı (st) ve bir valf (va) ile bağlanmış iki plastik tüp (t1 ve t2) içerir. Haustorium (ha) aracılığıyla kendisine bağlı bir parazit (P) taşıyan konakçı sapın (H) proksimal ucu, sistemin açık ucuna (B, genişlemiş) bağlanır. Boru sistemi içinde, kontrast çözeltinin (E) geçişini engelleyen hava kabarcıklarının oluşumunu önlemeye yardımcı olmak için üç yönlü (C) veya iki yönlü (D) valf kullanılır. Konakçı sapın (H) proksimal ucunun ucu, kontrast çözeltisinin (F) geçişine izin vermek için su altında kesilir. Fermuarlı bağlar, valf adaptörleri ve farklı çaplardaki borular, daha sıkı bağlantıların güvence altına alınmasına ve sistemde sızıntının önlenmesine yardımcı olur (G). Şekil 2B, D ve F BioRender ile oluşturulmuştur. Ölçek çubukları = 2 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63423/63423fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
3. Numune hazırlama ve montaj
<ol><li>Numuneyi 2 dakika suya batırarak yıkayın. DİKKAT: Numuneleri lavaboda yıkamayın, çünkü tüm zıt çözeltiler bileşimlerinde ağır metal tuzları içerir. Yıkama için kullanılan suyu seyreltilmiş kontrast bir çözelti olarak düşünün ve uygun şekilde atın.</li>
	<li>Numunenin boyutuna bağlı olarak fazla suyun 2-5 dakika buharlaşmasını sağlamak için numuneyi oda sıcaklığında bir kağıt havluya koyun. Alternatif olarak, numuneyi bir kağıt havlu yardımıyla hafifçe kurulayın. Numunenin tamamen kurumasına izin vermeyin.</li>
	<li>Numuneyi ince bir tabakaya gererek bir parafin filme sarın. Parafin filmi numunenin üzerine katlamaktan kaçının.</li>
	<li>Sarılmış numuneyi bir numune tutucuya monte edin, tarama sırasında dönerken sabit ve yerinde tutun. Numuneyi yerine sabitlemek için yapışkan bant, düşük yoğunluklu köpük, pipet uçları ve/veya şeffaf plastik kaplar kullanın.</li>
	<li>Numuneyi tarayın ve mevcut mikro-BT sistemi için oluşturulan belirli protokolleri ve yönergeleri izleyerek görüntüleri analiz edin.</li>
</ol>

