Name: Batofenantropin Bazlı Kolorimetrik Tahlil Kullanılarak Doku Non-Heme Demir İçeriğinin Ölçülmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-31T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 8 s
Description: Öğrenin, hayvan dokularındaki non-heme demir içeriğini Bathophenanthroline bazlı kolorimetrik tahlil ile ölçme yöntemini. Bu protokol demir metabolizması araştırmaları için yüksek verimli ve uygun maliyetli bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, UIDB/04293/2020 projesi kapsamında FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P. aracılığıyla Ulusal Fonlar tarafından finanse edilmiştir.

C57BL/6 fareler ticari olarak satın alındı ve C57BL/6 arka planındaki hepcidin-null (Hamp1−/-) fareler8 Sophie Vaulont'un (Institut Cochin, Fransa) nazik bir hediyesiydi. Hayvanlar, i3S hayvan tesisinde belirli patojensiz koşullar altında, sıcaklık ve ışık kontrollü bir ortamda, standart kemirgen chow ve suya serbest erişime sahip olarak barındırıldı. Avrupa levreği (Dicentrarchus labrax) ticari bir balık çiftliğinden satın alındı ve ICBAS hayvan tesisinde, sıcaklık ve ışık kontrollü bir ortamda barındırıldı ve günlük ad libitum'u standart levrek yemi ile besledi. Omurgalı hayvanları içeren tüm prosedürler i3S Hayvan Etik Komitesi ve ulusal otorite Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (DGAV) tarafından onaylanmıştır. Ticari reaktifler, ekipmanlar ve hayvanlar hakkındaki bilgiler Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Çözelti hazırlama
NOT: Tüm reaktifleri ve çözeltileri demir içermeyen cam eşyalarla veya tek kullanımlık plastik eşyalarla işleyin ve hazırlayın. Demir kontaminasyonu riski nedeniyle metalik laboratuvar malzemelerinin (örneğin paslanmaz çelik spatulalar) herhangi bir reaktif veya çözelti ile temas etmesine izin vermeyin. Yeniden kullanılabilir cam eşyaların demir içermediğinden emin olun. Malzemeleri 30-60 dakika boyunca uygun laboratuvar deterjanı ile yıkayın, deiyonize suyla durulayın, deiyonize su ile 1:3 seyreltilmiş% 37'lik bir nitrik asit çözeltisinde gece boyunca bekletin, tekrar deiyonize suyla durulayın ve kurumaya bırakın.
<ol><li>Asit karışımı: Bir cam şişede 82.2 mL% 37 hidroklorik aside 10 g trikloroasetik asit ekleyin, iyice çözün ve son hacmi deiyonize su ile 100 mL'ye ayarlayın. Kullanmadan önce çalkalayın. Alternatif olarak, doku sindirimi için sadece% 37 hidroklorik asit kullanın. NOT: Çözelti, koyu kahverengi cam reaktif şişelerinde saklandığında en az 2 ay boyunca stabildir. DİKKAT: Hidroklorik asit ve trikloroasetik asit aşındırıcıdır ve konsantre formlar toksik asidik buharları serbest bırakır. Asitleri kullanırken her zaman koruyucu giysiler, kimyasallara dayanıklı eldivenler ve kimyasal sıçrama gözlükleri kullanın. Onları solumaktan kaçının ve her zaman bir duman başlığının altındayken asitleri kullanın.</li>
	<li>Doymuş sodyum asetat: Bir cam şişede 400 mL deiyonize suya 228 g susuz sodyum asetat ekleyin ve oda sıcaklığında gece boyunca çalkalayın. Çözeltinin dinlenmesine ve bir gün boyunca çökelmesine izin verin. Yağış olmazsa, az miktarda sodyum asetat eklemeye devam edin. Çözeltiyi bir cam şişede saklayın.</li>
	<li>Kromojen Reaktif: 1 mL kromojen reaktif hazırlamak için, 500 μL deiyonize suya ve 10 μL konsantre (% 100) tiyoglikolik aside 1 mg 4,7-difenil-1,10-fenantropin disülfonik asit disodyum tuzu ekleyin ve iyice çözün. Son hacmi deiyonize su ile 1 mL'ye kadar yapın. NOT: Gerektiği kadar kromojen reaktif hazırlayın. Çözelti, ışıktan korunduğunda 1 ay boyunca kararlıdır.</li>
	<li>Çalışma Kromojen Reaktifi (WCR): 5 hacim doymuş sodyum asetat ve 5 hacim deiyonize suya 1 hacim Kromojen Reaktifi ekleyin. NOT: Bu çözelti kullanım gününde taze olarak hazırlanmalıdır.</li>
	<li>Stok Demir Standart Çözeltisi: 20 mM'lik bir stok demir çözeltisi hazırlamak için, 5.480 μL% 37 hidroklorik asit içeren 250 mL hacimsel şişeye 111.5 mg karbonil demir tozu yerleştirin. Oda sıcaklığında gece boyunca çözünmeye bırakın (veya kaynar su banyosunda inkübe edin). Daha sonra, çözeltiyi deiyonize su ile 100 mL'lik son bir hacme kadar hazırlayın. NOT: Standart çözelti, sıkıca kapatılmış bir kapta saklandığında süresiz olarak saklanabilir.</li>
	<li>Çalışma Demiri Standart Çözeltisi (WISS): 500 μL deiyonize suya 13,5 μL% 37 hidroklorik asit ekleyin. Stok Demir Standart Çözeltisinden 10 μL ekleyin ve deiyonize su ile 1 mL'ye kadar son hacmi oluşturun (11.169 μg Fe / mL, 200 μM; AAS ile ölçülür). NOT: Çalışma çözeltisi kullanım gününde taze olarak hazırlanmalıdır.</li>
</ol>2. Numune kurutma
