Floresan Etiketli Proteinlerin Yapay Fosfolipid Mikrovezikülleri ile Etkileşiminin Kantitatif Akış Sitometrisi Kullanılarak Analiz Edilmesi
April 6th, 2022
Burada, proteinlerin hücre zarları veya mikro-parçacıklarla etkileşimini karakterize etmek için bir dizi yöntem açıklıyoruz.
Bu miktar akış sitometrisi yöntemini kullanarak araştırmacılar, membran etkileşiminin kinetik ve denge geleneklerini hesaplayabilir ve PPH membranındaki siteler tarafından getirilen protein sayısını tahmin edebilirler. Bu yöntemin avantajları, reaktiflerin ve ekipmanların basitliği ve kullanılabilirliğidir. Bu yöntem sadece temel araştırmalar içindir.
Protokol, kan hesaplamasında protein lipit etkileşimlerini incelemek için geliştirilmiştir ve proteinlerin çeşitli lipit membranları ile etkileşimini karakterize etmek için diğer alanlarda kullanılabilir. Yöntem, çeşitli hücreler ve ligand tipleri üzerindeki ligand bağlanma dinamiklerinin miktar değerlendirmesi için kullanılabilir. Kinetik bağlanma deneylerini, Tyrode'un tamponundaki fosfolipid veziküllerini bir mikromolar konsantrasyona ve toplam 250 mikrolitre hacme seyrelterek başlatın.
Daha sonra floresan etiketli pıhtılaşma faktörü X veya FX FD ve 500 nanomolar konsantrasyonunu fosfolipid vezikülleri ile bire bir oranında karıştırarak toplam 500 mikrolitre hacim elde edin. Hemen 500 mikrolitre karışık süspansiyonu akış sitometresine enjekte edin. 488 nanometre uyarma dalga boyuna ve 585 nanometre emisyon filtresine sahip bir akış hızında; FL iki kanalı için 42 genişliğinde.
Daha sonra, FL dört kanalındaki ortalama floresansı, 633 nanometrede uyarma ve 20 genişliğinde 660 nanometrede emisyon filtresi ile ölçün. Bağlanmanın doygunluğu sağlandığında, numuneyi Tyrode tamponu ile 20 kat seyreltin ve bir taban çizgisi floresansına veya bir platoya ulaşılana kadar ayrışmayı izleyin. Denge bağlama deneyleri için, Tyrode'un tamponunda 20 dakika boyunca sıfırdan 1000 nanomolara kadar değişen FX FD konsantrasyonlarına sahip beş mikromolar yapay fosfolipid vezikülünü inkübe edin.
Kuluçkadan sonra her numuneyi Tyrode tamponu ile 200 mikrolitrelik son hacme 20 kat seyreltin ve seyreltilmiş numuneyi 30 saniye içinde akış sitometrisi ile analiz edin. Verileri analiz etmek için, FSC formatındaki deneyleri sitometri veri toplama yazılımından veri analizi için sitometre yazılımına aktarın. Dosyayı seçip dışa aktarma ve FSC dosyaları sekmelerini tıklatarak.
bittiğinde, bilgisayardaki dosyaları seçerek ve dosyaları programın çalışma alanına sürükleyerek FCS dosyalarını sitometre yazılımına açın. Mikro-parçacıkların geçişi için, lipofilik boyanın floresansı ile mikro-parçacıkların bölgesini tanımlayın, DIC 16 üç. Ardından, günlük koordinatlarında FL iki D I C 16'dan bir nokta grafiği SSC oluşturmak için çalışma sayfasındaki çizim düğmesini kullanın.
Ardından bir geçit bölgesi çizmek için dikdörtgen kapı düğmesini seçin. Kinetik deneyleri analiz etmek için, veziküllerin bölgesi için zaman içindeki floresan koordinatlarını kullanarak bir nokta grafiği oluşturun. Ardından, zaman içinde floresandaki değişimle ilgili verileri CSV formatında dışa aktarın; örneği seçip dışa aktarma sekmesine sağ tıklayarak, ardından parametrelerde dört kez FL'yi seçerek, CSV formatını seçmeden ve dışa aktarma sekmesine basmadan önce kaydetmek için dizini seçin.
