Filamentöz Cyanobacterium Phormidium lacuna'nın Doğal Transformasyonu, Protein İfadesi ve Kriyokorunumu

Bu protokol, oscillatoriales'e ait filamentli siyanobakterinin doğal dönüşüm ile nasıl dönüştürülebileceğini açıklar. Aynı zamanda farklı hareket türlerinin nasıl incelenebileceğini de gösterir. Doğal dönüşüm, eğer işe yararsa, en basit dönüşüm tekniğidir.

Sadece DNA, hücreler ve büyüme ortamı gereklidir. Şimdiye kadar, başka hiçbir osilatoryal üye doğal dönüşümle dönüştürülemedi. Çalışmalarımızın diğer grupları diğer salınımları denemeye teşvik ettiğini umuyoruz.

Dönüşüm için, iyi, sağlıklı görünen bir kültür ve iyi bir DNA hazırlığı yapın. Hareket çalışmaları için her zaman ultrasonla tedavi edilen bir kültür kullanın. Tedavi taze olmalıdır.

Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Nora Weber olacak. Çalışan bir kültürden bir mililitre P.lacuna filamentli iki 250 mililitrelik şişenin her birine 50 mililitre sıvı F2 ortamı aşılayarak başlayın. 25 santigrat derecede yaklaşık beş gün boyunca ajitasyon altında beyaz ışıkta yetiştirin.

Beş gün sonra, 100 mililitre P.lacuna hücre süspansiyonunu 10.000 RPM'de üç dakika boyunca homojenize edin ve optik yoğunluğu 750 nanometrede ölçün. Daha sonra, hücre süspansiyonunu 6.000 kez 15 dakika boyunca santrifüj edin G.Süpernatantı çıkarın ve peleti kalan sıvının 800 mikrolitresinde ve ek F2 + ortada askıya alın. Her bir agar plakasının ortasına mililitre başına 120 mikrogram kanamisin ve pipet 10 mikrogram DNA içeren sekiz F2 + Bacto agar plakası alın.

Hemen pipetin 100 mikrolitresi DNA'nın üzerine hücre süspansiyonu. Fazla sıvının buharlaşmasına izin vermek için agar plakasını kapaksız olarak temiz tezgahta tutun. Tabağı kapatın ve iki gün boyunca 25 santigrat derecede beyaz ışıkta yetiştirin.

İki gün sonra, her bir agar plakasının filamentlerini, bir aşılama döngüsü ile mililitre kanamisin başına 120 mikrogram içeren birkaç taze F2 + Bacto agar plakasına dağıtın. Plakaları beyaz ışıkta 25 santigrat derecede yetiştirin ve kültürleri mikroskop altında düzenli olarak kontrol edin. 14 ila 28 gün sonra, ölü kahverengimsi filamentleri tanımlayın ve mikroskop altında dönüştürülmüş filamentleri arayın.

Dönüştürülmüş filamentler sağlıklı ve yeşil görünür ve filamentlerin kütlesinden farklıdır. Her bir dönüştürülmüş filamenti, mililitre kanamisin başına 250 mikrogram ile 10 mililitre F2 + orta ile 50 mililitrelik şişelere aktarın. Bir çalkalayıcıda 25 santigrat derecede beyaz ışıkta yetiştirin ve dört haftaya kadar büyümeyi gözlemleyin.

Filamentleri, mililitre kanamisin başına 250 mikrogram içeren agar ortamına geri aktarın ve filamentlerin büyümesini bekleyin. Daha sonra, ayrışmayı hızlandırmak için kanamisin konsantrasyonunu tekrar arttırın. GFP ifadesi için, 40X veya 63X büyütmede floresan mikroskobu ile tek filamentleri gözlemler ve parlak alan iletim görüntüsü ve floresan görüntü yakalar.

P.lacuna'yı F2 ortamında, 750 nanometrede tahmini optik yoğunluk 0.35 olana kadar yaklaşık beş gün boyunca beyaz ışıkta 50 RPM yatay ajitasyonun altında yetiştirin. Numuneyi dört santigrat derecede saklayın. Filamentleri ultrasonla bir dakika boyunca maksimum güç ve döngüde homojenize edin.

Optik yoğunluğu 750 nanometrede ölçün ve P.lacuna içeren ortamın sekiz mililitresini altı santimetrelik bir Petri kabına aktarın. Numune oda sıcaklığına ulaşana kadar birkaç dakika bekleyin ve ardından Petri kabını selofan folyo ile örtün. Standart bir mikroskobun X-Y tablosuna kameralı bir mikroskop slaytı yerleştirin.

Mikroskop ışığını açın ve 4X veya 10X'lik bir hedefi ışığın yoluna taşıyın. Ardından, Petri kabını slaytın üstüne yerleştirin. Tek filamentleri veya filament demetlerini tablonun X, Y ve Z hareketlerine göre ayarlayın.

Tek filamentlerin veya demetlerin hareketlerini gözlemleyin ve hareketleri standart bir mikroskop kamerasıyla kaydedin. Objektif lensin sıvıya temas etmediğinden emin olun. Pipet, altı santimetrelik bir Petri kabının Bacto agar yüzeyinde P.lacuna içeren bir çözeltinin 0.5 mililitresidir.