<ol><li>Bir neşter bıçağı ile 10-100 mg ağırlığındaki bir doku örneğini kesin. Analitik/hassas terazide küçük bir parafilm parçası (Taze Ağırlık) üzerinde doğru şekilde tartın.</li>
	<li>Plastik cımbız kullanarak, doku parçasını 24 delikli bir plakaya (suyun buharlaşmasına izin vermek için kapaksız) yerleştirin ve 48 saat boyunca 65 ° C'de standart bir inkübatörde kurumasını bekleyin.</li>
	<li>Alternatif olarak, doku örneklerini kurutmak için bir laboratuvar mikrodalga sindirim fırını kullanın. Plastik cımbız kullanarak, tartılan doku parçasını demir içermeyen bir Teflon bardağa yerleştirin ve mikrodalgada kurutun. Çalışma parametrelerini cihazın kullanım kılavuzuna göre ayarlayın. NOT: Referans olarak, spesifik çürütme fırını kullanılarak karaciğer numunelerinin kurutulması için çalışma parametreleri (bkz. Malzeme Tablosu) Tablo 1'de gösterilmiştir.</li>
	<li>Plastik cımbız kullanarak, her kurumuş doku parçasını analitik/hassas bir terazinin içindeki küçük bir parafilm parçasının üzerine yerleştirin ve doğru şekilde tartın (Kuru Ağırlık).</li>
</ol>3. Asidik sindirimi örnekleyin
<ol><li>Plastik cımbız kullanarak, her kurutulmuş doku parçasını 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>1 mL asit karışımı ekleyin ve mikrosantrifüj tüpünü kapatın. Dokunun ihmal edilmesi dışında, aynı şekilde bir asit boşluğu hazırlayın. DİKKAT: Asit karışımı aşındırıcıdır ve toksik buharlar salgılar. Asit karışımını kullanırken koruyucu giysiler, kimyasallara dayanıklı eldivenler ve kimyasal sıçrama gözlükleri takın. Nefes almaktan kaçının ve her zaman bir duman başlığının altındayken kullanın.</li>
	<li>Mikrosantrifüj tüplerini bir inkübatörde 20 saat boyunca 65 ° C'de inkübe ederek dokuları sindirin.</li>
	<li>Oda sıcaklığına soğuduktan sonra, şeffaf (sarı) asit ekstraktının (süpernatant) 500 μL'sini, plastik uçlarla donatılmış bir mikropipet kullanarak yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Net bir süpernatan elde etmek mümkün değilse, kısa bir santrifüjleme spini gerçekleştirin. DİKKAT: Süpernatant oldukça asidiktir. Süper nantantları kullanırken koruyucu giysiler, kimyasallara dayanıklı eldivenler ve kimyasal sıçrama gözlükleri giyin. Her zaman bir duman başlığının altındayken onları kullanın. NOT: Bu noktada, asit ekstraktları kolorimetrik tahlil için hemen kullanılabilir veya daha sonra kullanmak üzere -20 ° C'de dondurulabilir. Dondurulmuş numuneleri oda sıcaklığına tamamen çözün ve kullanmadan önce vorteksleyin.</li>
</ol>4. Renk gelişimi
<ol><li>Tablo 2'de belirtildiği gibi 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerinde veya daha yüksek verim için doğrudan düz tabanlı, 96 delikli, berrak, işlenmemiş polistiren mikroplakalara kromojen reaksiyonları hazırlayın. Tüm reaksiyonları (asit boşluğu, standart ve numune) en azından kopya halinde hazırlayın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.</li>
</ol>5. Absorbans okuma
<ol><li>Bir spektrofotometrede veya plaka okuyucuda 535 nm dalga boyundaki numune emiciliğini deiyonize su referansına karşı ölçün. Plakalar kapaksız veya kapaklı olarak okunabilir. Kapaklı kasada, absorbans okumasına olası paraziti önlemek için ölçüm öncesinde kapaktan asit buharlarının salınması nedeniyle oluşan yoğuşmaları giderin. NOT: Deiyonize suya karşı okunan asit boşluğunun optik emilimi (referans) 0,015'ten az olmalıdır; standardın ve numunelerin optik absorbansı 0.100 ile 1.000 arasında olmalıdır. Çok yüksek veya çok düşük demir içeriğine sahip numuneler için, asit ekstraktı (süpernatant) ve diH2O hacimlerinin ayarlanması gerekebilir (Tablo 2): absorbans 1.0'dan büyükse, daha küçük bir numune (süpernatant) hacmi kullanın; absorbans 0.1'den düşük olduğunda, süpernatanın daha yüksek bir hacmini kullanın. Her numunenin doku demir içeriği hesaplanırken numune hacmi (Vsmp) dikkate alınır (bkz. adım 6).</li>
</ol>6. Doku demir içeriğinin hesaplanması
<ol><li>Aşağıdaki denklemle heme olmayan doku demir içeriğini hesaplayın: Doku demiri (μg/g kuru doku) = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63469/63469eq01v2.jpg"> AT = test numunesinin emilmesi AB = asit boşluğunun emilmesi AS = standardın absorbansı Fes = WISS'nin demir konsantrasyonu (μg Fe/mL) W = kuru mendilin ağırlığı (g) Vsmp = numune hacmi (Tablo 2'deki değişken Supernatant hacmi mL'ye dönüştürülür) Vf = 65 ° C'de gece inkübasyonundan sonra asit karışımının son hacmi (mL cinsinden asit hacmine artı kuru doku hacmine karşılık gelir; numune ağırlıkları önemli ölçüde farklılık göstermiyorsa, sabit bir hacim ≈ 1 mL varsayalım) Vstd = demir standart hacmi (Tablo 2'deki WISS hacmi mL'ye dönüştürülmüştür) Vrv = nihai reaksiyon hacmi (Tablo 2'deki toplam hacim mL'ye dönüştürülür)</li>
</ol>