<ol><li>Stock, S. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStock%2C+SR+%22Microcomputed+tomography%3A+Methodology+and+applications%22">Microcomputed tomography: Methodology and applications</a>. , CRC Press/Taylor and Francis. Boca Raton, FL. (2020).</li>
<li>Hounsfield, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computerized+transverse+axial+scanning+%28tomography%29%3A+I.+Description+of+system%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Radiology%22%5BJournal%5D)">Computerized transverse axial scanning (tomography): I. Description of system.</a> British Journal of Radiology. 46 (552), 1016-1022 (1973).</li>
<li>Dutilleul, P., Lafond, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editorial%3A+Branching+and+rooting+out+with+a+CT+Scanner%3A+The+why%2C+the+how%2C+and+the+outcomes%2C+present+and+possibly+future+pierre%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Editorial: Branching and rooting out with a CT Scanner: The why, the how, and the outcomes, present and possibly future pierre.</a> Frontiers in Plant Science. 7 (41), 5-6 (2016).</li>
<li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+applications+of+X-ray+microtomography%3A+Imaging+micro-+anatomy%2C+molecular+expression+and+organismal+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Analysis%22%5BJournal%5D)">Biological applications of X-ray microtomography: Imaging micro- anatomy, molecular expression and organismal diversity.</a> Microscopy and Analysis. 27 (2), 13-16 (2013).</li>
<li>Sakdinawat, A., Attwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+X-ray+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Nanoscale X-ray imaging.</a> Nature Photonics. 4 (12), 840-848 (2010).</li>
<li>Walton, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+characterisation+of+unstained+and+intact+tissue+micro-architecture+by+X-ray+computed+micro-+and+nano-tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Morphological characterisation of unstained and intact tissue micro-architecture by X-ray computed micro- and nano-tomography.</a> Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).</li>
<li>Lafond, J. A., Han, L., Dutilleul, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concepts+and+analyses+in+the+ct+scanning+of+root+systems+and+leaf+canopies%3A+A+timely+summary%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Concepts and analyses in the ct scanning of root systems and leaf canopies: A timely summary.</a> Frontiers in Plant Science. 6 (1111), 85-91 (2015).</li>
<li>Staedler, Y. M., Masson, D., Schönenberger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+tissues+in+3D+via+X-Ray+Tomography%3A+Simple+contrasting+methods+allow+high+resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Plant tissues in 3D via X-Ray Tomography: Simple contrasting methods allow high resolution imaging.</a> PLoS ONE. 8 (9), 75295(2013).</li>
<li>Heeraman, D. A., Hopmans, J. W., Clausnitzer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+dimensional+imaging+of+plant+roots+in+situ+with+X-ray+Computed+Tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Soil%22%5BJournal%5D)">Three dimensional imaging of plant roots in situ with X-ray Computed Tomography.</a> Plant and Soil. 189, 167-179 (1997).</li>
<li>Dhondt, S., Vanhaeren, H., Van Loo, D., Cnudde, V., Inzé, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+structure+visualization+by+high-resolution+X-ray+computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Plant structure visualization by high-resolution X-ray computed tomography.</a> Trends in Plant Science. 15 (8), 419-422 (2010).</li>
<li>McElrone, A. J., Choat, B., Parkinson, D. Y., MacDowell, A. A., Brodersen, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+high+resolution+computed+tomography+to+visualize+the+three+dimensional+structure+and+function+of+plant+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Using high resolution computed tomography to visualize the three dimensional structure and function of plant vasculature.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), e50162(2013).</li>
<li>Cochard, H., Delzon, S., Badel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+microtomography+%28micro-CT%29%3A+A+reference+technology+for+high-resolution+quantification+of+xylem+embolism+in+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+and+Environment%22%5BJournal%5D)">X-ray microtomography (micro-CT): A reference technology for high-resolution quantification of xylem embolism in trees.</a> Plant, Cell and Environment. 38 (1), 201-206 (2015).</li>
<li>Bastos, C. L., Tamaio, N., Angyalossy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+roots+of+lianas%3A+A+case+study+in+Sapindaceae%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Unravelling roots of lianas: A case study in Sapindaceae.</a> Annals of Botany. 118 (4), 733-746 (2016).</li>
<li>da Cunha Neto, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity%2C+distribution%2C+development%2C+and+evolution+of+medullary+bundles+in+Nyctaginaceae%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Diversity, distribution, development, and evolution of medullary bundles in Nyctaginaceae.</a> American Journal of Botany. 107 (5), 707-725 (2020).</li>
<li>Milien, M., Renault-Spilmont, A. S., Cookson, S. J., Sarrazin, A., Verdeil, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+3D+structure+of+the+graft+union+of+grapevine+using+X-ray+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Scientia+Horticulturae%22%5BJournal%5D)">Visualization of the 3D structure of the graft union of grapevine using X-ray tomography.</a> Scientia Horticulturae. 144, 130-140 (2012).</li>
<li>Paya, A. M., Silverberg, J. L., Padgett, J., Bauerle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+computed+tomography+uncovers+root-root+interactions%3A+Quantifying+spatial+relationships+between+interacting+root+systems+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">X-ray computed tomography uncovers root-root interactions: Quantifying spatial relationships between interacting root systems in three dimensions.</a> Frontiers in Plant Science. 6 (274), 54-65 (2015).</li>
<li>Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G. C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aligning+microtomography+analysis+with+traditional+anatomy+for+a+3D+understanding+of+the+host-parasite+interface+-+Phoradendron+spp.+Case+study%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Aligning microtomography analysis with traditional anatomy for a 3D understanding of the host-parasite interface - Phoradendron spp. Case study.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 1340(2016).</li>
<li>Lusic, H., Grinstaff, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray-computed+tomography+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">X-ray-computed tomography contrast agents.</a> Chemical Reviews. 113 (3), 1641-1666 (2013).</li>
<li>Těšitel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+biology+of+parasitic+plants%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Ecology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Functional biology of parasitic plants: a review.</a> Plant Ecology and Evolution. 149 (1), 5-20 (2016).</li>
<li>Teixeira-Costa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+living+bridge+between+two+enemies%3A+Haustorium+structure+and+evolution+across+parasitic+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+Brasileira+de+Botanica%22%5BJournal%5D)">A living bridge between two enemies: Haustorium structure and evolution across parasitic flowering plants.</a> Revista Brasileira de Botanica. 44 (1), 165-178 (2021).</li>
<li>Kuijt, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKuijt%2C+J+%22The+Biology+of+Parasitic+Flowering+Plants%22">The Biology of Parasitic Flowering Plants</a>. , University of California Press. Berkeley, USA. (1969).</li>
<li>Masumoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstructions+of+haustoria+in+two+parasitic+plant+species+in+the+Orobanchaceae%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstructions of haustoria in two parasitic plant species in the Orobanchaceae.</a> Plant Physiology. 185 (4), 1429-1442 (2021).</li>
<li>Calo, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+correlation+analysis+of+Light+Microscopy+and+X-ray+MicroCT+imaging+methods+applied+to+archaeological+plant+remains%27+morphological+attributes+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A correlation analysis of Light Microscopy and X-ray MicroCT imaging methods applied to archaeological plant remains' morphological attributes visualization.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).</li>
<li>Brodersen, C. R., Roddy, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+frontiers+in+the+three-dimensional+visualization+of+plant+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">New frontiers in the three-dimensional visualization of plant structure and function.</a> American Journal of Botany. 103 (2), 184-188 (2016).</li>
<li>Teixeira-Costa, L., Davis, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+history%2C+diversity%2C+and+distribution+in+parasitic+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Life history, diversity, and distribution in parasitic flowering plants.</a> Plant Physiology. 187 (1), 32-51 (2021).</li>
<li>Simpson, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Krameriaceae%5BTitle%5D)+AND+%22Flora+Neotropica+Monograph%22%5BJournal%5D)">Krameriaceae.</a> Flora Neotropica Monograph. 49, (1989).</li>
<li>Ruzin, S. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRuzin%2C+SE+%22Plant+microtechnique+and+microscopy%22">Plant microtechnique and microscopy</a>. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1999).</li>
<li>Nikolov, L. A., Tomlinson, P. B., Manickam, S., Endress, P. K., Kramer, E. M., Davis, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Holoparasitic+Rafflesiaceae+possess+the+most+reduced+endophytes+and+yet+give+rise+to+the+world%27s+largest+flowers%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Holoparasitic Rafflesiaceae possess the most reduced endophytes and yet give rise to the world's largest flowers.</a> Annals of Botany. 114, 233-242 (2014).</li>
<li>Thorogood, C. J., Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G., Davis, C., Hiscock, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoparasitic+plants+and+fungi+show+evolutionary+convergence+across+phylogenetic+divisions%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Endoparasitic plants and fungi show evolutionary convergence across phylogenetic divisions.</a> New Phytologist. 232 (3), 1159-1167 (2021).</li>
<li>Largent, D., Johnson, D., Watling, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLargent%2C+D+%22How+to+Identify+Mushrooms+to+Genus+III%3A+Microscopic+Features%22">How to Identify Mushrooms to Genus III: Microscopic Features</a>. , Mad River Press Inc. Eureka, CA. USA. (1977).</li>
<li>Busse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+virtual+histology+enabled+through+cytoplasm-specific+X-ray+stain+for+microscopic+and+nanoscopic+computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional virtual histology enabled through cytoplasm-specific X-ray stain for microscopic and nanoscopic computed tomography.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2293-2298 (2018).</li>
<li>Sperry, J. S., Donnelly, J. R., Tyree, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+measuring+hydraulic+conductivity+and+embolism+in+xylem%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+and+Environment%22%5BJournal%5D)">A method for measuring hydraulic conductivity and embolism in xylem.</a> Plant, Cell and Environment. 11, 35-40 (1988).</li>
<li>Calvin, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-formed+tyloses+in+vessels+of+the+mistletoe+Phoradendron+%28Viscaceae%29%5BTitle%5D)+AND+%22IAWA+Journal%22%5BJournal%5D)">Host-formed tyloses in vessels of the mistletoe Phoradendron (Viscaceae).</a> IAWA Journal. 18 (2), 117-126 (1997).</li>
<li>Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embolism+increase+and+anatomical+modifications+caused+by+a+parasitic+plant%5BTitle%5D)+AND+%22IAWA+Journal%22%5BJournal%5D)">Embolism increase and anatomical modifications caused by a parasitic plant.</a> IAWA Journal. 36 (2), 138-151 (2015).</li>
<li>Ellmore, G. S., Ewers, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+flow+in+the+outermost+xylem+increment+of+a+ring-porous+tree%2C+Ulmus+americana%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Fluid flow in the outermost xylem increment of a ring-porous tree, Ulmus americana.</a> American Journal of Botany. 73 (12), 1771-1774 (1986).</li>
<li>Ellis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+sectioned+biological+specimens+for+transmission+electron+microscopy%3A+Conventional+and+En+bloc+stains%5BTitle%5D)+AND+%22Electron+Microscopy%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Staining sectioned biological specimens for transmission electron microscopy: Conventional and En bloc stains.</a> Electron Microscopy: Methods and Protocols. 1117, 57-72 (2014).</li>
<li>Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+embolism+repair+in+xylem%3A+In+vivo+visualizations+using+high-resolution+computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">The dynamics of embolism repair in xylem: In vivo visualizations using high-resolution computed tomography.</a> Plant Physiology. 154 (3), 1088-1095 (2010).</li>
<li>Brodersen, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+three-dimensional+xylem+networks+using+high-resolution+computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of three-dimensional xylem networks using high-resolution computed tomography.</a> New Phytologist. 191 (4), 1168-1179 (2011).</li>
<li>Lee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+plant+development+and+gene+expression+in+three+dimensions+using+optical+projection+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing plant development and gene expression in three dimensions using optical projection tomography.</a> Plant Cell. 18 (9), 2145-2156 (2006).</li>
</ol>

