Descemet'in Sadece Mühendislik Fibroblast Büyüme Faktörü 1 Tarafından Uyarılan Hızlandırılmış İyileşme ile Sıyırılmasının İnsan Kornea Organ Kültürü Modeli

Bu videonun amacı, Descemet'in Sadece Sıyırma adlı insan kornea organ kültürü modelini, mühendislik fibroblast büyüme faktörü biri tarafından uyarılan hızlandırılmış iyileşme ile tanımlamaktır. Fuch Endotelyal Kornea Distrofisi veya FECD, kornea endotel hücrelerinde pompa fonksiyonunun kaybı ve Descemet zarının yüzeyinde kollajen ve diğer hücre dışı matriks proteinlerinin aşırı birikmesi ile karakterize bir hastalıktır ve kornea guttası oluşturur. FECD için bilinen tek tedavi, hepsi reddedilme ve endotel hücre kaybı riski taşıyan çeşitli formlarda endotelyal keratoplastidir.

Oftalmik cerrahideki ilerlemeler bu prosedürlerin zamanla daha az invaziv hale gelmesini sağlamış olsa da, herhangi bir transplantasyon şekli reddedilme riski ve ömür boyu steroid kullanımı olasılığı ile birlikte gelir. Descemet's Stripping Only veya DSO, korneanın merkezine lokalize guttae'li FECD hastalarının, greft replasmanı olmadan Descemet'in zarının merkezi dört milimetrelik çemberinin çıkarıldığı deneysel bir alternatiftir. Guttaların çıkarılması, sağlıklı periferik hücreleri içe doğru göç etmeye ve endotel tek tabakasını reforme etmeye, sonunda stromal ödemi tersine çevirmeye ve vizyonu iyileştirmeye teşvik eder.

Bu yöntemin birçok avantajı olmasına rağmen, iyileşme süreci uzun ve tutarsızdır ve bazı hastalar ameliyatı takip eden ayda iyileşme görülmezse kurtarma nakline ihtiyaç duyarlar. DSO'yu takiben daha hızlı yara iyileşmesini uyaran bir tedavi, prosedürü FECD'li hastalar için daha uygun bir seçenek haline getirebilir. Bu protokol, DSO'yu FECD'li hastalar için daha uygun bir seçenek haline getirmek için DSO'yu takiben yara iyileşmesini iyileştirmek için tedavileri test etmek amacıyla, insan donör kornealarını kullanarak klinik DSO prosedürünü bir organ kültürü formatında modellemektedir.

Laboratuvarımız bu modeli, bu videonun ilerleyen kısımlarında temsili sonuçlar göstereceğimiz mühendislik ürünü bir fibroblast büyüme faktörü ile tedavi edilen kornealarda yara iyileşmesini test etmek için kullanmaktadır. Prosedürün bu bölümünde, Descemet'in zarının sıyrılacağı dört milimetrelik yara alanını işaretlemek için bir biyopsi punch kullanılacaktır. Steril forseps kullanarak, korneayı ortamdan çıkarın ve artık ortamı ve hücre kalıntılarını gidermek için 1X PBS'de durulayın.

Duruladıktan sonra, kornea endotel tarafını bir Petri kabının kapağına yerleştirin. Bir kaynak kabına tripan mavisi renkte yeni bir dört milimetrelik biyopsi yumruğunu batırın ve fazlalıktan yararlanın. Her iki elinizi kullanarak yumruğu korneanın merkezinin üzerine yerleştirin ve minimum basınç uygulayarak doğrudan endotel yüzeyine indirin.

Kornea üzerindeki pozisyonu veya basıncı değiştirmeden yumruğu bir ele kaydırın ve yeni serbest elle forsepslere ulaşın. Biyopsi yumruğunu birkaç kez yaklaşık 90 derece ileri geri bükerken korneayı yerinde tutmak için forsepsleri kullanın. Biyopsi yumruğunu doğrudan korneadan yukarı kaldırın ve bir kenara koyun.

Fazla tripan mavisini gidermek için 1X PBS'de bir kez daha durulayın. Petri kabı kapağındaki korneayı diseksiyon kapsamına aktarın. Korneayı kavisli forseps ile yerinde tutmak, biyopsi yumruğunun bıraktığı tripan mavisi halkası boyunca keskin bir 30 gauge iğnenin ucunu hafifçe sürükleyerek Descemet'in zarını puanlamaktadır.

