Name: Merkezi Miyelinde Tubuline Bağlı Kusurların İncelenmesi için Etiketsiz Doğrusal Olmayan Optikler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T12:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Keşfedin, ikinci harmonik jenerasyon mikroskobisi ile tubulinopati modelinde mikrotübül yüklenmiş oligodendrositleri tespit etme yöntemini. Bu teknik, sinirbilim ve hücre biyolojisi araştırmalarında mikrotübül dinamiklerini incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) tarafından aşağıdaki hibelerle desteklenmiştir: VP-CIO'ya infraestructura 226450, V.P.'ye infraestructura 255277 ve FORDECYT-PRONACES/194171/2020 V.H.'ye. CIO'daki Juvenal Hernández Guevara'nın video yapımındaki desteğini kabul ediyoruz.

Açıklanan tüm prosedürler, Meksika Hükümeti Sağlık Araştırmalarına İlişkin Genel Sağlık Kanunu Yönetmeliği'nin yedinci başlığında (NOM-062-ZOO-1999) ve Deney Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri Rehberi'nin tavsiyelerine uygun olarak onaylanmış ve Universidad de Guanajuato ve Benemérita Universidad Autónoma de araştırmalarında kurumsal biyoetik komitesi tarafından onaylanmıştır. Puebla.
1. Mikroskop ayarları
<ol><li>Mikroskopi sistemini açın.</li>
	<li>Numune ekstraksiyonu ve hazırlanmasından sonra optimum ve sabit bir güç seviyesinde lase yapmaya hazır olacağını garanti etmek için darbeli lazeri açın.</li>
	<li>Lazeri 810 nm'ye ayarlayın. Tissular mikrotübülleri incelemek için, mevcut lazer gücünün% 10-20'si kullanılır, bu da tarif edilen sistemde, hedefin arka odak düzleminde ölçülen 13-26 mW'a karşılık gelir.</li>
	<li>Mikroskopun SHG görüntülemesi için kullanılacak amaçla Köhler hizalı olduğundan emin olun (Ek Dosya 1). NOT: Bu önemlidir, çünkü bu çalışmada kullanılan ticari kurulumda, algılama iletim modunda ve kondenser aracılığıyla gerçekleştirilir.</li>
	<li>İstenmeyen filtreleri optik algılama yolundan çıkarın (Şekil 1A).</li>
	<li>Bu seviyede gereksiz yere hiçbir ışığın durmadığından emin olmak için kondenser diyaframının tamamen açıldığından emin olun.</li>
	<li>Lense küçük bir damla daldırma yağı ile 25x/0,8 sayısal diyafram açıklığına (NA) yağ daldırma hedefi hazırlayın. NOT: Bu hedef, 0,55 olan NA≥ kondenserle en iyi eşleşmek için kullanılmıştır (ideal olarak, NAcond NAobj).</li>
</ol>2. Mikroskop ön kontrolleri
NOT: Kurulum değiştirilmediği sürece ön mikroskop kontrollerini bir kez gerçekleştirin.
<ol><li>Görüntü kuru mısır nişastası, lazer polarizasyon yönünü ortaya çıkaran SHG görüntüleri oluşturmak için SHG parametreleri ile cam slaytlar arasına sıkıştırılmıştır. Mısır nişastası için% 5'ten az olan lazer gücü hariç, Ek Dosya 2'de bildirilen adımları izleyin.</li>
	<li>Seyrek mısır nişastası tanelerinin bir görüntüsünü alın ve x-y düzleminde SHG lobüllerinin yönünü işaretleyin. Bu oryantasyon lazer oryantasyonuna karşılık gelir (Şekil 2A).</li>
	<li>Kontrol olarak, lazerin salınım yönünü değiştirmek için optik yola yarım dalga plakası ( Şekil 1A'da gösterilen konum) ekleyerek aynı numunenin başka bir görüntüsünü alın. Elde edilen görüntüde döndürülmüş SHG sinyal lobülleri görüntülenir (Şekil 2B, C).</li>
	<li>SHG için farklı türde bir bant geçişi filtresi kullanıyorsanız, görüntüleri (Şekil 2D, E) ve sinyal yoğunluklarını bir çizgi taraması boyunca piksel piksel karşılaştırarak en iyi iletim özelliklerine sahip olduğundan emin olun (Şekil 2F).</li>
</ol>3. Doku ekstraksiyonu
NOT: Cerrahi prosedürleri gerçekleştirmek için daima temiz aletler kullanın.
<ol><li>6-12 aylık taiep sıçanları ve yaşa uygun Sprague-Dawley kontrollerini (WT) kullanın.</li>
	<li>Hayvanları,% 0.9'luk steril bir NaCl çözeltisi içinde seyreltilmiş bir ketamin-ksilazin karışımının (0.125 mg / Kg ve 5 mg / Kg) bir i.p. enjeksiyonu ile anestezi yapın.<ol><li>Ağrı reflekslerini kontrol edin ve sadece yoksa, devam edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Hayvanı kafasını keserek kurban et.</li>
	<li>Kafa izole edildikten sonra, kafatası tonozunun kemiklerini, üstteki en kaudal noktadan buruna doğru, orbital boşluklardan orta hatta doğru ve daha sonra en kaudal noktadan beynin ve beyinciğin altına kadar orta hat boyunca dikkatlice açın. NOT: Kemik kesiciler ve Rongeur'lar, beyin yapılarına zarar vermeden kafa kemiklerinin uygun şekilde çıkarılmasını sağlar.</li>