Aktarımdan sonra, her 1000 olay için basit hareketli ortalama floresan ve zamanı hesaplamak için CSV dosyasını istatistiksel yazılımda açın, üstel bağımlılık varsayımı altında tek hareketli ortalama floresanın zamana bağımlılığının bir grafiğine yaklaşın ve bir denklem kullanarak kinetik ilişkilendirme sabitini hesaplamak için değeri kullanın. Ardından, daha önce açıklandığı gibi denklemi kullanarak kinetik ayrışma sabitini hesaplayın. Denge bağlama testinin tarihini analiz etmek için, seçilen her FX FD konsantrasyonu için veziküller bölgesindeki FX FD'nin ortalama floresansını belirleyin ve daha sonra bağlı faktör floresansının tek bölge bağlama varsayımında eklenen faktörün konsantrasyonundan bağımlılığına yaklaşın.
En az üç bağımsız tekrardan bir denklem kullanarak ortalama bağlama parametrelerini hesaplayın. Jel filtrelenmiş trombositleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 2.5 milimolar kalsiyum klorür varlığında kalsiyum IANA 4A yirmi üç, yüz seksen yedi ile inkübe ederek kalibre edilmiş boncuklar hazırlamaya devam edin. Aktif trombositler FX FD'nin çeşitli konsantrasyonlarını ekleyin ve trombositleri yüzde iki hacimli formaldehit ile inkübe edin.
Bir saat sonra, trombositleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca üç molar glisin ve% 5 BSA ile inkübe ederek reaksiyonu durdurun. Daha sonra karışımı reaksiyona girmemiş boyadan beş dakika boyunca 400 kez G'de santrifüjleme ile saflaştırın. Peleti Tyrode'un %0,5 BSA içeren tamponunda yeniden askıya almadan önce süpernatı çıkarın.
Ardından, her numunedeki kalibrasyon boncuklarının floresan seviyesini bir spektroflorometre kullanarak ve ardından akış sitometresini kullanarak ölçün. Bir hücre sayacı yardımıyla her numunedeki boncuk sayısını belirleyin. Her bir boncuk örneğinin floresan yoğunluğunu, bir spektroflorometre kullanarak çözünür floresan boya konsantrasyonuna dönüştürün ve spektroflorometre moleküllerinin sayısı için floresan boya konsantrasyonunu yeniden hesaplayın.
Her numune için flurofor moleküllerinin sayısı üzerine bir akış sitometresinde boncukların ortalama floresansının bir bağımlılık grafiğini oluşturun. Ardından, analiz uydurma özelliğini kullanarak satır orantılılığına göre bağımlılığı yaklaştırın ve doğrusal sekmeleri sırayla sığdırın. Denklemdeki yaklaşımdan, ortalama floresanın bağlanma bölgelerine dönüşüm faktörünü hesaplayın.
Daha sonra, ilgilenilen vezikül başına bağlanma bölgelerinin görünür sayısını hesaplayın. Temsili analiz, bir mikrometre büyüklüğündeki yapay fosfor lipid veziküllerinin, dahil edilmiş lipofilik floresan boya, boya I C 16 ile geçişini gösterir, kapı, floresan boya olmadan aynı boyutta yapay lipit vezikülleri içeren bir numuneye dayanarak ayarlanmıştır. Veziküllere bağlanan proteinin kinetiği, numunenin sürekli toplanmasıyla ilk aşamada analiz edildi.
Elde edilen veriler akım sitometrisi kullanılarak analiz edilmiştir. Akış sitometrik ölçümleri, çözeltileri karıştırdıktan ve Tyrode tamponu ile seyrelttikten sonra mümkün olan en kısa sürede başlamalıdır. Önerilen yöntem, iyi bir geçici çözünürlükle oldukça hassas olan ve teslimatın getirilmesini gerektirmeyen membran etkileşimlerini incelemek için yüzey plazma rezonansı ile desteklenebilir Bu yöntemin temel avantajı, erişilebilirliği ve basitliğidir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, proteinlerin hücre zarları ve mikrovezikuller ile etkileşimlerini karakterize etme yöntemlerini açıklar. Odak noktası, araştırmacıların bağlanma dinamiklerini değerlendirmelerine olanak tanıyan bir akış sitometri tekniğidir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyokimya
- Hücre Biyolojisi
- Protein-Lipit Etkileşimleri
Arka Plan
- Proteinlerin zarlarla etkileşimini anlamak, çeşitli biyolojik süreçler için kritik öneme sahiptir.