<ol><li>Muckenthaler, M. U., Rivella, S., Hentze, M. W., Galy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+red+carpet+for+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A red carpet for iron metabolism.</a> Cell. 168, 344-361 (2017).</li>
<li>Pagani, A., Nai, A., Silvestri, L., Camaschella, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepcidin+and+anemia%3A+A+tight+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hepcidin and anemia: A tight relationship.</a> Frontiers in Physiology. 10, 1294(2019).</li>
<li>Weiss, G., Ganz, T., Goodnough, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anemia+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Anemia of inflammation.</a> Blood. 133 (1), 40-50 (2019).</li>
<li>Altamura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+iron+homeostasis%3A+Lessons+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regulation of iron homeostasis: Lessons from mouse models.</a> Molecular Aspects of Medicine. 75, 100872(2020).</li>
<li>Torrance, J. D., Bothwell, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+measuring+storage+iron+concentrations+in+formalinised+liver+samples%5BTitle%5D)+AND+%22South+African+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">A simple technique for measuring storage iron concentrations in formalinised liver samples.</a> South African Journal of Medical Sciences. 33 (1), 9-11 (1968).</li>
<li>Torrence, J. D., Bothwell, T. H. Tissue iron stores. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTorrence%2C+JD+%22Methods+in+Haematology%22">Methods in Haematology</a>. Cook, J. D. , Churchill Livingston Press. New York. 104-109 (1980).</li>
<li>Rebouche, C. J., Wilcox, C. L., Widness, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microanalysis+of+non-heme+iron+in+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Biophysical+Methods%22%5BJournal%5D)">Microanalysis of non-heme iron in animal tissues.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 58 (3), 239-251 (2004).</li>
<li>Lesbordes-Brion, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+hepcidin+1+gene+results+in+severe+hemochromatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the hepcidin 1 gene results in severe hemochromatosis.</a> Blood. 108, 1402-1405 (2006).</li>
<li>Jumbo-Lucioni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+genetics+analysis+of+body+weight+and+energy+metabolism+traits+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systems genetics analysis of body weight and energy metabolism traits in Drosophila melanogaster.</a> BMC Genomics. 11, 297(2010).</li>
<li>Mandilaras, K., Pathmanathan, T., Missirlis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+Absorption+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Iron Absorption in Drosophila melanogaster.</a> Nutrients. 5, 1622-1647 (2013).</li>
<li>Grundy, M. A., Gorman, N., Sinclair, P. R., Chorney, M. J., Gerhard, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+non-heme+iron+assay+for+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Biophysical+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput non-heme iron assay for animal tissues.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 59, 195-200 (2004).</li>
<li>Adrian, W. J., Stevens, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wet+versus+dry+weights+for+heavy+metal+toxicity+determinations+in+duck+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wildlife+Diseases%22%5BJournal%5D)">Wet versus dry weights for heavy metal toxicity determinations in duck liver.</a> Journal of Wildlife Diseases. 15, 125-126 (1979).</li>
</ol>

