Name: Hepatositlerde Organeller Arası Temas Bölgelerinin Seri Kesitli Elektron Mikroskobu Kullanılarak Üç Boyutlu Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Keşfedin seri kesitli elektron mikroskobu ile hepatositlerde organeller arası temas bölgelerinin üç boyutlu karakterizasyonunu. Bu yöntem, hücresel süreçleri ve hastalıkları anlamak için organel etkileşimlerini incelemeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Joanna Hanley, Rebecca Fiadeiro ve Ania Straatman-Iwanowska'ya uzman teknik yardım için teşekkür ederiz. Ayrıca yararlı tartışmalar için Stefan laboratuvar üyelerine ve Ian J. White'a teşekkür ederiz. J.J.B., UCL'deki MRC Moleküler Hücre Biyolojisi MRC Laboratuvarı'na, ödül kodu MC_U12266B MRC finansmanı ile desteklenmektedir. C.J.S., UCL'deki Moleküler Hücre Biyolojisi Üniversite Birimi MRC Laboratuvarı'na MRC finansmanı ile desteklenmektedir, ödül kodu MC_UU_00012/6. P.G., Avrupa Araştırma Konseyi, hibe kodu ERC-2013-StG-337057 tarafından finanse edilmektedir.

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Organel yapısını ve etkileşimlerini 3D olarak görselleştirmek için erişilebilir bir vEM tekniği bu protokolde açıklanmıştır. Hepatositlerde interorganel temaslarının morfolojisi burada bir vaka çalışması olarak sunulmuştur. Bununla birlikte, bu yaklaşım, periferik sinirlerde Schwann hücresi-endotel etkileşimleri 45, endotel hücrelerinde Weibel Palade Vücut biyogenezi46, böbrek hücrelerinde kargo sekresyonu47 ve hipokampal nöronlarda sinaps morfolojisi48</s...

