Name: 3D Biyobaskı için Adipoz Türevi Kök Hücre Sferoidlerinin Büyük Ölçekli, Otomatik Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Öğrenin, otomatik pipetleme sistemiyle adipoz türevi kök hücre sferoidlerinin büyük ölçekli üretimini. Bu yöntem, 3D biyobaskı için homojen sferoidler elde ederek insan hatalarını ve kontaminasyon riskini azaltır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ulusal Metroloji, Kalite ve Teknoloji Enstitüsü'ne (INMETRO, RJ, Brezilya) tesislerinin kullanımı için teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Carlos Chagas Filho Rio de Janeiro Eyaleti Araştırma Destek Vakfı (Faperj) (finans Kodu: E26/202.682/2018 ve E-26/010.001771/2019), Ulusal Bilimsel ve Teknolojik Kalkınma Konseyi (CNPq) (finans kodu: 307460/2019-3) ve Deniz Araştırmaları Ofisi (ONR) (finans kodu: N62909-21-1-2091) tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma kısmen Rejeneratif Tıp Ulusal Bilim ve Teknoloji Merkezi-INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/) tarafından desteklenmiştir.

Bu çalışmada kullanılan ASC'ler daha önce sağlıklı insan donörlerinden izole edilmiş ve Brezilya Rio de Janeiro Federal Üniversitesi, Clementino Fraga Filho Üniversitesi Hastanesi Araştırma Etik Komitesi'ne göre14'te açıklandığı gibi kriyokorunmuştur (25818719.4.0000.5257). Bu çalışmada kullanılan tüm malzeme ve ekipmanlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakınız.
1. Üçüncü pasajda ASC tek katmanının tripsinizasyonu
<ol><li>ASC'lerin tek katmanını içeren 175cm2 uzunluğundaki doku kültürünü %80 birleşimde açın ve süpernatanı atın.</li>
	<li>7 mL fosfat tamponlu salin (PBS, 0,01 M) ekleyin ve tek katmanı iki kez yıkayın. Ardından, sıvıyı atın.</li>
	<li>0.78 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile 5 mL% 0.125 tripsin ekleyin. Daha sonra, 37 ° C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>175cm2 şişe doku kültürüne %10 fetal sığır serumu (FBS) ile 10 mL düşük glukozlu Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM LOW) ekleyin ve hücre süspansiyonunu 10 mL'lik bir sörolojik pipetle iyice karıştırın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 10 mL'lik bir serolojik pipetle toplayın ve 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra, ASC'lerin peletini elde etmek için 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüj yapın. % 10 FBS içeren DMEM LOW kullanarak hücre peletini yeniden askıya alın.</li>
	<li>Trypan dışlamasıyla hücre sayımı gerçekleştirin.</li>
	<li>Saydıktan sonra, yapışmaz hidrojel ile mikrokalıplanmış 81 durgunluğu tohumlamak için ayrı bir 15 mL santrifüj tüpünde toplam 1 × 106 ASC alın (burada tohumlanan toplam 10.000 hücre / mL). Mikrokalıplanmış yapışkan olmayan hidrojelin 256 durgunluğunu tohumlamak için, bir santrifüj tüpüne toplam 5 × 105 ASC alın (burada tohumlanan toplam 2.500 hücre / mL).</li>
</ol>2. Mikrokalıplanmış yapışkan olmayan agaroz hidrojel imalatı
<ol><li>Ultra saf suda% 0.9 NaCl'de% 2 ultrasaf agarozun 50 mL'lik steril bir çözeltisini hazırlayın. Çözeltiyi 121 °C'de 30 dakika otoklav yapın.</li>
	<li>81 veya 256 dairesel girinti içeren bir silikon kalıbın ortasına 500 μL steril% 2 ultrasaf agaroz çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>40 dakika sonra, ultra saf agarozu silikon kalıptan çıkarın ve 12 delikli plastik plakanın bir kuyucuğuna yerleştirin.</li>
	<li>Mikromolde agaroz ile kuyuya 2 mL DMEM LOW ekleyin ve ASC'leri tohumlamadan önce en az12 saat boyunca% 5 CO 2 atmosferinde 37 ° C'de bir inkübatörde inkübe edin.</li>
</ol>3. Otomatik pipetleme sistemi kullanılarak ASC sferoidlerinin biyofabrikasyonu
<ol><li>Aşağıdakileri kontrol edin:<ol>
<li>Laminer akışın açık olup olmadığını ve kabinin hava akışının düzgün çalışıp çalışmadığını kontrol edin.</li>
		<li>Ekipmanın doğru voltaja bağlı olup olmadığını kontrol edin.</li>