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Hayvan dokularındaki heme olmayan demir içeriğinin ölçümü için, başlangıçta Torrance ve Bothwell tarafından tanımlanan batofenantrolin bazlı kolorimetrik tahlilin adaptasyonu kullanılarak bir protokol sağlanmıştır5,6. Yöntemin kritik adımları doku numunesi kurutma; protein denatürasyonu ve asit hidrolizi ile inorganik demir salınması; indirgeyici ajan tiyoglikolik asit varlığında ferrik (Fe3+) demirin demir durumuna (Fe2+) indirgenmesi ve bi...

Demir, oksijen taşınması, enerji üretimi veya DNA sentezi gibi önemli biyolojik işlemlerde yer alan proteinlerin işlevi için gerekli olan temel bir mikro besindir. Önemli olarak, hem demir fazlalığı hem de demir eksikliği insan sağlığına oldukça zararlıdır ve doku demir seviyeleri ince bir şekilde düzenlenir. Anormal diyet demir emilimi, demir eksikliği olan diyetler, tekrarlanan kan transfüzyonları ve kronik inflamasyon, dünya çapında milyarlarca insanı etkileyen demir ile ilişkili bozuklukların yaygın nedenleridir1,2,3.
Aşırı demir yükü veya eksikliğinin deneysel hayvan modelleri, demir homeostazının sistemik ve hücresel regülasyonunda yer alan mekanizmalar hakkındaki bilgimizi ilerletmek için etkili olmuştur4. Son yirmi yılda kaydedilen önemli ilerlemelere rağmen, birçok kilit husus belirsizliğini korumaktadır. Önümüzdeki yıllarda, hayvan dokularındaki toplam demir seviyelerinin doğru ölçümü, demir biyolojisi alanındaki araştırmaları ilerletmek için kritik bir adım olmaya devam edecektir.
Çoğu laboratuvar, doku demirini atomik absorpsiyon spektroskopisi (AAS), endüktif olarak eşleşmiş plazma kütle spektrometresi (ICP-MS) veya heme olmayan demirin bir batofenantrolin reaktifi ile reaksiyonuna dayanan kolorimetrik bir tahlil ile ölçer. Sonuncusu, Torrance ve Bothwell tarafından 50 yıl önce tanımlanan orijinal yönteme dayanmaktadır5,6. Bu yöntemin bir varyasyonu daha sonra batofenantropin7'ye alternatif olarak ferrozin kullanılarak geliştirilmiş olsa da, ikincisi literatürde en çok atıfta bulunulan kromojenik reaktif olmaya devam etmektedir.
Tercih edilen yöntem genellikle mevcut uzmanlığa ve altyapıya bağlıdır. AAS ve ICP-MS daha hassas olsa da, kolorimetrik tahlil aşağıdaki önemli avantajları sunduğu için yaygın olarak kullanılmaya devam etmektedir: i) kırmızı kan hücrelerinde bulunan hemoglobinden elde edilen heme demirinin katkısını dışlar; ii) sofistike analitik beceriler veya çok pahalı ekipmanlar gerektirmez; ve iii) orijinal küvet bazlı tahlil, daha yüksek numune verimi sağlayan bir mikroplaka formatına uyarlanabilir. Bu çalışmada sunulan kolorimetrik yaklaşım, kemirgenlerden balıklara ve meyve sineklerine kadar çeşitli deneysel hayvan modellerinde aşırı demir yükü veya demir eksikliği olan doku non-heme demir seviyelerindeki değişiklikleri ölçmek için rutin olarak kullanılmaktadır. Burada, hayvan dokularındaki heme olmayan demir içeriğinin ölçümü için, çoğu laboratuvarın uygulamayı kolay bulması gereken basit, iyi kurulmuş, kolorimetrik bir tahlil kullanılarak bir protokol sağlanmaktadır.