1930'lardaki icatlarından bu yana, elektron mikroskopları araştırmacıların hücrelerin ve dokuların yapısal bileşenlerini görselleştirmelerine izin verdi 1,2. Çoğu araştırma, 3D modeller oluşturmak için özenli seri bölüm toplama, manuel fotoğrafçılık, negatif işleme, manuel izleme ve cam, plastik veya strafor 3,4 tabakalarından 3D modellerin oluşturulması ve montajı gerektiğinden, 2D bilgi sağlamıştır. Neredeyse 70 yıl sonra, mikroskop performansı, seri bölüm toplama, otomatik dijital görüntüleme, 3D rekonstrüksiyon, görselleştirme ve analiz için sofistike yazılım ve donanımdan, şimdi toplu olarak hacim EM (vEM) olarak adlandırılan alternatif yaklaşımlara kadar, sürecin birçok alanında önemli ilerlemeler olmuştur. Bu vEM tekniklerinin genellikle mikron ölçeklerinde nanometre çözünürlüklerinde 3D ultrayapısal bilgi sağladığı ve iletim elektron mikroskobu (TEM) ve daha yeni taramalı elektron mikroskobu (SEM) tekniklerini kapsadığı düşünülmektedir; Bkz.yorumlar 5,6,7,8.
Örneğin, odaklanmış iyon ışını SEM (FIB-SEM), bloğun yüzeyinin sıralı SEM görüntüleme taramaları arasında bloğun yüzeyini frezelemek için bir SEM içinde odaklanmış bir iyon ışını kullanır, böylece bir numunenin tekrarlanan otomatik frezelenmesine / görüntülenmesine ve yeniden yapılanma için bir 3D veri kümesi oluşturulmasına izin verir 9,10. Buna karşılık, seri blok yüzü SEM (SBF-SEM), görüntüleme 11,12'den önce blok yüzünden materyali çıkarmak için SEM içinde bir ultramikrotom kullanırken, dizi tomografisi, 3D veri kümesini oluşturmak için SEM'deki sıralı bölümlerdeki ilgi alanını görüntülemek için otomatik bir iş akışı kurmadan önce, seri bölümlerin, kapaklara, gofretlere veya bantlara toplanmasını gerektiren tahribatsız bir işlemdir13 . Dizi tomografisine benzer şekilde, seri kesit TEM (ssTEM), fiziksel kesitlerin görüntülemeden önce toplanmasını gerektirir; ancak, bu bölümler TEM ızgaralarında toplanır ve bir TEM 14,15,16'da görüntülenir. ssTEM tilt tomografi17,18,19 yapılarak genişletilebilir. Seri eğimli tomografi x, y ve z'de en iyi çözünürlüğü sağlar ve tüm hücreleri20 yeniden yapılandırmak için kullanılmış olsa da, oldukça zordur. Bu protokol, şu anda özel bölümleme veya vEM cihazlarına erişimi olmayan ancak 3D vEM verileri oluşturmaktan fayda sağlayacak birçok EM laboratuvarı için mevcut olan en erişilebilir vEM tekniği olarak ssTEM'in pratik yönlerine odaklanmaktadır.
3D rekonstrüksiyon için seri ultramikrotomi daha önce zor olarak kabul edildi. Eşit kesit kalınlığındaki düz şeritleri kesmek, doğru boyuttaki şeritleri doğru sırayla, yeterli desteğe sahip ızgaralara yerleştirebilmek ve alabilmek zordu, ancak ilgi alanlarını gizleyen ızgara çubukları olmadan ve en önemlisi, bölümleri kaybetmeden, tamamlanmamış bir seri tam 3D rekonstrüksiyonu önleyebilir21. Bununla birlikte, ticari ultramikrotomlar, elmas kesme ve kırpma bıçakları 22,23, ızgaralar 21,24 üzerindeki elektron parlaklığı destek filmleri ve kesit yapışmasına ve şerit korumasına yardımcı olmak için yapıştırıcılar 13,21'deki iyileştirmeler, tekniği birçok laboratuvarda daha rutin hale getiren yıllar içindeki artan gelişmelerden sadece birkaçıdır. Seri kesitler toplandıktan sonra, TEM'deki seri görüntüleme basittir ve x ve y cinsinden subnanometre px boyutlarına sahip EM görüntüleri sağlayabilir ve hücre altı yapıların yüksek çözünürlüklü sorgulanmasına izin verebilir - birçok araştırma sorusu için potansiyel bir gereklilik. Burada sunulan vaka çalışması, karaciğer hepatositlerinde endoplazmik retikulum (ER)-organel temaslarının incelenmesinde ssTEM ve 3D rekonstrüksiyonun kullanımını göstermektedir ve burada ER-organel temasları ilk kez gözlenmiştir25,26.
Nükleer zarfla bitişik olmakla birlikte, ER ayrıca lizozomlar, mitokondri, lipit damlacıkları ve plazma zarı27 dahil olmak üzere çok sayıda diğer hücre organelleriyle yakın temas kurar. ER-organel temasları lipid metabolizması28, fosfoinositid ve kalsiyum sinyalizasyonu29, otofaji regülasyonu ve stres yanıtı30,31 ile ilişkilendirilmiştir. ER-organel temasları ve diğer organeller arası temaslar, hücresel metabolik ihtiyaçlara ve hücre dışı ipuçlarına cevap veren oldukça dinamik yapılardır. Morfolojik olarak boyut ve şekillerinde ve organel zarları arasındaki mesafelerde32,33 olarak değiştiği gösterilmiştir. Bu ultrastrüktürel farklılıkların farklı protein/lipid bileşimlerini yansıtması ve34,35 fonksiyonunu yansıtması muhtemeldir. Bununla birlikte, organlar arası temasları tanımlamak ve bunları analiz etmek hala zor bir görevdir36. Bu nedenle, daha ileri araştırmalar için organlar arası temasları incelemek ve karakterize etmek için güvenilir ancak basit bir protokol gereklidir.
ER-organel kontakları membrandan membrana ayırmada 10 ila 30 nm arasında değişebildiğinden, tanımlama için altın standart tarihsel olarak TEM olmuştur. İnce kesitli TEM, farklı membran temaslarında yerleşik ER proteinleri için spesifik alt alan lokalizasyonu ortaya koymuştur37. Geleneksel olarak, bu, nm çözünürlüklü ER-organel temaslarını ortaya çıkarmıştır, ancak genellikle bu etkileşimlerin yalnızca 2D bir görünümünü sunmuştur. Bununla birlikte, vEM yaklaşımları, bu temas bölgelerinin ultrayapısal sunumunu ve bağlamını 3D olarak ortaya koyarak, temasların tam olarak yeniden yapılandırılmasını ve kontakların daha doğru sınıflandırılmasını (nokta vs boru şeklindeki ve sarnıç benzeri) ve nicelleştirme38,39'u mümkün kılmaktadır. ER-organel temaslarının 25,26 gözlendiği ilk hücre tipi olmasının yanı sıra, hepatositler mimarilerinde ve fizyolojilerinde hayati roller üstlenen diğer organeller arası temaslardan oluşan kapsamlı bir sisteme sahiptir28,40. Bununla birlikte, hepatositlerde ER-organel ve diğer interorganel temaslarının tam morfolojik karakterizasyonu hala eksiktir. Buna göre, rejenerasyon ve onarım sırasında organeller arası temasların nasıl oluştuğu ve yeniden şekillendiği, hepatosit biyolojisi ve karaciğer fonksiyonu ile özellikle ilgilidir.