Sıvının yüzeye girmesine izin verin. Yaklaşık 20 dakika sonra, Petri kabını kapatın ve 4X veya 10X hedefi kullanarak yüzeydeki filamentlerin hareketini gözlemleyin. Oküler kamera ve mini bilgisayar sistemi kullanarak hızlandırılmış kayıtları yakalayın.

Filamentler önce gözle, sonra oküler kamera aracılığıyla odaklanmalıdır. Sonraki görüntüler arasındaki zaman aralığının beş saniye ila bir dakika arasında olduğundan emin olun. Hızlandırılmış kaydı kontrol etmek için mini bilgisayarın Linux komut dosyasını programlayın.

Aşağıdan yukarıya doğru 20 milimetre karelik bir alanı ışınlamak için beş milimetrelik LED'lerin monte edildiği LED tutucuları hazırlayın. LED yoğunluklarını ölçün ve ayarlayın. Tüm ortamın karanlık bir odada veya kapalı, karanlık bir kapta olduğundan emin olun.

P.lacuna içeren ortamın sekiz mililitresini altı santimetrelik bir Petri kabına yerleştirin, Petri kabını kapakla kapatın ve LED'in Petri kabının ortasında olması için bir LED tutucuya yerleştirin. Tipik olarak iki gün sonra, Petri kabının bir görüntüsünü, doğrudan ışık tedavisinin konumuna yönelik bir akıllı telefon kamerasıyla yakalayın. Her resim için aynı mesafe ve ışık koşullarını sağlamak için arka plan olarak bir tutucu ve beyaz bir sayfa kullanın.

ImageJ yazılımını açın, Dosya, Aç'a tıklayın ve dosyayı seçin. Ardından, Enter tuşuna basın. Düz düğmeyi seçin ve Petri kabının bir ucundan karşı ucuna bir çizgi çizmek için farenin sol düğmesine basın.

Çizginin filament çemberinin ortasından geçtiğinden emin olun. Petri kabının uzunluğunu görmek için Analiz ve Ölç'e tıklayın. Ardından, ImageJ menüsünde Profili Analiz Et ve Çiz'e tıklayın.

Dairenin dışındaki piksel yoğunluğu için ortalama bir değer ve dairenin içindeki piksel yoğunluğu için başka bir ortalama değer tahmin edin. Dairenin her iki tarafının X değerlerini tahmin etmek için fareyi bu değerler arasındaki Y konumuna getirin. Her iki değeri de not edin ve farkı hesaplayın.

Ardından düz düğmeyi seçin ve piksel yoğunluğunun orta-maksimum değerinde bir çizgi çizin. Son olarak, iç hücre çemberinin uzunluğunu almak için Analiz Et'e ve ardından Ölç'e tıklayın. P.lacuna'nın PAK1 ile dönüştürülmesinden sonra kesici ucun entegrasyonu ve ayrılması burada gösterilmiştir.

Transformasyondan yaklaşık bir hafta sonra dış primerlerle yapılan bir PCR testi, tipik olarak elektroforez jeli üzerinde, biri vahşi tip bandın boyutuna sahip iki banda ve direnç kasetinin yerleştirilmesini gösteren daha yavaş göç eden bir banda sahiptir. Burada, şerit 1 ila 4, dirençli bir filamentin izolasyonundan yedi gün, 11 gün, 14 gün ve 17 gün sonra filamentlerin PCR ürünlerini temsil eder ve şerit 5, vahşi tipte PCR ürününü temsil eder. Yedi günlük numunede, kesici uç kromozomların küçük bir kısmında bulunur.

Bu fraksiyon, vahşi tip bandın görünmediği 17 güne kadar artar; yani, ayrışma tamamlanır. Bu görüntü, endojen fikosiyanin beta promotörünün kontrolü altında sfGHP ekspresyonu için pMH1 vektörünü temsil etmektedir. P.lacuna homolog dizilimi, pUC19 vektör omurgası ve sfGFP ve kanamisin direncine sahip kesici uç burada gösterilmiştir.

pMH1'de, sfGHP geni fikosiyanin beta geninin üç primine yerleştirilir; bu nedenle, endojen cpc beta promotörü tarafından tahrik edilir. P.lacuna vahşi tip filamentlerin floresan görüntüleri ve PAK1, PAK2, PAK3 ve pMH1 ile dönüşümden sonra burada gösterilmiştir. sfGFP'nin ifadesi cpc 560 destekçisi, a2813 destekçisi, psbA2S destekçisi veya endojen cpc beta destekçisi tarafından yönlendirilir.

Burada sunulan birleştirilmiş görüntüler Phormidium lacuna'nın hareketliliğini göstermektedir. Agar yüzeyindeki hareket burada gösterilmiştir. Zaman aralığı bir dakikaydı.

Sıvı ortamdaki hareket burada sunulmaktadır. Zaman aralığı 10 saniyeydi. Doğal dönüşüm basit bir yöntemdir.

Plazmid DNA'sını hücrelerle homolog sekanslarda bir direnç kaseti ile karıştırın ve hücrelerin antibiyotiklerle bir ortamda büyümesine izin verin. Genler inaktive edilebilir ve proteinler aşırı eksprese edilebilir. Bu, herhangi bir temel araştırma ve biyoteknik çalışmalar için önemlidir.

Doğal dönüşümün de kurulduğu tek hücreli siyanobakterilerde, fotosentez veya fotoreseptörler vb. Üzerine moleküler çalışmalar ele alınmıştır.