- Akış sitometri, bu etkileşimleri incelemek için nicel bir yaklaşım sağlar.
- Yöntem, çoklu alanlarda temel araştırmalar için uygulanabilirdir.
- Bu yöntem özellikle kandaki protein-lipid etkileşimlerini incelemek için geliştirilmiştir.
Çalışmanın Amacı
- Proteinlerin lipid zarları ile etkileşimini karakterize etmek.
- Belirli zar bölgeleri ile etkileşime giren proteinlerin sayısını tahmin etmek.
- Araştırmacılar için basit ve erişilebilir bir yöntem sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Protein-zar etkileşimlerini nicellemek için akış sitometri.
- Tiroid tamponunda fosfolipit veziküllerinin seyreltilmesi.
- Ligand bağlanma dinamiklerinin değerlendirilmesi.
- Deneyler için bir mikromolar konsantrasyonun kullanılması.
Ana Sonuçlar
- Yöntem, kinetik ve denge sabitlerinin hesaplanmasına olanak tanır.
- Protein etkileşimlerini inceleme sürecini basitleştirir.
- Araştırmacılar, zar bölgeleri tarafından getirilen proteinlerin sayısını tahmin edebilir.
- Yaklaşım, çeşitli lipid zarları için çok yönlüdür.
Sonuçlar
- Bu akış sitometri yöntemi, protein-lipid etkileşimlerini incelemek için etkilidir.
- Temel araştırma uygulamaları için basit bir protokol sunar.
- Teknik, farklı hücre ve ligand türleri için uyarlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantitative flow cytometry of fluorescent-labeled proteins binding to artificial phospholipid microvesicles enables precise measurement of protein-membrane interactions, a critical step in early discovery and target validation. This approach provides kinetic and equilibrium binding data, supporting predictive confidence in membrane-associated targets and facilitating risk-adjusted portfolio decisions. Its accessibility and reproducibility make it a valuable capability for biopharma R&D teams focused on mechanistic de-risking and assay development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of protein-lipid binding kinetics and affinities.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying membrane interaction pathways.
- Provides functional target validation data for membrane-associated proteins.
- Facilitates predictive confidence in target engagement and triage decisions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated artificial vesicle systems for downstream screening workflows.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative binding measurements.
- Enables scalability and platform reuse for diverse ligand and membrane types.
- Supports reliable evaluation of compound effects on protein-membrane interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems where membrane interactions drive biological outcomes.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of membrane-targeted agents.
- Enables risk-adjusted advancement by quantifying binding site occupancy and kinetics.
- Supports translational biomarker development for membrane-associated processes.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, particularly for membrane-associated targets.
- Discovery Biology: Quantifies protein-membrane binding kinetics and site occupancy to clarify biological mechanisms.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible vesicle systems with quantitative outputs for compound evaluation.
- Analytics: Generates kinetic and equilibrium constants, enabling direct comparison of binding conditions and ligands.
- Translational Research: Supports preclinical continuity by modeling disease-relevant membrane interactions.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable, standardized workflow for membrane interaction studies across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in membrane-targeted discovery.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable quantitative assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust binding data early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of membrane-associated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry and quantitative data analysis.
- Needs access to calibrated flow cytometers and fluorescent labeling reagents.
- Demands cross-team standardization for gating, calibration, and data interpretation.
- Adaptable to various artificial and natural membrane systems with appropriate controls.
- Limited to basic research applications; not validated for clinical or regulatory use.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:58
Kinetic Binding Experiments
2:13
Equilibrium Binding Experiments
2:45
Analysis of Flow Cytometry Data
5:13
Converting Fluorescence Intensity to the Mean Number of Binding Sites
7:05
Results: Specific Binding of Fluorescent-Labeled Coagulation Factor X or fX to Artificial Phospholipid Vesicles
7:42
Conclusion