		<li>Tabletin ekipmana bağlı olup olmadığını kontrol edin.</li>
		<li>Kabin koruma camının yüksekliğinin, ekipmanın sensör işaretiyle aynı yükseklikte olup olmadığını kontrol edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Ekipmanın sol tarafındaki Açma/Kapama düğmesine basın ve tabletin ve ekipmanın başlamasını bekleyin.</li>
	<li>Uç kutularını, santrifüj tüpleri için rafı ve mikrokalıplanmış agaroz hidrojelini içeren plakayı ekipmanın çalışma alanına yerleştirin.</li>
	<li>Yazılımın açık olduğu tablette, önce Labware Editor'a tıklayın.</li>
	<li>Sanal bir çalışma masası kurun ve pipetlerin, uç kutularının, plastik tüplerin rafının ve plakaların konumlarını seçin. NOT: Sanal çalışma masası, ekipmandaki aksesuarların fiziksel konumlarını temsil etmelidir.</li>
	<li>Ekipmanın deney boyunca gerçekleştireceği parametreleri (bkz. adım 3.10) ve komutları dahil etmek için Üretime Geç'e tıklayın düğmesine tıklayın. Yazılımda bir araç çubuğunun ve bir Üretim Listesinin açılmasını bekleyin.</li>
	<li>Başlangıçta, komutları belirtmek için, pipetlenecek örneklerin sayısını ekleyin ve Üretme Listesi'ne sürükleyin. NOT: Numune sayısı, mikro kalıpların ortasına tohumlanacak ASC süspansiyonunu içeren plastik santrifüj tüplerinin sayısıdır.</li>
	<li>Numune sayısını girdikten sonra, ASC süspansiyonunu mikro kalıpları içeren 12 delikli plakanın kuyularına aktarmak için yazılımdaki Numune Aktarımı komut düğmesine tıklayın ve Ürün Listesi'ne sürükleyin.</li>
	<li>Ekipmanın numuneyi aktarması için başlangıç ve bitiş konumlarını ayarlamak üzere Özellikler'e tıklayın.</li>
	<li>Yazılımın Çalışma Masası sayfasına dönmesini bekleyin. ASC'lerin otomatik tohumlama parametrelerini ayarlamak için Seçenekler düğmesine tıklayın: i) 15.4 s-1 Aspirasyon Hızı; ii) 1 s-1 Dağıtım Hızı; iii) 0 ms'lik Darbe Gecikmesi; iv) 15.4 s-1 Üfleme Hızı; v) %100 İlk İnme. Standart Sıvı Türü olarak Su'yu seçin. </li>
	<li>Homojen bir süspansiyon elde etmek için ASC'leri karıştırmak üzere parametreleri ayarlayın: i) 5'lik Döngü Sayısı; ii) 6,5 s-1 hızı; iii) 300 μL'lik hacim.</li>
	<li>Parametreleri ayarladıktan sonra, Üretim Listesi'ne 40 dakikalık Süre ekleyin. NOT: Bu süre, ASC süspansiyonunun mikro kalıbın dibinde sönmesini beklemek için gereklidir.</li>
	<li>Ürün Listesi'nde, küresel kültür ortamını plakanın karşılık gelen kuyucuklarına aktarmak için Reaktif Transferi seçeneğini ekleyin.</li>
	<li>Küresel kültür ortamını aktarmak üzere konum ve parametre yapılandırmalarını ayarlamak için 3.9-3.11 arasındaki adımları yineleyin.</li>
	<li>Programlama hatası olmadığından emin olmak için yazılımın üst çubuğunda bir kontrol sembolü bulunan düğmeye tıklayın.</li>
	<li>Programı başlatmak için yazılımın üst çubuğundaki Oynat düğmesine (üçgen sembolü ile) tıklayın.</li>
	<li>Ekipmanın programlandığı gibi başlamasına izin verin ve bittiğini belirten bir ses çıkarmasını bekleyin.</li>
	<li>12 delikli plakayı toplayın ve sferoidlerin tamamen oluşması ve kompakt olması için 37 ° C'de,% 5 CO2'de en az 18 saat boyunca bir inkübatörde inkübe edin.</li>
	<li>Analiz için 1, 3 ve 7 günlük kültürden sonra sferoidleri manuel olarak hasat edin. Sferoidleri mikrokalıplanmış yapışkan olmayan agaroz hidrojelinden kurtarmak için ortamı bir mikropipetle manuel olarak yıkayın.</li>
	<li>5 dakika sonra, sferoidlerin mikrokalıplanmış yapışkan olmayan agaroz hidrojelinden tamamen salınıp salınmadığını belirlemek için mikroskop altında kontrol edin.</li>
	<li>Bir mikropipet kullanarak sferoidleri manuel olarak toplayın ve 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>Sferoidleri 0.01 M PBS ile en az iki kez yıkayın. Canlılığı değerlendirin ve taze küresel numuneler üzerinde biyomekanik analizler gerçekleştirin. Morfoloji analizi (histoloji) için, küresel numuneleri PBS'de% 4 paraformaldehit içinde 2-8 ° C'de en az 18 saat boyunca inkübe edin.</li>
</ol>