<table><tbody><tr><td>96 kuyulu UV şeffaf plaka</td><td>Sarstedt</td><td>82.1581.001</td><td></td></tr><tr><td>Analitik terazi</td><td>Kern</td><td>ABJ 220-4M</td><td></td></tr><tr><td>Susuz sodyum asetat</td><td>Merck</td><td>106268</td><td></td></tr><tr><td>Bathofenantrolin sülfonat (4,7-Difenil-1,10-fenantrolin dissülfonik asit)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>B1375</td><td></td></tr><tr><td>C57BL / 6 fare ( Mus musculus)</td><td>Charles River Laboratuvarları</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Karbonil demir tozu, &ge; %99,5</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>44890</td><td></td></tr><tr><td>Polimetil metakrilat (PMMA) içinde tek kullanımlık küvetlerVWR</td><td></td> <td>634-0678P</td><td></td></tr><tr><td>Çift damıtılmış, steril su</td><td>B. Braun</td><td>0082479E</td><td></td></tr><tr><td>Floresan mikroplaka okuyucu</td><td>BioTek Instruments</td><td>FLx800</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit, %37</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodalga sindirim fırını ve beyaz teflon kaplar</td><td>CEM</td><td>MDS-2000</td><td></td></tr><tr><td>Nitrik asit</td><td>Fisher Scientific</td><td>15687290</td><td></td></tr><tr><td>Fırını</td><td>Bağlayıcı</td><td>ED115</td><td></td></tr><tr><td>Kemirgen yemeği</td><td>Harlan Laboratories</td><td>2014S</td><td>Teklad Global 175 mg / kg demir içeren% 14 Protein Kemirgen Bakım Diyeti</td></tr><tr><td>Levrek (Dicentrarchus labrax)</td><td>Sonrionansa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Levrek yemi</td><td>Skretting</td><td>L-2 Alterna 1P</td><td></td></tr><tr><td>Tek ışınlı UV-Vis spektrofotometresi</td><td>Shimadzu</td><td>UV mini 1240</td><td></td></tr><tr><td>Tiyoglikolik asit</td><td>Merck</td><td>100700</td><td></td></tr><tr><td>Trikloroasetik asit</td><td>Merck</td><td>100807</td><td></td></tr></tbody></table>

batofenantropin bazlı kolorimetrik tahlil kullanılarak doku non-heme demir İçeriğinin Ölçülmesi

Measurement of Tissue Non-Heme Iron Content using a Bathophenanthroline-Based Colorimetric Assay

