Name: Filamentöz Cyanobacterium Phormidium lacunanın Doğal Transformasyonu, Protein İfadesi ve Kriyokorunumu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Keşfedin filamentöz siyanobakteri Phormidium lacuna'da doğal transformasyon ve hareketlilik analizi yöntemlerini. Bu protokol Oscillatoriales takımında genetik manipülasyon ve protein ifadesi çalışmaları için temel oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Çalışma Karlsruher Teknoloji Enstitüsü tarafından desteklendi.

<ol><li>Brasil, B., de Siqueira, F. G., Salum, T. F. C., Zanette, C. M., Spier, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microalgae+and+cyanobacteria+as+enzyme+biofactories%5BTitle%5D)+AND+%22Algal+Research-Biomass+Biofuels+and+Bioproducts%22%5BJournal%5D)">Microalgae and cyanobacteria as enzyme biofactories.</a> Algal Research-Biomass Biofuels and Bioproducts. 25, 76-89 (2017).</li>
<li>Gundolf, R., Oberleitner, S., Richter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+New+Genetic+Toolkits+and+Their+Role+for+Ethanol+Production+in+Cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Energies%22%5BJournal%5D)">Evaluation of New Genetic Toolkits and Their Role for Ethanol Production in Cyanobacteria.</a> Energies. 12 (18), 3515(2019).</li>
<li>Wendt, K. E., Pakrasi, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomics+approaches+to+deciphering+natural+transformation+in+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genomics approaches to deciphering natural transformation in cyanobacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1259(2019).</li>
<li>Tandeau de Marsac, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+for+molecular+cloning+in+cyanobacteria%3A+cloning+of+an+Anacystis+nidulans+met+gene+using+a+Tn901-induced+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A new approach for molecular cloning in cyanobacteria: cloning of an Anacystis nidulans met gene using a Tn901-induced mutant.</a> Gene. 20 (1), 111-119 (1982).</li>
<li>Porter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+in+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Transformation in cyanobacteria.</a> Critical Reviews in Microbiology. 13 (2), 111-132 (1986).</li>
<li>Joset, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+in+Synechocystis+PCC+6714+and+6803%3A+preparation+of+chromosomal+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Transformation in Synechocystis PCC 6714 and 6803: preparation of chromosomal DNA.</a> Methods in Enzymology. 167, 712-714 (1988).</li>
<li>Tsinoremas, N. F., Kutach, A. K., Strayer, C. A., Golden, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+Synechococcus+sp+strains+PCC-7942+and+PCC-6301+by+interspecies+conjugation+and+chromosomal+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in Synechococcus sp strains PCC-7942 and PCC-6301 by interspecies conjugation and chromosomal recombination.</a> Journal of Bacteriology. 176 (21), 6764-6768 (1994).</li>
<li>Matsunaga, T., Takeyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+in+marine+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Phycology%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering in marine cyanobacteria.</a> Journal of Applied Phycology. 7 (1), 77-84 (1995).</li>
<li>Frigaard, N. U., Sakuragi, Y., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+inactivation+in+the+cyanobacterium+Synechococcus+sp.+PCC+7002+and+the+green+sulfur+bacterium+Chlorobium+tepidum+using+in+vitro-made+DNA+constructs+and+natural+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene inactivation in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002 and the green sulfur bacterium Chlorobium tepidum using in vitro-made DNA constructs and natural transformation.</a> Methods in Molecular Biology. 274, 325-340 (2004).</li>
<li>Iwai, M., Katoh, H., Katayama, M., Ikeuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+genetic+transformation+of+the+thermophilic+cyanobacterium%2C+Thermosynechococcus+elongatus+BP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Improved genetic transformation of the thermophilic cyanobacterium, Thermosynechococcus elongatus BP-1.</a> Plant and Cell Physiology. 45 (2), 171-175 (2004).</li>
<li>Vioque, A. Transformation of cyanobacteria. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVioque%2C+A+%22Transgenic+Microalgae+as+Green+Cell%22">Transgenic Microalgae as Green Cell</a>. Leon, R., Galvan, A., Fernandez, E. , Springer. 12-22 (2007).</li>
<li>Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+transformation+of+the+filamentous+cyanobacterium+Phormidium+lacuna%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna.</a> Plos One. 15 (6), 0234440(2020).</li>
<li>Ravindran, C. R. M., Suguna, S., Shanmugasundaram, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+as+a+tool+to+transfer+the+plasmid+pRL489+in+Oscillatoria+MKU+277%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Electroporation as a tool to transfer the plasmid pRL489 in Oscillatoria MKU 277.</a> Journal of Microbiological Methods. 66 (1), 174-176 (2006).</li>
<li>El Semary, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+electroporation-induced+transformation+in+Microcystis+aeruginosa+PCC7806%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnologie+Agronomie+Societe+et+Environnement%22%5BJournal%5D)">Optimized electroporation-induced transformation in Microcystis aeruginosa PCC7806.</a> Biotechnologie Agronomie Societe et Environnement. 14 (1), 149-152 (2010).</li>
<li>Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+transformation+of+the+filamentous+cyanobacterium+Phormidium+lacuna%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna.</a> PLoS One. 15 (6), 0234440(2020).</li>
<li>Sode, K., Tatara, M., Takeyama, H., Burgess, J. G., Matsunaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugative+gene-transfer+in+marine+cyanobacteria+-+Synechococcus+Sp%2C+Synechocystis+Sp+and+Pseudanabaena+Sp%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Conjugative gene-transfer in marine cyanobacteria - Synechococcus Sp, Synechocystis Sp and Pseudanabaena Sp.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 37 (3), 369-373 (1992).</li>
<li>Stucken, K., Ilhan, J., Roettger, M., Dagan, T., Martin, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+and+conjugal+transfer+of+foreign+gGenes+into+the+filamentous+multicellular+cyanobacteria+%28Subsection+V%29+Fischerella+and+Chlorogloeopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Transformation and conjugal transfer of foreign gGenes into the filamentous multicellular cyanobacteria (Subsection V) Fischerella and Chlorogloeopsis.</a> Current Microbiology. 65 (5), 552-560 (2012).</li>
<li>Bellali, S., Khalil, J. B., Fontanini, A., Raoult, D., Lagier, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+protectant+medium+preserving+bacterial+viability+after+freeze+drying%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Research%22%5BJournal%5D)">A new protectant medium preserving bacterial viability after freeze drying.</a> Microbiological Research. 236, 126454(2020).</li>
<li>Wallner, T., Pedroza, L., Voigt, K., Kaever, V., Wilde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cyanobacterial+phytochrome+2+regulates+the+expression+of+motility-related+genes+through+the+second+messenger+cyclic+di-GMP%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemical+%26+Photobiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The cyanobacterial phytochrome 2 regulates the expression of motility-related genes through the second messenger cyclic di-GMP.</a> Photochemical & Photobiological Sciences. 19 (5), 631-643 (2020).</li>