	<li>Beyni ve beyinciği kemikten serbest bırakın. İki yarımküre ayrılabilir. Yarımküreler bölünmüşse, SHG görüntüleme için bir yarısını kullanın ve diğer yarısını, sonraki bölümleme ve boyama için kimyasal bir başlık içinde 20 dakika boyunca fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 3.7 paraformaldehit içinde sabitleyin.</li>
</ol>4. Vibratom kesitleme
<ol><li>Sıcak (37 °C) Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ile doldurulmuş bir vibratom tampon tepsisi hazırlayın.</li>
	<li>Beyni, bir parça maskeleme bandı aracılığıyla siyanoakrilat yapıştırıcı kullanarak numune plakasına sabitleyin. En kaudal kısım / bölge tutkalla temas eder, böylece karşıttan kullanılabilir koronal bölümler, rostral kısım kesilebilir.<ol><li>Numunenin etkili bir şekilde bağlanmasını sağlamak için tutkalın polimerize olması için ~ 10 s bekleyin. NOT: En iyi sonuçlar, beyin bıçağın "bir yandan diğer yana" yerine "yukarıdan aşağıya" keseceği şekilde yönlendirildiğinde elde edilir (Şekil 1B).</li>
	</ol></li>
	<li>Numune plakasını tampon tepsisinin içindeki manyetik desteğine aktarın.</li>
	<li>Üretilen dilimler beynin tüm yüzeyini kapsayana kadar 300-500 μm kesitleri kesmeye başlayın.</li>
	<li>Bu noktada, bölümün kalınlığını 160 μm'ye düşürün.</li>
	<li>Korpus kallozum seviyesinde tam bir 160 μm kesit kesildikten sonra, büyük, alevli bir deliğe sahip modifiye edilmiş bir cam Pasteur pipet ile geri kazanın (Şekil 1C).</li>
	<li>Yeni sıcak HBSS ile temiz bir Petri kabına veya mikroskopi için doğrudan cam desteğine (kapak kayması veya cam tabanlı tabak) aktarın. NOT: Açıklanan deneysel koşullar için, numunenin üzerine bir kapak lipi eklemek görüntülemeye zararlıdır.</li>
</ol>5. Mikroskopa aktarma
<ol><li>Mikroskop farklı bir odadaysa, sıcaklığı korurken doku bölümlerini aktarmak için ısıtılmış jel paketleriyle yalıtımlı bir kutu hazırlayın. Kutu ayrıca bölümleri görüntülenene kadar sıcak tutmaya da yarar.</li>
	<li>Numuneyi mikroskop altına koyun ve iletilen ışıkla oküler boyunca doğrudan gözlem yaparak hedefin altına doğru şekilde yerleştirildiğinden emin olun. NOT: Amaç, yayılan (ve dolayısıyla algılanan) SHG sinyalini en üst düzeye çıkarmak için tahmin edilen yayan yapıları lazerin salınım yönüyle hizalamaktır.</li>
	<li>İnce bir sıvı filmin tüm numuneyi kaplaması için fazla HBSS'yi çıkarın. Numunenin aşırı buharlaşmasını ve kurumasını önlemek için sıvı filmi birkaç dakikada bir görsel olarak kontrol edin. NOT: Açıklanan koşullarda, bir bölüm en fazla 20 dakika kullanılır. Numunenin kurutulması ciddi yapay etkilere neden olur (Ek Şekil 1A). Daha fazla HBSS eklemek yerine, daha uzun görüntüleme sürelerine ihtiyaç duyulursa, bölümün periyodik olarak ılık, taze ortamda ıslatılması önerilir. Dokuyu hareketsiz hale getirmek için perfüzyon odalarının ve tutkal veya düşük erime noktalı agarozun kullanılması da daha uzun deneyler yapılacağında önerilir.</li>
	<li>Mikroskop aşamasını, karanlık inkübasyon odasının tüm kapılarını kapatmayı veya kuluçka odasını siyah naylon poliüretan kaplı bir kumaşla kaplamayı içerebilecek taranmamış görüntüleme için hazırlayın.</li>
</ol>6. Görüntüleme
<ol><li>İletim yolu boyunca "taranmamış" görüntüleme modunu seçin. Bu şekilde, tübülinin zayıf SH sinyalinin yakalanması optimize edilecektir.</li>
	<li>LCI Plan-Neofluar 25x/0,8 NA hedefini seçin.</li>
	<li>12,6 μs piksel bekleme süresiyle 13 mW ile 26 mW arasında bir lazer gücü ayarlayın. Ortalama 15 sn'lik bir yakalama süresi için 512 piksel x 512 pikselden daha büyük olmayan, hız 5 ve ortalama 2 olan görüntüler çekin. NOT: Daha yüksek lazer güçleri ve/veya daha uzun bekleme süreleri kullanmak numuneye zarar verebilir (Ek Şekil 1B).</li>
	<li>Önce 485 nm kısa geçişli filtre (SP485) kullanarak görüntü alın ve ikinci adımda keskin bir 405 nm bant geçişi filtresi ekleyin (BP405; Şekil 3). Ek Dosya 2'de bildirilen adımları izleyin. NOT: Sahte parlak alan görüntüleri, görünür bir çizginin artık lazer ışığı kullanılarak aynı dedektör aracılığıyla alınabilir (405 nm veya 488 nm lazerler en iyi sonucu verir).</li>
</ol>7. Beyinciğin işlenmesi
<ol><li>İlk olarak, beyinciği bir neşterle iki yarım küreye kesin ve daha sonra orta kısımla (kesimden sonra elde edilen düz kısım) vibratom desteğine yapıştırın.</li>
	<li>Beyinciği beyin için tarif edildiği gibi kesit ve görüntü (160 μm kesitler, aynı vibratom ayarları, aynı bıçak, aynı mikroskop ayarları, vb.). NOT: Beyinciğin anatomisi nedeniyle, bölümleme anındaki yönü kritik değildir; yüzeyden uzakta üretilen dilimlerin çoğunda, beyaz maddeye iyi kesitlenmiş folia olacaktır.</li>
</ol>