Demir önemli bir mikro besindir. Hem aşırı demir yükü hem de eksikliği insanlar için oldukça zararlıdır ve doku demir seviyeleri ince bir şekilde düzenlenir. Demir yükü veya eksikliğinin deneysel hayvan modellerinin kullanılması, demir homeostazının sistemik ve hücresel düzenlenmesinde rol oynayan mekanizmaların bilgisini ilerletmek için etkili olmuştur. Hayvan dokularındaki toplam demir seviyelerinin ölçümü genellikle atomik absorpsiyon spektroskopisi veya heme olmayan demirin bir batofenantrolin reaktifi ile reaksiyonuna dayanan kolorimetrik bir tahlil ile gerçekleştirilir. Uzun yıllar boyunca, kolorimetrik tahlil, çok çeşitli hayvan dokularında heme olmayan demir içeriğinin ölçümü için kullanılmıştır. Atomik absorpsiyon spektroskopisinden farklı olarak, kırmızı kan hücrelerinde bulunan hemoglobinden türetilen heme demirinin katkısını dışlar. Dahası, sofistike analitik beceriler veya çok pahalı ekipmanlar gerektirmez ve bu nedenle çoğu laboratuvarda kolayca uygulanabilir. Son olarak, kolorimetrik tahlil küvet bazlı olabilir veya daha yüksek numune verimi sağlayan bir mikroplaka formatına uyarlanabilir. Bu çalışma, aşırı demir yükü veya demir eksikliğinin çeşitli deneysel hayvan modellerinde doku demir seviyelerindeki değişikliklerin tespiti için uygun olan iyi kurulmuş bir protokol sunmaktadır.

Cuvette ile 96 kuyucuklu mikro plaka karşılaştırması Doku heme olmayan demirin, orijinal olarak Torrance ve Bothwell tarafından tanımlanan bir batofenantropin reaktifi ile reaksiyona girerek ölçülmesi5,6, absorbans okuması için bir spektrofotometrenin kullanılmasına dayanır. Bu nedenle, kromojen reaksiyonunda kullanılan hacimler, normal bir spektrofotometre küvetinin boyutuyla uyumludur. Bu çalışma, kromojen reaksiyonlarının bir mikroplaka oku...

Burada, hayvan dokularındaki heme olmayan demir içeriğinin ölçümü için, çoğu laboratuvarda kolayca uygulanabilen basit, köklü bir kolorimetrik test kullanılarak bir protokol sağlanmaktadır.

Batofenantropin Bazlı Kolorimetrik Tahlil Kullanılarak Doku Non-Heme Demir İçeriğinin Ölçülmesi

Iron is an essential micronutrient. Both iron overload and deficiency are highly detrimental to humans, and tissue iron levels are finely regulated. The ...