<table><tbody><tr><td>0.22 ve mikro; m şırınga filtresi</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>Alüminyum tepsiler</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG3912</td><td></td></tr><tr><td>Amira v6</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>https://www.thermofisher.com</td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Fisher</td><td>C/4960/PB08</td><td></td></tr><tr><td>DDSA/Dodecenyl Süksinik Anhidrit</td><td>TAAB</td><td>T027</td><td>Epon bileşen</td></tr><tr><td>Elmas bıçak</td><td>DiaTOME</td><td>ultra 45 derece;</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30/2,4,6-tri (Dimetilaminometil) fenol</td><td>TAAB</td><td>D032</td><td>Epon bileşeni</td></tr><tr><td>Dumont Cımbız N5</td><td>Agar Scientific</td><td>AGT5293</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>https://imagej.net/ Fiji TrakEM2 eklentisi</td><td></td><td></td><td>https://imagej.net/</td></tr> <tr><td>Formaldehit %36 çözelti</td><td>TAAB</td><td>F003</td><td></td></tr><tr><td>Formvar kaplamalı yuva ızgarası</td><td>Ev Yapımı</td><td></td><td>Alternatif: EMS diasum (FF2010-Cu)</td></tr><tr><td>Aplikatör çubuklu cam şişe</td><td>Medisca</td><td>6258</td><td></td></tr><tr><td>Cam şişeler</td><td>Fisher Scientific</td><td>15364769</td><td></td></tr><tr><td>Gluteraldehit% 25 çözelti</td><td>TAAB</td><td>G011</td><td></td></tr><tr><td>MNA/Metil Nadik Anhidrit</td><td>TAAB</td><td>M011</td><td>Epon bileşeni</td></tr><tr><td>Osmiyum Tetroksit %2 çözelti</td><td>TAAB</td><td>O005</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Ferrisiyanür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8131</td><td></td></tr><tr><td>Propilen oksit</td><td>Fisher Scientific E</td><td>/0050/PB08</td><td></td></tr><tr><td>Yeniden kullanılabilir yapıştırıcı</td><td>Blue Tack</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reynolds Kurşun Sitrat</td><td>TAAB</td><td>L037</td><td>Bölüm lekesi</td></tr><tr><td>Sodyum Kakodilat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-0250</td><td>to 0.1 M Caco tamponu yapmak</td></tr><tr><td>Süper Yapıştırıcı</td><td>RS Bileşenleri</td><td>918-6872</td><td>Siyanoakrilat yapıştırıcı, Adım 1.3</td></tr><tr><td>TAAB 812 Reçine</td><td>TAAB</td><td>T023</td><td>Epon bileşeni</td></tr><tr><td>Tanik asit</td><td>TAAB</td><td>T046</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>İki parçalı Epoksi Reçine</td><td>RS Bileşenleri</td><td>132-605</td><td>Alternatif: Adım 2.13</td></tr><tr><td>Ultramikrotom</td><td>Leica</td><td>UC7</td><td></td></tr><tr><td>Titreşimli mikrotom</td><td>Leica</td><td></td><td>100 & mikro; m kalınlığında dilimler, 1 mm genlikte 0,16 mm/sn kesim.</td></tr><tr><td>Weldwood Orijinal Temas çimentosu</td><td>DAP</td><td>107</td><td>Kontak yapıştırıcısı: Adım 3.1.4</td></tr></tbody></table>

