Fare Beyin Parankiminin Arteriyolar Endotelinin İzolasyonu ve Fonksiyonel Analizi
11 Mart 2022
Serebral parankimal arteriollerden sağlam fare serebral endotelyal "tüplerinin" yoğun bir şekilde hazırlanması, serebral kan akışı regülasyonunu incelemek için gösterilmiştir. Ayrıca, bu endotel çalışma modelinin floresan görüntüleme ve anahtar hücresel sinyal yollarının elektrofizyoloji ölçümü için, hücre içi [Ca2+] ve membran potansiyelindeki değişiklikler de dahil olmak üzere deneysel güçlerini gösteriyoruz.
Bu yöntem, intraserebral kan akışını beyindeki nöronal ve glial aktivitenin körüklenmesine doğrudan bağlayan parankimal arteriyolar endotelin işlevi hakkında daha iyi bir fikir verecektir. Arteriol endotel üzerinde belirgin bir teknik avantaj, bireysel intraserebral endotel hücreleri ve bunların ilgili organelleri arasında morfolojik boyutların ve kalsiyum ve elektrik sinyalizasyonunun artmış çözünürlüğüdür. Başlangıçta, intraserebral endotelin izolasyonu ve muayenesi çok zor olacaktır.
Bununla birlikte, bu tekniğe sabır ve özveri eşliğinde bol miktarda uygulama ile hakim olmak mümkündür. Beynin yüzeyinden kalan kanı çıkarmak için izole edilmiş beyni bir beher veya Petri kabında soğuk bir diseksiyon çözeltisi ile yıkayın. Parankimal arteriolleri izole etmek için ventral beyin tarafını yukarı bakacak şekilde soğuk diseksiyon çözeltisi içeren bir odaya yerleştirin.
Parankimal arteriolleri izole etmek için, izole edilmiş beyni, 50 santimetreden daha derin odun kömürü infüzyonlu silikon polimer kaplama içeren bir Petri kabında soğuk diseksiyon çözeltisinde çelik pimlerle sabitleyin. MCA'nın etrafındaki keskin ve hizalanmış diseksiyon makaslarıyla her iki yarımküreden bir beyin dokusu dikdörtgenini kesin, doku segmentinin üst kısmının Willis çemberinden dallanma noktasını geçmesini sağlayın. MCA çelik pimlerle yukarı bakacak şekilde beyin dokusunu kabın içine sabitleyin.
Pimlerin yakınında sığ bir kesi dikkatlice yapın ve piayı küçük forsepslerle çıkarın, bir uçtan diğerine doğru hafifçe soyun. İzole edilmiş piayı, çanaktaki MCA'dan dallanmış parankimal arteriollerle pimlerle dikkatlice sabitleyin ve parankimal arteriolleri dikkatlice diseke edin. Kalan distal dalları kesin ve arteriolün doku takılmadan temiz olduğundan emin olun.
Enzimatik sindirim için bu temiz bozulmamış arteriol kullanın. Alternatif olarak, istenirse endotel tüpleri hazırlamak için enzimatik sindirim için her arteriol iki parçaya bölün. Arteriyolar segmentlerin kısmi sindirimi için, bozulmamış arteriyolar segmentleri papain, ditiyoeritritol, kollajenaz ve elastaz içeren 10 mililitrelik bir cam tüp içinde bir mililitre ayrışma çözeltisine yerleştirin.
Arteriyolar segmentleri 10 ila 12 dakika boyunca 34 santigrat derecede inkübe edin. Arteriyolar endotel tüpünü izole etmek için, mikro şırınga enjektörüne bağlı tritürasyon pipetini odadaki ayrışma çözeltisine yerleştirin ve sindirilmiş damar segmentinin bir ucuna yakın bir yere yerleştirin. Nazik tritürasyon için pompa kontrolöründe saniyede bir ila üç nanolitre aralığında bir hız ayarlayın.
100X ila 200X büyütmeyi korurken, arteriyolar segmenti pipete çekin ve daha sonra adventiti ve düz kas hücrelerini ayırmak için enjekte edin. Tüm düz kas hücreleri ayrışana ve sadece endotel hücreleri sağlam bir tüp olarak kalana kadar damar segmentini tritüre edin. Mikro manipülatörlerle, odadaki cam kapaklar üzerindeki endotel tüpünün her bir ucunu borosilikat cam iğneleme pipetleri ile sabitleyin Endotel zarı potansiyelini ölçmek için, 4X hedefini incelerken, keskin elektrot ucunu arteriyolar endotel tüpünün bir hücresinin hemen üzerine dikkatlice yerleştirin.
Büyütmeyi kademeli olarak 400X'e yükseltin ve elektrot ucunu gerektiği gibi yeniden konumlandırın. Mikro manipülatörü kullanarak, keskin bir elektrotun ucunu endotel tüpünün hücrelerinden birine yavaşça yerleştirin ve bir elektrometre kullanarak VM kaydetmeye başlayın. Endotel istirahat VM'si eksi 30 ila eksi 40 milivolt arasında stabil hale geldiğinde, deneysel amaç başına istenen farmakolojik ajanları uygulayın.
Endotel tüpünü, plazma zarı veya istenen organel için floresan izleyici ile 15 ila 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede yükleyin. Hücreleri taze süperfüzyon fizyolojik tuz çözeltisi ile yıkayın ve canlı hücreleri mikroskop altında ilgili boyaların uyarma dalga boyunda görüntüleyin. Endotel fonksiyonu, 37 santigrat derecede güçlü bir pürinerjik reseptör agonisti olan farmakolojik ajan MTA'ya yanıt olarak hücre içi kalsiyum ve membran potansiyeli ölçülerek değerlendirildi.