Yazarın açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Bitki dokusu kontrastını iyileştirmek için ağır metal çözeltilerinin kullanılması, mikro-BT analizi için numune hazırlamada çok önemli bir adım haline gelmiştir. Bitki mikromorfolojisi laboratuvarlarında yaygın olarak bulunan çeşitli bileşikler, fosfotungstatın nüfuz eden numunelerde ve kontrast indeksi8'in arttırılmasında en etkili ajan olarak kullanılmasını öneren Staedler ve ark. tarafından test edilmiştir. Burada P. pubera haustoriumunun analizinde elde edilen sonuçlar bu öneriyi doğr...

Yüksek çözünürlüklü röntgen mikrobilgisayarlı tomografi (mikro-BT), bir numunenin çoklu radyografilerinin (projeksiyonlarının) farklı görüş açılarından kaydedildiği ve daha sonra numunenin sanal bir rekonstrüksiyonunu sağlamak için kullanıldığı bir görüntüleme yöntemidir1. Bu sanal nesne daha sonra analiz edilebilir, manipüle edilebilir ve bölümlere ayrılabilir, böylece üç boyutlu2'de tahribatsız keşif yapılabilir. Başlangıçta tıbbi analizler ve daha sonra endüstriyel uygulamalar için tasarlanan mikro-BT, invaziv prosedürlere gerek kalmadan iç organları ve dokuları görselleştirme avantajı da sunar3. Diğer görüntüleme biçimleri gibi, mikro-BT de görüş alanı ve piksel boyutu arasında bir denge ile çalışır, bu da büyük örneklerin yüksek çözünürlüklü görüntülemesinin neredeyse ulaşılamaz olduğu anlamına gelir4. Yüksek enerjili X-ışını kaynaklarının (yani senkrotron) ve ikincil optik büyütmenin kullanımındaki ilerlemeler sürekli olarak yapılmakta ve en küçük çözünürlüğün 100 nm 5,6'nın altına ulaşmasına izin verilmektedir. Bununla birlikte, büyük numuneler için daha uzun tarama süreleri gereklidir, bu da tarayıcı içindeki numune hareketi veya deformasyonu nedeniyle artefakt olasılığını artırır. Ayrıca, mikro-BT genellikle numune içindeki doğal yoğunluk değişimleri ve numunenin X-ışınları ile nasıl etkileşime girdiği ile sınırlıdır. Daha yoğun numunelere nüfuz etmek için daha yüksek bir X-ışını dozu en iyisi olsa da, numune ile çevresindeki ortam7 içindeki ve arasındaki yoğunluk değişikliklerini yakalamada daha az etkilidir. Öte yandan, daha düşük bir X-ışını dozu daha az penetrasyon gücü sunar ve genellikle daha uzun tarama süreleri gerektirir, ancak yoğunluk algılamada daha fazla hassasiyet gerektirir7.
Bu kısıtlamalar, çoğu bitki dokusunun düşük X-ışını emilimine sahip hafif (yoğun olmayan) dokudan oluştuğu göz önüne alındığında, bitki bilimleri için mikrotomografi kullanımını uzun zamandır engellemiştir8. Mikro-BT'nin ilk uygulamaları, toprak matrisi 9,10 içindeki kök ağlarının haritalandırılmasına odaklanmıştır. Daha sonra, ahşap gibi doku yoğunluğunda daha önemli farklılıklar gösteren bitki yapıları araştırılmaya başlandı. Bu, ksilem işlevselliğinin 11,12, karmaşık doku organizasyonlarının gelişiminin 13,14 ve bitkiler arasındaki etkileşimlerinaraştırılmasına izin vermiştir 15,16,17. Yumuşak ve homojen doku analizi, bitki örneklerinin mikro-BT taraması için preparatlarda artık standart prosedür olan kontrast maddeler nedeniyle yaygınlaşmaktadır. Bununla birlikte, kontrast tanıtımı protokolleri, numune hacmine, yapısal özelliklere ve kullanılan çözeltinin türüne bağlı olarak farklı sonuçlara sahip olabilir8. İdeal olarak, kontrast madde farklı dokular arasındaki ayrımı arttırmalı, doku/organ işlevselliğinin değerlendirilmesini sağlamalı ve/veya bir doku hakkında biyokimyasal bilgi sağlamalıdır18. Bu nedenle, taramadan önce yeterli numune tedavisi, hazırlanması ve montajı, herhangi bir mikro-BT analizi için çok önemli hale gelir.
Parazitik bitki haustoriumunun mikro-BT'si Parazitik çiçekli bitkiler, haustorium19 olarak bilinen bir organ ile karakterize edilen anjiyospermlerin ayrı bir fonksiyonel grubunu temsil eder. Modifiye edilmiş bir kök ve bir kök arasındaki gelişimsel bir melez olan bu çok hücreli organ, konakçının bağlanmasına, nüfuz etmesine ve bir parazit20 ile temasına etki eder. Bu nedenle, haustoriumun "bitkiler arasındaki parazitizm fikrini somutlaştırdığı"21 düşünülmektedir. Bu organın gelişiminin, yapısının ve işleyişinin ayrıntılı bir şekilde anlaşılması, parazitik bitki ekolojisi, evrimi ve yönetimi çalışmaları için çok önemlidir. Bununla birlikte, parazitik bitkilerin genel karmaşıklığı ve yüksek oranda değiştirilmiş yapısı ve haustoria genellikle ayrıntılı analiz ve karşılaştırmayı engellemektedir. Haustorium bağlantıları da genellikle geniştir ve doku ve hücre dağılımında homojen değildir (Şekil 1). Bu bağlamda, küçük doku parçaları ile çalışmak daha kolay manipülasyon ve daha yüksek çözünürlük sağlarken, parazitik bitki haustorium gibi karmaşık yapıların üç boyutlu mimarisi hakkında hatalı sonuçlara yol açabilir.