hepatositlerde organeller arası temas bölgelerinin seri kesitli elektron mikroskobu kullanılarak Üç boyutlu karakterizasyonu

Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy

İletim elektron mikroskobu, uzun zamandır hücresel ultrayapının görselleştirilmesi için altın standart olarak kabul edilmiştir. Bununla birlikte, analiz genellikle iki boyutla sınırlıdır ve organeller arasındaki üç boyutlu (3D) ultra yapıyı ve fonksiyonel ilişkiyi tam olarak tanımlama yeteneğini engeller. Hacim elektron mikroskobu (vEM), hücresel ultrayapının mezo ölçekte, mikro ölçekte ve nano ölçekli çözünürlüklerde 3D olarak sorgulanmasını sağlayan tekniklerin bir koleksiyonunu tanımlar. 
Bu protokol, seri kesit iletimi EM'sini (TEM) kullanarak vEM verilerini elde etmek için erişilebilir ve sağlam bir yöntem sağlar ve numune işlemenin teknik yönlerini tek, basit bir iş akışında dijital 3D rekonstrüksiyona kadar kapsar. Bu tekniğin yararlılığını göstermek için, endoplazmik retikulum ve mitokondri arasındaki 3D ultrastrüktürel ilişki ve karaciğer hepatositlerindeki temas bölgeleri sunulmuştur. Organeller arası temaslar, iyonların, lipitlerin, besinlerin ve diğer küçük moleküllerin organeller arasındaki transferinde hayati rol oynar. Bununla birlikte, hepatositlerdeki ilk keşiflerine rağmen, fiziksel özellikleri, dinamikleri ve işlevleri hakkında öğrenilecek çok şey var. 
Organeller arası temaslar, iki organelin birbirine yakınlığında (tipik olarak ~ 10-30 nm) ve temas bölgesinin kapsamında (noktalama kontaklarından daha büyük 3D sarnıç benzeri kontaklara kadar) değişen bir dizi morfoloji görüntüleyebilir. Yakın temaslıların incelenmesi yüksek çözünürlüklü görüntüleme gerektirir ve seri kesit TEM, hepatosit farklılaşması sırasında organeller arası temasların 3D ultrastrüksiyonunu ve metabolik hastalıklarla ilişkili hepatosit mimarisindeki değişiklikleri görselleştirmek için çok uygundur.

Bu teknik için, ilgilenilen bölgeler biyolojik araştırma amacına göre seçilir ve gömülü dokunun kesilmesi ve bölümlenmesinden önce belirlenir. Benzer şekilde, blok yüzünün boyutu araştırma sorusu tarafından belirlenebilir; Bu durumda, numune yaklaşık 0,3 mm x 0,15 mm'lik bir blok yüzü bırakacak şekilde kesildi (Şekil 4A). Bu, ızgara başına 9 seri bölümden oluşan iki ızgaraya izin verdi, 18 seri bölüm sağladı ve yaklaşık 62 μm3 (316 μm x 150 μm x 1.3 μm) hacimli bir karaciğer dokus...