Bir mikromolar MTA'nın uygulanması üzerine, hücre içi kalsiyum konsantrasyonu, eşlik eden bir hiperpolarizasyon ile hızla artar. Ayrıca, bozulmamış endotel, hücresel morfolojiyi incelemek için görselleştirme için floresan izleyicilerle 37 santigrat derecede inkübe edildi. Canlı endotel hücre görüntülemesinde plazma membranı ve çekirdekleri için ko-boyanma görüldü.
Plazma zarı, endoplazmik retikulum floresan boyası ile birlikte boyandı ve bu sayede plazma zarının yakınında ER'nin görünür örtüşme alanları turuncu göründü. Deneyci, arteriollerin zarar görmesini önlemek için diseksiyon ve izolasyon sırasında dikkatli olmalıdır, çünkü hasarlı bir arteriol kesinlikle sağlam bir endotel tüpü vermeyecektir. İşlemi takiben, hücreler floresan antikorları ile sabit immünohistokimya veya organellerin ve membran lipitlerinin canlı hücre boyaması için kullanılabilir.
Bu teknik, fizyoloji için temel düzeyde serebral kan akışının altında yatan mekanizmaları anlamak ve tedavi için patolojiye geçişleri seçmek için yeni bilgiler üretecektir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, serebral parensemal arteriollerden sağlam fare serebral endotel "tüpleri" hazırlamak için bir yöntem sunar ve serebral kan akışı düzenlemesinin incelenmesini kolaylaştırır. Model sistem, floresan görüntüleme ve elektrofizyolojik ölçümlerde güçlü yönlere sahiptir ve hücresel sinyal yollarının, hücre içi kalsiyum dinamiği ve membran potansiyeli değişiklikleri gibi incelenmesine olanak tanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Serebral kan akışı düzenlemesi
- Endotel hücre sinyalleşmesi
- Floresan görüntüleme teknikleri
Arka Plan
- Parensemal arterioler endotelinin nöronal ve glial aktivitede önemi
- İntra serebral endotel hücrelerinde hücresel sinyal çalışmalarının çözünürlüğünün arttırılması
- İntra serebral endotelin yalıtılması ve incelenmesinde karşılaşılan zorluklar
Kullanılan Yöntemler
- Çalışma için parensemal arteriollerin yalıtılması
- Fare model sistemi
- Floresan görüntüleme ve elektrofizyoloji teknikleri
Ana Sonuçlar
- Sağlam hücresel sinyal kapasitesine sahip endotel tüplerinin başarılı şekilde yalıtılması
- Farmakolojik uyarım üzerine hücre içi kalsiyum konsantrasyonunun artması ve membran hiperpolarizasyonu
- Floresan boyaların kullanılmasıyla hücre morfolojisinin görselleştirilmesi
Sonuçlar
- Bu yöntem, serebral kan akışını düzenleyen mekanizmalar hakkında yeni bilgiler sağlar.
- Model, beyin fonksiyonlarındaki fizyolojik süreçlerin ve potansiyel patolojilerin anlaşılmasında ilerlemeye yardımcıdır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Direct isolation and functional analysis of mouse brain parenchymal arteriolar endothelium enables precise interrogation of cerebrovascular mechanisms critical for neurovascular health. This method enhances predictive confidence in target validation for vascular contributions to neurodegenerative disease and supports mechanistic de-risking at the discovery stage. Its high-resolution functional readouts position it as a pivotal tool for early-stage portfolio triage in neurovascular research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct testing of endothelial K+ channel function and regulatory mechanisms in a disease-relevant system.
- Supports mechanistic de-risking by resolving intracellular Ca2+ dynamics and membrane potential changes in intact endothelium.
- Facilitates functional target validation for pathways implicated in cerebral blood flow and neurodegeneration.
Screening & Assay Development
- Provides a validated ex vivo system for quantitative measurement of endothelial responses to pharmacological agents.
- Delivers reproducible, high-resolution imaging and electrophysiological outputs for assay standardization.
- Enables screening of compounds affecting endothelial signaling with direct physiological relevance.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by linking endothelial function to neurovascular health.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation in models of cognitive impairment and dementia.
- Offers predictive value for risk-adjusted advancement of neurovascular targets.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, mechanistic validation, and quantitative screening of endothelial function in brain microvasculature.
- Discovery Biology: Resolves pathway-specific effects on endothelial signaling and morphology in a native context.
- Screening: Provides quantitative, reproducible readouts for compound evaluation and assay development.
- Analytics: Supports statistical comparison of membrane potential and intracellular Ca2+ responses across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges mechanistic findings to disease-relevant endpoints in neurovascular health.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse neurovascular research and target validation efforts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurovascular target validation.
- Operational Value: Standardizes high-resolution functional assays for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and capital allocation for neurovascular discovery programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets linked to cerebral blood flow and neurodegeneration.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microdissection, electrophysiology, and live-cell imaging.
- Demands specialized instrumentation for fluorescence and membrane potential measurements.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for reproducible outputs.
- Adaptation may be needed for different brain regions or disease models.
- Technical challenges in isolating intact arteriolar endothelium may limit throughput.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:58
Dissection and Isolation of Mouse Cerebral Arterioles
2:30
Digestion of Parenchymal Arterioles and Preparation of Endothelial Tubes
3:47
Utilization of Arteriolar Endothelial Tubes for the Examination of Cellular Physiology and Cellular Imaging
4:54
Results: Assessment of Endothelial Function
5:50
Conclusion