<li>Wilde, A., Fiedler, B., Borner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cyanobacterial+phytochrome+Cph2+inhibits+phototaxis+towards+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The cyanobacterial phytochrome Cph2 inhibits phototaxis towards blue light.</a> Molecular Microbiology. 44 (4), 981-988 (2002).</li>
<li>Bhaya, D., Takahashi, A., Grossman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+regulation+of+type+IV+pilus-dependent+motility+by+chemosensor-like+elements+in+Synechocystis+PCC6803%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Light regulation of type IV pilus-dependent motility by chemosensor-like elements in Synechocystis PCC6803.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (13), 7540-7545 (2001).</li>
<li>Guillard, R. R., Ryther, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+marine+planktonic+diatoms.+I.+Cyclotella+nana+Hustedt%2C+and+Detonula+confervacea+%28cleve%29+Gran%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran.</a> Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).</li>
<li>Kester, D. R., Duedall, I. W., Connors, D. N., Pytkowicz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+artificial+seawater%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography%22%5BJournal%5D)">Preparation of artificial seawater.</a> Limnology and Oceanography. 12 (1), 176-179 (1967).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning.+A+Laboratory+Manual.+3rd+edition%22">Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 3rd edition</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Cold Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTAB+DNA+extraction+buffer%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">CTAB DNA extraction buffer.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (3), (2009).</li>
<li>Singh, S. P., Rastogi, R. P., Häder, D. -P., Sinha, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+genomic+DNA+extraction+from+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Microbiology+%26+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">An improved method for genomic DNA extraction from cyanobacteria.</a> World Journal of Microbiology & Biotechnology. 27, 1225-1230 (2011).</li>
<li>French, C. S., Milner, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disintegration+of+bacteria+and+small+particles+by+high-pressure+extrusion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Disintegration of bacteria and small particles by high-pressure extrusion.</a> Methods in Enzymology. 1, 64-67 (1955).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%2C+a+laboratory+manual.+2nd+ed%22">Molecular cloning, a laboratory manual. 2nd ed</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).</li>
<li>Lamparter, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+involvement+of+type+IV+pili+and+phytochrome+in+gliding+motility%2C+lateral+motility+and+phototaxis+of+the+cyanobacterium+Phormidium+lacuna%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The involvement of type IV pili and phytochrome in gliding motility, lateral motility and phototaxis of the cyanobacterium Phormidium lacuna.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Nies, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Phormidium+lacuna+strains+from+the+North+Sea+and+the+Mediterranean+Sea+for+biotechnological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Process+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of Phormidium lacuna strains from the North Sea and the Mediterranean Sea for biotechnological applications.</a> Process Biochemistry. 59, 194-206 (2017).</li>
<li>Kachel, B., Mack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+Synechococcus+sp.+strain+PCC+7002+for+the+photoautotrophic+production+of+light-sensitive+riboflavin+%28vitamin+B2%29%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Engineering of Synechococcus sp. strain PCC 7002 for the photoautotrophic production of light-sensitive riboflavin (vitamin B2).</a> Metabolic Engineering. 62, 275-286 (2020).</li>
<li>Lukavsky, J., Cepak, V., Komarek, J., Kasparkova, M., Takacova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalogue+of+algal+and+cyanobacterial+strains+of+culture+collection+of+autotrophic+organisms+at+Trebon%5BTitle%5D)+AND+%22Algological+Studies%22%5BJournal%5D)">Catalogue of algal and cyanobacterial strains of culture collection of autotrophic organisms at Trebon.</a> Algological Studies. 63, 59-112 (1992).</li>
<li>Philbrick, J. B., Diner, B. A., Zilinskas, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+cyanobacterial+mutants+lacking+the+manganese-stabilizing+polypeptide+of+photosystem-ii%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of cyanobacterial mutants lacking the manganese-stabilizing polypeptide of photosystem-ii.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (20), 13370-13376 (1991).</li>
<li>Pinevich, A. V., Veprritskii, A. A., Gromov, B. V., Krautvald, K., Titova, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+cultural+properties+and+characterization+of+the+pigment+in+Nostoc+sp%2C+a+cyanobacterium+unusually+rich+in+c-phycoerythrin%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cellular and cultural properties and characterization of the pigment in Nostoc sp, a cyanobacterium unusually rich in c-phycoerythrin.</a> Microbiology. 63 (5), 481-485 (1994).</li>
<li>Schlosser, U. G., Friedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additions+to+the+culture+collection+of+algae+at+Gottingen+since+1997%5BTitle%5D)+AND+%22Nova+Hedwigia%22%5BJournal%5D)">Additions to the culture collection of algae at Gottingen since 1997.</a> Nova Hedwigia. 71 (1-2), 243-262 (2000).</li>
<li>Takano, H., Arai, T., Hirano, M., Matsunaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+intensity+and+quality+of+light+on+phycocyanin+production+by+a+marine+cyanobacterium+Synechococcus+sp.+042902%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Effects of intensity and quality of light on phycocyanin production by a marine cyanobacterium Synechococcus sp. 042902.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 43 (6), 1014-1018 (1995).</li>
<li>Carrer, H., Hockenberry, T. N., Svab, Z., Maliga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kanamycin+resistance+as+a+selectable+marker+for+plastid+transformation+in+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+General+Genetics%3A+MGG%22%5BJournal%5D)">Kanamycin resistance as a selectable marker for plastid transformation in tobacco.</a> Molecular and General Genetics: MGG. 241 (1-2), 49-56 (1993).</li>
<li>Kaulen, H., Schell, J., Kreuzaler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+expression+of+the+chimeric+chalcone+synthase-NptII+gene+in+tobacco+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Light-induced expression of the chimeric chalcone synthase-NptII gene in tobacco cells.</a> EMBO Journal. 5 (1), 1-8 (1986).</li>
<li>Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+fluorescence+dynamics+of+single+molecules+of+a+green+fluorescent+protein%3A+One-+versus+two-photon+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation.</a> Chemphyschem. 7 (1), 250-260 (2006).</li>
<li>Taton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circadian+clock+and+darkness+control+natural+competence+in+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The circadian clock and darkness control natural competence in cyanobacteria.</a> Nature Communications. 11 (1), 1688(2020).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Kültür koleksiyonlarından birçok siyanobakteri suşu mevcut olmasına rağmen 32,33,34,35,36, vahşi doğadan yeni siyanobakterilere hala talep vardır, çünkü bu türler belirli özelliklere uyarlanmıştır. P. lacuna kaya havuzlarından toplandı ve tuz konsantrasyonlarının ve sıcaklığın30 varyasyonlarına uyarlandı. Bu türün suşları 2008,...

