Name: Crohn Hastalığında Mekanik Stresin Patojenik Rolünü İncelemek için TNBS Kaynaklı Bir Kemirgen Modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 8 s
Description: Keşfedin, Crohn hastalığında mekanik stresin patojenik rolünü incelemek için TNBS kaynaklı bir kemirgen modeli kullanarak transmural kolit geliştirme protokolünü. Bu yöntem, stenotik koşullarda mekanik değişiklikleri araştırmaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma kısmen NIH (R01 DK124611'den XZS'ye) ve ABD Savunma Bakanlığı'ndan (W81XWH-20-1-0681'den XZS'ye) gelen hibelerle desteklenmektedir. Histoloji çalışmaları UTMB Cerrahi Patoloji Laboratuvarı yardımıyla yapıldı.

Tüm hayvan deneyleri, Teksas Üniversitesi Tıp Şubesi'nin (#0907051C) kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesine göre yürütülmüştür. Çalışma için ~ 8-9 haftalık erkek veya dişi Sprague-Dawley sıçanları kullanıldı.
1. Hayvan hazırlığı
<ol><li>Hızlı sıçanlar 24 saat boyunca ve gece boyunca müshil (bağırsak temizleyici, Malzeme Tablosuna bakınız) ile tedavi edin.</li>
	<li>Ertesi gün, TNBS uygulaması sırasında 1 L / dak oksijen ile birlikte% 2 izoflurana maruz bırakarak bir anestezi sistemi kullanarak sıçanları anestezi altına alın ( Malzeme Tablosuna bakınız). Anesteziyi onaylamak için refleksleri kontrol edin veya ayak parmaklarını sıkıştırın.</li>
	<li>Vücut ağırlıklarına göre taze TNBS çözeltisi hazırlayın. NOT: TNBS - 65 mg / kg vücut ağırlığında 250 μL% 40 etanol kullanıldı.</li>
	<li>Sıçanları anestezi masasında sırtüstü pozisyonda koyun. Koliti indüklemek için, anüs içinden anal köşeden ~ 7-8 cm boyunca tıbbi sınıf açık uçlu bir poliüretan kateter yerleştirin ve TNBS'yi (adım 1.3'te hazırlanan) kolon19'a nazikçe damlatın. Sahte kontrol sıçanlarını sadece 250 μL salin ile uygulayın.</li>
	<li>TNBS veya salin damlattıktan sonra, TNBS dağılımına yardımcı olmak ve dökülmeleri önlemek için sıçanları sırtüstü ve hafif baş aşağı pozisyonda (~ 30 °) tutun, anüs 2 dakika kapalı tutun.</li>
	<li>Sıçanlara 7 gün boyunca yiyecek ve su ad libitum sağlayın ve sıçanları vücut ağırlığı, yiyecek alımları, dışkı ve genel sağlık durumu için günlük olarak gözlemleyin.</li>
</ol>2. Doku preparatları
<ol><li>Ötanazi gününde, CO2 inhalasyonunu kullanarak sıçanları ötenazi yapın ve servikal çıkık ile ötenaziyi onaylayın.</li>
	<li>Cerrahi sınıf makas ve forseps kullanarak sıçan karnını açın.</li>
	<li>Tüm kolonu (anal kanalın üstünde) dikkatlice çıkarın ve kolonu hemen buz gibi soğuk 1x HBSS tamponuna aktarın.</li>
	<li>Tampondaki iki noktayı düzeltin ve bir cetvel kullanarak iki nokta üst üste uzunluğunu ölçün. Naylon ipliği alın ve kontroldeki kolon segmentlerinin ve TNBS ile tedavi edilen sıçanların dış çevresini ölçmek için kolonun etrafında daire çizin. Histoloji için tam kalınlıkta dokular alın.</li>
	<li>Kolonu mezenterik tahta boyunca kesin ve kolonu HBSS tamponu ile iyice temizleyin. Makroskopik inflamasyon skoru için kolonu, daha önce tarif edildiği gibi kriterlere göre değerlendirin19 minimal modifikasyonlarla. NOT: 0 = normal mukoza; 1 = lokalize hiperemi ancak erozyon veya ülser yok; 2 = ülser ve darlık (etkilenen bölge < 5 mm); 3 = şiddetli ülser, yara izi ve darlık (etkilenen bölge > 5 mm).</li>
	<li>TNBS ile tedavi edilen sıçanlardan sırasıyla P bölgesinden (inflamasyon bölgesinin oral marjından 2-3 cm önceki kısım), bölge I'den (inflamasyon bölgesi, tipik olarak TNBS'nin aşılandığı kolonun ucundan 4-6 cm) ve D bölgesinden (inflamasyon bölgesinin aboral marjına 1-2 cm distal kısım) kolon dokusu örnekleri toplayın. NOT: Her segmentten ~1-2 cm uzunluğunda kolon dokusu alındı. Ayrıca salin ile tedavi edilen sıçanların 2 cm uzunluğundaki (kolonun ucundan ~4-6 cm) kolon dokuları sahte kontrol (S) olarak alınmıştır (Şekil 1).</li>
	<li>Tam kalınlıkta preparasyon için her bölgeden doku örnekleri alın ve istenirse sırasıyla mukoza / submukoza ve muscularis eksterna katmanları ve21,22.</li>