Karaciğerden hepatositlerdeki organeller veya diğer dokulardaki hücreler arasındaki membran temas bölgelerinin üç boyutlu ayrıntılarını elde etmek için basit ve kapsamlı bir protokoldür.

Hepatositlerde Organeller Arası Temas Bölgelerinin Seri Kesitli Elektron Mikroskobu Kullanılarak Üç Boyutlu Karakterizasyonu

Transmission electron microscopy has been long considered to be the gold standard for the visualization of cellular ultrastructure. However, analysis is ...

Bu protokol, organellerin basit ve sağlam bir şekilde 3D rekonstrüksiyonuna izin verirken, şu anda uzman hacimli elektron mikroskoplarına sahip olmayan laboratuvarlar tarafından erişilebilir. Bu teknik son derece esnektir ve mükemmel X/Y çözünürlüğü sağlarken, gerektiğinde numuneleri yeniden görüntüleyebilir. Ayrıca çok yüksek Z çözünürlüğü gerektiğinde tilt tomografi ile de uyumludur.Bu teknik, organeller arası bağlamda organel morfolojisinin sorgulanmasına izin verir. Bu nedenle, organel defekti olan herhangi bir patolojik durumu incelemek için genişletilebilir. Bu yaklaşım, organel etkileşimleri ve hücresel kaçakçılık olayları hakkında fikir verebilir.Bu yöntem, hepatositlere ek olarak diğer dokulara, organoid modellere ve hücre kültürü sistemlerine de uygulanabilir. İlk kez kullananlar seri bölümlemeyi bulabilir ve kayıpsız olarak zorlu bir şekilde alabilirler. Bu protokolü değerli bir numuneye uygulamadan önce düzenli ultra ince kesitlemede yetkin olmanız önerilir.Reçineye gömülü dokuyu, numune kırpma adaptöründe kilitli olacak şekilde bir tıraş bıçağı kullanarak dikkatlice kırparak başlayın. Numune arkını, mandren ve numune ile birlikte mikrotomun numune koluna aktarın ve numune arkını, geminin hareket aralığı yukarıdan aşağıya doğru uzanacak şekilde konumlandırın. Elmas bıçağı bıçak tutucusuna yerleştirin ve kilitleyerek bıçağın kesme açısının uygun şekilde ayarlandığından emin olun.Bıçak tutucuyu sahneye güvenli bir şekilde kilitleyin. Sahne alanı aşağı aydınlatmasını kapatın, sahne alanı yukarı aydınlatmasını açın, bıçağı numuneye doğru dikkatli bir şekilde hareket ettirin, blok yüzü bıçağın kenarına hizalanana kadar ilgili düğmeleri ayarlayarak bıçağın yanal açısını, numune eğimini ve numune dönüşünü sürekli olarak ayarlayın. Numune kolunun kesme penceresinin üstünü ve altını ayarlayın ve numuneyi bıçak kenarının hemen altında bırakın.Bıçaklı tekneyi temiz, çift damıtılmış suyla doldurun ve su yüzeyinin bıçağın kenarı ve hafif içbükey olduğu düz olduğundan emin olun. Ardından, bölümleri kesmeye başlayın. Numune bıçağın kenarından geçtikten hemen sonra kesmeyi durdurun.Her kılavuzda toplanacak bölüm sayısını tahmin etmek için boş bir yuva ızgarası kullanın. Her elinizde bir kirpik kullanarak, şeridi yavaşça yuva ızgarasının uzunluğuna sığabilecek daha küçük şeritlere ayırın. Örnek içindeki göreceli konumlarını zihinsel olarak not edin.Bir cam aplikatör çubuğu kullanarak, düzleştirmek için bölümlerin üzerine bir damla kloroform getirin. İlk numaralı forseps ile ilk boş yuva ızgarasını alın ve yavaşça Triton X-100'e ve ardından damıtılmış suya iki kez batırın. Forsepsin kenarındaki fazla suyu çıkarmak için bir parça filtre kağıdı kullanın.Forseps kullanarak, formvar kaplı yuva ızgarasının yaklaşık 2 / 3'ünü bıçaklı teknenin suyuna yavaşça indirin. Formvar tarafının aşağı baktığından ve yuvanın uzun sağ kenarının su yüzeyinde ve su kenarına paralel olduğundan emin olun. Izgarayı yavaşça sudaki şeritlere doğru kaydırın, böylece dönüş vuruşunda bölümler ızgaraya doğru sürüklenir.Bunu, şeridin sağ kenarı yuvanın sağ el kenarıyla aynı hizaya gelene kadar daha küçük ve daha küçük waft'larda yapmaya devam edin. Ardından, son waft ile, bölümleri yuva ızgarasına almak için ızgarayı yavaşça yukarı kaldırın. Karbondioksit içermeyen bir ortam sağlamak için Petri kabı kapağının altına birkaç sodyum hidroksit topağı yerleştirin.Daha sonra, Reynold'un kurşun sitratının 40 mikrolitrelik damlalarını parafilm üzerine dikkatlice pipetleyin, her ızgara için bir damla. Her ızgarayı kurşun sitrat damlasına ters çevirin ve Petri kabı kapağı tarafından 7 ila 10 dakika boyunca korunarak bırakın. Izgaralar boyanırken, parafilm üzerine her ızgara için yaklaşık 300 mikrolitrelik beş damla damıtılmış su yerleştirin.Kurşun sitrat inkübasyonunun sonunda, her ızgarayı doğrudan ızgaralarda nefes almadan bir dakika boyunca yıkamak için bir damla damıtılmış su damlacığına aktarın. Bunu dört kez daha tekrarlayın. İlk ızgarayı almak için numaralandırılmış çapraz forseps kullanın.Suyun çoğunu fitillemek üzere kağıdı filtrelemek için ızgaranın kenarına dokunun ve forsepslerde en az 20 dakika kurumaya bırakın. Bunu her ızgara için tekrarlayın. Düşük büyütmede, seri bölümlerin sırasını, konumunu ve konumunu gözlemleyin.Kılavuzdaki serinin orta bölümüne gidin. Örneğe göz atın ve ilgilenilen bir bölge belirleyin. Ardından, numuneyi istenen büyütmede gözlemleyin.Seriyi biraz daha düşük bir büyütmede toplamayı düşünün, çünkü bölümler genellikle mükemmel bir şekilde hizalanmaz ve görüntülerin daha sonra kırpılması gerekebilir. Ardından, referans görüntüleri daha düşük büyütmelerde çekin. Bu, ilgi alanının bağlamını, bölüm sınırlarına göre farklı büyütmelerde kaba konumunu ve örneklemdeki yer işareti özelliklerini takdir etmeye yardımcı olacaktır.İlgi alanını diğer bölümlere işaretlemek için bunları kullanın. Ekran referansı için, ekrana geçici işaretçiler yerleştirmek üzere yeniden kullanılabilir yapışkan macun, çıkartmalar veya ekrana bantlanmış bir parça tepegöz kağıdı kullanın. Bu, veri kümesi boyunca görüntünün merkezindeki ilgi bölgesinin aynı özelliklerinin rutin olarak yeniden tasarlanmasına olanak tanır.Görüntü yığınını açın, voksel ölçümlerini belirtin ve segmentasyonu başlatmak için Segmentasyon sekmesini seçin. Malzeme listesinde yeni nesneler tanımlamak için segmentasyon düzenleyici panelinde Yeni'yi tıklatın. Nesnenin rengini değiştirmek için sağ tıklatın ve nesneyi yeniden adlandırmak için çift tıklatın.Manuel segmentasyon için, malzeme listesinin altındaki segmentasyon aracını seçin ve pikselleri vurgulamak için varsayılan fırça aracını seçin. İki karşıt hepatositin elektron mikroskobu görüntüsü burada gösterilmiştir. Daha yüksek büyütmeli görüntüleme, nanometre çözünürlüğü ile farklı organellerin morfolojik detaylarının gözlemlenmesini sağlar.Temsili görüntü, aynı tomogramın parçalanmış versiyonunu, endoplazmik retikulumun izini, mitokondri ve ER ile farklı boşlukların mitokondrileri arasındaki membranlar arası temasları göstermektedir. Temsili görüntü, segmentasyon izleri ve tüm mitokondri içindeki göreceli konumu ile kaplanmış eğimli bir orto-dilimi göstermektedir. Parçalı organellerin 3D rekonstrüksiyonu ve endoplazmik retikulum-mitokondri temasları burada gösterilmiştir.Bu protokol çok yüksek Z çözünürlüğüne ihtiyaç duyulduğunda tilt tomografi ile uyumlu olduğu için küçük veya kıvrımlı yapıların çözülmesine yardımcı olur. Bu teknik, farklı organeller arasındaki uzamsal ilişkinin ilk değerlendirmesi için mükemmeldir ve bu nedenle, membran homeostazında membran temaslarının ilerleyen alanında özellikle yararlıdır.