<ol><li>Gentile, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filling+the+gaps+between+the+in+vivo+and+in+vitro+microenvironment%3A+Engineering+of+spheroids+for+stem+cell+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Filling the gaps between the in vivo and in vitro microenvironment: Engineering of spheroids for stem cell technology.</a> Current Stem Cell Research & Therapy. 11 (8), 652-665 (2016).</li>
<li>Bartosh, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+human+mesenchymal+stromal+cells+%28MSCs%29+into+3D+spheroids+enhances+their+antiinflammatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).</li>
<li>Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+three-dimensional+culture+methods+enhance+mesenchymal+stem+cell+properties+and+increase+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 16 (4), 735-749 (2009).</li>
<li>Cortês, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scaffold-+and+serum-free+method+to+mimic+human+stable+cartilage+validated+by+secretome%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%3A+Part+A%22%5BJournal%5D)">A scaffold- and serum-free method to mimic human stable cartilage validated by secretome.</a> Tissue Engineering: Part A. 27 (5-6), 311-327 (2021).</li>
<li>Kronemberger, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-+and+serum-free+hypertrophic+cartilage+tissue+engineering+as+an+alternative+approach+for+bone+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Artificial+Organs%22%5BJournal%5D)">Scaffold- and serum-free hypertrophic cartilage tissue engineering as an alternative approach for bone repair.</a> Artificial Organs. 44 (7), 288-299 (2020).</li>
<li>Kronemberger, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hypertrophic+cartilage+induction+influences+the+building-block+capacity+of+human+adipose+stem%2Fstromal+cell+spheroids+for+biofabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Artificial+Organs%22%5BJournal%5D)">The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication.</a> Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).</li>
<li>Mehesz, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+robotic+biofabrication+of+tissue+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids.</a> Biofabrication. 3 (2), 025002(2011).</li>
<li>Koudan, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+scalable+standardized+biofabrication+of+tissue+spheroids+from+different+cell+types+using+nonadhesive+technology%5BTitle%5D)+AND+%223D+Printing+and+Additive+Manufacturing%22%5BJournal%5D)">The scalable standardized biofabrication of tissue spheroids from different cell types using nonadhesive technology.</a> 3D Printing and Additive Manufacturing. 4 (1), 53-60 (2017).</li>
<li>Parfenov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((label-free+and+nozzle-free+biofabrication+technology+using+magnetic+levitational+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly.</a> Biofabrication. 10 (3), 034104(2018).</li>
<li>Laschke, M. W., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+is+3D%3A+Boosting+spheroid+function+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering.</a> Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).</li>
<li>Gutzweiler, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+scale+production+and+controlled+deposition+of+single+HUVEC+spheroids+for+bioprinting+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Large scale production and controlled deposition of single HUVEC spheroids for bioprinting applications.</a> Biofabrication. 9 (2), 025027(2017).</li>
<li>Lin, H., Li, Q., Lei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tissues+using+human+pluripotent+stem+cell+spheroids+as+biofabrication+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tissues using human pluripotent stem cell spheroids as biofabrication building blocks.</a> Biofabrication. 9 (2), 025007(2017).</li>
<li>Groll, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofabrication%3A+reappraising+the+definition+of+an+evolving+field%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Biofabrication: reappraising the definition of an evolving field.</a> Biofabrication. 8 (1), 013001(2016).</li>
<li>Baptista, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+method+for+the+isolation+of+mesenchymal+stromal+cells+derived+from+lipoaspirate+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">An alternative method for the isolation of mesenchymal stromal cells derived from lipoaspirate samples.</a> Cytotherapy. 11 (6), 706-715 (2009).</li>
<li>Conway, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+96-well+plate+based+iPSC+culture+and+production+using+a+robotic+liquid+handling+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3AJoVE%22%5BJournal%5D)">Scalable 96-well plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (99), e52755(2015).</li>
<li>Moutsatsou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation+in+cell+and+gene+therapy+manufacturing%3A+from+past+to+future%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Letters%22%5BJournal%5D)">Automation in cell and gene therapy manufacturing: from past to future.</a> Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).</li>
<li>Doulgkeroglou, M. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation%2C+monitoring%2C+and+standardization+of+cell+product+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811(2020).</li>
<li>Bhise, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+liver-on-a-chip+platform+with+bioprinted+hepatic+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">A liver-on-a-chip platform with bioprinted hepatic spheroids.</a> Biofabrication. 8 (1), 014101(2016).</li>
<li>Daly, A. C., Kelly, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofabrication+of+spatially+organised+tissues+by+directing+the+growth+of+cellular+spheroids+within+3D+printed+polymeric+microchambers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biofabrication of spatially organised tissues by directing the growth of cellular spheroids within 3D printed polymeric microchambers.</a> Biomaterials. 197, 194-206 (2019).</li>
<li>Lopa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+biofabrication+of+3D+multicellular+spheroids+by+modulation+of+non-geometrical+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic biofabrication of 3D multicellular spheroids by modulation of non-geometrical parameters.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 366(2020).</li>
<li>Meseguer-Ripolles, J., Kasarinaite, A., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+automated+production+of+human+stem+cell+derived+liver+spheres%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for automated production of human stem cell derived liver spheres.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100502(2021).</li>
<li>Lee, G. -H., Suh, Y., Park, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+paired+bead+and+magnet+array+for+molding+microwells+with+variable+concave+geometries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55548(2018).</li>
<li>Becerra, D., Wu, T., Jeffs, S., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+culture+method+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C+-+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput culture method of induced pluripotent stem cell-derived alveolar epithelial cells.</a> Tissue Engineering Part C - Methods. 27 (12), 639-648 (2021).</li>
<li>Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+printing%3A+from+bioprinter+to+organ+biofabrication+line%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line.</a> Current Opinion Biotechnology. 22 (5), 667-673 (2011).</li>
<li>De Moor, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+fabrication+of+vascularized+spheroids+for+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting.</a> Biofabrication. 10 (3), 035009(2018).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Bu yazıda, otomatik pipet sistemi kullanılarak ASC sferoidlerinin büyük ölçekli üretimi sunulmaktadır. Protokolün kritik adımı, pipetleme için doğru hücre süspansiyonu, hızı ve mesafe hacmini sağlamak için yazılımı hassas bir şekilde ayarlamaktır. Protokolde açıklanan parametreler, ASC hücre süspansiyonunun mikrokalıplanmış, yapışkan olmayan hidrojelleri içeren 12 kuyucuklu plakaların kuyucuklarına dağıtılmasını optimize etmek için bir dizi denemeden sonra belirlenmiştir. Optimizasyon, sferoidlerin çapı ve sferikliği ölç...

