Floresan Etiketli Proteinlerin Yapay Fosfolipid Mikrovezikülleri ile Etkileşiminin Kantitatif Akış Sitometrisi Kullanılarak Analiz Edilmesi

Bu miktar akış sitometrisi yöntemini kullanarak araştırmacılar, membran etkileşiminin kinetik ve denge geleneklerini hesaplayabilir ve PPH membranındaki siteler tarafından getirilen protein sayısını tahmin edebilirler. Bu yöntemin avantajları, reaktiflerin ve ekipmanların basitliği ve kullanılabilirliğidir. Bu yöntem sadece temel araştırmalar içindir.

Protokol, kan hesaplamasında protein lipit etkileşimlerini incelemek için geliştirilmiştir ve proteinlerin çeşitli lipit membranları ile etkileşimini karakterize etmek için diğer alanlarda kullanılabilir. Yöntem, çeşitli hücreler ve ligand tipleri üzerindeki ligand bağlanma dinamiklerinin miktar değerlendirmesi için kullanılabilir. Kinetik bağlanma deneylerini, Tyrode'un tamponundaki fosfolipid veziküllerini bir mikromolar konsantrasyona ve toplam 250 mikrolitre hacme seyrelterek başlatın.

Daha sonra floresan etiketli pıhtılaşma faktörü X veya FX FD ve 500 nanomolar konsantrasyonunu fosfolipid vezikülleri ile bire bir oranında karıştırarak toplam 500 mikrolitre hacim elde edin. Hemen 500 mikrolitre karışık süspansiyonu akış sitometresine enjekte edin. 488 nanometre uyarma dalga boyuna ve 585 nanometre emisyon filtresine sahip bir akış hızında; FL iki kanalı için 42 genişliğinde.

Daha sonra, FL dört kanalındaki ortalama floresansı, 633 nanometrede uyarma ve 20 genişliğinde 660 nanometrede emisyon filtresi ile ölçün. Bağlanmanın doygunluğu sağlandığında, numuneyi Tyrode tamponu ile 20 kat seyreltin ve bir taban çizgisi floresansına veya bir platoya ulaşılana kadar ayrışmayı izleyin. Denge bağlama deneyleri için, Tyrode'un tamponunda 20 dakika boyunca sıfırdan 1000 nanomolara kadar değişen FX FD konsantrasyonlarına sahip beş mikromolar yapay fosfolipid vezikülünü inkübe edin.

Kuluçkadan sonra her numuneyi Tyrode tamponu ile 200 mikrolitrelik son hacme 20 kat seyreltin ve seyreltilmiş numuneyi 30 saniye içinde akış sitometrisi ile analiz edin. Verileri analiz etmek için, FSC formatındaki deneyleri sitometri veri toplama yazılımından veri analizi için sitometre yazılımına aktarın. Dosyayı seçip dışa aktarma ve FSC dosyaları sekmelerini tıklatarak.

bittiğinde, bilgisayardaki dosyaları seçerek ve dosyaları programın çalışma alanına sürükleyerek FCS dosyalarını sitometre yazılımına açın. Mikro-parçacıkların geçişi için, lipofilik boyanın floresansı ile mikro-parçacıkların bölgesini tanımlayın, DIC 16 üç. Ardından, günlük koordinatlarında FL iki D I C 16'dan bir nokta grafiği SSC oluşturmak için çalışma sayfasındaki çizim düğmesini kullanın.

Ardından bir geçit bölgesi çizmek için dikdörtgen kapı düğmesini seçin. Kinetik deneyleri analiz etmek için, veziküllerin bölgesi için zaman içindeki floresan koordinatlarını kullanarak bir nokta grafiği oluşturun. Ardından, zaman içinde floresandaki değişimle ilgili verileri CSV formatında dışa aktarın; örneği seçip dışa aktarma sekmesine sağ tıklayarak, ardından parametrelerde dört kez FL'yi seçerek, CSV formatını seçmeden ve dışa aktarma sekmesine basmadan önce kaydetmek için dizini seçin.