three-dimensional-characterization-interorganelle-contact-sites

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Hayvan alınan hücre hatları var gibi birincil hücreleri ile karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri (sn) çalışma yapılmalıdır. Bu yöntem, karaciğer sindirim ve diferansiyel santrifüj sonraki kültür ve deney için SEC arıtma dayanmaktadır.

Karaciğer Hücreleri Karaciğer Perfüzyon Arıtma Takip in vivo Karaciğer endositoz

Bu iletişim kuralı bir Taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanarak Nano çözünürlükte görüntüleme için bir doku belirli hücreleri hedef alıyor. Biyolojik malzeme reçine gömülü seri bölümleri çok sayıda hedefi tanımlamak için bir ışık mikroskobu ve sonra SEM hiyerarşik bir düzen izler ilk...

Geniş hacimli içinde belirli hücresel hedefleri bulmak için seri bölümlerin Multimodal hiyerarşik görüntüleme

Genetik modifikasyondan sonra tüm hücrelerde mitokondri ve endoplazmik retiplinin dağılımını incelemek için bir protokol sunuyoruz, askorbat peroksidaz 2 ve horserpu peroksidaz boyama da dahil olmak üzere bağıntılı ışık ve hacim Elektron Mikroskopisi kullanılarak aynı bölümde hedef geni olan ve olmayan hücrelerin seri bölümlemesi ve elektron mikroskobu ile seri görüntüleme.

Göreli ışık ve hacim elektron mikroskobu ile mitokondri ve endoplazmik reticulum görüntüleme

Burada sunulan değiştirilmiş bir kollajenaz perfüzyon tekniği kullanılarak yetişkin fare karaciğerlerinden fare hepatositizolasyon için bir protokoldür. Ayrıca açıklanan bir 3D kollajen sandviç ayarında hepatosituzun kültürü yanı sıra safra kanaliküler oluşumu ve tedaviye yanıt çalışma için sitoskeletal bileşenlerin immünetiketleme.

İzolasyon ve 3D Kollajen Sandviç Kültürü Birincil Fare Hepatositler Safra Canaliküler Oluşumunda Sitoskeleton Rolünü Çalışma In Vitro

Burada, formalin-sabit parafin gömülü tümör doku bölümlerinde bağışıklık hücrelerini görselleştirmek, ölçmek ve haritalamak için basit ve erişilebilir bir strateji tanımlıyoruz. Bu metodoloji, mevcut görüntüleme ve dijital analiz tekniklerini görüntüleme testlerinin çoklama yeteneğini ve multiparametre analizini genişletmek amacıyla birleştirir.