Sferoidler, doku mühendisliğinde iskelesiz bir yaklaşım olarak kabul edilir. ASC'ler, kendi kendine montaj işlemi ile sferoidler oluşturabilir. Küreselin 3D mikromimarisi, çoklu soylarafarklılaşma kapasitesi de dahil olmak üzere ASC'lerin rejeneratif potansiyelini arttırır 1,2,3. Bu araştırma grubu, kıkırdak ve kemik dokusu mühendisliği 4,5,6 için ASC sferoidleri ile çalışmaktadır. Daha da önemlisi, sferoidler, esas olarak füzyon kapasiteleri nedeniyle, doku ve organların biyofabrikasyonunda yapı taşları olarak kabul edilir.
Doku oluşumu için sferoidlerin kullanımı üç ana noktaya bağlıdır: (1) biyofabrikasyonları için standartlaştırılmış ve ölçeklenebilir robotik yöntemlerin geliştirilmesi7, (2) doku sferoidlerinin sistematik fenotiplenmesi8, (3) 3D dokuların montajı için yöntemlerin geliştirilmesi9. Bu sferoidler farklı hücre tipleri ile oluşturulabilir ve asılı damla, yeniden agregasyon, mikroakışkanlar ve mikrokalıplar 8,9,10 dahil olmak üzere çeşitli yöntemlerle elde edilebilir. Bu yöntemlerin her birinin, sferoidlerin boyut ve şeklinin homojenliği, sferoidlerin oluştuktan sonra geri kazanımı, üretilen sferoid sayısı, proses otomasyonu, emek yoğunluğu ve maliyetleri ile ilgili avantaj ve dezavantajları vardır11.
Mikrokalıp yönteminde, hücreler yerçekimi nedeniyle mikro kalıbın dibinde dağıtılır ve biriktirilir. Yapışkan olmayan hidrojel, hücrelerin tabana yapışmasına izin vermez ve hücreden hücreye etkileşimler, durgunluk başına tek bir sferoid oluşumuna yol açar 8,12. Bu biyofabrikasyon yöntemi, homojen ve kontrollü boyutta sferoidler üretir, büyük ölçekli üretim için minimum çabayla zaman verimli bir şekilde robotlaştırılabilir ve doku sferoidinin biyofabrikasyonunun tasarımında iyi maliyet etkinliği-kritik faktörlere sahiptir 7,8. Bu yöntem, öngörülebilir, optimal ve kontrol edilebilir özelliklere sahip yeni bir doku tipi hazırlamak için herhangi bir hücre soyunun sferoidlerini oluşturmak için uygulanabilir8.
Biyofabrikasyon, "biyolojik olarak işlevsel ürünlerin yapısal organizasyonla otomatik olarak üretilmesi" olarak tanımlanmaktadır."13. Bu nedenle, sferoidlerin otomatik üretimi, 3D biyobaskı sürecinde devam eden ve sferoid füzyon ile biyobaskılı dokunun tam olgunlaşmasında biten bir biyofabrikasyon hattı geliştirmek için ilk zorunlu adım olarak kabul edilir. Bu çalışmada, ASC sferoid biyofabrikasyonunun ölçeklenebilirliğini artırmak için, hücre süspansiyonunu tohumlamak için otomatik bir pipetleme sistemi kullanıyoruz, böylece küresel boyut ve şeklin homojenliğini sağlıyoruz. Bu makale, daha karmaşık doku modellerini biyofabrikasyona dönüştürmek için 3D biyobaskı yaklaşımları için gerekli olan çok sayıda (binlerce) sferoid üretmenin mümkün olduğunu göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>12 kuyulu plastik plaka</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>50 mL santrifüj tüpü</td><td>Corning</td><td>CLS430828</td><td></td></tr><tr><td>EpMotion 5070</td><td>Eppendorf</td><td>5070000282</td><td></td></tr><tr><td>epT.I.P.S. Hareket</td><td>Eppendorf</td><td>30015231</td><td></td></tr><tr><td>etilendiamintetraasetik asit (EDTA)</td><td>İnvitrojen</td><td>15576028</td><td></td></tr><tr><td>fetal sığır serumu (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Düşük Glikoz Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM DÜŞÜK)</td><td>Gibco</td><td>31600034</td><td></td></tr><tr><td>MicroTissue 3D Petri Kabı mikro kalıp sferoidleri - 16 x 16 dizi</td><td>Sigma</td><td></td><td></td>Z764000</tr><tr><td>MicroTissue 3D Petri Kabı mikro kalıp sferoidleri - 9 x 9 dizi</td><td>Sigma</td><td>Z764019</td><td></td></tr><tr><td>fosfat salin tamponu (PBS)</td> <td>Sigma</td><td>806552</td><td></td></tr><tr><td>sodyum klorür (NaCl)</td> <td>Sigma</td><td>S8776</td><td></td></tr><tr><td>doku kültürü</td><td>şişesi Corning</td><td>430720U</td><td></td></tr><tr><td>tripan</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>tripsin</td><td>Gibco</td><td>27250018</td><td></td></tr><tr><td>ultra saf agaroz</td><td>Invitrogen</td><td>16500100</td><td></td></tr></tbody></table>