Siyanobakteriler, fotosentezi bir enerji kaynağı olarak kullanan prokaryotik organizmalardır 1,2. Araştırmalar giderek siyanobakteriyel türlere odaklanmaktadır. Birkaç siyanobakteri DNA3 ile dönüştürülebilir. Genler bu türlerde nakavt edilebilir veya aşırı eksprese edilebilir. Bununla birlikte, dönüşüm birkaç türle sınırlıdır 4,5,6,7,8,9,10,11 ve kültür koleksiyonlarından veya vahşi 8'den gelen suşlarda dönüşüm sağlamak zor olabilir. Filamentli Phormidium lacuna türlerinin suşları (Şekil 1), tuz konsantrasyonları veya sıcaklık gibi çevresel koşulların zamanla dalgalandığı deniz kaya havuzlarından izole edilmiştir. Bu filamentli siyanobakteriler, ait oldukları Oscillatoriales12 sırası için model organizmalar olarak kullanılabilir.
Elektroporasyon ile gen transferini test eden denemeler sırasında 13,14 P. lacuna'nın doğal dönüşüm ile dönüştürülebileceği bulunmuştur 15. Bu süreçte, DNA bazı hücreler tarafından doğal olarak alınır. Diğer dönüşüm yöntemleriyle karşılaştırıldığında16,17, doğal dönüşüm, prosedürü karmaşıklaştırabilecek ek araçlara ihtiyaç duymama avantajına sahiptir. Örneğin, elektroporasyon uygun küvetler, sağlam teller ve uygun voltajın seçilmesini gerektirir. P. lacuna şu anda doğal dönüşüme duyarlı tek Oscillatoriales üyesidir. Orijinal protokol elektroporasyon protokollerine dayandığından, yine de gereksiz olabilecek birkaç yıkama adımı içeriyordu. Protokolü basitleştirmek için farklı yaklaşımlar test edildi ve burada sunulan dönüşüm protokolüne yol açtı.
Genom dizisi, gen nakavtına veya aşırı ekspresyonuna dayanan daha ileri moleküler çalışmalar için gereklidir. Genom dizileri yeni nesil dizileme makineleri ile kısa süreler içinde elde edilebilse de, DNA'nın çıkarılması zor olabilir ve türlere bağlıdır. P. lacuna ile çeşitli protokoller test edildi. Modifiye edilmiş bir setil trimetil amonyum bromür (CTAB) bazlı yöntem oluşturuldu ve bu da DNA'nın kabul edilebilir saflığı ve laboratuvarda devam eden çalışmalar için her saflaştırma döngüsünün DNA verimi ile sonuçlandı. Beş suşun genomu bu protokolle dizilenebilir. Bir sonraki mantıksal dönüşüm adımı, P. lacuna'da protein ekspresyonu oluşturmaktı.
Bu protokolde belirteç protein olarak kullanılan sfGFP, herhangi bir floresan mikroskobu ile tespit edilebilir. Test edilen tüm promotörler P. lacuna sfGFP ekspresyonu için kullanılabilir. Dönüşümden kaynaklanan suşların sayısının artması, kültürlerin depolanması için bir yönteme ihtiyaç duyulmasına neden olmuştur. Bu tür yöntemler Escherichia coli ve diğer birçok bakteri için kurulmuştur18. Standart protokollerde, gliserol kültürleri hazırlanır, sıvı azot içinde aktarılır ve -80 ° C'de depolanır. Bu yöntem sadece birkaç adım gerektirir ve kurulduğu türler için oldukça güvenilirdir. Standart protokol P. lacuna için uygun değildi, çünkü canlı hücreler her durumda kurtarılamadı. Bununla birlikte, gliserol çözüldükten sonra çıkarıldığında, tüm denemelerin hücreleri hayatta kaldı. Tip IV pili veya fotoreseptörlerin rolünü araştırmak için nakavt mutagenezi ile birleştirilebilen P. lacuna'nın hareketliliğinin analizi için basit yöntemler sunulmaktadır. Bu tahliller, tek hücreli siyanobakteriler 19,20,21'inkilerden farklıdır ve diğer Osilatoryalar için de yararlı olabilir.

<table><tbody><tr><td>Otoklav 3870 ELV</td><td>Tuttnauer</td><td>3870 ELV</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>OttoNorwald</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>BG-11 Tatlı Su Çözeltisi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3061</td><td></td></tr><tr><td>BG-11 orta</td><td>Merck</td><td>73816-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Borik asit</td><td>Merck</td><td>10043-35-3</td><td>H3BO3</td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür dihidrat</td><td>Carl Roth</td><td>10035-04-8</td><td>CaCl2 & orta nokta; 2 H2O</td></tr><tr><td>Hücre kültürü şişeleri Cellstar, filtre vidalı kapaklı, steril, 250 mL</td><td>Greiner</td><td>658190</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü şişeleri Cellstar, filtre vidalı kapaklı, steril, 50 mL</td><td>Greiner</td><td>601975</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj LYNX 4000</td><td>Thermo Scientific</td><td>75006580</td><td>ve rotor</td></tr><tr><td>13.000 rpm'ye kadar</td>santrifüj <td>microstar 17</td><td>VWR International</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Setiltrimetilamonyum Bromür (CTAB)</td><td>PanReac AppliChem</td><td>57-09-0</td><td>C19H42BrN</td></tr><tr><td>Kloroform : İzoamil Alkol 24 : 1</td><td>PanReac AppliChem</td><td> A1935</td><td></td></tr><tr><td>Kobalt(II) klorür hekzahidrat</td><td>Merck</td><td>7791-13-1</td><td>CoCl2 & orta nokta; 6 H2O</td></tr><tr><td>Bakır(II) sülfat pentahidrat</td><td>Merck</td><td>7758-99-8</td><td>&nbsp; CuSO4 ve orta nokta; 5 H < alt > 2 < / alt > O</td></tr><tr><td>D (+) - Biotin</td><td>Carl Roth</td><td>58-85-5</td> <td>&nbsp; C10H16N2O3S</td></tr><tr><td>DNA merdiveni 1 kb</td><td>New England Biolabs</td><td>N3232</td><td></td></tr><tr><td>DNA merdiveni 100 bp</td><td>New England Biolabs</td><td>N3231</td><td></td></tr><tr><td>Elektrikli pipetleme yardımı accujet-pro S Brand</td><td>GmbH</td><td>26360</td><td>pipetleme için 1-25 mL</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>64-17-5</td><td>C2H6O</td></tr><tr><td>Etilendiamin tetraasetik asit disodyum tuzu dihidrat</td><td>Carl Roth</td><td>6381-92-6</td><td>EDTA-Na2 ve orta nokta; 2 H2O</td></tr><tr><td>Floresan mikroskobu ApoTome</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Floresan mikroskobu Axio Imager 2</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fransız Basınç Hücresi Presi</td><td>Amerikan Enstrüman Şirketi</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Jel dokumasyon Sistemi Saffe Görüntü</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelelctrophoresis sistemi Mupid-One/-exu</td><td>ADVANCED</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Züccaciye, farklı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Carl Roth</td><td>56-81-5</td><td>C3H8O<>3</td></tr><tr><td>Demir(III) klorür hekzahidrat</td><td>Merck</td><td>10025-77-1&</td><td>nbsp; FeCl<alt>3</alt> ve orta nokta; 6 H2O</td></tr><tr><td>Kanamisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25389-94-0</td><td></td></tr><tr><td>Kanamisin sülfat</td><td>Carl Roth</td><td>25389-94-0</td><td>C18H36N4O11 &middot; H<alt>2</alt>SO<alt>4</alt></td></tr><tr><td>Lauroylsarcosine, Sodyum Tuzu (Sarkosil)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>137-16-6</td><td>C<alt>15</alt>H<alt>28</alt>NO3</alt> & orta nokta; Na</td></tr><tr><td>LB Et Suyu (Lennox)</td><td>Carl Roth</td><td>X964.4</td><td></td></tr><tr><td>Işık kaynağı, floresan tüp L18W/954 gün ışığı</td><td>OSRAM</td><td></td><td>siyanobakteri yetiştiriciliği</td></tr><tr><td>Işık kaynağı, LED panel XL 6500K 140 W</td><td>Bloom Star</td><td>N/A</td><td>1.000 & mikroya kadar siyanobakteri yetiştiriciliği; mol m-2 s-1</td></tr><tr><td>Magnezyum klorür hekzahidrat</td><td>Carl Roth</td><td>7791-18-6</td><td>MgCl2 & orta nokta 6 H < alt > 2 < / alt >O</td></tr><tr><td>Manganez (II) klorür tetrahidrat</td><td>Serva</td><td>13446-34-9</td><td>MnCl < alt > 2 < / alt > ve orta nokta; 4 H < alt > 2 < / alt >O</td></tr><tr><td>Mikroskop DM750</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Midi hazırlık plazmid ekstraksiyon kiti NucleoBond Xtra Midi kiti</td><td>Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG</td><td>REF740410.50</td><td></td></tr><tr><td>Hızlandırılmış kayıt için</td><td>mini bilgisayar Raspberry Pi 4 +</td><td>Conrad Electronics</td><td>2138863-YD</td></tr><tr><td>Oküler kamera EC3</td><td>30 saniyeye kadar sürekli kayıt için</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>Oküler kamera MikrOkular Full HD</td><td>Bresser</td><td></td><td>hızlandırılmış kayıtlar için, Raspberry Pi mini bilgisayarına bağlı</td></tr><tr><td>Petri kapları polistirol, 100 mm x 20 mm</td><td>Merck</td><td>P5606-400EA</td><td></td></tr><tr><td>Petri kapları polistirol, 60 mm x 15 mm</td><td>Merck</td><td>P5481-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Fotometre Nanodrop ND-1000</td><td>Peqlab Biotechnologie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fotometre Uvikon XS</td><td>Goebel Instrumentelle Analytik GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetman 100-1.000 & mikro; L</td><td>Gilson</td><td>SKU: FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman 10-100 ve mikro; L</td><td>Gilson</td><td>SKU: FA10004M</td><td></td></tr><tr><td>Plastik pipetler 10 mL, steril</td><td>Greiner</td><td>607107</td><td></td></tr><tr><td>Plastik tüp, steril, 15 mL</td><td>Greiner</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Plastik tüp, steril, 50 mL</td><td>Greiner</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum bromür</td><td>Carl Roth</td><td>7758-02-3</td><td>KBr</td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Carl Roth</td><td>7447-40-7</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Güç kaynağı Statron 3252-1</td><td>Statron Ger&auml; tetechnik GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Güç kaynağı Voltcraft PPS 16005</td><td></td><td>Maxwell'den LED</td>Proteinaz K Promega MC500C için Conrad <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Elektronik 16 miRNA Doku Kiti AS1470</td></tr><tr><td>Q5 polimeraz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>Sıralama kiti NextSeq 500/550 v2.5</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sıralama sistemi NextSeq 550 SY-415-1002</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shaker Unimax 2010</td><td>Heidolph Yetiştirme Aletleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum asetat</td><td>Carl Roth</td><td>127-09-3</td><td>NaCH3COO</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Carl Roth</td><td>7647-14-5</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Sodyum dihidrojen fosfat monohidrat</td><td>Carl Roth</td><td>10049-21-5</td><td>NaH2PO4 &middot; H2O</td></tr><tr><td>Sodyum florür</td><td>Carl Roth</td><td>7681-49-4</td><td>NaF</td></tr><tr><td>Sodyum hidrojen karbonat</td><td>Carl Roth</td><td>144-55-8</td><td>NaHCO3</td></tr><tr><td>Sodyum molibdat dihidrat</td><td>Serva</td><td>10102-40-6</td><td>Na2MoO4 & middot; 2 H2O</td></tr><tr><td>Sodyum nitrat</td><td>Merck</td><td>7631-99-4</td><td>NaNO3</td></tr><tr><td>Sodyum sülfat</td><td>Carl Roth</td><td>7757-82-6</td><td>Na2SO4</td></tr><tr><td>Stronsiyum klorür hekzahidrat</td><td>Carl Roth</td><td>10025-70-4</td><td>SrCl2 &middot; 6 H2O</td></tr><tr><td>Tiamin hidroklorür</td><td>Merck</td><td>67-03-8</td><td>C12H17ClN4OS ve orta nokta; HCl</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Carl Roth</td><td>77-86-1</td><td>C4H11NO3</td></tr><tr><td>Ultrasonik cihaz UP100H sonotrot MS3</td><td>Hielscher Ultrason Teknolojisi</td><td>UP100H</td><td></td></tr><tr><td>Ultraturrax Sessiz Kırıcı M</td><td>Heidolph Instruments</td><td></td><td>homojenizatör</td></tr><tr><td>Üre</td><td>Carl Roth</td><td>57-13-6</td><td>CH4N2O</td></tr><tr><td>Vitamini B12</td><td>Sigma</td><td>68-19-9</td><td>C63H88CoN14O14P</td></tr><tr><td>Vitamin çözeltisi</td><td></td><td></td><td>0.3 ve mikro; M tiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM siyanokobalamin</td></tr><tr><td>Su İmtilatörleri, Su arıtma</td><td>VEOLIA su teknolojileri</td><td>ELGA_21001</td><td></td></tr><tr><td>Çinko sülfat heptahidrat</td><td>Sigma</td><td>7446-20-0</td><td>ZnSO4 &middot; 7 H2O</td></tr><tr><td>software, URL </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>gatb-minia DNA montajı</td> <td>için programhttps://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline</td><td>, kısa DNA okumalarından büyük iskeleler yapar,</td> immage işleme için Linux tabanlı <td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td>yazılımı (piksel yoğunlukları, daire çapı)</td><td></td></tr><tr><td>RAST açıklama sunucusu</td><td>https://rast.nmpdr.org</td><td>girişi: genom DNA dizisi, açık okuma çerçevelerini algılar, protein dizilerini ve işlevlerini</td><td></td> listeler</tr><tr><td><güçlü>Kültür ortamı</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yapay deniz suyu</td><td>0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2, 9 mM&nbsp; KCl, 2,4 mM NaHCO<alt>3 </alt>,0,84 mM KBr, 0,49 mM H<alt>3</alt>BO<alt>3</alt>, 90 & mikro; M SrCl2, 72 & M NaF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>f/2 -sıvı ortam</td><td>yapay deniz suyu, % 0.1 (h / h) eser element çözeltisi, % 0.05 (h / h) vitamin çözeltisi, 0.88 mM NaNO<alt>3< / alt>, 36 & mikro; M NaH2PO4&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>f/2+ sıvı ortam</td><td>f/2-orta, 10 kat artırılmış NaNO3 ve NaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 &mikro; M NaH2PO4</td><td></td><td></td></tr><tr><td>f/2+-agar</td><td>% 3 (a/h) bacto agar, yapay deniz suyu, % 0.1 (h / h) eser element çözeltisi, % 0.05 (h / h) vitamin çözeltisi, 8.8 mM NaNO< alt > 3 < / alt >, 0.36 mM NaH <alt >2< / alt >PO< alt >4< / alt ></td><td></td><td></td></tr><tr><td>f / 2-agar</td><td>% 3 (a / h) bacto agar, yapay deniz suyu, % 0.1 (h / h) eser element çözeltisi,% 0.05 (h / h) vitamin çözeltisi, 0.88 mM NaNO<alt>3< / alt>, 36 & mikro; M NaH < alt > 2 PO < alt > 4 </td><td></td><td></td></tr> <tr><td>eser element çözeltisi</td><td>0.36 mM NaH < alt > 2 PO < < >/ alt >, 12 ve mikro; M Na<alt>2</alt>EDTA, 39 nM CuSO<alt>4</alt>, 26 nM Na<alt>2</alt>MoO<alt>4</alt>, 77 nM ZnSO<alt>4</alt>, 42 nM CoCl<alt>2</alt>, 0.91 ve mikro; M MnCl2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vitamin çözeltisi</td><td>0.3 &mikro; M tiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM siyanokobalamin</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