Tümör Mikroortamında Bağışıklık Hücre Popülasyonlarının Görselleştirilmesi, Ölçülmesi ve Haritalanması

Membran temas bölgelerini (MCS'ler) incelemek için yeni yaklaşımlara duyulan ihtiyaç, bu hücresel yapıları ve bileşenlerini incelemeye olan ilginin artması nedeniyle artmıştır. Burada, MCS'lerde bulunan organel içi ve organeller arası protein komplekslerini tanımlamak ve ölçmek için önceden mevcut olan mikroskopi teknolojilerini entegre eden bir protokol sunuyoruz.

ER-Mitokondri Temas Bölgelerinde Endojen Organel İçi Protein Etkileşimlerinin Yakınlık Ligasyon Testleri ile Görselleştirilmesi ve Miktarının Belirlenmesi

Bu protokol, hızlı ve tekrarlanabilir endodermal hepatik organoidlerin (eHEPO'lar) oluşumunu tanımlar. Bu protokol ile eHEPO'lar 2 hafta içinde üretilebilmekte ve farklılaşma ve işlevselliklerini kaybetmeden uzun vadede (1 yıldan fazla) genişleyebilmektedir.

Fonksiyonel Endodermal Hepatik Organoidlerin Üretimi

Kriyo-STEM tomografisi, bozulmamış hücrelerin organellerini gömme, kesitleme veya diğer invaziv preparatlar olmadan görselleştirmek için bir araç sağlar. Elde edilen 3D çözünürlük şu anda birkaç nanometre aralığında, birkaç mikrometrelik bir görüş alanı ve 1 μm mertebesinde erişilebilir bir kalınlık ile.

Kriyo-STEM Tomografi ile Organellerin In Situ Görüntülenmesi

Burada, hücresel üst yapı ile ilgili olarak nadir proteinlerin lokalizasyonunu araştırmak için bir araç olarak endojen, floresan etiketlemeye dayalı optimize edilmiş kesit korelasyonlu ışık-elektron mikroskobu için bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşımın gücü, Bafilomisin tedavisi olmadan aç bırakılmış hücrelerde endojen LC3'ün ultrastrüktürel lokalizasyonu ile gösterilmiştir.

Kesit Üzerinde Korbağül Işık-Elektron Mikroskobu ile Endojen LC3'ün Ultrastrüktürel Lokalizasyonu

Bu protokol, yüksek doğruluk, yüksek çözünürlük ve yüksek verim ile 3D görüntüleme elde etmek için mitokondriyal cristae'nin nasıl yeniden yapılandırılacağını açıklar.

Pankreas Kanseri Hücrelerinde Mitokondriyal Ultrastrüktürel Değişikliklerin Görselleştirilmesi için Üç Boyutlu Bir Teknik

Bu protokol, sağlam karaciğer dokusunda karaciğer stellat hücrelerinin morfolojisini görselleştirmek ve modellemek için kapsamlı bir görüntüleme hattı sunar. Bu yaklaşım, fare genetiği kullanılarak fibroblastların floresan etiketlenmesini, yerinde karaciğer perfüzyon tabanlı doku hazırlığını ve modifiye edilmiş iDISCO doku temizleme yöntemini birleştirerek optik şeffaflığı sağlar.

Karaciğer Fibrozisi Fare Modellerinde Hepatik Yıldız Hücre Morfolojisinin Haritalanması

Keşfedin seri kesitli elektron mikroskobu ile hepatositlerde organeller arası temas bölgelerinin üç boyutlu karakterizasyonunu. Bu yöntem, hücresel süreçleri ve hastalıkları anlamak için organel etkileşimlerini incelemeye olanak tanır.

Hepatositlerde Organeller Arası Temas Bölgelerinin Seri Kesitli Elektron Mikroskobu Kullanılarak Üç Boyutlu Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet