Name: Burada: Ovo Tavuk Embriyolarında İntravasküler Enjeksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Keşfedin tavuk embriyolarında in ovo intravasküler enjeksiyon tekniğini. Bu yöntem, gelişim biyolojisi ve gen transfeksiyonu çalışmalarında dışsal materyallerin damar yoluyla embriyoya verilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31972547) tarafından desteklenmiştir. Jing Wang'ın metin editörlüğünü ve Malik Donlic'in Washington State Üniversitesi, ABD'deki seslendirmesini takdir ediyoruz.

Hayvanların bakımı ve kullanımını içeren tüm prosedürler, ABD Ulusal Sağlık Enstitüsü yönergelerine (NIH Pub. No. 85-23, revize edilmiş 1996) ve tavuk embriyosu protokollerine uygun olarak, Çin Yangzhou Üniversitesi Laboratuvar Hayvan Yönetimi ve Deneysel Hayvan Etiği Komitesi (No.201803124) tarafından onaylanmıştır.
1. Döllenmiş yumurta toplama ve hazırlama
NOT: Memelilerin aksine, tavuğun tek bir yumurtalıkta milyonlarca folikülü vardır, ancak bu foliküllerin sadece birkaçı yumurtlamak için yeterince olgundur. Her folikül bir yumurta veya germ hücresi içerir. Folikül olgunlaşır olgunlaşmaz ve sarısını serbest bırakır bırakmaz, fallop tüpünün hunisine dahil edilir. Folikül, yumurta kanalının juguler karnına girdiğinde, meni tavuğun vücudundaki yumurtaya bağlanır ve tavuğun vücudundaki kalsiyum, döllenmiş yumurtayı saran ve vücutta yumuşak kabuklu bir yumurta oluşturan bir kabuk oluşturur. Kalsiyum kabuğu, yumurta üretilene kadar yavaş yavaş kalınlaşır.
<ol><li>Döllenmiş yumurtaları, 1 hafta boyunca 16 ° C'de saklanabilen yerel bir satıcıdan veya kurumdan toplayın. NOT: Yüksek depolama sıcaklığı embriyonun gelişmesine yardımcı olurken, düşük sıcaklık embriyonun yaşayabilirliğini azaltacaktır. Depolama süresi çok uzunsa embriyolar gelişemez.</li>
	<li>Yumurtaları inkübatöre aktarmadan önce yumurta kabuğunu% 75 etanol ile yumuşak ve yavaş bir şekilde ovalayın.</li>
	<li>Yumurtaları yanlara, 37.8 ° C'de ve% 60 nemde bir inkübatördeki bir rafa düzgünce yerleştirin. 60 saatlik inkübasyondan sonra (HH evre 17), embriyolar görünür kan damarları geliştirecek ve kalp15 atmaya başlayacaktır. NOT: 2 günlük inkübasyondan sonra, kalbin erken evresi olan küçük ilkel noktalar ortaya çıkar. Bu işleme kiraz boncuklama denir. ~ 2.5 günde, kalp ve diğer vücut segmentleri görünür damarlarla oluşur.</li>
</ol>2. Enjeksiyondan önce hazırlık
<ol><li>İğne olarak kullanılacak cam kılcal damarlar hazırlayın. Enjeksiyondan önce, çektirmeyi kullanarak dış çapı 1 mm ve iç çapı 0,6 mm olan 90 mm cam kılcal damarları çekin. Forseps kullanarak uçları kırın (cam kılcal damarın açısı genellikle 45 ° 'dir) ve kılcal damarları UV ışığı altında 2 saat boyunca sterilize edin.</li>
	<li>Plazmidler, paketlenmiş lentivirüsler ve PGC'ler gibi eksojen malzemeler hazırlayın.<ol>
<li>Plazmid pEGFP-N1'i (plazmidi eksprese eden gelişmiş bir GFP, 1μg / μL) lipozomla 1: 3 oranında (m / v) yavaşça karıştırın. 10 ng / μL'lik nihai bir DNA konsantrasyonu elde etmek için su ekleyin. DNA karışımının enjeksiyondan önce 20 dakika boyunca 37 ° C'de oturmasına izin verin.</li>