<ol><li>Palmiter, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+ablation+in+transgenic+mice+by+cell-specific+expression+of+a+toxin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell lineage ablation in transgenic mice by cell-specific expression of a toxin gene.</a> Cell. 50 (3), 435-443 (1987).</li>
<li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monoclonal+antibody+against+the+type+II+isotype+of+beta-tubulin.+Preparation+of+isotypically+altered+tubulin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A monoclonal antibody against the type II isotype of beta-tubulin. Preparation of isotypically altered tubulin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 263 (6), 3029-3034 (1988).</li>
<li>Banerjee, A., Roach, M. C., Trcka, P., Luduena, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+monoclonal+antibody+specific+for+the+class+IV+isotype+of+beta-tubulin.+Purification+and+assembly+of+alpha+beta+II%2C+alpha+beta+III%2C+and+alpha+beta+IV+tubulin+dimers+from+bovine+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Preparation of a monoclonal antibody specific for the class IV isotype of beta-tubulin. Purification and assembly of alpha beta II, alpha beta III, and alpha beta IV tubulin dimers from bovine brain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (8), 5625-5630 (1992).</li>
<li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+%CE%B2v+tubulin+in+the+cochlea+and+cultured+cells+with+a+novel+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Localization of βv tubulin in the cochlea and cultured cells with a novel monoclonal antibody.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 505-514 (2008).</li>
<li>Cross, A. R., Williams, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinky+microtubules%3A+Bending+and+breaking+induced+by+fixation+in+vitro+with+glutaraldehyde+and+formaldehyde%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Kinky microtubules: Bending and breaking induced by fixation in vitro with glutaraldehyde and formaldehyde.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 20 (4), 272-278 (1991).</li>
<li>Van Steenbergen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+understanding+of+label-free+second+harmonic+imaging+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Molecular understanding of label-free second harmonic imaging of microtubules.</a> Nature Communications. 10 (1), 3530(2019).</li>
<li>Campagnola, P. J., Clark, H. A., Mohler, W. A., Lewis, A., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-harmonic+imaging+microscopy+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Second-harmonic imaging microscopy of living cells.</a> Journal of Biomedical Optics. 6 (3), 277(2001).</li>
<li>Campagnola, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+high-resolution+second-harmonic+generation+imaging+of+endogenous+structural+proteins+in+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues.</a> Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).</li>
<li>Yu, C. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+microtubule+polarity+in+spindles+with+second-harmonic+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Measuring microtubule polarity in spindles with second-harmonic generation.</a> Biophysical Journal. 106 (8), 1578-1587 (2014).</li>
<li>Bancelin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+microtubules+polarity+in+mitotic+spindles+in+situ+using+Interferometric+Second+Harmonic+Generation+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Probing microtubules polarity in mitotic spindles in situ using Interferometric Second Harmonic Generation Microscopy.</a> Scientific Reports. 7, 6758(2017).</li>
<li>Dombeck, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniform+polarity+microtubule+assemblies+imaged+in+native+brain+tissue+by+second-harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Uniform polarity microtubule assemblies imaged in native brain tissue by second-harmonic generation microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7081-7086 (2003).</li>
<li>Psilodimitrakopoulos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+the+effective+orientation+of+the+SHG+source+in+primary+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Estimation of the effective orientation of the SHG source in primary cortical neurons.</a> Optics Express. 17 (16), 14418(2009).</li>
<li>Sharoukhov, D., Bucinca-Cupallari, F., Lim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+imaging+reveals+cytoskeletal+deficit+predisposing+the+retinal+ganglion+cell+axons+to+atrophy+in+DBA%2F2J%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Opthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Microtubule imaging reveals cytoskeletal deficit predisposing the retinal ganglion cell axons to atrophy in DBA/2J.</a> Investigative Opthalmology & Visual Science. 59 (13), 5292(2018).</li>
<li>Alata, M., Piazza, V., Eguibar, J. R., Cortes, C., Hernandez, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H-ABC+tubulinopathy+revealed+by+label-free+second+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">H-ABC tubulinopathy revealed by label-free second harmonic generation microscopy.</a> Scientific Reports. 12, 14417(2022).</li>
<li>Duncan, I. D., Lunn, K. F., Holmgren, B., Urba-Holmgren, R., Brignolo-Holmes, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+taiep+rat%3A+A+myelin+mutant+with+an+associated+oligodendrocyte+microtubular+defect%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">The taiep rat: A myelin mutant with an associated oligodendrocyte microtubular defect.</a> Journal of Neurocytology. 21 (12), 870-884 (1992).</li>
<li>Duncan, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutation+in+the+Tubb4a+gene+leads+to+microtubule+accumulation+with+hypomyelination+and+demyelination%3A+Tubb4a+Mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">A mutation in the Tubb4a gene leads to microtubule accumulation with hypomyelination and demyelination: Tubb4a Mutation.</a> Annals of Neurology. 81 (5), 690-702 (2017).</li>
<li>Garduno-Robles, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+features+in+a+rat+model+of+H-ABC+tubulinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">MRI features in a rat model of H-ABC tubulinopathy.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 555(2020).</li>
<li>Lopez-Juarez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+impairment+in+H-ABC+tubulinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Auditory impairment in H-ABC tubulinopathy.</a> Journal of Comparative Neurology. 529 (5), 957-968 (2021).</li>
<li>Alata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+evaluation+of+cerebellar+signs+of+H-ABC+tubulinopathy+in+a+patient+and+in+the+taiep+model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Longitudinal evaluation of cerebellar signs of H-ABC tubulinopathy in a patient and in the taiep model.</a> Frontiers in Neurology. 12, 702039(2021).</li>
<li>Parodi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+optical+microscopy%3A+From+fundamentals+to+applications+in+live+bioimaging%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nonlinear optical microscopy: From fundamentals to applications in live bioimaging.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 585363(2020).</li>
<li>Lefort, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+biomedical+multiphoton+microscopy+and+its+laser+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics+D%3A+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">A review of biomedical multiphoton microscopy and its laser sources.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (42), 423001(2017).</li>
<li>Campagnola, P. J., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-harmonic+imaging+microscopy+for+visualizing+biomolecular+arrays+in+cells%2C+tissues+and+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms.</a> Nature Biotechnology. 21 (11), 1356-1360 (2003).</li>
<li>vander Knaap, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+syndrome+characterized+by+hypomyelination+with+atrophy+of+the+basal+ganglia+and+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Neuroradiology%22%5BJournal%5D)">New syndrome characterized by hypomyelination with atrophy of the basal ganglia and cerebellum.</a> American Journal of Neuroradiology. 23 (9), 1466(2002).</li>
<li>Stoller, P., Kim, B. -M., Rubenchik, A. M., Reiser, K. M., Da Silva, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization-dependent+optical+second-harmonic+imaging+of+a+rat-tail+tendon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Polarization-dependent optical second-harmonic imaging of a rat-tail tendon.</a> Journal of Biomedical Optics. 7 (2), 205(2002).</li>
<li>Brown, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurement+of+gene+expression%2C+angiogenesis+and+physiological+function+in+tumors+using+multiphoton+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy.</a> Nature Medicine. 7 (7), 864-868 (2001).</li>
<li>Chakraborti, S., Natarajan, K., Curiel, J., Janke, C., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+the+tubulin+code%3A+From+the+tubulin+molecule+to+neuronal+function+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">The emerging role of the tubulin code: From the tubulin molecule to neuronal function and disease.</a> Cytoskeleton. 73 (10), 521-550 (2016).</li>
</ol>