	<li>Doku örneklerini bir yıla kadar ve gelecekteki amaçlar için (yani, RNA preparatları) depolamak için -80 ° C'de saklamadan önce sıvı azotta dondurun.</li>
</ol>3. Bağırsak iltihabı ve fibrozisin histopatolojik değerlendirmesi
<ol><li>Tam kalınlıktaki kolon dokularını 48 saat boyunca% 10 formalin içinde sabitleyin, ardından 24-48 saat boyunca% 70 etanol'e aktarın.</li>
	<li>Hematoksilin ve eozin (H & E) ve Masson'un Trikrom boyaları 6,19,23 için sırasıyla 5 μm kalınlığında parafin kesitlerini kesmek için bir mikrotom kullanın (bkz.</li>
	<li>Uyumlu yazılıma sahip yüksek çözünürlüklü bir kamerayla donatılmış dik bir mikroskopla görüntüleri elde edin ve görüntüleyin (bkz.</li>
	<li>Dereceli inflamasyon ve fibrozis indeksleri, daha önce tarif edilen kriterlere göre bir gastrointestinal cerrahi patolog da dahil olmak üzere iki bağımsız araştırmacı tarafından 6,23 modifikasyonlarla birlikte. Puanlar için Ek Dosya 1'e bakın.</li>
	<li>Her H&E boyalı numunenin dört görünümünde kesit başına dairesel ve uzunlamasına kas katmanlarının kalınlığını ve hücre numaralarını ölçün ve her örnek için dört ölçümün ortalamasını alın.</li>
</ol>4. RNA ekstraksiyonu ve kantitatif RT-PCR
<ol><li>Sahte kontrolden ve TNBS kolit sıçanlarının üç bölgesinden (P, I, D) elde edilen eksize kolon dokularını, bir RNA ekstraksiyon kitinin ekstraksiyon reaktifinde homojenize edin (bakınız Malzeme Tablosu).</li>
	<li>Kiti kullanarak RNA'yı her numuneden izole edin. RNA peletini 30 μL RNaz içermeyen suda süzün.</li>
	<li>RNA konsantrasyonunu ölçün ve bir mikro hacimli UV-Vis spektrofotometresi kullanarak saflığı kontrol edin (bkz.</li>
	<li>RNA sentez kitini kullanarak cDNA21,22'yi sentezlemek için 1 μg toplam RNA kullanın (bkz.</li>
	<li>Gerçek zamanlı PCR sistemi için ticari bir PCR kiti kullanarak şablon olarak 50 ng cDNA, IL-6 probları ve CTGF ile gerçek zamanlı PCR gerçekleştirerek gen ekspresyon seviyelerini analiz edin ve ölçün (bkz.</li>
	<li>Örnekleri normalleştirmek ve elde edilen Cq değerlerini kullanarak göreceli gen ekspresyonunu ölçmek için kontrol geni 18S rRNA'yı kullanın.</li>
</ol>5. İstatistiksel analiz
<ol><li>Sahte kontrol ve TNBS kolit sıçanlarını karşılaştırmak için istatistiksel analiz yazılımını kullanın (bakınız Malzeme Tablosu).</li>
	<li>0.05 < p değerinin istatistiksel olarak anlamlı15,19 olduğunu düşünün.</li>
	<li>İki grup arasındaki farkları test etmek için, Student'ın t-testi analizini kullanın ve karşılaştırmalar ikiden fazla grup15,19 ise bir ANOVA testi yapın.</li>
</ol>

<ol><li>Kappelman, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+and+geographic+distribution+of+Crohn%27s+disease+and+ulcerative+colitis+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The prevalence and geographic distribution of Crohn's disease and ulcerative colitis in the United States.</a> Clinical Gastroenterology and Hepatology. 5 (12), 1424-1429 (2007).</li>
<li>Hwang, J. M., Varma, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgery+for+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Surgery for inflammatory bowel disease.</a> World Journal of Gastroenterology. 14 (17), 2678-2690 (2008).</li>
<li>Latella, G., Rieder, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+fibrosis%3A+Ready+to+be+reversed%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Intestinal fibrosis: Ready to be reversed.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 33 (4), 239-245 (2017).</li>
<li>Rieder, F., Fiocchi, C., Rogler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms%2C+management%2C+and+treatment+of+fibrosis+in+patients+with+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms, management, and treatment of fibrosis in patients with inflammatory bowel diseases.</a> Gastroenterology. 152 (2), 340-350 (2017).</li>
<li>Bettenworth, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Crohn%27s+disease-associated+small+bowel+strictures+and+fibrosis+on+cross-sectional+imaging%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Assessment of Crohn's disease-associated small bowel strictures and fibrosis on cross-sectional imaging: A systematic review.</a> Gut. 68 (6), 1115-1126 (2019).</li>
<li>Chen, W., Lu, C., Hirota, C., Iacucci, M., Ghosh, S., Gui, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+hyperplasia%2Fhypertrophy+is+the+most+prominent+histological+change+in+Crohn%27s+fibrostenosing+bowel+strictures%3A+A+semiquantitative+analysis+by+using+a+novel+histological+grading+scheme%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Crohn%27s+and+Colitis%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle hyperplasia/hypertrophy is the most prominent histological change in Crohn's fibrostenosing bowel strictures: A semiquantitative analysis by using a novel histological grading scheme.</a> Journal of Crohn's and Colitis. 11 (1), 92-104 (2017).</li>
<li>Olaison, G., Smedh, K., Sjödahl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+course+of+Crohn%27s+disease+after+ileocolic+resection%3A+Endoscopically+visualised+ileal+ulcers+preceding+symptoms%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Natural course of Crohn's disease after ileocolic resection: Endoscopically visualised ileal ulcers preceding symptoms.</a> Gut. 33 (3), 331-335 (1992).</li>
<li>Lin, Y. M., Li, F., Shi, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress+is+a+pro-inflammatory+stimulus+in+the+gut%3A+In+vitro%2C+in+vivo+and+ex+vivo+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress is a pro-inflammatory stimulus in the gut: In vitro, in vivo and ex vivo evidence.</a> PLoS One. 9, 106242(2014).</li>
<li>Gabella, G., Yamey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+collagen+by+smooth+muscle+in+the+hyertrophic+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Synthesis of collagen by smooth muscle in the hyertrophic intestine.</a> Experimental Physiology. 62 (3), 257-264 (1977).</li>
<li>Katsanos, K. H., Tsianos, V. E., Maliouki, M., Adamidi, M., Vagias, I., Tsianos, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obstruction+and+pseudo-obstruction+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Obstruction and pseudo-obstruction in inflammatory bowel disease.</a> Annals of Gastroenterology. 23 (4), 243-256 (2010).</li>
<li>Johnson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+stiffness+corresponding+to+strictured+bowel+induces+a+fibrogenic+response+in+human+colonic+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Disease%22%5BJournal%5D)">Matrix stiffness corresponding to strictured bowel induces a fibrogenic response in human colonic fibroblasts.</a> Inflammatory Bowel Disease. 19 (5), 891-903 (2013).</li>
<li>Gayer, C. P., Basson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+mechanical+forces+on+intestinal+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signalling%22%5BJournal%5D)">The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology.</a> Cell Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).</li>
<li>Cox, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertonic+saline+modulation+of+intestinal+tissue+stress+and+fluid+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Hypertonic saline modulation of intestinal tissue stress and fluid balance.</a> Shock. 29 (5), 598-602 (2008).</li>
<li>Shi, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+gene+expression+in+gut+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of gene expression in gut smooth muscle cells.</a> Frontiers in Physiology. 8, 1000(2017).</li>
<li>Shi, X. Z., Lin, Y. M., Powell, D. W., Sarna, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+motility+dysfunction+in+bowel+obstruction%3A+Role+of+stretch-induced+COX-2%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of motility dysfunction in bowel obstruction: Role of stretch-induced COX-2.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 99-108 (2011).</li>