Altta yatan stromayı bozmamak için minimum basınç kullanın. Bir sinskey kancası ile Descemet'in zarını yara kenarının etrafına kaldırmak ve soymak için nazik kepçe hareketleri kullanın. Lezyonun merkezine doğru çalışmak.

Descemet'in zarı çok az dirençle ortaya çıkmalıdır. Zorluk yaşıyorsanız, muhtemelen stromayı yukarı çekiyorsunuzdur. Bu olursa, yara kenarı boyunca yeni bir noktadan kaldırarak tekrar başlayın.

Descemet'in zarının çoğunluğu stromadan ayrıldıktan sonra, zarı çıkarmak ve bir kenara koymak için Gorovoy forseps kullanın. Kalan membran parçaları için sıyrılmış alanı inceleyin ve Gorovoy forseps ile çıkarın. Descemet'in sıyırılmasını takiben, yara bölgesini görselleştirmek için korneayı tripan mavisi ile lekeleyin.

Korneayı %0.01 kalsiyum klorür ve magnezyum klorür içeren 1X PBS'de durulayarak tripan mavisi ile etkileşime girebilecek hücre kalıntılarını giderin ve kalan CEC'lerin bozulmamış Descemet'in zarına sıkı sıkıya yapışmasını kolaylaştırın. Korneayı kaynaklı bir kaba yerleştirin ve 30 saniye boyunca endotel tabakasına 30 mikrolitre tripan mavisi pipet yerleştirin. Tüm endotel yüzeyinin kaplandığından emin olmak için korneayı hafifçe sallamak için forseps kullanın.

PDS'deki fazla tripan mavisini kalsiyum ve magnezyum ile durulayın ve lekeli korneayı diseksiyon mikroskobu altında gün sıfır zaman noktası için görüntüleyin. Bu işlem tamamlandıktan sonra, aşağıdaki listelenen bileşenlerden oluşan düşük serum ortamı içeren altı kuyucuklu bir plakada korneaları kültürleyin. Sol korneayı sadece sekiz değirmen düşük serum ortamında ve sağ korneayı, mühendislik FGF-1 veya diğer istenen test tedavileri ile desteklenmiş düşük serum ortamında kültürleyin.

Korneaları günlük ortam değişiklikleri ile 14 gün boyunca% 6 CO2 ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Tripan boyama prosedürünü üç, altı, dokuz, 12 ve 14. günlerde tekrarlayın ve boyama işleminden hemen sonra her korneayı görüntüleyin. Kamera ayarlarını tüm zaman noktalarında tutarlı tuttuğunuzdan emin olun.

Kültür dönemini takiben, özellikle deneye yönelik araştırma ilgi alanlarına dayanarak kornealarda ek lekeler yapılabilir. Laboratuvarımızın araştırma ilgi alanlarıyla ilgili ek boyamalar arasında Alizarin boyamasının yanı sıra EDU kuruluşu ve ZO-1 sıkı bağlantı proteinleri için floresan boyama yer almaktadır. Alizarin boyama, tripan boyama sonuçlarını doğrulamak ve iyileşen bölgedeki hücre morfolojisini görselleştirmek için hücre sınırlarını görselleştirmek için yapılır.

ZO-1 immünofloresan boyama, iyileşen bölgede ve çevresinde özellikle ilgi çekici olan CEC'ler arasındaki sıkı bağlantı oluşumunun görselleştirilmesine izin verir. EdU etiketlemesi, proliferasyonun iyileşmeye katkıda bulunduğunu doğrulamak için kalitatif bir önlem olarak gerçekleştirilir ve bazı bağlamlarda çoğalan hücreleri ölçmek için de kullanılabilir. Bu özel boyama prosedürlerinin nasıl gerçekleştirileceğine dair daha ayrıntılı talimatlar, bu videoya karşılık gelen makalede yer almaktadır.