3d biyobaskı için adipoz türevi kök hücre sferoidlerinin büyük Ölçekli, otomatik Üretimi

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Adipoz kaynaklı stromal/kök hücreler (ASC'ler), klasik mezenkimal stromal/kök hücre kaynağı olarak kabul edilen insan deri altı yağ dokusunun stromal vasküler fraksiyonunda bulunan hücrelerin bir alt popülasyonudur. İskele tabanlı doku mühendisliği yaklaşımları için ASC'lerle birçok çalışma yayınlanmıştır, bu da esas olarak bu hücrelerin biyoaktif iskelelerde tohumlandıktan sonraki davranışlarını araştırmıştır. Bununla birlikte, iskele tabanlı yaklaşımların sınırlamalarının üstesinden gelmek için in vitro ve in vivo dokuları mühendislik yapmak için, esas olarak sferoidler kullanarak, iskelesiz yaklaşımlar ortaya çıkmaktadır.
Sferoidler, kendi kendine montaj işlemi ile oluşan 3D mikrodokulardır. Doğal dokuların mimarisini ve mikro ortamını, esas olarak hücreden hücreye ve hücreden hücre dışı matris etkileşimlerinin büyütülmesinden dolayı daha iyi taklit edebilirler. Son zamanlarda, sferoidler esas olarak hastalık modelleri, ilaç tarama çalışmaları ve 3D biyobaskı için yapı taşları olarak araştırılmaktadır. Bununla birlikte, 3D biyobaskı yaklaşımları için, karmaşık doku ve organ modellerini biyofabrikasyon yapmak için boyut ve şekil olarak homojen çok sayıda sferoid gereklidir. Ek olarak, sferoidler otomatik olarak üretildiğinde, mikrobiyolojik kontaminasyon için çok az şans vardır ve bu da yöntemin tekrarlanabilirliğini arttırır.
Büyük ölçekli sferoidlerin üretimi, 3D biyobaskı sürecinde devam eden ve biyoreaktörlerdeki doku yapısının tam olgunlaşmasında biten bir biyofabrikasyon hattı geliştirmek için ilk zorunlu adım olarak kabul edilir. Bununla birlikte, büyük ölçekli ASC sferoid üretimini araştıran çalışmaların sayısı, ASC sferoidlerini 3D biyobaskı için yapı taşları olarak kullanan çalışmaların sayısı ile birlikte hala azdır. Bu nedenle, bu makale, ASC sferoidlerini 3D biyobaskı yaklaşımları için yapı taşları olarak yayan yapışkan olmayan mikrokalıplanmış bir hidrojel tekniği kullanılarak ASC sferoidlerinin büyük ölçekli üretimini göstermeyi amaçlamaktadır.