		<li>Enjeksiyondan önce virüsleri buz üzerinde çözün. Enjeksiyon için kullanılan lentivirüs titresi 5 x 106 Tu / mL'nin üzerinde olmalıdır.</li>
		<li>Ebeveyn veya modifiye gonad PGC'leri (E4.5, HH evre 24) 2.000-5.000 hücre/μL'ye seyreltin. NOT: Burada tripan mavisi kullanarak enjeksiyon prosedürünü gösterdik.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Pencereleme
<ol><li>Embriyoları açığa çıkarmadan önce, yumurta kabuklarının yüzeyini bir pamuk topu kullanarak% 75 alkolle nazikçe ve yumuşak bir şekilde silerek sterilize edin ve yumurtaların kör kenarını iyice sterilize edin.</li>
	<li>Sterilizasyondan sonra, embriyoyu açığa çıkarmak için yumurta kabuğu yüzeyinde küçük bir pencere (0,5 cm x 0,5 cm) oluşturmak için forseps ile künt uca hafifçe dokunun. Embriyo zarını çıkarın ve ardından yumurtayı diseksiyon mikroskobu altında tutucuya yerleştirin.</li>
</ol>4. Enjeksiyon
<ol><li>Mikroskop altında kan damarlarını arayın ve embriyoyu bulmak için diseksiyon mikroskobunun odağını ayarlayın ve ardından enjeksiyon için hazır kan damarını bulun.</li>
	<li>Cam iğneyi eksojen çözelti (plazmid, lentivirüs veya PGC'ler) ile yavaşça bir pipet kullanarak doldurun ve iğnedeki hava kabarcıklarını önleyin.</li>
	<li>İğneyi kan damarında eksojen çözelti ile, iğne enjekte edilen kan damarına paralel olarak hedefleyin.</li>
	<li>Doldurulmuş iğneyi yavaşça kabın içine yerleştirin ve çözeltiyi mikroskop altında çıkarmak için pompayı açın (genellikle enjekte edilen hacim ~ 1-5 μL'dir). Hava pompası basıncı, damarların tahrip olmasını önleyecek kadar düşük olmalıdır, çünkü aşırı yüksek hava basıncı, yüksek hızlı akışa yol açan kan damarlarına zarar verecektir.<ol>
<li>Eksojen çözelti kaba enjekte edildikten sonra, kabın renginin çözelti rengine dönüştüğünden ve eksojen çözeltinin kaba başarıyla verildiğini gösteren 2-5 s'de kırmızıya geri döndüğünden emin olun. Bu noktada çözelti artere girer ve kalbin atmasıyla birlikte arter yoluyla embriyoya ve daha sonra damara geri döner. NOT: Vasküler enjeksiyon için iki enjeksiyon bölgesi vardır (Şekil 1B): Birincisi, eksojen çözeltinin embriyonun başındaki damardan ve kan akışı yoluyla kalbe enjekte edildiği, daha sonra kalp atışı ile tüm embriyoya dolaştığı kafadır (Şekil 1B, Ok 1). Bir diğeri embriyo kanının dorsal aortundan geçer; eksojen çözelti enjekte edilir ve tüm embriyoya yayılır (Şekil 1B. Ok 2) embriyonik kalbin atışı ile.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enjeksiyondan sonra, yumurtayı stereo mikroskoptan çıkarın ve yumurta kabuğunun içine 200 μL Penisilin çözeltisi bırakın. 3 cm uzunluğunda bir tıbbi bant parçası kesin ve pencereyi kapatın. Hava kabarcıklarını sıkmak için bandı makasla yavaşça kazıyın ve ardından açıklığı kapatmak için başka bir parça kesin.</li>
	<li>Enjekte edilen yumurtayı etiketleyin ve inkübatöre geri yerleştirin ve gerekli gelişim aşamasına veya kuluçkaya kadar inkübe edin.</li>
</ol>