Çoğu parazitik bitki türü için haustorium anatomisi ve ultrayapısı hakkında geniş bir literatür olmasına rağmen, parazit ve konakçı dokular arasındaki üç boyutlu organizasyon ve mekansal ilişki hala yeterince araştırılmamıştır17. Masumoto ve ark.22 tarafından yapılan yakın tarihli bir çalışmada, 300'den fazla seri yarı ince mikrotom bölümü görüntülendi ve iki parazit türünün haustoriumunu temsil eden üç boyutlu bir sanal nesneye yeniden yapılandırıldı. Bu yöntemin mükemmel ayrıntı seviyesi, haustoriumun hücresel ve anatomik 3-D yapısı hakkında benzeri görülmemiş bilgiler sağlar. Bununla birlikte, böyle zaman alıcı bir teknik, daha kapsamlı haustorium bağlantılarına sahip parazitlerde benzer bir analizi yasaklayacaktır. Mikro-BT kullanımı, parazitik bitkilerin karmaşık ve genellikle hacimli haustorialarının üç boyutlu analizi için mükemmel bir araç olarak ortaya çıkmaktadır. Ayrıntılı anatomik kesitleme ve mikroskopi analizlerinin diğer tamamlayıcı formlarının yerine geçmese de17,23, özellikle büyük numuneler için mikro-BT taraması yoluyla elde edilen sonuçlar, daha sonra konfokal ve elektron mikroskobu gibi diğer araçlar kullanılarak analiz edilebilen veya yüksek çözünürlüklü mikro-BT sistemleriyle yeniden analiz edilebilen daha küçük segmentlerin alt örneklemesini yönlendirmek için bir rehber görevi görebilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63423/63423fig01.jpg"> Şekil 1: Bu protokolde kullanılan farklı fonksiyonel gruplara ait paraziter bitkiler. Euphytoid parazit Pyrularia pubera (A), endoparazit Viscum minimum (B) yeşil meyveler (kesikli siyah daire), parazitik asma Cuscuta americana (C), ökse otu Struthanthus martianus (D), zorunlu kök paraziti Scybalium fungiforme (E). Konakçı kökün (Hr) veya gövdenin (Hs) segmentleri, parazit haustoriuma (P) kontrast uygulanmasını kolaylaştırır. Numunede parazit ana kökü/gövdesinin (okların) varlığı, haustorium damar organizasyonunun analizine olanak sağlar. Dikdörtgenler, analiz için kullanılan numunenin segmentlerini gösterir. Ölçek çubukları = 2 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63423/63423fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Mikro-BT, bitki bilimlerinde giderek daha popüler bir teknik haline geldikçe, örnek tarama, üç boyutlu rekonstrüksiyon, segmentasyon ve analiz 3,10,24 ile ilgili kılavuzlar, protokoller ve literatür bulunmaktadır. Bu nedenle, bu adımlar burada tartışılmayacaktır. Herhangi bir hayal etme tekniğinde olduğu gibi, numunelerin uygun şekilde işlenmesi ve montajı, çoğu zaman göz ardı edilen bir prosedür olmasına rağmen, temel bir prosedürdür. Bu nedenle, bu protokol mikro-BT taraması için haustorium örneklerinin hazırlanmasına odaklanmaktadır. Daha spesifik olarak, bu protokol, haustoriumdaki farklı dokuların ve hücre tiplerinin görselleştirilmesini iyileştirmek, konakçı kök / kök içindeki parazitik dokunun tespitini kolaylaştırmak ve parazit-konakçı vasküler bağlantılarını üç boyutlu olarak analiz etmek için haustoryum örneklerine kontrast maddeler sokmak için iki yaklaşımı açıklamaktadır. Burada açıklanan preparatlar, diğer bitki yapılarının analizine de uyarlanabilir.
Burada açıklanan protokolün rahatlığını daha iyi göstermek için beş tür kullanılmıştır. Her tür, parazitik çiçekli bitkilerin beş fonksiyonel grubundan birini temsil eder, böylece her grubun işlevselliği ile ilgili belirli noktaları ele alır. Pyrularia pubera (Santalaceae), toprakta çimlenen ve paraziti konakçılarının köklerine bağlayan çoklu haustoria oluşturan öfitoid parazitleri temsil etmek üzere seçildi25. Bu bitkiler tarafından yaratılan haustoria genellikle zayıftır ve konakçı26'dan kolayca ayrılır (Şekil 1A), bu nedenle daha hassas bir işleme süreci gerektirir. Endoparazitler burada Viscum minimum (Viscaceae) ile temsil edilir. Bu fonksiyonel gruptaki türler sadece kısa süreler için konakçılarının vücudunun dışında görülebilir (Şekil 1B) ve yaşam döngülerinin çoğunu konakçı dokuların içine gömülü hücrelerin önemli ölçüde azalmış ve miselli benzeri iplikçikleri olarak yaşarlar25. Üçüncü bir fonksiyonel grup, zeminde çimlenen, ancak konakçı bitkilerin gövdelerine bağlanan çoklu haustorialara dayanan sadece ilkel kökler oluşturan parazitik asmalardan oluşur25 (Şekil 1C). Burada, bu fonksiyonel grup Cuscuta americana (Convolvulaceae) ile temsil edilmektedir. Parazitik asmaların aksine, ökse otu doğrudan konakçı bitkilerinin dalları üzerinde çimlenir ve çoklu veya yalnız haustoria25 geliştirir. Bu fonksiyonel grubu göstermek için seçilen tür, konakçı dal ile çeşitli bağlantılar oluşturan Struthanthus martianus'tur (Loranthaceae). Mikro-BT ve ışık mikroskobu kombinasyonu kullanılarak yalnız ökse otu haustoria'nın analizi Teixeira-Costa &amp;; Ceccantini17'de bulunabilir. Son olarak, zorunlu kök parazitleri, zeminde çimlenen ve en erken büyüme aşamalarından25'ten itibaren tamamen bağımlı oldukları konakçı bitkilerin köklerine nüfuz eden türlerden oluşur. Bu bitkiler burada büyük yumru benzeri haustoria üreten Scybalium fungiforme (Balanophoraceae) ile temsil edilmektedir (Şekil 1E).
Bu protokolde kullanılan tüm bitki örnekleri% 70 formalin asetik asit alkolüne (FAA 70) sabitlenmiştir. Örnekleme üzerine sabitleme, özellikle daha sonraki anatomik analizlere ihtiyaç duyulduğunda, bitki dokularını korumak için çok önemlidir. Parazitik bitki haustorium durumunda, fiksasyon da önemlidir, çünkü bu organ genellikle öncelikle odunlaşmamış parankim hücrelerinden oluşur20. Fiksatif çözeltilerin hazırlanması da dahil olmak üzere bitki dokusu fiksasyonu için ayrıntılı protokoller başka bir yerde bulunabilir27. Öte yandan, fiksatifler az ya da çok bir dereceye kadar, bir numunenin fiziksel ve kimyasal özelliklerinde değişikliklere neden olabilir ve bu da numuneyi spesifik biyomekanik ve histokimyasal analizler için uygun hale getiremez. Böylece, taze numuneler, yani hazırlıktan hemen önce toplanan sabitlenmemiş malzeme de bu protokolle kullanılabilir. Yeni numunelerin nasıl işleneceğine ilişkin ayrıntılar ve sabitlenmiş malzeme için sorun giderme önerileri tartışma bölümünde verilmiştir.

