Floresan Görüntüleme için Bitki Dokularının Optik Temizlenmesi

Bu yöntem, bozulmamış morfolojiyi, gelişimsel süreçleri ve bitki-mikrop etkileşimlerini ortaya çıkarmak için tüm bitki görüntülemede yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, bir bitki gövdesinin içini zarar vermeden doğrudan gözlemleyebilmemizdir. Bu yöntem çok çeşitli bitki türleri ve dokuları için geçerli olduğundan, bitki biyolojik araştırmalarında yeni olayların keşfini hızlandırmaya yardımcı olabilir.

Fiksasyon bu yordamda kritik bir adımdır. Temizleme adımından önce, fiksasyondan sonra floresan proteinin yoğunluğunu kontrol etmek gerekir. Bitki numunelerini fiksatif çözeltiye bir mikro tüp içinde daldırmaya başlamak ve fiksatif çözeltinin hacminin numune hacminin beş katından fazla olduğundan emin olmak.

Mikro tüpü bir parafilm ile kapatın ve bir iğne kullanarak delikler açın. Mikro tüpü bir kurutucuya yerleştirin ve vakum derecesini yavaşça yaklaşık 690 milimetre cıvaya ayarlayın, böylece kabarcıklar numunelerden yavaş yavaş ortaya çıkar. Kurutucuyu tahliye ettikten sonra vakum pompasını kapatın.

Numuneleri rahatsız etmeden kurutucuyu dikkatlice havalandırın. Vakum pompasını tekrar açın ve kurutucuyu tahliye ettikten sonra kapatın. Fiksatif çözeltiyi mikrotüp içinde çarpmadan kurutucuyu dikkatlice açın.

Fiksatif çözeltiyi çıkarın ve mikro pipetle 1x PBS ekleyin. Bir dakika sakladıktan sonra, eski PBS'yi yeni 1x PBS ile değiştirin. PBS'yi temizleme çözeltisinin numune hacminin beş katından çıkardıktan sonra, mikro tüpü parafilm ile kapatın ve bir iğne ile delikler açın.

Örnekleri kurutucuya yerleştirin. Vakum pompasını boşaltın ve kapatın. Kurutucuyu yavaşça açın, ardından mikrotüpü kapatın.

Temizleme işlemini hızlandırmak için mikro tüpü her bir ila iki günde bir ters çevirin. Ara parça çerçevesi için, silikon kauçuk levha kalınlığını numune kalınlığına göre ayarlayan bir jilet bıçağı ile bir silikon kauçuk levha kesin. Silikon çerçeveyi bir kapak camına yerleştirin, ardından işlenmiş numuneleri çerçevenin içine yerleştirin ve kabarcıkları gidermek için yaklaşık 100 mikrolitre temizleme çözeltisi ekleyin.

Temizleme çözeltisinin buharlaşmasını önlemek için başka bir kapak camı ile örtün. Örnekleri floresan mikroskop altında gözlemleyin. Gözlemden sonra numuneleri bir mikrotüp içindeki temizleme çözeltisine geri döndürün.

Çeşitli türlerin sabit yaprakları PBS veya ClearSee'de sekiz gün, ClearSee veya ClearSeeAlpha'da iki gün boyunca inkübe edildi. ClearSee çeşitli türlerin yapraklarını temizleyebilir. Kütiküler çıkarıldıktan sonra, ClearSee pirinç yapraklarını temizleyebilir.

ClearSeeAlpha'daki sodyum sülfit bileşeni, indirgeyici etki nedeniyle polifenol oksidasyonunu önlediğinden, ClearSeeAlpha herhangi bir kahverengi pigmentasyon olmadan tütün ve tirania tabancalarını temizleyebilir. Arabidopsis thaliana'nın Ubiquitin-10 promotörü H2B-mClover yaprakları üç gün boyunca PBS veya ClearSee ile tedavi edildi. ClearSee tedavisi, arabidopsis H2B-mClover yaprağının soluk yeşil rengini azalttı ve PBS inkübasyonuna kıyasla H2B-mClover'ın floresan yoğunluğunu arttırdı.

ClearSee ile tedavi edilen yapraklar, 950 nanometre uyarma ile iki foton uyarma mikroskobu ile gözlendi. Hücre duvarı kalsaun beyazı ile boyanır. Çekirdekler ubikitin-10 promotörü, H2B-mClover ile etiketlenmiştir.

Y Z ve X Z görüntüleri, beyaz kesikli çizgilerle gösterilen konumda kesitlerdir. Fiksatif çözeltinin hazırlanması, numuneleri sabitlemek için önemlidir. Bununla birlikte, vakum altındaki numunelerin zarar görmesini önlemek için özen gösterilmelidir.

Bu prosedürü takiben bitki gelişimi ve enfeksiyonu sırasında çoklu gen ekspresyon paternlerini ve hücre içi iletişimi incelemek için mikroskobik görüntüleme yapılabilir.