<ol><li>Bednarczyk, M., Dunislawska, A., Stadnicka, K., Grochowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chicken+embryo+as+a+model+in+epigenetic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Chicken embryo as a model in epigenetic research.</a> Poultry Science. 100 (7), 101164(2021).</li>
<li>Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. The chick embryo as a model system for analyzing mechanisms of development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDarnell%2C+DK+%22Developmental+Biology+Protocols%22">Developmental Biology Protocols</a>. , Humana Press. New York, NY. 25-29 (2000).</li>
<li>Fauzia, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+embryo%3A+a+preclinical+model+for+understanding+ischemia-reperfusion+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Chick embryo: a preclinical model for understanding ischemia-reperfusion mechanism.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 1034(2018).</li>
<li>Fonseca, B. B., da Silva, M. V., de Morais Ribeiro, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+embryo+as+an+in+vivo+experimental+model+for+drug+testing%3A+Advantages+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">The chicken embryo as an in vivo experimental model for drug testing: Advantages and limitations.</a> Lab Animal. 50 (6), 138-139 (2021).</li>
<li>Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+ovo+electroporations+of+HH+stage+10+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (9), e408(2007).</li>
<li>Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+ovo+electroporation+in+embryonic+chick+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In ovo electroporation in embryonic chick retina.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3792(2012).</li>
<li>Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+ovo+electroporation+in+the+chicken+auditory+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55628(2017).</li>
<li>van de Lavoir, M. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transmission+of+genetically+modified+primordial+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Germline transmission of genetically modified primordial germ cells.</a> Nature. 441 (7094), 766-769 (2006).</li>
<li>Ballantyne, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+primordial+germ+cells+are+bipotent+for+male+or+female+gametogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Avian primordial germ cells are bipotent for male or female gametogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 726827(2021).</li>
<li>Park, T. S., Han, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+transposition+into+primordial+germ+cells+is+an+efficient+tool+for+transgenesis+in+chickens%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">piggyBac transposition into primordial germ cells is an efficient tool for transgenesis in chickens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (24), 9337-9341 (2012).</li>
<li>Lee, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+insertion+into+Z+chromosome+of+chicken+primordial+germ+cells+for+avian+sexing+model+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Targeted gene insertion into Z chromosome of chicken primordial germ cells for avian sexing model development.</a> The FASEB Journal. 33 (7), 8519-8529 (2019).</li>
<li>Han, J. Y., Lee, B. R. Isolation and characterization of chicken primordial germ cells and their application in transgenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHan%2C+JY+%22Avian+and+Reptilian+Developmental+Biology%3A+Methods+and+Protocols%22">Avian and Reptilian Developmental Biology: Methods and Protocols</a>. , Humana Press. New York, NY. 229-242 (2017).</li>
<li>Naito, M., Harumi, T., Kuwana, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+chicken+primordial+germ+cells+isolated+from+embryonic+blood+and+production+of+germline+chimaeric+chickens%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Reproduction+Science%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of chicken primordial germ cells isolated from embryonic blood and production of germline chimaeric chickens.</a> Animal Reproduction Science. 153, 50-61 (2015).</li>
<li>Yu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterization+and+germline+chimera+preparation+of+primordial+germ+cells+from+the+Chinese+Meiling+chicken%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterization and germline chimera preparation of primordial germ cells from the Chinese Meiling chicken.</a> Poultry Science. 98 (2), 566-572 (2019).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+genes+and+pathways+in+chicken+germ+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Crucial genes and pathways in chicken germ stem cell differentiation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (21), 13605-13621 (2015).</li>
<li>Jin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UBE2I+stimulates+female+gonadal+differentiation+in+chicken+%28Gallus+gallus%29+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Integrative+Agriculture%22%5BJournal%5D)">UBE2I stimulates female gonadal differentiation in chicken (Gallus gallus) embryos.</a> Journal of Integrative Agriculture. 20 (11), 2986-2994 (2021).</li>
<li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HMGCS1+promotes+male+differentiation+of+chicken+embryos+by+regulating+the+generate+of+cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22All+Life%22%5BJournal%5D)">HMGCS1 promotes male differentiation of chicken embryos by regulating the generate of cholesterol.</a> All Life. 14 (1), 577-587 (2021).</li>
<li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin1z+induces+the+male+pathway+in+the+chicken+by+down-regulating+Tcf4%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Spin1z induces the male pathway in the chicken by down-regulating Tcf4.</a> Gene. 780, 145521(2021).</li>
<li>Zhao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+viable+chicken+by+allogeneic+transplantation+of+primordial+germ+cells+induced+from+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Production of viable chicken by allogeneic transplantation of primordial germ cells induced from somatic cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 2989(2021).</li>
</ol>

Herhangi bir çıkar çatışması ilan edilmedi.

Tavuk embriyolarının in ovo intravasküler enjeksiyonu yöntemi, embriyoya aktarılacak eksojen materyaller (vektör, viral veya PGC'ler) için optimize edilmiştir. Bu yönteme dayanarak, kararlı gen aşırı ekspresyonu veya girişimi (SpinZ, JUN, UBE2I, vb.) 17,18,19. Bu köklü modeller bu yaklaşımın fizibilitesini kanıtlamaktadır. Ek olarak, izole PGC'leri sadece alıcının embriyo gonadına transfer etmekle kalmadık, aynı zamanda...

Tavuk embriyoları gelişimsel, immünolojik, patolojik ve diğer biyolojik uygulamalarda yüzyıllardır yaygın olarak kullanılmaktadır 1,2,3. Toksikoloji ve hücre biyolojisi çalışmalarında diğer hayvan modellerine göre birçok doğal avantaja sahiptirler4. Tavuk embriyolarına kolayca erişilebilir ve in vitro olarak manipüle edilebilir ve kullanışlı bir embriyo araştırma modeli sistemi sağlayan herhangi bir gelişim aşamasında doğrudan gözlemlenebilir.
Genel olarak, elektrotransfeksiyon ve subgerminal kavite enjeksiyonu gibi mevcut tavuk embriyosu verme yöntemleri, uzman ekipman ve tasarlanmış bir programın gerekliliği ve yumurta sarısı ve albümen 5,6,7'nin varlığından kaynaklanan verimsizlik gibi sınırlamalara sahiptir. Burada, eksojen materyalleri tavuk embriyolarına iletmek için basit ve etkili bir taşıma yöntemi gösteriyoruz. Bu, gelişim biyolojisi çalışmalarında kullanılan güçlü bir araç olabilir. Enjekte edilen materyaller kan dolaşımı yoluyla tüm embriyoya yayılır. Tavuk embriyolarının erken gelişimi sırasında, PGC'ler kan yoluyla göç edebilir, genital sırtı kolonize edebilir ve daha sonra eksojen materyalleri vermek için değerli bir olası yol sağlayan gametlere dönüşebilir8. Şimdi, bu yöntem gen fonksiyonu, embriyo ve gelişim biyolojisi ve kimerik ve transgenik tavuk üretimi 9,10,11 çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır.
In ovo tavuk embriyolarında intravasküler enjeksiyon köklü ve yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir12,13,14. Bu yazıda, enjeksiyon malzemeleri, bölgeler, dozaj ve temsili sonuçlar dahil olmak üzere bu protokolün kapsamlı bir tanımını göstereceğiz.

<table><tbody><tr><td>Floresan makro mikroskop</td><td>OLYMPUS</td><td>MVX10</td><td></td></tr><tr><td>Cam Kılcal Damarlar</td><td>Narishige</td><td>G1</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin 2000</td><td>Invitrogen</td><td>12566014</td><td>lipozom</td></tr><tr><td>pEGFP-N1 vektör</td><td>Clontech</td> <td># 6085-1</td><td></td></tr><tr><td>PKH26 Kırmızı Floresan Hücre Bağlayıcı Kiti ve nbsp;</td><td>Sigma</td><td>PKH26GL</td><td></td></tr><tr><td>pLVX-EGFP lentivirüs vektörü</td><td>Addgene</td><td>128652</td><td></td></tr><tr><td>Pnömatik Mikroenjektör</td><td>Narishige</td><td>IM-11-2</td><td></td></tr><tr><td>Çektirme</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavi Leke</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

burada: ovo tavuk embriyolarında İntravasküler enjeksiyon

In Ovo Intravascular Injection in Chicken Embryos

Embriyo biyolojisinin klasik bir model sistemi olarak, tavuk embriyosu embriyonik gelişimi ve farklılaşmayı araştırmak için kullanılmıştır. Eksojen materyallerin tavuk embriyolarına verilmesi, embriyonik gelişim sırasında gen fonksiyonunu, transgenik ıslahı ve kimera preparatını incelemek için büyük bir avantaja sahiptir. Burada, plazmid vektörleri veya modifiye primordial germ hücreleri (PGC'ler) gibi eksojen materyallerin erken gelişim evrelerinde donör tavuk embriyolarına aktarılabildiği in ovo intravasküler enjeksiyon yöntemini gösteriyoruz. Sonuçlar, dorsal aort ve kafa yoluyla intravasküler enjeksiyonun, enjekte edilen materyallerin kan dolaşım sistemi yoluyla tüm embriyoya yayılmasına izin verdiğini göstermektedir. Sunulan protokolde, eksojen plazmid ve lentiviral vektör girişinin etkinliği ve alıcı gonadda enjekte edilen eksojen PGC'lerin kolonizasyonu, embriyolarda floresan gözlenerek belirlenmiştir. Bu makalede, bu yöntemin ayrıntılı prosedürleri açıklanmakta ve böylece gen fonksiyonu, embriyo ve gelişim biyolojisi ve gonad-kimerik tavuk üretimini incelemek için mükemmel bir yaklaşım sağlanmaktadır. Sonuç olarak, bu makale araştırmacıların tavuk embriyolarına eksojen materyallerin ovo intravasküler enjeksiyonunda büyük başarı ve tekrarlanabilirlik ile gerçekleştirmelerini sağlayacaktır.

Burada tavuk embriyolarının in ovo intravasküler enjeksiyonunu gösteriyoruz. İntravasküler enjeksiyonun şematik bir süreci Şekil 1'de gösterilmiştir; Çalışmamızda, enjeksiyonu test etmek ve doğrulamak için çeşitli eksojen çözümler kullandık.
Enjekte edilen materyalleri daha iyi görselleştirmek için, Tripan Mavisi (% 0.4) embriyoya izleyici olarak enjekte edildi. İzleyicinin (mavi) dorsal aort veya kafa enjeksiyonu ile kan dolaşımı yoluyla tüm emb...

Bu makalenin genel amacı, tavuk embriyolarına eksojen materyallerin hücre içi enjeksiyonunda nasıl gerçekleştirileceğini tanımlamaktır. Bu yaklaşım, tavuk embriyolarının gelişimsel biyolojisini incelemek için çok yararlıdır.

Burada: Ovo Tavuk Embriyolarında İntravasküler Enjeksiyon

As a classical model system of embryo biology, the chicken embryo has been used to investigate embryonic development and differentiation. Delivering ...