<table><tbody><tr><td>3D X-ışını mikroskobu (XRM) sistemi</td><td></td><td>Zeiss Versa 620</td><td>taramak için kullanılır Pyrularia pubera</td></tr><tr><td>3D X-ışını mikroskobu + A2:D22</td><td>Zeiss</td><td>Versa 620</td><td>Türlerin taranması için kullanılır P. pubera</em</td></tr><tr><td>>CT-Pro 3D yazılımı</td><td>Nikon</td><td>sürüm XT 3.1.11</td><td>Taramaların üç boyutlu rekonstrüksiyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>CT-Vox yazılımı</td><td>Bruker</td><td>Sürüm 3.3.1</td><td>Görüntülerin ve videoların analizi ve elde edilmesi için kullanılır</td></tr><tr><td>Dragonfly yazılımı</td><td>Nesne Araştırma Sistemleri - ORS</td><td>sürümü</td><td>Görüntülerin ve videoların analizi ve edinimi için kullanılır</td></tr><tr><td>Cam şişeler Cam şişeler</td><td>Inc. SE</td><td>V2708C-FM-SP</td><td>VWR - ABD tarafından satılır; şişelerin yaklaşık 10 psi'de vakuma dayanabildiğinden emin olun</td></tr><tr><td>Inspect-X</td><td>Zeiss</td><td>sürüm XT 3.1.11</td><td>Nikon X-Tek HMXST225 sistemini kontrol etmek için kullanılır</td></tr><tr><td>İyot çözeltisi 0.0282 N</td><td>WR Kimyasallar BDH</td><td>BDH7422-1</td><td>VWR tarafından satılır - ABD</td></tr><tr><td>Kurşun Nitrat II PA 500 g</td><td>Vetec</td><td>361.08</td><td>SPLab tarafından satılır</td></tr><tr><td>Mikrotomografi tarayıcı</td><td>Bruker</td><td>Skyscan1176</td><td>C. americana, S. martianus, türlerini taramak için kullanılır, ve S. fungiforme</td></tr><tr><td>Mikrotomografi tarayıcı</td><td>Nikon</td><td>X-Tek HMXST225</td><td>Türlerin V. minimum</td></tr><tr><td>NRecon yazılımını</td> taramak için kullanılır <td>Bruker</td><td>sürüm 1.0.0</td><td>Üç boyutlu rekonstrüksiyon için kullanılır</td></tr><tr><td>Sulu çözelti içinde fosfotungstik asit hidrat %3</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>101410-756</td><td>VWR tarafından satılmaktadır - ABD</td></tr><tr><td>Plastik film (Parafilm)</td><td>Heathrow Scientific</td><td>PM996</td><td>VWR tarafından satılıyor - ABD</td></tr><tr><td>Plastik IV torba 500 mL</td><td>Taylor</td><td>3478</td><td>Fibra Cirurgica tarafından satılıyor Produtos para Saude</td></tr><tr><td>PVC boru 3/4''</td><td>Nalge Nunc International</td><td>SC63013-164</td><td>VWR tarafından satılıyor - ABD</td></tr><tr><td>Tarama sistemi</td><td></td><td>Nikon X-Tek HMXST225</td><td>Viscum minimum</td></tr><tr><td><</td><td>em>C. taramak için kullanılan</td> tarama sistemi <td></td><td>Bruker Skyscan 1176</td>. americana</tr><tr><td>Scout-and-ScanTM yazılımı</td><td>Zeiss</td><td>sürüm 16</td><td>Zeiss Versa 620 sistemini kontrol etmek ve taramaların üç boyutlu rekonstrüksiyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>Üç vana</td><td>ToToT</td><td>DMTWVS-5</td><td>Amazon ABD tarafından satılır</td></tr><tr><td>İki parçalı şırınga</td><td>HSW Henke-Ject</td><td>4850001000</td><td>olmadan kullanılır piston</td></tr><tr><td>Vakum odası Bağlayıcı</td><td></td><td>80080-434</td><td>VWR - ABD tarafından satılır; pompa ve bağlantı borularını içerir</td></tr><tr><td>VG Studio Max yazılımı</td><td>Volume Graphics</td><td>sürüm 3.0</td><td>Görüntülerin ve videoların analizi ve elde edilmesi için kullanılır</td></tr></tbody></table>

parazitik bitki-konakçı etkileşimlerini analiz etmek için mikro-bt taramasından yararlanma

Leveraging Micro-CT Scanning to Analyze Parasitic Plant-Host Interactions

Mikro-BT taraması, bitki yapısını ve işlevini araştırmada yerleşik bir araç haline gelmiştir. Tahribatsız doğası, üç boyutlu görselleştirme ve sanal bölümleme olasılığı ile birleştiğinde, karmaşık bitki organlarının yeni ve giderek daha ayrıntılı analizine izin vermiştir. Paraziter bitkiler ve konakçıları da dahil olmak üzere bitkiler arasındaki etkileşimler de araştırılabilir. Bununla birlikte, taramadan önce numune hazırlama, genellikle doku organizasyonu ve kompozisyonunda farklılık gösteren bu bitkiler arasındaki etkileşim nedeniyle çok önemli hale gelir. Ayrıca, parazitik çiçekli bitkilerin geniş çeşitliliği, oldukça azaltılmış bitkisel gövdelerden ağaçlara, bitkilere ve çalılara kadar, parazit konakçı materyalin örneklenmesi, işlenmesi ve hazırlanması sırasında dikkate alınmalıdır. Burada, haustoryumu analiz etmeye odaklanarak parazit ve / veya konakçı bitkilere kontrast çözeltileri sokmak için iki farklı yaklaşım açıklanmaktadır. Bu organ iki bitki arasındaki bağlantıyı ve iletişimi teşvik eder. Basit bir yaklaşımı takiben, haustorium doku organizasyonunun ayrıntıları, burada öfitoid, asma ve ökse otu parazitik türleri için gösterildiği gibi üç boyutlu olarak araştırılabilir. Spesifik zıt ajanların seçilmesi ve uygulama yaklaşımları, burada zorunlu bir kök parazit için gösterildiği gibi, konakçı vücutta endoparazit yayılımının ayrıntılı olarak gözlemlenmesine ve parazit ile konakçı arasındaki doğrudan damardan damara bağlantının tespit edilmesine de olanak tanır. Bu nedenle, burada tartışılan protokol, gelişimlerinin, yapılarının ve işlevlerinin anlaşılmasını ilerletmek için parazitik çiçekli bitkilerin geniş çeşitliliğine uygulanabilir.

Parazitik bitkilerin haustoriumu, konakçı olarak kullanılan başka bir bitkinin dokularıyla iç içe geçen ve bağlanan farklı doku ve hücre tiplerinden oluşan karmaşık bir organdır20. Mikro-BT taraması, hem küçük (Şekil 1A-C) hem de büyük (Şekil 1D, E) haustoria'yı analiz ederken bu karmaşık yapıyı tahribatsız ve üç boyutlu bir şekilde daha iyi anlamak için kullanılabilir. Bunu yapmak i...

Mikro-BT, bitki yapılarını üç boyutlu olarak analiz edebilen tahribatsız bir araçtır. Mevcut protokol, parazitik bitki yapısını ve işlevini analiz etmek için mikro-BT'den yararlanmak için numune hazırlamayı açıklamaktadır. Belirli preparatlarla birleştirildiğinde bu yöntemin avantajlarını vurgulamak için farklı türler kullanılır.

Parazitik bitki-konakçı etkileşimlerini analiz etmek için mikro-BT taramasından yararlanma

Micro-CT scanning has become an established tool in investigating plant structure and function. Its non-destructive nature, combined with the possibility ...