Burada hayvan dokularındaki Heme olmayan içerikleri ölçmek için bir protokol sağladık. Çoğu laboratuvarda kolayca uygulanabilen, iyi kurulmuş basit bir kolorimetrik tahlil kullanarak. Batofenantropin Bazlı Kolorimetrik Tahlil, sofistike beceriler veya oldukça pahalı ekipman gerektirmez ve daha yüksek numune verimi ve maliyet etkinliği için mikroplaka formatına uyarlanabilir.Bu protokol, aşırı demir yükü veya demir verimliliği ile ilgili çeşitli deneysel hayvan modellerinde doku demir seviyelerindeki değişiklikleri tespit etmek için uygundur. 10 ila 100 gram ağırlığındaki bir doku örneğini neşter bıçağı ile keserek başlayın. Analitik terazide küçük bir parafilm parçası üzerinde doğru şekilde tartın.Doku parçasını 24 kuyucuklu bir plakaya yerleştirmek için plastik cımbız kullanın. Standart bir inkübatörde 65 santigrat derecede 48 saat kurumaya bırakın. Alternatif olarak, çubuk cımbız kullanarak wade doku parçasını demirsiz bir Teflon bardağa yerleştirin ve laboratuvar mikrodalga sindirim fırınında kurutun.Her kurumuş doku parçasını analitik terazinin içindeki küçük bir paraform parçasının üzerine yerleştirin ve doğru şekilde tartın. Her kurutulmuş doku parçasını 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Tüpe asit karışımının bir ışığını ekleyin ve kapatın.Dokunun burada ihmal edilmesi dışında aynı şekilde bir asit boşluğu hazırlayın. Dokuyu sindirmek için tüpleri 20 saat boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin. Oda sıcaklığına soğuduktan sonra, 500 mikrolitre şeffaf asit ekstraktını yeni bir 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarmak için plastik uçlarla donatılmış bir mikro pipet kullanın.Kromojen reaksiyonlarını doğrudan düz tabanlı 96 kuyucuklu, berrak işlenmemiş polistiren mikro plakalara hazırlayın. 15 dakika boyunca inkübe edilmiş oda sıcaklığı. Bir plaka okuyucudaki numune emiciliğini, deiyonize su referansına karşı 535 nano metre dalga boyunda ölçün.Küvet ile heme olmayan demirin tayini ve 96 delikli mikroplaka esaslı kolorimetrik tahliller burada gösterilmiştir. Altı aylık erkek siyah, karaciğer, dalak, kalp, akciğer ve kemik iliği dahil olmak üzere altı fareden alınan 55 doku örneğinde küvet bazlı ve mikro plaka bazlı heme olmayan demir seviyeleri arasındaki korelasyon burada gösterilmiştir. İki metodoloji arasındaki yüksek korelasyon, mikro plaka bazlı yöntemin orijinal küvet bazlı yönteme geçerli bir alternatif olduğunu göstermektedir.Son olarak, heme olmayan demir seviyeleri, aynı dokulardan elde edilen numunenin hidroklorik asit ve trikloroasetik asit veya hidroklorik asit karışımı ile asidik sindiriminden sonra mikro plaka bazlı yöntemle ölçülmüştür. Yüksek korelasyon, trikloroasetik asidin asit sindiriminden yayılabileceğini göstermektedir. Temsili görüntü, Bathophenanthroline Based Colorimetric Testi ile ölçülen siyah altı genetik arka plan üzerinde erkek siyah altı vahşi tip farenin ve erkek hepcidin nakavt farelerinin karaciğer, dalak, kalp ve pankreasındaki heme olmayan demir seviyelerini göstermektedir.Hepcidinin bozulması, şiddetli hepatik, pankreas ve kardiyak demir birikimi ve dalak demir tükenmesi ile demir birikimi fenotipi gibi hemokromatoza yol açar. Deneysel demir modülasyonunu takiben genç dişi Avrupa levreklerinde hepatik heme olmayan demir seviyeleri burada gösterilmiştir. Hepatik demir seviyeleri, demir ile muamele edilen hayvanlarda büyük ölçüde artmıştır.Oysa anemi hepatik demir depolarında hafif bir azalmaya neden oldu. Temsili görüntüler, bir aylık Drosophila'da Bathophenanthroline Bazlı Kolorimetrik Tahlil ile ölçülen heme olmayan demir seviyelerini göstermektedir. Sonuçlar, 20 sineğin her havuzundaki heme olmayan demir içeriğini veya her bir sineğin tahmini demir içeriğini göstermektedir.Sinek başına ortalama 0.64 miligram ağırlık göz önüne alındığında. Bu prosedürü denerken tüm cam aşınmasını iyice temizlemeyi unutmayın ve kontaminasyon riski nedeniyle metalik laboratuvar malzemelerinin herhangi bir reaktif veya çözelti ile temas etmesine izin vermeyin.

measurement-tissue-non-heme-iron-content-using-bathophenanthroline

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu videoda, fare karaciğer dokusundaki hem olmayan demir içeriğini belirlemek için kolorimetrik tabanlı bir yöntemi açıklıyoruz. Batofenantrolin sülfonat, ferrik demiri şelatlanabilir demirli demire dönüştüren bir indirgeyici ajanın varlığında kromojenik substrat olarak kullanılır.

Bathofenantrolin Sülfonat Bazlı Kolorimetrik Test: Fare Karaciğer Dokusunda Heme Olmayan Demirin Kantitasyonu İçin Basit ve Hızlı Bir Yöntem

Bu video, karmaşık gıda kaynaklarında demir biyoyararlanımını değerlendirmek için bir in vitro tekniği göstermektedir. Teknik, farklılaşmış Caco-2 hücreleri tarafından demir alımı ile birlikte insan sindiriminin simülasyonunu birleştirir. Hücre içi ferritin oluşumu, hücresel demir alımı için bir belirteç görevi görür.

Caco-2 Hücre Biyo-Testi: Karmaşık Gıda Kaynaklarında Demir Biyoyararlanımını Ölçmek için İn Vitro Bir Yöntem

Değişen hücre içi heme seviyeleri, kanser gibi yaygın hastalıklarla ilişkilidir. Bu nedenle, çeşitli hücrelerde hem biyosentez seviyelerinin ölçülmesine ihtiyaç vardır. Bu protokolün amacı, farklı hücrelerde hem sentezi seviyelerini ölçmek ve karşılaştırmak için hızlı ve hassas bir yöntem sağlamaktır.

Memeli Hücrelerde Heme Sentezi Düzeylerinin Ölçümü

Biz demir içeriği bitki dokularında Renkölçer Prusya Mavisi yöntemini kullanarak ölçmek için basit ve güvenilir bir iletişim kuralı mevcut.