Yazarların rekabet eden finansal çıkarları yoktur.

SHG mikroskopisi, iki foton uyarma mikroskobu, üçüncü harmonik nesil mikroskopi ve tutarlı anti-Stokes Raman saçılma mikroskobu içeren ve geleneksel optik mikroskopinin yaşam bilimlerine uygulama yelpazesinin genişletilmesine katkıda bulunan bir grup doğrusal olmayan optik tekniğin bir parçasıdır20.
Spesifik olarak, SHG mikroskobunun ana gücü ve zayıflığı aynı durumla ilgilidir: sinyal üreteci merkez-simetrik olmayan21'dir. Böyle özel bir mimari ...

Dokulardaki ve organ preparatlarındaki sitoiskelet yapılarının optik olarak görüntülenmesi kolay bir iş değildir. Sitoiskelet filamentleri her yerde bulunur, bu nedenle jenerik boyama yapılırsa, örneğin, bir epitel örneğinde alfa-tübülin veya beta-aktin veya potansiyel olarak keratine karşı, sinyal muhtemelen numunenin her tarafına homojen bir şekilde dağıtılacaktır. Boyama işlemini hücresel bileşenlerin daha anlamlı bir alt kümesiyle sınırlamak için, hedeflenen ekspresyon1 ile transgenik fareler kullanılabilir veya izoforma özgü antikorlar kullanmayı planlayabilir. İkincisinin çok azı piyasada olsa da (ve çok azı 2,3,4'te mevcut), transgenik bir hayvan modeli mevcut olabilir. Bununla birlikte, laboratuvar tarafından satın alınması ve sürece dahil olan tüm masraflarla birlikte uygun şekilde barındırılması gerekir. Bazı antikorlar veya kimyasallar, örneğin, faloidin veya paklitaksel gibi florofor konjuge ilaçlar, canlı hücrelerde veya dokularda kullanımla kısmen veya tamamen uyumsuz olabilir, bu nedenle uygulanabilirliklerini yalnızca sabit numunelerin çalışmalarına sınırlandırır.
Tübülin durumunda, polimerin fiksasyona duyarlılığı olan ek bir husus dikkate alınmalıdır. Formaldehit ile konvansiyonel kimyasal fiksasyonun, mikrotübüllerin bütünlüğünü en iyi şekilde korumak için yeterli olmadığı bilinmektedir5. Ek olarak, yakın tarihli bir rapor, formaldehit çapraz bağlanmasının, bazı ilaçların veya GTP6 gibi fizyolojik moleküllerin bağlanmasıyla olanlara benzer şekilde, mikrotübülün ultrayapısında ince değişikliklere neden olduğunu doğrulamaktadır.
Bu nedenle, lekesiz, sabitlenmemiş numunelerde mikrotübüllerin doğrudan görselleştirilmesi genellikle arzu edilir. Bunu başarmak için, bir teknik çözüm, paralel mikrotübül demetlerinin harmonofor gibi davranma ve yoğun, darbeli bir kızılötesi lazerle uygun şekilde aydınlatıldığında frekansı iki katına çıkaran ışık yayma yeteneğine dayanan ikinci harmonik nesil (SHG) mikroskopi7'dir. Frekans ikiye katlanabildiği bilinen diğer iki biyolojik materyal olan kollajen ve miyosin'den daha güçlü ve daha kararlı bir ikinci harmonik sinyal üretilebilse de, tübülinden gelen sinyal şimdiye kadar çoğunlukla mitotik iğ yeniden düzenlemelerini incelemek için kullanılmıştır 8,9,10 ve aksonal mikrotübül morfolojisi11,12,13.
Bu çalışmada, tübülin beta 4 A (TUBB4A) tübülinopatisinden etkilenen merkezi sinir sistemi (CNS) dokularını sağlıklı muadillerinden ayırt etmek için tanı aracı olarak SHG mikroskobunun yeni bir kullanımını tanıtıyoruz14. Tübülinin bu ağırlıklı olarak nöral izoformunda meydana gelen mutasyonlardan bazıları, bazal gangliyon ve serebellumun (H-ABC) hipomiyelinasyonuna ve atrofisine neden olanlar gibi, oligodendrositlerde mikrotübül aşırı dolgusunu indükler15,16; sitoiskelet değişiklikleri, sırayla, dismiyelinasyon gibi aşağı akış etkileriyle, motor ve duyusal yolakların derin bozulmasıyla ilişkilidir16,17,18,19. Bu çalışmada kullanılan taiep murin modeli, oligodendrositlerde anormal mikrotübül içeriği gösterir ve H-ABC hastalarının duyusal-motor semptomlarının çoğunu özetler17. Protokol, sağlıklı ve mutant dokular arasındaki SH sinyallerindeki farklılıkları vurgulamak için, genellikle yüksek oranda miyelinli olan ve insan hastalarında ve taiep sıçan19'da ciddi şekilde etkilenen korpus kallozum ve beyincik olarak yapıların nasıl görüntüleneceğini açıklar.