Bu protokol, mikrotomografi kullanılarak analiz edilecek örneklerde parazitik bitkinin dokuları ile konakçı arasındaki kontrastı önemli ölçüde artırır. Burada tarif edilen teknik, numune boyunca kontrast perfüzyon sürecini hızlandırır ve parazitik bitki ile konakçı arasında oluşan spesifik dokuların ve yapıların analizine izin verir. Vakum yaklaşımı çok basittir ve hiçbir zorluk sunmamalıdır.Öte yandan, perfüzyon aparatının kurulumu biraz zor olabilir. Ancak önceden pratik yapmak yardımcı olabilir. Odunsu olmayan küçük numuneler için, uygulama için vakum yöntemi kullanılabilir.Oysa profüzyon yöntemi, konakçı sapının veya kökün bir segmenti de dahil olmak üzere daha büyük ve odunsu numuneler için kullanılmalıdır. Vakum yöntemini kullanıyorsanız, numuneyi zıt çözeltiyi içeren şişeye yerleştirin. Ardından, şişeyi bir vakum pompasına bağlı bir vakum odasına veya kurutucuya yerleştirin.Kapağı şişeden çıkarın ve vakum odasını veya kurutucuyu kapatın. Vakum odasında veya kurutucuda çatlak olmadığını kontrol edin. Havayı dışarı çıkmaya zorlamak için haznenin veya kurutucunun egzoz valfini açın.Pompayı açın ve basınç yaklaşık 20 inç cıva veya 10 psi'ye ulaşana kadar bekleyin. Havanın tekrar girmesini önlemek için hazneyi veya kurutucu egzoz valfini kapatın. Ardından pompayı hızla kapatın.Numuneyi en az iki saat vakum altında bırakın. Profüzyon yöntemini kullanıyorsanız, besleme tankını numune boyutuna göre seçin. Küçük numuneler için, iğnesiz 50 mililitrelik bir şırınga tank olarak kullanılabilir.Şeffaf bir plastik borunun bir ucunu besleme tankına bağlayın. Ardından diğer ucunu iki yönlü veya üç bir valfe bağlayın. İkinci bir boruyu valfteki farklı bir prize bağlayın.Önceki adımda kurulan aparatı sökmeden besleme tankını yüksek bir konumda sabitleyin. Sıvının boru sisteminden çıkmasını önlemek için üç yönlü veya iki yönlü valfi kapatın ve kontrast çözeltiyi besleme tankına dökün. Boru sisteminde büyük hava kabarcıkları olmadığından emin olun ve aparatı yerinde bırakarak vanayı tekrar kapatın.Numuneyi kontrast çözeltisinin bolluğuna hazırlamak için, sıvıya batırılmış halde tutun ve konakçı sapının veya kökün proksimal ucunun ucunu kesin. Zıt çözeltinin yavaşça akmasına izin vermek için vanayı dikkatlice açın ve zıt çözeltinin dökülmesini önlemek için sistemin açık ucunu hafifçe yükseltilmiş bir konumda tutarken tanka bağlı plastik boruyu doldurun. Numunedeki konakçı gövdenin veya kökün proksimal ucunu boru sisteminin açık ucuna bağlayın.Çözeltinin numuneyi en az iki saat boyunca veya çözelti kabın içinde birikinceye kadar perfüze etmesine izin verin. Vanayı kapatın ve numuneyi cihazdan dikkatlice ayırın. Numuneyi iki dakika suya batırarak yıkayın.Numunenin tamamen kurumasına izin vermeden fazla suyun iki ila beş dakika buharlaşmasını sağlamak için numuneyi oda sıcaklığında bir kağıt havluya koyun. Numuneyi bir parafin filme sarın ve filmi numunenin üzerine katlamaktan kaçının. Mikro-BT taraması, parazitik bitkilerin karmaşık yapılarını ve konakçılarla etkileşimlerini tahribatsız, üç boyutlu bir şekilde daha iyi anlamak için kullanılabilir.Burada açıklanan protokoller farklı mikro-BT sistemleri için çalışır. Ancak, ayarlar ve parametreler sisteme ve örneklere bağlıdır. 3D X-ışını mikroskobu görüntüleri, parazit konakçı arayüzünde doku organizasyonunu ve topolojiyi analiz etmek için ışık mikroskobu altında gözlemlenen anatomik kesitler kadar etkiliydi.Kontrast çözeltisinin diferansiyel emilimine bağlı parlak beyaz ve koyu gri renk farkına dayanarak, haustoriumun vasküler çekirdeğini çevreleyen parankimin bolluğunu gözlemlemek mümkündür. İki vasküler iplikçik parankim ile ayrıldığı için vasküler çekirdek enine kesitlerde kolayca gözlenir. Etli bir konakçı bitkinin içinde büyüyen endoparazit Viscum minimum, karbonhidratları nişasta şeklinde depolayan parankim hücrelerini gösterdi.İyot emilimindeki fark, konakçı vücuttaki endoparazit tarafından oluşturulan karmaşık kortikal iplikçik ağının tespit edilmesine izin verdi. Cuscuta Americana ve Struthantus marcianus için elde edilen sonuçlar, sırasıyla küçük ve büyük örnekler için mikrotomografi yaklaşımının rahatlığını göstermeye yardımcı olmaktadır. Sanal seri kesitleme Sibelium fungiform, konakçı kökündeki damarların parazit yumrusuna çatallandığını ve iki bitki arasındaki ksilem sürekliliğinin perforasyon plakaları aracılığıyla damardan damara bağlantı ile oluştuğunu göstermiştir.Burada açıklanan prosedür, parazitik bitkiler ve konakçıları arasındaki bağlantının üç boyutlu yapısına yeni bakış açıları sağlamak için sanal segmentasyon gibi diğer tekniklerle birleştirilebilir. Bu teknik, endoparazitlerin gelişimi ve hiperparaziter bağlantıların işlevselliği de dahil olmak üzere parazitik bitkilerin biyolojisinin farklı yönlerini analiz etmenin yolunu açmıştır.

leveraging-micro-ct-scanning-to-analyze-parasitic-plant-host

Research

JoVE Journal

Environment

Çevre

Örümcek akarları, deney bitkilerin istilası ve bitki hasar değerlendirme homojen numune etkili hazırlanması için protokoller, bitki-zararlı etkileşim çalışmaları için gerekli olan geliştirilmiştir.

İki-benekli örümcek kenesi Uygulama<em&gt; Tetranychus urticae</em&gt; Bitki-belâ Etkileşim Çalışmaları

Taramalı elektron mikroskobu gözlemi için biyolojik örneklerin işlenmesindeki sorunlar arasında hücre çökmesi, ıslak mikro ortamlardan alınan örneklerin işlenmesi ve hücre tahribatı yer alır. Çiçek meristemleri, oomycete kistleri ve mantarlar (Agaricales) gibi zorlu numunelerin hazırlanması için uygun düşük maliyetli ve nispeten hızlı protokoller burada derlenmiş ve detaylandırılmıştır.

Sorunlu Tesisi, Oomiçet ve fungal Örnekleri için Elektron Mikroskobu (SEM) Protokoller tarayarak

Biz x-ışını soğurma kontrast Mısır doku sıradan microcomputed tomografi taramak için uygun geliştirmek için yeni bir yöntem sağlar. CT görüntüleri baz alınarak, biz görüntü işleme iş akışları için etkili bir şekilde Mısır Vaskular demetleri mikroskobik fenotipleri ayıklamak farklı Mısır malzeme bir dizi tanıtmak.

X-ışını Microcomputed tomografi üzerinde dayalı Mısır Vaskular demetleri mikron çaplı fenotipleme teknikleri

Burada, üç deniz omurgasız hayvanın microfocus X-ışını bilgisayarlı tomografi (microCT) görüntülenmesi için protokoller ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu çalışmada örnek fiktasyon, boyama, montaj, tarama, görüntü yeniden yapılanma ve veri analizleri gibi adımlar açıklanmaktadır. Protokolün farklı örnekler için nasıl ayarlanacağı konusunda öneriler de sağlanmıştır.

Actinia equina (cnidaria), harmothoe Sp. (Annelida) ve xenoturbella japonica (xenacoelomorpha) Microfocus X-Ray CT (MicroCT) görüntüleme

Toplumları büyük olasılıkla içinde birçok bitki arbuscular mikorizal (AM) mantarlar tarafından birbirine bağlanır, ancak onlar tarafından bitki etkileşimlerin arabuluculuk öncelikle mycorrhizas olmadan karşı ile bitkiler büyüyen tarafından araştırıldı. Biz onların sonuçları bitki etkileşimleri için araştırmaya mikorizal bitkiler arasında ortak mikorizal ağları yönetmek için bir yöntem mevcut.

Bitki etkileşimleri döndürülmüş çekirdeği kullanan ortak mikorizal ağlar üzerinden incelenmesi

Mevcut protokol, Ditylenchus dipsaci'nin kültürlenmesi, toplanması ve taranması için güvenilir ve basit bir yöntem tanımlamaktadır.

Bitki Parazitik Nematodu Ditylenchus dipsaci Kültürleme ve Eleme

Bu protokol, bitki köklerini toprak kaynaklı mikroplarla aşılamak için stratejilerin ayrıntılı bir özetini sunar. Verticillium longisporum ve Verticillium dahliae mantarları için örneklendirilen üç farklı kök enfeksiyon sistemi tanımlanmıştır. Potansiyel uygulamalar ve olası aşağı akış analizleri vurgulanır ve her sistem için avantajlar veya dezavantajlar tartışılır.

Bitki Köklerini Toprak Kaynaklı Mikroorganizmalarla Enfekte Etmek için Aşılama Stratejileri

Buradaki protokol, arbusküler mikorizal kolonizasyon paternlerinin değerlendirilmesi için yöntemleri ve iki türün köklerindeki stratejiyi açıklamaktadır: Zea mays ve Festuca rubra. MycoPatt yönteminin kullanılması, parametrelerin hesaplanmasına, mikorizal yapıların dijital verilere dönüştürülmesine ve köklerdeki gerçek konumlarının haritalandırılmasına izin verir.

Festuca rubra ve Zea mays'ın Köklerinde Kolonizasyon Kalıplarını ve Mantar Stratejilerini Keşfetmek İçin Bir Araç Olarak Mikorizal Haritalar

Bu protokol, mikoheterotrofik bitki örneklerinin toplanması, sabitlenmesi ve sürdürülmesi için ayrıntılı prosedürler sağlamayı, mikorizal mantarlarla çimlenmiş bitki dokularında ve tohumlarda mantar kolonizasyonunu incelemek için tarama ve iletim elektron mikroskobu, ışık, konfokal ve floresan mikroskobu gibi farklı mikroskopi tekniklerini uygulamayı amaçlamaktadır.

Mikoheterotrofik Bitki Dokularında Mantar Kolonizasyonunu Yorumlamak ve Tohumların Simbiyotik Çimlenmesi için Mikroskopi Teknikleri

Bu makale, mantar bitki patojenleri ile mısır etkileşimlerinin tekrarlanabilir sitolojik, fizyolojik ve moleküler çalışmaları için ayrılmış mısır yaprağı kılıflarını kullanan optimize edilmiş bir aşılama protokolünü detaylandırmaktadır. Yaprak kılıfları, sabitlenmemiş dokularda canlı bitki ve mantar arasındaki hücresel etkileşimlerin gerçek zamanlı gözlemini kolaylaştırır.

Mantar yaprakları mısır patojenlerinin neden olduğu enfeksiyonun canlı hücre görüntülemesi için müstakil mısır kılıfları

Mikrobiyota ve biyofilm ile birlikte bitki ve mantar biyokütlesi içeren oldukça heterojen ve hassas numuneleri görselleştirmek için optimize edilmiş bir Taramalı Elektron Mikroskobu protokolü öneriyoruz. Bu protokol, mikrobiyota organizasyonunun mekansal boyutlarının tanımlanmasına izin verir.

Attine Karıncalarının Bahçelerinin Mikrobiyotası: Elektron Mikroskobunu Tarayarak Mikrobiyal Bir Manzarayı Görselleştirmek

Öğrenin parazitik bitki-konakçı etkileşimlerini analiz etmek için mikro-BT taraması ve vakum perfüzyon yöntemi kullanarak. Bu teknik, dokular arası kontrastı artırarak üç boyutlu yapıların incelenmesini sağlar.

Parazitik bitki-konakçı etkileşimlerini analiz etmek için mikro-BT taramasından yararlanma

Daha fazla video keşfet