Demir içeriği tesislerinde ölçme kolorimetrik yöntemi

İmmobilize metal afinite kromatografisi kullanılarak hazırlanan numunelere tanıtılan metallerin kolay ölçülmesi için bir test salıyoruz. Yöntem, kolorimetrik metal göstergesi olarak hidroksinaphthol mavisi ve dedektör olarak UV-Vis spektrofotometresi kullanır.

Immobilize Metal Affinity Kromatografisinde Metal Yıkamanın Ölçülmesi

Bu demir redoks speksiyon yöntemi kapiller elektroforez-endüktif plazma kütle spektrometresi ile birleştirilmiş plazma kütle spektrometresi ve numune istifleme ile tek bir vadede kısa analiz ile birlikte dayanmaktadır. Bu yöntem, çeşitli doku lar ve biyosıvı örnekleri arasında demir redoks türleri için hızlı bir şekilde analiz eder ve düşük niceleme limitleri sağlar.

Demir Redoks Türlerinin Nicelleştirilmesi İçin Kapiller Elektroforez-Endüktif Birleştirilmiş Plazma Kütle Spektrometresi (CE-ICP-MS) Kurulumu (Fe(II), Fe(III))

Bu makalede, fare gebeliğinde demir taşıma çalışmaları için transferrine bağlı radyoaktif olmayan izotopik demirin nasıl hazırlanacağı ve uygulanacağı gösterilmektedir. Fetoplasental bölmelerde izotopik demirin miktarının belirlenmesi yaklaşımı da açıklanmaktadır.

Radyoaktif Olmayan Demir İzotopları Kullanarak Fare Plasentası In Vivo Boyunca Demir Taşımacılığının Ölçülmesi

Demir (Fe) biyoyararlanımı için Caco-2 hücre biyotahlili, gıdalardan, gıda ürünlerinden, takviyelerden, yemeklerden ve hatta diyet rejimlerinden Fe biyoyararlanımını değerlendirmek için uygun maliyetli ve çok yönlü bir yaklaşımı temsil eder. İnsan çalışmalarına tamamen doğrulanmış, Fe biyoyararlanımı çalışmaları için en son teknolojiyi temsil eder.

Gıda Demir Biyoyararlanımının Ölçümü için Caco-2 Hücre Biyotahlili

Yeni bileşiklerin demiri şelatlama yeteneğini hızlı ve ucuz bir şekilde doğrulayabilen bir floresan tahlili tarif ediyoruz. Tahlil, bileşiklerin, zayıf demir şelatlama floresan probu Calcein'in demir bağlama aktivitesini aşma yeteneğini ölçer ve şelasyon meydana geldiğinde floresanda ölçülebilir bir artışa neden olur.

Yeni bileşiklerin demiri şelatlama yeteneğini doğrulamak için ölçülebilir ve ucuz hücresiz floresan yöntemi 

Bu protokol, dokularda, özellikle beyinde demir birikiminin dağılımını ve miktarını değerlendirmek için yöntemler sunar. Protokol, numune hazırlama, Perls/DAB boyama, görüntü yakalama ve veri analizi prosedürlerini detaylandırır.

5xFAD Farelerin Beyinlerinde Demir Birikiminin Perls/DAB Boyama ile Değerlendirilmesi

Bu çalışma, çevresel numunelerde, biyolojik numunelerde ve yiyecek ve içeceklerde Fe, Cr, As ve F'yi tespit etmek için bir E-Eye-Enable POCT cihazı tasarlama ve geliştirme protokolünü tartışmıştır. Yaklaşık 2000 numune test edildi ve sonuçlar altın standart tekniğe uygun.

Çevresel, Biyolojik ve Gıda Numunelerinde Fe, Cr, F ve As'ın Yerinde Miktar Tayini için TD-DFT Kılavuzlu Gelişmiş E-Göz Algılama Tekniği

Öğrenin, hayvan dokularındaki non-heme demir içeriğini Bathophenanthroline bazlı kolorimetrik tahlil ile ölçme yöntemini. Bu protokol demir metabolizması araştırmaları için yüksek verimli ve uygun maliyetli bir araçtır.

Batofenantropin Bazlı Kolorimetrik Tahlil Kullanılarak Doku Non-Heme Demir İçeriğinin Ölçülmesi

Daha fazla video keşfet