<table><tbody><tr><td>405/10 nm BrightLine(R) tek bantlı bandpass filtre&nbsp;</td><td>Semrock</td><td>FF01-405/10-25</td><td>32 mm çap, gövde halkalı</td></tr><tr><td>Siyah naylon, poliüretan kaplı kumaş</td><td>Thorlab'lar</td><td>BK5</td><td>5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Kalın&nbsp;</td></tr><tr><td>Vibratom için bıçaklar</td><td>herhangi bir ticari; örneğin Wilkinson Kılıcı</td><td></td><td>&nbsp; Klasik paslanmaz çelik çift kenarlı tıraş bıçakları</td></tr><tr><td>Hücre kültürü kapları, 35 mm</td><td>herhangi bir ticari; örneğin Şahin</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM710NLO AxioObserver Z1</td><td>Ters mikroskop, kullanılan objektif LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA&nbsp;</td></tr><tr><td>Soğutucu</td><td>herhangi bir ticari</td><td></td><td>Herhangi bir yalıtımlı, polistiren kutu işe yarayabilir, örneği yaklaşık 37 &deg; C</td></tr><tr><td>Mısır stach</td><td>örneğin Maizena</td><td></td><td>Süpermarketten</td></tr><tr><td>Lameller #1.5</td><td>herhangi bir ticari</td><td></td><td>Dikdörtgen</td></tr><tr><td>Siyanoakrilat yapıştırıcı</td><td>örneğin Loctite</td><td></td><td>Beyni maskeleme bandına yapıştırmak için</td></tr><tr><td>İnce forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11412-11</td><td>Meninkslerden tutarak doku kesitlerini manipüle etmek</td></tr><tr><td>İnce makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14370-22</td><td>Cildi kesmek için&nbsp;</td></tr><tr><td>İnce makas kavisli uç</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14061-09</td><td>Orta hat boyunca kesmek için</td></tr><tr><td>Formaldehit %37</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td>PBS'de 1:10 oranında seyreltmek için</td></tr><tr><td>Friedman Rongeur</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>16000-14</td><td>Kemiği kesmek için</td></tr><tr><td>Jel paketleri</td><td>herhangi bir ticari</td><td></td><td>37 &deg'ye önceden ısıtılmış; C, soğutucunun içindeki sıcaklığın korunmasına yardımcı olmak için</td></tr><tr><td>Cam Pasteur pipeti, modifiye</td><td>herhangi bir ticari</td><td></td><td>Doku kesitini transfer etmek için</td></tr><tr><td>Hanks&prime; Dengeli Tuz çözeltisi (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14025-076</td><td>Tozlardan hazırlanabilir</td></tr><tr><td>Kelly kanama durdurucuları</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>13018-14</td><td>Kemiği ayırmak için&nbsp;</td></tr><tr><td>Maskeleme bandı</td><td>herhangi bir ticari</td><td></td><td>Numune plakasının yüzeyini korumak için</td></tr><tr><td>NDD modülü, C tipi</td><td>Zeiss</td><td>000000-1410-101</td><td>Sinyali algılamak için ışık kaybını azaltır. SP485 ile 000000-1935-163 filtre setini barındırır</td></tr><tr><td>Ofset kemik pense</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>16101-10</td><td>Kemiği kesmek için</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010-031</td><td>Tozlardan veya tabletlerden hazırlanabilir</td></tr><tr><td>Darbeli lazer</td><td>Yapışık</td><td>Bukalemun Vizyonu II</td><td>680&ndash; 1080 nm ayarlanabilir lazer</td></tr><tr><td>Neşter</td><td>herhangi bir ticari</td><td></td><td>Keskin uçlu düz bıçak</td></tr><tr><td>Standart model forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11000-18</td><td></td></tr><tr><td>Vannas yaylı makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>15018-10</td><td>Hem vibratom kesiminden elde edilen dilime hem de numune plakasına yapıştırılan bölüme bağlı kalan meninksleri kesmek için.</td></tr><tr><td>Titreşim</td><td>herhangi bir ticari; örneğin Leica</td><td>VT1200 Serisi</td><td></td></tr></tbody></table>

merkezi miyelin'de tubuline bağlı kusurların İncelenmesi için etiketsiz doğrusal olmayan optikler

Label-Free Non-Linear Optics for the Study of Tubulin-Dependent Defects in Central Myelin

Beyindeki sitoiskelet bileşenlerinin tatmin edici bir şekilde görselleştirilmesi zordur. Tüm sinir dokularında mikrotübüller, mikrofilamentler ve ara filamentlerin ağlarının her yerde bulunması, floresan protein füzyon stratejilerinin sonuçlarındaki değişkenlik ve bunların kromofor araçları olarak antikorların ve ilaçların dinamik çalışmalarına sınırlı uygulanabilirliği ile birlikte, klasik optik yaklaşımları diğer proteinler kadar etkili kılmamaktadır. Tubulinin incelenmesi gerektiğinde, ikinci harmoniklerin etiketsiz üretimi, molekülün merkez-simetrik olmayan organizasyonu nedeniyle çok uygun bir seçenektir. Bu teknik, mikroskopiye konjuge edildiğinde, biyolojik örneklerdeki paralel mikrotübül demetlerinin hacimsel dağılımını, sabitlenmemiş ve geçirgenleşmemiş taze dokularla çalışmanın ek avantajıyla niteliksel olarak tanımlayabilir. Bu çalışma, yakın zamanda tanımlanmış bir miyelin bozukluğu olan bazal gangliyon ve serebellum (H-ABC) tübülinopatisinin atrofisi ile hipomiyelinasyonda olduğu gibi, oligodendrositlerin tübülinle zenginleştirilmiş yapılarındaki mikrotübülleri vurgulamak için ticari bir ikinci harmonik nesil mikroskopi kurulumuyla tübülinin nasıl görüntüleneceğini açıklamaktadır.

Bu metodoloji ile elde edilen görüntüler, biyolojik dokularda bulunan çok sınırlı sayıda harmonofor nedeniyle içsel düşük bir arka plan seviyesine sahiptir ve bu da yöntemin önemli avantajlarından biridir.
Korpus kallozumun lifleri görüntülendiğinde, lif benzeri kısa yapılar ve yuvarlak elemanlar taiep beyninde tutarlı bir şekilde bulunabilir (Şekil 3B), kontrol beyninin korpus kallozumu beyin bölgesi boyunca çok daha heterojen ve izotropik bir sinyal gösterir (Şe...

Bu makalede, basit, yenilikçi bir ikinci harmonik nesil mikroskopi yaklaşımı ile bir tübülinopati modelinde mikrotübül yüklü oligodendrositleri tespit etmek için bir protokol sunuyoruz.

Merkezi Miyelin'de Tubuline Bağlı Kusurların İncelenmesi için Etiketsiz Doğrusal Olmayan Optikler

The satisfactory visualization of cytoskeletal components in the brain is challenging. The ubiquitous distribution of the networks of microtubules, ...