Otomatik pipet sistemi, ASC hücre süspansiyonunu 15 dakika içinde 12 delikli bir plakanın 12 kuyucuğuna tohumlayabilir. 81 mikrokalıplanmış yapışkan olmayan hidrojelin kullanılması, protokolün sonunda 972 sferoid üretecektir. 256 mikrokalıplanmış yapışkan olmayan hidrojelin kullanılması, protokolün sonunda 3.072 sferoid üretecektir. ASC sferoidleri, boyutlarının ve şekillerinin homojenliği açısından analiz edildi. 81 resesyonlu mikromoldlardan elde edilen ASC sferoidleri, 256 resesyon ile mikromoldlardan ASC sferoidlerin...

Burada, hücre süspansiyonunu tohumlamak için otomatik bir pipetleme sistemi kullanarak adipoz türevli stromal/kök hücre (ASC) sferoidlerinin büyük ölçekli üretimini açıklıyoruz, böylece küresel boyut ve şeklin homojenliğini sağlıyoruz. Bu ASC sferoidleri, 3D biyobaskı yaklaşımları için yapı taşları olarak kullanılabilir.

3D Biyobaskı için Adipoz Türevi Kök Hücre Sferoidlerinin Büyük Ölçekli, Otomatik Üretimi

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

Protokolün önemi, insan hatalarını ve mikrobiyoloji kontaminasyonunu azaltmaya dayanmaktadır. Buna ek olarak, 3D biyobaskı yaklaşımları için binlerce sferoid üretmekten sorumludur. Bununla birlikte, bu konunun en büyük avantajı, çalışma saatlerini optimize etmesidir.Yazılım parametreleri çok önemlidir çünkü sferoidlerin nihai kalitesini etkileyebilirler. Ve en iyi tavsiye, sadece hücre kültürü ortamı ile testler yapmak olacaktır. Bu yöntemin görsel gösterimi kritiktir, çünkü kök hücre süspansiyonunu 10 mililitrelik bir serolojik pipetle hasat ederek ve 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktararak Begin'e dayanan eski bir geleneksel 3D hücre kültürü yöntemidir.Daha sonra, ASC peletini elde etmek için 5 dakika boyunca 400 RCF'de santrifüj yapın. % 10 FBS içeren DMEM-Low kullanarak hücre peletini yeniden askıya alın. Hücre sayımını gerçekleştirdikten sonra, yapışmaz hidrojel ile mikro kalıplanmış 81 ve 256 durgunluklarını tohumlamak için ASC'leri ayrı 15 mililitrelik santrifüj tüplerine alın.Kullanılan hücre sayısının ayrıntıları için metin el yazmasına bakın. 81 veya 256 dairesel girinti içeren bir silikon kalıbın ortasına 500 mikrolitre steril% 2 ultra saf agaroz çözeltisi ekleyin. 40 dakika sonra, ultra saf agarozu silikon kalıptan çıkarın ve 12 delikli plastik plakanın bir kuyusuna yerleştirin.Mikrokalıplanmış agaroz ile kuyuya iki mililitre DMEM-Low ekleyin ve ASC'leri tohumlamadan önce en az 12 saat boyunca% 5 atmosferik karbondioksit kaynağı ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Laminer akışın açık olduğundan ve kabinin hava akışının düzgün çalıştığından emin olun. Ekipmanın doğru voltaja bağlı olduğunu ve tabletin ekipmana bağlı olduğunu onaylayın.Kabin koruma camının yüksekliğinin, ekipmanın sensör işaretiyle aynı seviyede olup olmadığını kontrol edin. Ekipmanın sol tarafındaki açma veya kapama düğmesine basın. Ardından, tabletin ve ekipmanın başlamasını bekleyin.Uç kutularını, santrifüj tüpleri için rafı ve mikrokalıplanmış agaroz hidrojelini içeren plakayı ekipmanın çalışma alanına yerleştirin. Tablette açılan yazılımda LabWare Editor'ı (LabWare Düzenleyicisi) tıklatın. Sanal bir çalışma masası kurun ve pipetlerin, uç kutularının, plastik tüplerin rafının ve plakaların konumlarını seçin.Deney boyunca ekipman tarafından gerçekleştirilen tüm parametreleri ve komutları dahil etmek için "prosedüre geç" düğmesine tıklayın. Yazılımda bir araç çubuğunun ve prosedür listesinin açılmasını bekleyin. Başlangıçta, komutları belirtmek için, pipetlenecek örnek sayısını ekleyin ve yordam listesine sürükleyin.Ardından, ASC süspansiyonunu mikro kalıpları içeren 12 delikli plakanın kuyularına aktarmak için yazılımdaki reaktif transferi" komut düğmesine tıklayın ve prosedür listesine sürükleyin. Ekipmanın numuneyi aktarması için "başlangıç" ve bitiş konumlarını ayarlamak üzere özellikler"e tıklayın. Yazılımın Çalışma Masası sayfasına dönmesini bekleyin.ASC'lerin otomatik olarak tohumlanması için parametreleri metin makalesinde açıklandığı gibi ayarlayın. Standart sıvı tip olarak suyu seçin. Metin makalesinde açıklandığı gibi ASC'lerin homojen bir süspansiyonunu oluşturmak üzere parametreleri ayarlamak için "seçenekler" düğmesine tıklayın.Programlama hatası olmadığından emin olmak için yazılımın üst çubuğundaki "kontrol" sembolü bulunan düğmeye tıklayın. Programı başlatmak için yazılımın üst çubuğundaki oynat" düğmesine tıklayın. Ekipmanın programlandığı gibi başlamasına izin verin.Ve bittiğini gösteren bir ses çıkarmasını bekleyin. 12 kuyucuklu plakayı toplayın, ardından tam ve kompakt sferoidlerin oluşumuna izin vermek için en az% 5'lik bir atmosferik karbondioksit kaynağı ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Analiz için bir, üç ve yedi günlük kültürden sonra sferoidleri manuel olarak hasat edin.Sferoidleri mikrokalıplanmış yapışkan olmayan agaroz hidrojelinden serbest bırakmak için ortamı bir mikro pipetle yıkayın. Bir mikro pipet kullanarak sferoidleri manuel olarak toplayın ve 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Sırasıyla 81 ve 256 dairesel durgunluğa sahip mikrokalıplanmış yapışkan olmayan hidrojellerden toplam 85 ve 160 sferoid ölçülmüştür.Otomatik pipet sistemi, ASC hücre süspansiyonunu 15 dakika içinde tek bir 12 delikli plakanın 12 kuyucuğuna yerleştirdi. 81 mikrokalıplanmış yapışkan olmayan hidrojeli kullanarak, bu çalışmada 972 sferoid üretildi. 256 mikrokalıplanmış yapışkan olmayan hidrojel iken, 3072 sferoid üretti.ASC sferoidleri, boyutlarının ve şekillerinin homojenliği açısından analiz edildi. 81 resesyonlu mikro küflerden ASC steroidleri kültür döneminde homojen çap gösterdi. 256 durgunluğa sahip mikro kalıplardan ASC steroidlerinin aksine, en küçük ve en büyük çap oranı, 81 ve 256 durgunluklu mikro kalıplardan ASC sferoidlerinde bire yakındı.Canlılık, morfoloji ve kuvvet analizleri, ASC sferoidlerinin başarılı, büyük ölçekli üretimi için kanıt sağlamıştır. En çok karşılaşılan durum, sorunun hatasız bir şekilde aniden çözülmesini sağlamaktır.

large-scale-automated-production-adipose-derived-stem-cell-spheroids

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bir Kartezyen biyoyazıcı, hassas, tekrarlanabilir geometrilerde çok malzemeli biriktirmeye izin verirken aynı zamanda çevresel faktörlerin kontrolüne de izin verecek şekilde tasarlanmış ve üretilmiştir. Üç boyutlu biyo-yazıcıyı kullanarak, karmaşık ve uygulanabilir yapılar basılabilir ve kolayca çoğaltılabilir.

Üç Verici Kartezyen Yazıcı Kullanımı Bioprinted Hücresel Yapıların Canlılık

Bu protokol, kazınmış topografik kılavuz ipuçlarını hidrojel biyomürekkebi taşıyan bir hücrenin hassas birikimiyle birleştiren otomatik bir robotik biriktirme sistemi kullanan bir biyo-baskı metodolojisini açıklar. Basılı hücreler doğrudan kazınmış özelliklere iletilir ve onlarla birlikte algılayabilir ve yönlendirebilir.

Hücre Yüzey Rehberlik ve Bioprinting için Otomatik Robotik Dağıtım Tekniği

Bu protokol, biyomalzemeler kullanılmadan kalp dokusunun 3D biyoprintini açıklamaktadır. 3D biyoprote edilmiş kalp yamaları bileşen küremsiklerin mekanik entegrasyonunu sergiler ve kalp dokusunun yenilenmesinde ve kalp hastalığının 3D modellerinde son derece umut vericidir.

3D Bioprinting&#39;i Kullanan Sferoidlerin Mekanik Entegrasyonu Sergileyen Kalp Doku Oluşturma

Biz bir bioprintable aljinat/jelatin bioink gömülü ölümsüzleştirdi tümör ve fibroblast hücreleri içeren türdeş olmayan meme kanseri modeli geliştirilmiştir. Model vivo içinde tümör microenvironment recapitulates ve çok hücreli tümör pulcuklarının, kavrama tumorigenesis sürüş mekanizmaları içine verimli oluşumunu kolaylaştırır.

Bioprintable aljinat/jelatin hidrojel 3D Vitro Model sistemleri hücre küresel oluşumu teşvik

Biz hücre küresel leri yetiştirmek için bir motor destekli santrifüj mikroakışkan cihaz satıyoruz. Bu cihazı kullanarak, tek veya birden fazla hücre tiplerinin küresel leri yüksek yerçekimi koşullarında kolayca cokültüre edilebilir.

Çok Hücreli Üç Boyutlu Spheroidler Üretmek için Lab-on-a-CD Platformu

Bu protokolün amacı, ilaç tarama çalışmaları için kullanılabilecek 3D meme endotelyal ortak kültür modellerini hızla oluşturmak için önceden oluşturulmuş endotel ağlarına çok hücreli sferoidler olarak meme epitel hücrelerini doğrudan biyobaskılamaktır.

3D Çok Hücreli Meme Sferoidlerinin Endotel Ağlarına Doğrudan Biyobaskı

Mevcut protokol, 3D baskılı damga benzeri bir cihaz kullanarak uygun maliyetli bir şekilde büyük ölçekte doku sferoidleri üretmek için bir tekniği açıklamaktadır.

3D baskılı damga benzeri bir cihaz aracılığıyla doku sferoidlerinin üretilmesi

Tasarlanmış flepler, dahil edilmiş bir fonksiyonel vasküler ağ gerektirir. Bu protokolde, hiyerarşik vasküler ağ ve onun doğrudan mikrocerrahi anastomozlarını sıçan femoral arterine içeren 3D baskılı bir doku flebi üretme yöntemini sunuyoruz.

3D Baskı Teknolojileri Kullanılarak Mühendislik Vasküler Flaplarının İmalatı

Burada, takip çok parametreli canlı hücre mikroskobu gerçekleştirmek için farklı çok hücreli sferoid oluşturma yöntemlerini açıklıyoruz. Floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobu (FLIM), hücresel otofloresan, boyama boyaları ve nanopartiküller kullanılarak, canlı üç boyutlu (3D) kanser ve kök hücre türevli sferoidlerde hücre metabolizması, hipoksi ve hücre ölümünün analizi için yaklaşım gösterilmiştir.

Çok Hücreli Sferoidlerin Üretimi ve Çok Parametreli Canlı Hücre Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu (FLIM)

Bu çalışma, agaroz kalıplarında mikro kuyular oluşturmak için damga tabanlı bir sistem kullanarak 3D hücre yapıları oluşturmak için uygun maliyetli ve verimli bir metodoloji sunmaktadır. Sistem, tek tip sferoidlerin/organoidlerin oluşumunu teşvik eder, böylece hücre etkileşimlerini iyileştirir. Bu yaklaşım deneysel değişkenliği azaltır ve ilaç testi ve doku mühendisliğindeki uygulamaları destekler.

Yeni Bir Damga Cihazı Kullanılarak İki Boyutlu Hücre Kültürlerinden Üç Boyutlu Sferoidlerin/Organoidlerin Üretilmesi

Öğrenin, otomatik pipetleme sistemiyle adipoz türevi kök hücre sferoidlerinin büyük ölçekli üretimini. Bu yöntem, 3D biyobaskı için homojen sferoidler elde ederek insan hatalarını ve kontaminasyon riskini azaltır.

3D Biyobaskı için Adipoz Türevi Kök Hücre Sferoidlerinin Büyük Ölçekli, Otomatik Üretimi

Daha fazla video keşfet