Tonotopik gradyanları ve mikrodevreleri değerlendirmek için embriyonik tavuk işitsel beyin sapının dilimlenmesi

Bu yöntem, aynı dilimde daha büyük bir frekans bölgesi gradyanını kapsayan tavuk işitsel beyin sapının canlı dilimlerini elde eder. Bu dilimler daha büyük bir tonotopik eksene sahip elektrofizyolojik ve anatomik deneyler için uygundur. Bu metodoloji, işitsel beyin sapındaki mikro devre gelişimini anlamaya yardımcı olacaktır.

Anatomi tavuğa özgü olsa da, bıldırcınlar ve ötücü kuşlar gibi diğer kuş türleri de benzer anatomiye sahiptir. Başlamak için, yumurtaları% 70 etanol ile sterilize edin ve 38 santigrat derece ve% 50 nemde kuluçkaya yatırın. Daha sonra, ACSF için köpürme oranını, pH litre başına 300 ila 310 miliozmolar arasında bir ozmolalite ile 7.2 ila 7.4 olacak şekilde ayarlayın.

Daha sonra 100 mililitre dACSF'de beş gram agarozu karıştırın. Agaroz köpürmeye başlayana kadar agarozu bir su banyosu veya mikrodalga kullanarak tamamen çözün. Erimiş agarozu beş milimetre kalınlığa kadar bir Petri kabına dökün ve ayarlamak için oda sıcaklığında tutun.

Ayarladıktan sonra, Petri kabını kapatın ve dört santigrat derecede saklayın. Agarozu diseksiyon sırasında kullanılmak üzere kabin blokları halinde kesin. İlk olarak,% 70 etanol kullanarak diseksiyon alanını temizleyin.

Destek veya açılı agaroz bloğunu vibratom tepsisine yapıştırın. Yumurtayı parlak bir ışığın altına yerleştirin ve hava dolu boşluğu yumurtanın daha büyük veya yuvarlak tarafına yerleştirin, ardından kabuğu hava dolu boşluğun üzerine çatlatın ve membran kesesini açığa çıkarın. Gagayı açığa çıkarmak için kese içinde nazik bir kesi yapın.

Bir neşter ile, boynu ve başını yavaşça yumurtadan çekin. Kafa kesmeden sonra, kafayı soğutulmuş dACSF ile temizleyin. Kafayı soğutulmuş dACSF'de sabit tutun ve rostrokaudal bir kesi yapın.

Gözlerin arkasında ve arasında kesiyi başlatın ve hasat edilen boynun uzunluğunu takip edin. Kafatasını ortaya çıkarmak için cildi ayırın. Gözün arkasındaki kafatasını orta çizgiden yanal yöne doğru kesin.

Her iki yarım küre için de tekrarlayın. Bıçağı gözlerin arkasına yerleştirerek ve hızlı bir kesim yaparak kafatasının rostral kısmını dilimleyin. Sonra kafayı soğutulmuş bir dACSF kabına batırın.

Bir çift küçük makas kullanarak, doku hasarına neden olmadan beyni ayırmak için kafatasının kaudal bölgesinde orta hat ila yanal kesikler yapın. Beyin sapını ve beyinciği nazikçe ortaya çıkarın. Tüm kafatasının sırt bölgesini geri çekin.

Beyin sapını çıkarın ve ince bir boya fırçası kullanarak hafif fırçalayarak ortaya çıkarın. Beyin sapını doku ve kan damarlarını birbirine bağlayan dokudan temizlemek için kavisli forseps kullanın. Pedinkülleri keserek ve kan damarlarını dikkatlice çıkararak beyin sapını beyincikten ayırın.

Ek kan damarlarının beyin sapını kesin. İlk olarak, vibratom bıçağını yatay eksen boyunca yerleştirin. Koronal dilimler için, beyin sapını rostral taraftaki bir dilimleme tepsisine yapıştırın ve rostrokaudal ekseni dikey tutun.

Sagital dilimler için, lateral medial ekseni dikey tutun. Yatay dilimler için, dorsal ventral ekseni dikey tutarak ventral tarafı yapıştırın. Akut açısal sagital yatay düzlemi elde etmek için, beyin sapının ventral tarafını, ventral dorsal eksen hipotenüs yüzey agaroz bloğu üzerinde dikey olacak şekilde yapıştırın.

Agaroz bloğunun dilimleme tepsisine bakan karşı yüzeyini yapıştırın ve rostrokaudal ekseni bıçak kenarına paralel tutun. Vibratom dilimlemeye alternatif olarak, izole edilmiş beyin sapını 35 x 10 milimetrelik bir Petri kabında 40 santigrat derecede %4 düşük erime noktası agarozuna batırın. Agaroz katılaştıktan sonra, kabin agaroz bloğunu keskin bir tıraş bıçağı kullanarak kesin.

Agaroz bloğunu, beyin sapının rostrokaudal eksenini dikey tutarak rostral tarafına yapıştırın. NM bölgesi görülene kadar koronal dilimler alın. Agaroz bloğunu tutkaldan keskin bir bıçakla çıkarın.

İnce bir iğneyle, çekirdekleri tespit etmek için NM'ye yavaşça 0,5 mikrolitre toluidin mavisi boya yerleştirin. Sagital veya yatay dilimler için bu bloğu dilimleme tepsisine yeniden takın. Çekirdekleri lekeli bölgeye göre tanımlayın ve beyin sapını kesitleyin.

Kesitlemeden sonra, sırayla toplanan 200 ila 300 mikron dilimleri, oda sıcaklığında bir saat boyunca dengelemek için ACSF içeren dilimlenmiş bir odaya yerleştirin. Bir E19 ila 21 tavuk embriyosundan beyin sapı dokusunun koronal bölümleri, işitsel beyin sapı çekirdeklerinin göreceli izofrekans bölgelerini en düşükten en yüksek karakteristik frekans işitsel bölgeye kadar temsil eder. Afferent işitme siniri lifleri ve NM aksonlarının çatallanması görülebiliyordu.

Nucleus angularis de gözlendi. Rostral kesitlerde, superior olivary çekirdeği koronal dilimin ventral lateral bölgesi boyunca bulunur. Sagital kesitlerde, işitme siniri liflerinin nöron kümesine girdiği yerde NM ve çekirdek laminaris veya NL tanımlandı.

Rostrolateral bölgede superior olivary çekirdeği saptandı. Rostrokaudal eksen boyunca NM ve NL'den düşük ve yüksek karakteristik frekanslı işitsel bölgeler görüldü. En medial dilim ipsilateral ve kontralateral aksonal tutamları ve işitsel bölgenin bitiş noktasını gösterdi.

Yatay dilimlerde, orta hatta doğru NM ve NL tanımlandı ve nöronlar lateral medial eksen boyunca yayıldı. Beyin sapı dokusunun yatay bir düzlemden keskin bir açıyla dilimleri, işitsel beyin sapı çekirdeklerini büyük bir diyagonal yayılım boyunca gösterdi. Büyütülmüş görüntüler, işitsel çekirdeklerin tonotopik eksenini rostromedial ila kaudolateral eksen boyunca gösterdi.

Tüm işlemin karbonhidrat oksijeni ile sürekli kabarcıklanmış buz soğutmalı dACSF'de gerçekleştirildiğinden emin olun. Bu protokol, beyin sapı mikrodevrelerinin anatomik ve biyofiziksel özelliklerini, özellikle de ana işitsel çekirdekler arasındaki ilişkiyi araştıran araştırmacılar için kullanılır.