filamentöz cyanobacterium phormidium lacuna'nın doğal transformasyonu, protein İfadesi ve kriyokorunumu

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

Siyanobakteriler, güneş enerjisinin biyokütle üretimi için kullanıldığı temel araştırma ve biyoteknolojik projelerin odak noktasıdır. Phormidium lacuna, yeni izole edilmiş bir filamentli siyanobakteridir. Bu makalede, yeni filamentli siyanobakterilerin deniz kaya havuzlarından nasıl izole edilebileceği açıklanmaktadır. Ayrıca DNA'nın filamentlerden nasıl çıkarılabileceğini ve genomların nasıl sıralanabileceğini de açıklar. Birçok tek hücreli tür için transformasyon kurulmuş olmasına rağmen, filamentli siyanobakteriler için daha az sıklıkla bildirilmektedir. P. lacuna'nın doğal dönüşümü için basitleştirilmiş bir yöntem burada açıklanmaktadır. P. lacuna, doğal dönüşümün kurulduğu Oscillatoriales düzeninin tek üyesidir. Bu makale aynı zamanda süper klasör yeşil floresan proteinini (sfGFP) eksprese etmek için doğal dönüşümün nasıl kullanıldığını göstermektedir. Endojen bir cpcB promotörü, Synechocystis sp. PCC6803'ten cpc560, A2813 veya psbA2 promotörlerinden yaklaşık 5 kat daha güçlü ekspresyonu indükledi. Ayrıca, P. lacuna ve Synechocystis sp.CPP 6803'ün kriyoprezervasyonu için bir yöntem oluşturulmuş ve sıvı bir ortamda ve agar ve plastik yüzeylerde hareketliliği değerlendirmek için yöntemler tanımlanmıştır.

Yukarıda belirtilen yöntemler izlenerek 5 farklı P. lacuna suşu kaya havuzlarından izole edilmiş ve sıralanmıştır (Şekil 1 ve Tablo 1). P. lacuna HE10JO hariç tüm kültürler ~ 1 yıllık alt kültürlemeden sonra sterildi. Bu suş hala bir deniz bakterisi olan Marivirga atlantica ile kirlenmiştir. Sonraki Helgoland gezileri sırasında, diğer filamentli siyanobakteriler, P. lacuna'dan farklı olan ve karakterize edilmesi gereken kaya havuzlarından ...

Phormidium lacuna , deniz kaya havuzlarından izole edilmiş filamentli bir siyanobakteridir. Bu makalede filamentlerin doğal kaynaklardan izolasyonu, DNA ekstraksiyonu, genom dizilimi, doğal transformasyon, sfGFP ekspresyonu, kriyokonservasyon ve motiliteye yöntemleri anlatılmaktadır.

Filamentöz Cyanobacterium Phormidium lacuna'nın Doğal Transformasyonu, Protein İfadesi ve Kriyokorunumu

Cyanobacteria are the focus of basic research and biotechnological projects in which solar energy is utilized for biomass production. Phormidium lacuna is ...

Bu protokol, oscillatoriales'e ait filamentli siyanobakterinin doğal dönüşüm ile nasıl dönüştürülebileceğini açıklar. Aynı zamanda farklı hareket türlerinin nasıl incelenebileceğini de gösterir. Doğal dönüşüm, eğer işe yararsa, en basit dönüşüm tekniğidir.Sadece DNA, hücreler ve büyüme ortamı gereklidir. Şimdiye kadar, başka hiçbir osilatoryal üye doğal dönüşümle dönüştürülemedi. Çalışmalarımızın diğer grupları diğer salınımları denemeye teşvik ettiğini umuyoruz.Dönüşüm için, iyi, sağlıklı görünen bir kültür ve iyi bir DNA hazırlığı yapın. Hareket çalışmaları için her zaman ultrasonla tedavi edilen bir kültür kullanın. Tedavi taze olmalıdır.Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Nora Weber olacak. Çalışan bir kültürden bir mililitre P.lacuna filamentli iki 250 mililitrelik şişenin her birine 50 mililitre sıvı F2 ortamı aşılayarak başlayın. 25 santigrat derecede yaklaşık beş gün boyunca ajitasyon altında beyaz ışıkta yetiştirin.Beş gün sonra, 100 mililitre P.lacuna hücre süspansiyonunu 10.000 RPM'de üç dakika boyunca homojenize edin ve optik yoğunluğu 750 nanometrede ölçün. Daha sonra, hücre süspansiyonunu 6.000 kez 15 dakika boyunca santrifüj edin G.Süpernatantı çıkarın ve peleti kalan sıvının 800 mikrolitresinde ve ek F2 + ortada askıya alın. Her bir agar plakasının ortasına mililitre başına 120 mikrogram kanamisin ve pipet 10 mikrogram DNA içeren sekiz F2 + Bacto agar plakası alın.Hemen pipetin 100 mikrolitresi DNA'nın üzerine hücre süspansiyonu. Fazla sıvının buharlaşmasına izin vermek için agar plakasını kapaksız olarak temiz tezgahta tutun. Tabağı kapatın ve iki gün boyunca 25 santigrat derecede beyaz ışıkta yetiştirin.İki gün sonra, her bir agar plakasının filamentlerini, bir aşılama döngüsü ile mililitre kanamisin başına 120 mikrogram içeren birkaç taze F2 + Bacto agar plakasına dağıtın. Plakaları beyaz ışıkta 25 santigrat derecede yetiştirin ve kültürleri mikroskop altında düzenli olarak kontrol edin. 14 ila 28 gün sonra, ölü kahverengimsi filamentleri tanımlayın ve mikroskop altında dönüştürülmüş filamentleri arayın.Dönüştürülmüş filamentler sağlıklı ve yeşil görünür ve filamentlerin kütlesinden farklıdır. Her bir dönüştürülmüş filamenti, mililitre kanamisin başına 250 mikrogram ile 10 mililitre F2 + orta ile 50 mililitrelik şişelere aktarın. Bir çalkalayıcıda 25 santigrat derecede beyaz ışıkta yetiştirin ve dört haftaya kadar büyümeyi gözlemleyin.Filamentleri, mililitre kanamisin başına 250 mikrogram içeren agar ortamına geri aktarın ve filamentlerin büyümesini bekleyin. Daha sonra, ayrışmayı hızlandırmak için kanamisin konsantrasyonunu tekrar arttırın. GFP ifadesi için, 40X veya 63X büyütmede floresan mikroskobu ile tek filamentleri gözlemler ve parlak alan iletim görüntüsü ve floresan görüntü yakalar.P.lacuna'yı F2 ortamında, 750 nanometrede tahmini optik yoğunluk 0.35 olana kadar yaklaşık beş gün boyunca beyaz ışıkta 50 RPM yatay ajitasyonun altında yetiştirin. Numuneyi dört santigrat derecede saklayın. Filamentleri ultrasonla bir dakika boyunca maksimum güç ve döngüde homojenize edin.Optik yoğunluğu 750 nanometrede ölçün ve P.lacuna içeren ortamın sekiz mililitresini altı santimetrelik bir Petri kabına aktarın. Numune oda sıcaklığına ulaşana kadar birkaç dakika bekleyin ve ardından Petri kabını selofan folyo ile örtün. Standart bir mikroskobun X-Y tablosuna kameralı bir mikroskop slaytı yerleştirin.Mikroskop ışığını açın ve 4X veya 10X'lik bir hedefi ışığın yoluna taşıyın. Ardından, Petri kabını slaytın üstüne yerleştirin. Tek filamentleri veya filament demetlerini tablonun X, Y ve Z hareketlerine göre ayarlayın.Tek filamentlerin veya demetlerin hareketlerini gözlemleyin ve hareketleri standart bir mikroskop kamerasıyla kaydedin. Objektif lensin sıvıya temas etmediğinden emin olun. Pipet, altı santimetrelik bir Petri kabının Bacto agar yüzeyinde P.lacuna içeren bir çözeltinin 0.5 mililitresidir.Sıvının yüzeye girmesine izin verin. Yaklaşık 20 dakika sonra, Petri kabını kapatın ve 4X veya 10X hedefi kullanarak yüzeydeki filamentlerin hareketini gözlemleyin. Oküler kamera ve mini bilgisayar sistemi kullanarak hızlandırılmış kayıtları yakalayın.Filamentler önce gözle, sonra oküler kamera aracılığıyla odaklanmalıdır. Sonraki görüntüler arasındaki zaman aralığının beş saniye ila bir dakika arasında olduğundan emin olun. Hızlandırılmış kaydı kontrol etmek için mini bilgisayarın Linux komut dosyasını programlayın.Aşağıdan yukarıya doğru 20 milimetre karelik bir alanı ışınlamak için beş milimetrelik LED'lerin monte edildiği LED tutucuları hazırlayın. LED yoğunluklarını ölçün ve ayarlayın. Tüm ortamın karanlık bir odada veya kapalı, karanlık bir kapta olduğundan emin olun.P.lacuna içeren ortamın sekiz mililitresini altı santimetrelik bir Petri kabına yerleştirin, Petri kabını kapakla kapatın ve LED'in Petri kabının ortasında olması için bir LED tutucuya yerleştirin. Tipik olarak iki gün sonra, Petri kabının bir görüntüsünü, doğrudan ışık tedavisinin konumuna yönelik bir akıllı telefon kamerasıyla yakalayın. Her resim için aynı mesafe ve ışık koşullarını sağlamak için arka plan olarak bir tutucu ve beyaz bir sayfa kullanın.ImageJ yazılımını açın, Dosya, Aç'a tıklayın ve dosyayı seçin. Ardından, Enter tuşuna basın. Düz düğmeyi seçin ve Petri kabının bir ucundan karşı ucuna bir çizgi çizmek için farenin sol düğmesine basın.Çizginin filament çemberinin ortasından geçtiğinden emin olun. Petri kabının uzunluğunu görmek için Analiz ve Ölç'e tıklayın. Ardından, ImageJ menüsünde Profili Analiz Et ve Çiz'e tıklayın.Dairenin dışındaki piksel yoğunluğu için ortalama bir değer ve dairenin içindeki piksel yoğunluğu için başka bir ortalama değer tahmin edin. Dairenin her iki tarafının X değerlerini tahmin etmek için fareyi bu değerler arasındaki Y konumuna getirin. Her iki değeri de not edin ve farkı hesaplayın.Ardından düz düğmeyi seçin ve piksel yoğunluğunun orta-maksimum değerinde bir çizgi çizin. Son olarak, iç hücre çemberinin uzunluğunu almak için Analiz Et'e ve ardından Ölç'e tıklayın. P.lacuna'nın PAK1 ile dönüştürülmesinden sonra kesici ucun entegrasyonu ve ayrılması burada gösterilmiştir.Transformasyondan yaklaşık bir hafta sonra dış primerlerle yapılan bir PCR testi, tipik olarak elektroforez jeli üzerinde, biri vahşi tip bandın boyutuna sahip iki banda ve direnç kasetinin yerleştirilmesini gösteren daha yavaş göç eden bir banda sahiptir. Burada, şerit 1 ila 4, dirençli bir filamentin izolasyonundan yedi gün, 11 gün, 14 gün ve 17 gün sonra filamentlerin PCR ürünlerini temsil eder ve şerit 5, vahşi tipte PCR ürününü temsil eder. Yedi günlük numunede, kesici uç kromozomların küçük bir kısmında bulunur.Bu fraksiyon, vahşi tip bandın görünmediği 17 güne kadar artar; yani, ayrışma tamamlanır. Bu görüntü, endojen fikosiyanin beta promotörünün kontrolü altında sfGHP ekspresyonu için pMH1 vektörünü temsil etmektedir. P.lacuna homolog dizilimi, pUC19 vektör omurgası ve sfGFP ve kanamisin direncine sahip kesici uç burada gösterilmiştir.pMH1'de, sfGHP geni fikosiyanin beta geninin üç primine yerleştirilir; bu nedenle, endojen cpc beta promotörü tarafından tahrik edilir. P.lacuna vahşi tip filamentlerin floresan görüntüleri ve PAK1, PAK2, PAK3 ve pMH1 ile dönüşümden sonra burada gösterilmiştir. sfGFP'nin ifadesi cpc 560 destekçisi, a2813 destekçisi, psbA2S destekçisi veya endojen cpc beta destekçisi tarafından yönlendirilir.Burada sunulan birleştirilmiş görüntüler Phormidium lacuna'nın hareketliliğini göstermektedir. Agar yüzeyindeki hareket burada gösterilmiştir. Zaman aralığı bir dakikaydı.Sıvı ortamdaki hareket burada sunulmaktadır. Zaman aralığı 10 saniyeydi. Doğal dönüşüm basit bir yöntemdir.Plazmid DNA'sını hücrelerle homolog sekanslarda bir direnç kaseti ile karıştırın ve hücrelerin antibiyotiklerle bir ortamda büyümesine izin verin. Genler inaktive edilebilir ve proteinler aşırı eksprese edilebilir. Bu, herhangi bir temel araştırma ve biyoteknik çalışmalar için önemlidir.Doğal dönüşümün de kurulduğu tek hücreli siyanobakterilerde, fotosentez veya fotoreseptörler vb. Üzerine moleküler çalışmalar ele alınmıştır.

natural-transformation-protein-expression-cryoconservation

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kaynak: Weber, N. ve diğerleri, İpliksi Siyanobakteri Phormidium lacuna'nın Doğal Dönüşümü, Protein Ekspresyonu ve Kriyopkonservasyonu. J. Vis. Uzm. (2022)Bu video, filamentli siyanobakterilerde fototaksiyi incelemek için odaklanmış bir LED tabanlı testi göstermektedir. Bakteriler ışık kaynağına doğru göç ederek, aydınlatılan merkezde, yakalanan görüntünün piksel yoğunluğu analizi yoluyla görselleştirilen ve ölçülen yoğun bir birikim oluşturur.

Odaklanmış Işık Aydınlatması Kullanılarak İpliksi Siyanobakterilerin Fototaksi Testi

Kaynak: Weber, N., ve diğerleri, İpliksi Siyanobakteri Phormidium lacuna'nın Doğal Dönüşümü, Protein Ekspresyonu ve Kriyopkonservasyonu. J. Vis. Uzm. (2022)Bu video, homolog rekombinasyon yoluyla stabil GFP ekspresyonu ve antibiyotik direnci elde etmek için plazmit DNA kullanarak filamentli siyanobakterilerde doğal dönüşüm gerçekleştirmeye yönelik bir prosedürü açıklamaktadır.

İpliksi Siyanobakteri Phormidium lacuna'da Doğal Dönüşüm ve GFP İfadesi

Kaynak: Weber, N., ve diğerleri, İpliksi Siyanobakteri Phormidium lacuna'nın Doğal Dönüşümü, Protein Ekspresyonu ve Kriyopkonservasyonu. J. Vis. Uzm. (2022)Bu video, tek tip bir süspansiyon oluşturmak için filament kültürlerini homojenleştirerek, bir mikroskop lamı üzerinde bir Petri plakası tahlili kurulumu hazırlayarak ve filament hareketini görselleştirerek Phormidium lacuna'daki kayma hareketliliğini değerlendirme prosedürünü göstermektedir.

Phormidium lacuna Filamentlerinde Kayma Hareketliliği

Sentetik Biyoloji Mühendisliği proteinlerin kanonik olmayan amino asitlerin co-translational ekleme kullanarak benzersiz özellikleri ile sağlar. Burada, GFP türü fluorophore "altın" floresan protein (GdFP) olarak adlandırdığı roman Floresans spektroskopik özellikleri ile hayalice kırmızı kaymıştır bir türevi E. coli seçici basınç birleşme (SPI) yolu ile nasıl üretilir sundu.

Mühendislik kanonik olmayan Amino asitler ve seçici basınç eklenmesi tarafından 'Altın' floresan ve kütle spektrometresi ve floresan göre Protein analizi

Bu iletişim kuralı, siyanobakteriler geçici DNA sıkıştırma görselleştirmek açıklar. Zaman uyumlu ekimi, floresans mikroskobu, Hızlı dondurma ve yüksek tarafından izleme gerilim cryo-elektron tomografi kullanılır. Bu metodolojileri için bir protokol sundu ve gelecekteki uygulamalar ve gelişmeler ele alınmıştır.

Siyanobakteriler yüksek gerilim Cryo-elektron tomografi tarafından DNA sıkıştırma görselleştirme

Bu iletişim kuralı tarafından cryo-elektron mikroskobu, verimli bir şekilde en az çaba ve toksisite, protein ayıklama, arıtma ile memeli hücrelerinde genlerin ifade etmek için kullanılan bir baculovirus sistemi de dahil olmak üzere iyon kanal yapılarını belirlemek için kullanılan teknikler açıklanır, ve kalite kontrol, örnek kılavuz hazırlık ve tarama, hem de veri toplama ve işleme.

İfade ve insan Lipid duyarlı ba * kanal TRPC3 arınma için tek-parçacık Cryo-elektron mikroskobu ile yapısal kararlılık

Burada, i) CyanoGate modüler klonlama araç kiti kullanarak kendi kendini çoğaltan bir vektör monte etmek açıklayan bir protokol sokulması, ii) konjugasyon ile bir siyanobakteriyel konak içine vektör tanıtmak ve iii) transgenik siyanobakteri suşları karakterize bir plaka okuyucu veya akış sitometri.

CyanoGate Modüler Klonlama Araç Kiti Kullanılarak Konjugasyon ile Siyanobakterilerin Genetik Modifikasyonu

Bakteri hücrelerinin görüntülenmesi, büyük makromoleküler makinelerin işlevini belirleyen statik ve dinamik süreçleri tanımlamaya odaklanmış yeni ortaya çıkan bir sistem biyolojisi yaklaşımıdır. Burada Lejyonella pnömophila tip IV salgı sistemi mimarisi ve fonksiyonlarını incelemek için kantitatif canlı hücre görüntüleme ve kriyo-elektron tomografisi entegrasyonu kullanılmaktadır.

Legionella pnömophila Dot/Icm Salgı Sisteminin Spatiotemporal Özelliklerini Çözmek İçin Canlı Hücre Görüntüleme ve Kriyo-Elektron Tomografisi Uygulama

Bu protokol, RNA ve protein üreten sentetik hücrelerin aşağıdan yukarıya hazırlanması için yöntem, malzeme, ekipman ve adımları açıklamaktadır. Sentetik hücrelerin iç sulu bölmesi bir lipid bilayer içinde kapsüllenmiş S30 bakteriyel lizat içeriyordu (yani, istikrarlı lipozomlar), bir su-in-oil emülsiyon transferi yöntemi kullanarak.

Hücre Serbest Bakteriyel Özler, Lipozomlar ve Emülsiyon Transferi Kullanarak Protein Üreten Sentetik Hücreler Hazırlama

XY düzleminde filamentli siyanobakteriyel görselleştirme için basit ve erişilebilir bir yöntem sunuyoruz. Düşük erime noktalı bir agaroz matrisi kullanıldı ve bölünmede yer alan proteinlerin görüntülerinin dikey bir yönde elde edilmesine izin verildi. Bu nedenle, bu metodoloji herhangi bir filamentli organizmaya ve farklı protein türlerine uygulanabilir.

Filamentli Siyanobakterilerde Hızlandırılmış Mikroskopi Analizi için Dikey İmmobilizasyon Yöntemi

Keşfedin filamentöz siyanobakteri Phormidium lacuna'da doğal transformasyon ve hareketlilik analizi yöntemlerini. Bu protokol Oscillatoriales takımında genetik manipülasyon ve protein ifadesi çalışmaları için temel oluşturur.

Filamentöz Cyanobacterium Phormidium lacuna'nın Doğal Transformasyonu, Protein İfadesi ve Kriyokorunumu

Daha fazla video keşfet