Aktarımdan sonra, her 1000 olay için basit hareketli ortalama floresan ve zamanı hesaplamak için CSV dosyasını istatistiksel yazılımda açın, üstel bağımlılık varsayımı altında tek hareketli ortalama floresanın zamana bağımlılığının bir grafiğine yaklaşın ve bir denklem kullanarak kinetik ilişkilendirme sabitini hesaplamak için değeri kullanın. Ardından, daha önce açıklandığı gibi denklemi kullanarak kinetik ayrışma sabitini hesaplayın. Denge bağlama testinin tarihini analiz etmek için, seçilen her FX FD konsantrasyonu için veziküller bölgesindeki FX FD'nin ortalama floresansını belirleyin ve daha sonra bağlı faktör floresansının tek bölge bağlama varsayımında eklenen faktörün konsantrasyonundan bağımlılığına yaklaşın.

En az üç bağımsız tekrardan bir denklem kullanarak ortalama bağlama parametrelerini hesaplayın. Jel filtrelenmiş trombositleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 2.5 milimolar kalsiyum klorür varlığında kalsiyum IANA 4A yirmi üç, yüz seksen yedi ile inkübe ederek kalibre edilmiş boncuklar hazırlamaya devam edin. Aktif trombositler FX FD'nin çeşitli konsantrasyonlarını ekleyin ve trombositleri yüzde iki hacimli formaldehit ile inkübe edin.

Bir saat sonra, trombositleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca üç molar glisin ve% 5 BSA ile inkübe ederek reaksiyonu durdurun. Daha sonra karışımı reaksiyona girmemiş boyadan beş dakika boyunca 400 kez G'de santrifüjleme ile saflaştırın. Peleti Tyrode'un %0,5 BSA içeren tamponunda yeniden askıya almadan önce süpernatı çıkarın.

Ardından, her numunedeki kalibrasyon boncuklarının floresan seviyesini bir spektroflorometre kullanarak ve ardından akış sitometresini kullanarak ölçün. Bir hücre sayacı yardımıyla her numunedeki boncuk sayısını belirleyin. Her bir boncuk örneğinin floresan yoğunluğunu, bir spektroflorometre kullanarak çözünür floresan boya konsantrasyonuna dönüştürün ve spektroflorometre moleküllerinin sayısı için floresan boya konsantrasyonunu yeniden hesaplayın.

Her numune için flurofor moleküllerinin sayısı üzerine bir akış sitometresinde boncukların ortalama floresansının bir bağımlılık grafiğini oluşturun. Ardından, analiz uydurma özelliğini kullanarak satır orantılılığına göre bağımlılığı yaklaştırın ve doğrusal sekmeleri sırayla sığdırın. Denklemdeki yaklaşımdan, ortalama floresanın bağlanma bölgelerine dönüşüm faktörünü hesaplayın.

Daha sonra, ilgilenilen vezikül başına bağlanma bölgelerinin görünür sayısını hesaplayın. Temsili analiz, bir mikrometre büyüklüğündeki yapay fosfor lipid veziküllerinin, dahil edilmiş lipofilik floresan boya, boya I C 16 ile geçişini gösterir, kapı, floresan boya olmadan aynı boyutta yapay lipit vezikülleri içeren bir numuneye dayanarak ayarlanmıştır. Veziküllere bağlanan proteinin kinetiği, numunenin sürekli toplanmasıyla ilk aşamada analiz edildi.

Elde edilen veriler akım sitometrisi kullanılarak analiz edilmiştir. Akış sitometrik ölçümleri, çözeltileri karıştırdıktan ve Tyrode tamponu ile seyrelttikten sonra mümkün olan en kısa sürede başlamalıdır. Önerilen yöntem, iyi bir geçici çözünürlükle oldukça hassas olan ve teslimatın getirilmesini gerektirmeyen membran etkileşimlerini incelemek için yüzey plazma rezonansı ile desteklenebilir Bu yöntemin temel avantajı, erişilebilirliği ve basitliğidir.