Biyolojik numunelerin İkinci Harmonik Nesil görüntülemesi, sentrosimetrik olmayan moleküllerin ve bunların montajlarının bir etiket veya boyaya ihtiyaç duymadan görselleştirilmesini sağlayan optik bir tekniktir. Bu yöntemle üretilen görüntüler düşük arka plana sahiptir, çünkü çok az biyolojik molekül zararlı bir kuvvet olarak hareket edebilir. Bu protokol, Tubulin beta-4A'nın tanısal görüntüleme tekniğinin taiep hayvan modelinde uygulanmasını açıklamaktadır.Tubulinopatiler son zamanlarda tanımlanan hastalıklardır. Bu nedenle, hücresel düzeyde patofizyolojinin altında yatan temel mekanizmalar hakkında sınırlı miktarda bilgi mevcuttur. Başlamak için, optimum ve sabit bir güç seviyesinde lase yapmaya hazır olacağını garanti etmek için darbeli lazeri açın.Tissular mikrotübülleri incelemek için, mevcut lazer gücünün% 10 ila% 20'si kullanılır, bu da tarif edilen sistemde hedefin arka odak düzleminde ölçülen 13 ila 26 miliwatt'a karşılık gelir. Görüntülemeden önce, lazeri 810 nanometreye çevirin. Ardından, mikroskopun İkinci Harmonik Nesil veya SHG görüntüleme için kullanılan hedefle Koehler hizasında olduğundan emin olun.İstenmeyen filtreleri optik algılama yolundan çıkarın ve kondenser diyaframının tamamen açıldığından ve gereksiz yere ışığın durmadığından emin olun. Lense küçük bir damla daldırma yağı ile 25x x 0,8 sayısal diyaframlı yağ daldırma hedefi hazırlayın. Mısır nişastası için% 5'ten az olan lazer gücü hariç, buradaki tabloda bildirilen adımları izleyin.Cam slaytlar arasına sıkıştırılmış görüntü kuru mısır nişastası. SHG görüntüleri oluşturmak için SHG parametreleri ile lazer polarizasyon yönünü ortaya çıkarırlar. Seyrek mısır nişastası tanelerinin bir görüntüsünü yakalayın ve lazer polarizasyon oryantasyonuna karşılık gelen XY düzlemindeki SHG lobüllerinin yönünü işaretleyin.Kontrol için, lazerin salınım yönünü değiştirmek için optik yola yarım dalga plakası yerleştiren aynı numunenin başka bir görüntüsünü alın. Elde edilen görüntüde döndürülmüş SHG sinyal lobülleri görüntülenir. SHG için farklı bir bant geçişi filtresi kullanıyorsanız, tarama hattı boyunca görüntüleri ve sinyal yoğunluklarını piksel piksel karşılaştırarak optimum iletim özelliklerine sahip olduğundan emin olun.Sıcak bir Hanks'Balanced Salt Solution veya HBSS ile doldurulmuş bir vibratom tampon tepsisi hazırlayın. Beyni, bir parça maskeleme bandı aracılığıyla siyanoakrilat yapıştırıcı kullanarak numune plakasına sabitleyin. En kaudal kısım tutkalla temas eder, böylece karşı rostral kısımdan kullanılabilir koronal bölümler kesilebilir.Numune plakasını tampon tepsisinin içindeki manyetik desteğine aktarın. Dilimler tüm beyin yüzeyini kapsayana kadar 300 ila 500 mikron kesitleri kesmeye başlayın. Daha sonra bölümün kalınlığını 160 mikrona düşürün.Korpus kallozum seviyesinde 160 mikronluk bir kesit kesildikten sonra, büyük flanşlı delikli modifiye edilmiş bir cam Pasteur pipet ile geri kazanın. Bölümü, yeni sıcak HBSS ile temiz bir Petri kabına veya mikroskopi için doğrudan kapak kaymasına veya cam alt kabın üzerine aktarın. Numuneyi mikroskop altına yerleştirin ve iletilen ışıkla oküler boyunca doğrudan gözlem yaparak objektif altında uygun şekilde konumlandırın.İnce bir sıvı filmin tüm numuneyi kaplaması için fazla HBSS'yi çıkarın. Numunenin aşırı buharlaşmasını ve kurumasını önlemek için sıvı filmi birkaç dakikada bir görsel olarak kontrol edin. Mikroskop aşamasını, karanlık inkübasyon odasının tüm kapılarını kapatmayı veya inkübasyon odasını siyah naylon poliüretan kaplı bir kumaşla kaplamayı içeren taranmamış görüntüleme için hazırlayın.İletim yolu boyunca taranmamış görüntüleme modunu seçin. Bu şekilde, tübülinin zayıf SH sinyalinin yakalanması optimize edilecektir. Ardından reklam verme amacını seçin.Ardından, 12,6 mikrosaniyelik piksel bekleme süresine sahip bir lazer gücü ayarlayın. Ortalama 15 saniyelik bir edinme süresi için beş hız ve ortalama iki piksel ile 512 x 512 pikselden daha büyük olmayan görüntüler çekin. Önce 485 nanometre kısa geçiş filtresi kullanarak görüntüleri yakalayın ve ikinci adımda keskin bir 405 nanometre bant geçişi filtresi ekleyin.Beyinciğin bir neşterle iki yarım küreye kesilmesi ve orta kısımla vibratom desteğine sabitlenmesidir. Beyin için tarif edildiği gibi aynı vibratom, bıçak ve mikroskop ayarlarını kullanarak beyinciği kesitleyin ve görüntüleyin. Korpus kallozumun lifleri görüntülendiğinde, taiep beyninde lif benzeri kısa yapılar ve yuvarlak elemanlar gözlenir.Buna karşılık, kontrol beyninin korpus kallozumu, beyin bölgesi boyunca çok daha heterojen ve izotropik bir sinyal gösterir. Diferansiyel sinyalin kökeni özellikle İkinci Harmonik Üretim fenomeninde yatmaktadır, çünkü dar bant geçişi filtresinin eklenmesi yalnızca kontrol görüntülerinden spesifik olmayan sinyal yoğunluğunu azaltırken, bu düşük dağınık sinyali soma benzeri çevreden seçici olarak ve taiep görüntülerindeki kısa uzatılmış yapıları seçici olarak ortadan kaldırır. her zaman yoğun SH ışığı üretir. Serebellar beyaz cevher kontrol dokusunda, SH sinyalinin tamamen yokluğu gözlendi.Kısa geçiş filtresi kullanılırken Purkinje hücreleri zar zor görülebilir ve uzatılmış ve yuvarlatılmış yapılar SH görüntüsünde taiep dokusundan devam eder. En iyi görüntüyü elde etmek için kritik bir adım, doku kesitlerini mümkün olduğunca ince kesmektir. Ayrıca, akut doku kesitleriyle çalışmak, doku bozulmasını önlemek için hızlı protokoller gerektirir.Bu nedenle, optik sistemi önceden kurmak ve kontrol etmek çok önemlidir. Mikrotübüllerden gelen ikinci harmonik sinyal, nişastadan gelen ikinci harmonik sinyalden daha zayıftır. Bu nedenle, mikrotübülleri görüntülemek için daha fazla lazer gücü kullanılmalıdır.Lazer gücü dikkatli bir şekilde arttırılmalıdır, çünkü görüntüleme için yüksek sayısal açıklık hedefi kullanıldığından, numunedeki yoğunluk hızla artacaktır İkinci Harmonik Nesil görüntüleme ile, tübülinopatik modelin merkezi miyelinomatiğindeki patolojik değişiklikler hızlı ve kolay bir şekilde tanımlanır. Bu tekniğin potansiyel uygulamaları, H-ABC tübülinopatisinin temel mekanizmalarının incelenmesi ve hastaları tedavi etmek için farmakolojik tedavilerin değerlendirilmesi için kullanımını içerir. Uzun vadede, teknik intrakraniyal olarak veya taze biyopsilerde kullanılmak üzere ücretsiz bir tanı aracı olma potansiyeline sahiptir.

label-free-non-linear-optics-for-study-tubulin-dependent-defects

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu videoda, uygun bir tampon varlığında bir lamel yüzeyinde büyüyen mikrotübülleri görselleştirmek için girişim yansıma mikroskobu (IRM) tekniğini açıklıyoruz. Gelen ışıkla aydınlatıldıktan sonra, lamel tampon arayüzü ve tampon-mikrotübül arayüzü ışığı yansıtır, bu da bir girişim deseni oluşturmak için birleşerek mikrotübüllerin parlak bir arka plana karşı yüksek kontrastlı görüntüler olarak görselleştirilmesini sağlar.

Mikrotübül Dinamiğinin Etiketsiz Görselleştirilmesi için Girişim Yansıma Mikroskobu

Kaynak: Piazza, V., et al., Santral Miyelinde Tübüline Bağlı Defektlerin İncelenmesi için Etiketsiz Doğrusal Olmayan Optikler. J. Vis. Uzm. (2023)Bu video, iki fotonlu uyarma mikroskobu kullanılarak bir sıçan beyin dokusu dilimindeki mikrotübül anormalliklerini görüntüleme prosedürünü göstermektedir. Tübülin kusurlarını ve azaltılmış miyelin üretimini tespit etmek için ikinci harmonik üretim (SHG) sinyallerini kullanır.

Tübülin Kusurlarını İncelemek için Bir Sıçan Modelinde İkinci Harmonik Nesil Görüntüleme

Akson ve miyelin yaralanmalarının dinamiklerini gerçek zamanlı olarak aynı anda görselleştirmek için iki foton uyarımlı hızlandırılmış mikroskopi kullanan bir protokol sunuyoruz. Önerilen bu protokol, yaralanma sonrası merkezi miyelinli akson kaderini etkileyebilecek ve kalıcı klinik sakatlığa katkıda bulunabilecek hem içsel hem de dışsal faktörlerin çalışmasına izin vermektedir.

Bir Ex vivo Lazer kaynaklı Omurilik Felçlileri Modeli Gerçek zamanlı aksonal Dejenerasyon mekanizmaları değerlendirmek için

Immunolabeling yöntemleri mikrotübüller gelişmekte olan Zebra balığı beyinde farklı nüfus analiz etmek için burada, genel olarak diğer dokulara geçerlidir açıklanmıştır. İlk protokol immunolabeling istikrarlı ve dinamik mikrotübüller için en iyi duruma getirilmiş bir yöntemi özetliyor. İkinci Protokolü görüntü ve doğmakta olan mikrotübüller özellikle ölçmek için bir yöntem sağlar.

Zebra balığı embriyo, dinamik, kararlı ve doğmakta olan mikrotübüller analiz etmek için Immunolabeling kullanımı

Burada, myelinated aksonlar üzerinde spektral reflectometry dayalı teknik görüntüleme bir etiket ücretsiz Nano kullanarak sabit beyin dilim içinde görüntüleme için adım adım bir iletişim kuralı mevcut.

Myelinated akson in Situ üzerinde spektral Reflectometric mikroskobu

Burada canlı hücre dönen disk konfokal mikroskopisi ve MATLAB tabanlı görüntü işleme kullanarak prometafazda senkronize hücrelerde mikrotübül dinamiği analizinin sağlam ve ayrıntılı bir yöntemini sıyoruz.

Monopolar Mitotik İğlerde Dönen Disk Mikroskobu ile Mikrotübül Dinamiğinin Ölçülmesi

Dinamik mikrotübüllerin floresan etiketli Uç bağlayıcı protein kullanılarak vivo olarak görüntülenmesi için bir protokol sunulmuştur. C. elegans'ınPosterior lateral mikrotübül (PLM) nöronunda dinamik mikrotübülleri etiketleme, görüntüleme ve analiz etme yöntemlerini açıkladık.

In vivo Caenorhabditis elegans Nöronlarında Mikrotübül Dinamiklerinin ve Oryantasyonunun Değerlendirilmesi

Bu protokol, birincil hücre kültüründeki dinamik özelliklerini incelemek için EB3 protein transfeksiyonu ile mikrotübül artı-uç görselleştirmesine adanmıştır. Protokol, Huntington hastalığı hastalarından elde edilen insan primer deri fibroblastları üzerinde uygulandı.

İnsan Primer Cilt Fibroblastlarına Dayalı Huntington Hastalık Modelinde Mikrotübül Artı-Uç Dinamikleri Görselleştirmesi

Burada, iki mikrotübül popülasyonunun dinamiklerini aynı anda ölçmek ve karşılaştırmak için TIRF mikroskopi tabanlı in vitro resusyon testi sunulmaktadır. Çapraz bağlı mikrotübül demetleri ve tek mikrotübüller üzerindeki çoklu mikrotübül ile ilişkili proteinlerin kolektif aktivitesini eşzamanlı olarak görüntülemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Çapraz Bağlı ve Tek Mikrotübüllerin Dinamiğinin In Vitro TIRF Mikroskobu ile Eşzamanlı Görselleştirilmesi

Burada, mikrotübül demetlerini in vitro olarak yeniden yapılandırmak ve eşzamanlı optik yakalama ve toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanarak içlerinde uygulanan kuvvetleri doğrudan ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Bu tahlil, aktif mikrotübül ağları içindeki protein toplulukları tarafından üretilen kuvvetlerin ve yer değiştirmelerin nano ölçekte ölçülmesine izin verir.

Yeniden yapılandırılmış aktif mikrotübül demetleri içindeki kuvvetleri doğrudan ölçme

Bu makalede, bitki bazlı bir mikrotübül çapraz bağlayıcısı olan MAP65 ve kalabalıklaştırıcı ajan olarak PEG kullanılarak taktoidler şeklinde mikrotübül montajlarının oluşumu için bir protokol sunulmaktadır.

Mikrotübül taktoidlerinin kendi kendine montajı

Keşfedin, ikinci harmonik jenerasyon mikroskobisi ile tubulinopati modelinde mikrotübül yüklenmiş oligodendrositleri tespit etme yöntemini. Bu teknik, sinirbilim ve hücre biyolojisi araştırmalarında mikrotübül dinamiklerini incelemek için kullanılır.

Merkezi Miyelin'de Tubuline Bağlı Kusurların İncelenmesi için Etiketsiz Doğrusal Olmayan Optikler

Daha fazla video keşfet