Merhaba, ben Yangzhou Üniversitesi'nden Kai Jin. Araştırma grubumuz adına, gelişimsel araştırmalarda tavuk embriyosunun güçlü bir aracını sunacağım. Tavuk embriyosu, gelişimi ve farklılaşmayı araştırmak için kullanılan klasik bir gelişim modelidir, aslında, laboratuvarın tavuk embriyolarına yönelik yabancı önlemleri, gen transfeksiyonu, transgenik ıslah ve gonadal transmural preparat gibi gelişimsel biyoloji için değerli bir araçtır.Laboratuvarımızda mu-tipi enjeksiyon yöntemlerini belirledik, ancak birçok araştırmacı için enjeksiyonun detayı belirsiz ve çizgilenmesi zor. Bu nedenle, bu videoda, ovo'daki tavuk embriyosu gelişiminin erken aşamasında vasküler enjeksiyonun ayrıntılarını göstereceğiz. İlgileniyorsanız bizimle iletişime geçmekten çekinmeyin.Burada, protokolün ayrıntılarını gösteriyoruz. Döllenmiş yumurta toplama ve hazırlama. İlk olarak, memelilerin aksine, tavuğun tek bir yumurtalıkta milyonlarca folikülü vardır, ancak bu foliküllerin sadece birkaçı yumurtlamak için yeterince olgundur.Her folikül bir yumurta veya germ hücresi içerir. Folikül olgunlaşır olgunlaşmaz ve sarısını serbest bırakır bırakmaz, fallop tüpünün hunisine dahil edilir. Folikül yumurta kanalının juguler karnına girdiğinde, meni tavuğun vücudundaki yumurtaya bağlanır ve tavuğun vücudundaki kalsiyum, döllenmiş yumurtayı saran ve vücutta yumuşak bir kabuk yumurta oluşturan bir kabuk oluşturur.Kalsiyum kabukları, yumurta üretilene kadar yavaş yavaş kalınlaşır. Akademik olarak embriyo yumurtaları olarak adlandırılan döllenmiş yumurtayı toplayın ve bunları 37.8 santigrat derece ve% 60 nemde bir inkübatördeki bir rafa düzgünce yerleştirin. Embriyolar uygun koşullar altında inkübe edilir.İki günlük inkübasyonlardan sonra, ilkel kalpler adı verilen küçük titreşen kırmızı noktalar ortaya çıkar. Bu işleme kiraz dövme denir. Yaklaşık 2,5 günde, kan damarları görülebilir ve kalp ve vücut segmentleri oluşmuştur.İğne ve plazmid hazırlanması. Cam kılcal damarları iğne olarak kullanıyoruz. Enjeksiyondan önce, dış çapı bir milimetre ve iç çapı 0,6 milimetre olan cam kılcal damarlar hazırlayın.Eksojen materyaller genellikle plazmidler, paketlenmiş lentivirüsler ve ilkel germ hücreleri veya PGC'lerdir. Bu videoda, enjekte edilen malzemelerin izini göstermek için tripan mavisini kullanıyoruz. Pencereleme. Embriyoları açığa çıkarmadan önce, mikrop kontaminasyonunu önlemek için embriyoları sterilize etmemiz gerekir.Bu, embriyoların yüzeyinin yumurta açıklığı bölgesinde% 75'lik bir alkol pamuk topu ile hafifçe silinmesiyle yapılır. Dezenfeksiyondan sonra, yumurta kabuğunun künt ucuna forseps ile hafifçe dokunun ve embriyoyu ortaya çıkarmak için forseps ile yumurta kabuğunun yüzeyinde 0,5 santimetre x 0,5 santimetrelik bir deliği dikkatlice kırpın. İnovo-intravasküler enjeksiyon.Mikroskop altındaki görünüme bakın, önce embriyoyu bulmak için mikroskopun odağını ayarlayın ve ardından tavuk embriyosunun kan damarlarını enjeksiyona hazır bulun. İğneyi eksojen madde ile kan damarına hedefleyin, iğnenin enjekte edilen kan damarına paralel olduğunu unutmayın. İğneyi yavaşça kan damarına yerleştirin ve ardından hava pompasını açın.Bu noktada, yabancı madde artere girer ve kalbin atmasıyla birlikte, arter yoluyla embriyoya ve daha sonra damara geri döner. İki tip vasküler enjeksiyon vardır. Birincisi, yabancı maddenin embriyonun başındaki bir damardan enjekte edildiği ve kalbe geri aktığı bir kafa enjeksiyonudur.Diğeri ise yabancı maddenin kalbin atmasıyla embriyoya dolaştığı dorsal aort enjeksiyonudur. Embriyonik kalbin atması ve kan dolaşımı ile yabancı maddenin arterin sonundaki kılcal damarlar tarafından damar içine alındığını ve daha sonra damardan embriyoya geri döndüğünü açıkça görebiliriz, bu da enjekte edilen yabancı maddenin embriyonun her bir bölümüne etkili bir şekilde verildiğini gösterir. Enjeksiyondan sonra, yumurtayı stereomikroskoptan çıkarın, küçük makasla üç santimetre uzunluğunda bir tıbbi bant parçasını kesin ve bandı açıklığa takın.Herhangi bir hava kabarcığını sıkmak için bandı makasla yavaşça kazıyın ve ardından açıklığı bir haç içine kapatmak için başka bir bant parçasını kesin. Açıklığı kapattıktan sonra, enjekte edilen embriyolar dikkatlice inkübatöre geri yerleştirilir. Burada enjeksiyon sonrası tavuk embriyolarının temsili görüntülerini gösteriyoruz.İlk görüntü lentivirüs plazmid enjeksiyonunun sonucunu göstermektedir. Stereoskopik floresan mikroskobu altındaki yeşil floresan, embriyolarda enjekte edilen plazmidin başarılı bir şekilde ekspresyonunu gösterir. Bu, plazmidlerin tavuk embriyolarına intravasküler enjeksiyonunun fizibilitesini göstermektedir.İkinci görüntü PGC enjeksiyonunun sonuçlarını göstermektedir. PGC'ler RFP ile etiketlendi. Bu resimde, alıcıların gonadında bulunan kırmızı noktalar olan enjekte edilen PGC'leri görebiliyorduk.Bu, donör PGC'lerin alıcıların gonadına etkili bir şekilde girebildiğini ve kolonize edebildiğini göstermektedir. Sonuç olarak, bu protokol eksojen materyallerin, plazmidlerin veya PGC'lerin tavuk embriyolarına in-ovo intravasküler enjeksiyonu işlemini sunmaktadır. Burada gösterilen yöntemin takip edilmesi ve öğrenilmesi kolaydır ve birçok alanda uygulamaya değer.Sizinle paylaşmak istediğim tek şey bu. Umarım bu yaklaşım, tavuk embriyolarının ve gelişim biyolojisinin belirlenmesinde güçlü bir araştırma aracı olarak çalışmanızı kolaylaştırır. Bu videoyu izlediğiniz için teşekkür ederiz ve araştırmanızda iyi şanslar.

in-ovo-intravascular-injection-in-chicken-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Ovo elektroporasyon Civciv kuş embriyonun genetik manipülasyon sağlayan bir tekniktir. Bu tekniğin yaygın uygulamalar genlerin fonksiyonel analiz ve olası artırıcı unsurları içerir. Bu video HH 10 civciv embriyosunda nöral tüp elektroporasyon göstermektedir. Enjeksiyon tekniği ve uygun yumurta taşıma tartışılmıştır.

HH Sahne 10 Tavuk Embriyolar Ovo Electroporations

Bu yazıda, tavuk embriyo merkezi sinir sisteminin çeşitli bölgelerinde insan kök hücrelerinin nakli için bir yöntem mevcut. Bu...

Tavuk embriyo haline İnsan Kök Hücre Xenotransplantation

Ince ucunu kullanarak, biz, tavuk Somitlerin veya sinir tüpleri alt etki alanlarını içine plazmid DNA enjekte mikropipetler. Plazmid konsantrasyonu tek transfekte hücreler oluşturmak için ayarlanır. Daha sonra hücreler klonal popülasyonları dönüşmesine izin verir.

Civciv Embriyolar Tek Hücreli Transfeksiyon

Bu videonun genel amacı hedef retina enjeksiyon nasıl gerçekleştirileceği göstermek için...

Embriyonik Chick Retina Ovo Elektroporasyon

Bu video, bir CAM kanseri metastaz modeli oluşturmak için kanser hücrelerinin tavuk koryoallantoik membran damar sistemine intravenöz olarak enjekte edilmesi prosedürünü göstermektedir. Enjekte edilen hücreler sonunda dağınık tek kanser hücresi kolonileri oluşturur ve bu da kanser istilası ve metastazı çalışmasına izin verir.

Kanser Hücrelerinin Tavuk Korioallantoik Membran Damar Sistemine İntravenöz Enjeksiyonu: Kanser İstilasını ve Metastazı İncelemek için Korioallantoik Membran Kanseri Modeli Oluşturma Prosedürü

Dış ifade beyin gelişiminde microRNA rolünü izah etmek için bir tekniktir. Ancak, ovo elektroporasyon kullanarak belirli alanları hedefleyen zordur. Burada, biz verimli bir şekilde seçici electroporate ventral ve dorsal orta beyin bölgeleri göstermek.

Ventral Chick orta beyin içinde MikroRNA ovo İfade

Kuş ve memelilerin işitsel beyin sapı nöronları, normal işitme işlevleri için temel bir süreç olan hızlı sinirsel kodlama için uzmanlaşmıştır. Bu nöronlar, embriyonik arka bedenin belirgin öncüllerinden kaynaklanmaktadır. İşitme gelişiminde gen işlevini incelemek için tavuk embriyolarının arka bacasında genleri ifade etmek için elektroporasyon teknikleri sunuyoruz.

Tavuk İşitsel Beyinsapındaki Ovo Elektroporasyonunda

Bu yöntemde, embriyonik kalp dokuları cerrahi olarak microdissected, ayrışmış, fluorescently etiketli ve ana bilgisayar embriyonik dokuların implante vardır. Bu kişi veya doku düzeyinde gelişimsel organizasyon ektopik hemodinamik koşullar ve/veya değiştirilmiş parakrin/juxtacrine ortamlar altında eğitimi için bir platform sağlar.

Embriyonik Cardiomyocytes kuş embriyo implantasyonu Vivo için Mikroenjeksiyon tabanlı sistem

Bu protokol, kontrastlı ultrason görüntüleme ve mikrokabarcık aracılı ilaç dağıtımını incelemek için 5 ila 8 günlük tavuk embriyolarının ve bunların koryoallantoik membranının (CAM) in vivo bir model olarak nasıl elde edileceği ve kullanılacağına dair üç yöntemi açıklamaktadır.

Kontrastlı Ultrason Görüntüleme ve Mikrokabarcık Aracılı İlaç Dağıtım Çalışmaları için Tavuk Ex Ovo Embriyolarının ve Korioallantoik Membran Damarlarının In Vivo Model Olarak Hazırlanması

Tavuk embriyoları, klasik bir gelişim modeli olarak, laboratuvarımızda çeşitli çevresel kirleticilere maruz kalmanın ardından gelişimsel kardiyotoksioksiklikleri değerlendirmek için kullanılır. Bu yazıda maruz kalma yöntemleri ve kurulan morfolojik/fonksiyonel değerlendirme yöntemleri açıklanmıştır.

Gelişimsel Kardiyotoksikliklerin Değerlendirilmesinde Tavuk Embriyosunun Güçlü Bir Araç Olarak Kullanılması

Keşfedin tavuk embriyolarında in ovo intravasküler enjeksiyon tekniğini. Bu yöntem, gelişim biyolojisi ve gen transfeksiyonu çalışmalarında dışsal materyallerin damar yoluyla embriyoya verilmesini sağlar.

Burada: Ovo Tavuk Embriyolarında İntravasküler Enjeksiyon

Daha fazla video keşfet