İşte Göz Bankası tarafından distrofik olarak değerlendirilen ve 14 günlük bir süre boyunca mühendislik FGF-1 ile veya mühendislik FGF-1 olmadan inkübe edilen bir çift korneanın temsili görüntüleri. Görüntülerde görüldüğü gibi, mühendislik ürünü FGF-1 ile tedavi edilen kornea, tedavi edilmeyen kontrol korneasına kıyasla hızlandırılmış iyileşme göstermiştir. Kültür döneminin sonunda ek Alizarin boyaması, hücre sınırlarını tanımlamaya hizmet etmiş ve bu bulgularla doğrulanmıştır.

Bu gözlem, klinik DSO prosedürüyle en alakalı kornea örneğindeki modeli doğrulamak için 11 çift distrofik korneada çoğaltıldı. ImageJ gibi görüntü işleme yazılımı, burada görülebileceği gibi, yara iyileşmesi ilerlemesini ölçmek için bu görüntülerdeki lekeli alanı ölçmek için kullanılabilir. Mühendislik FGF-1 ile tedavi edilen tüm distrofik kornealar, 14. günde tedavi edilmeyen eşe kıyasla daha fazla iyileşme gösterdi ve kontrol kornealarında% 38'in aksine% 91'lik bir iyileşme ile sonuçlandı.

Ve bu fark istatistiksel olarak anlamlıydı. Konfokal görüntüleme ile görselleştirilen ek immünohistokimya, önceki Alizarin boyama modellerini yansıtan ZO-1 sıkı bağlantı proteininin yarı organize ekspresyonunu ortaya çıkardı. EDU etiketlemesi, yara bölgesinde ve çevresinde proliferasyon yapan hücrelerin varlığını doğruladı ve tedavi edilmeyen kontrollere kıyasla tedavi edilen kornealarda daha yüksek seviyelerde görülebildi.

Bazı kornea çiftlerinde, CEC ölümü, özellikle distrofik kornealarda, yara bölgesinin periferisinde görülebilir. İşte önemli periferik hücre ölümü sergileyen tripan lekeli korneaların örnek görüntüleri. Görüntülerde görüldüğü gibi, periferik hücre ölümü öncelikle daha erken zaman noktalarında meydana gelir ve kültür periyodu boyunca yavaş yavaş tersine döner.

Bu periferik boyama, yaraya bağlandığında yara alanının kantitasyonunu zorlaştırabilir, çünkü yara alanı kenarının yerini belirlemek zor olabilir. Bununla birlikte, her durumda, periferik tripan boyaması, son gün 14 zaman noktasında ölçülebilir görüntüler üretecek kadar temizlenmiştir. Bu fenomenin ex vivo kültürlü donör kornealara özgü olduğuna ve in vivo olarak insan kornealarıyla ilgili olmadığına inanıyoruz.

Periferik endotel hasarı olarak DSO'nun herhangi bir klinik vaka çalışmasında tarafımıza bildirilmemiştir. Alizarin Kırmızısı görüntülerinde çok periferik boyama olarak adlandırılan ikinci bir boyama paterni yakalandı, ancak kültür dönemi boyunca tripan mavisi görüntülerde de belirgindi. Bu gözlem, limbüsün etrafında tehlikeye atılmış endotel gösteren koyu renkli bir lekelenme halkası ile karakterizedir.

Terime rağmen, bu model hem normal hem de distrofik kornealarda o kadar yaygındı ki, periferik boyama için pozitif olarak sayılmadılar. Bu protokol, Descemet'in sıyırılmasını takiben mühendislik ürünü FGF-1 ile tedavi edilen kültürlü kornealarda daha iyi iyileşme sonuçları göstermemizi sağladı. Ek olarak, bu sıyırma protokolü, DSO'yu inceleyen diğer araştırmacılar için değerli bir yöntem olarak hizmet eder ve diğer yara iyileştirme tedavilerini test etmek, cerrahi teknikteki değişiklikleri değerlendirmek ve farklı donör popülasyonları veya hastalığın aşamaları arasında iyileşmeyi karşılaştırmak da dahil olmak üzere çok çeşitli uygulamalar için kullanılabilir.

Bu araştırmanın ve bu protokolü kullanan diğer araştırmaların klinisyenleri DSO'yu gelecekte uygun FECD hastaları için değerli bir tedavi seçeneği olarak görmeye teşvik edeceğini umuyoruz.