<li>Gutierrez, J. A., Perr, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stretch+modulates+TGF-beta1+and+alpha1%28I%29+collagen+expression+in+fetal+human+intestinal+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanical stretch modulates TGF-beta1 and alpha1(I) collagen expression in fetal human intestinal smooth muscle cells.</a> American Journal of Physiology. 277 (5), 1074-1080 (1999).</li>
<li>Lipson, K. E., Wong, C., Teng, Y., Spong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTGF+is+a+central+mediator+of+tissue+remodeling+and+fibrosis+and+its+inhibition+can+reverse+the+process+of+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Fibrogenesis+Tissue+Repair%22%5BJournal%5D)">CTGF is a central mediator of tissue remodeling and fibrosis and its inhibition can reverse the process of fibrosis.</a> Fibrogenesis Tissue Repair. 5, Supp 1 24(2012).</li>
<li>Chaqour, B., Goppelt-Struebe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+the+Cyr61%2FCCN1+and+CTGF%2FCCN2+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of the Cyr61/CCN1 and CTGF/CCN2 proteins.</a> The FEBS Journal. 273 (16), 3639-3649 (2006).</li>
<li>Shi, X. Z., Winston, J. H., Sarna, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+immune+and+genetic+responses+in+rat+models+of+Crohn%27s+colitis+and+ulcerative+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver%22%5BJournal%5D)">Differential immune and genetic responses in rat models of Crohn's colitis and ulcerative colitis.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 41-51 (2011).</li>
<li>Antoniou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TNBS-induced+colitis+animal+model%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Medicine+and+Surgery+%28London%29%22%5BJournal%5D)">The TNBS-induced colitis animal model: An overview.</a> Annals of Medicine and Surgery (London). 11, 9-15 (2016).</li>
<li>Shi, X. Z., Sarna, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+of+Cav1.2+channel+with+VIP+and+VIP+receptor+agonists+and+antagonists%3A+A+novel+approach+to+designing+promotility+and+antimotility+agents%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver%22%5BJournal%5D)">Gene therapy of Cav1.2 channel with VIP and VIP receptor agonists and antagonists: A novel approach to designing promotility and antimotility agents.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 295 (1), 187-196 (2008).</li>
<li>Lin, Y. M., Sarna, S. K., Shi, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prophylactic+and+therapeutic+benefits+of+COX-2+inhibitor+on+motility+dysfunction+in+bowel+obstruction%3A+Roles+of+PGE2+and+EP+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver%22%5BJournal%5D)">Prophylactic and therapeutic benefits of COX-2 inhibitor on motility dysfunction in bowel obstruction: Roles of PGE2 and EP receptors.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 302 (2), 267-275 (2012).</li>
<li>Morris, G. P., Beck, P. L., Herridge, M. S., Depew, W. T., Szewczuk, M. R., Wallace, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hapten-induced+model+of+chronic+inflammation+and+ulceration+in+the+rat+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon.</a> Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).</li>
<li>Mudter, J., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Il-6+signaling+in+inflammatory+bowel+disease%3A+Pathophysiological+role+and+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Disease%22%5BJournal%5D)">Il-6 signaling in inflammatory bowel disease: Pathophysiological role and clinical relevance.</a> Inflammatory Bowel Disease. 13 (8), 1016-1023 (2007).</li>
<li>Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K., Shi, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+mechano-transcription+process+as+therapeutic+intervention+in+gastrointestinal+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Targeting mechano-transcription process as therapeutic intervention in gastrointestinal disorders.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 809350(2021).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını ve açıklayacak hiçbir şeyleri olmadığını bildirmektedir.

TNBS kaynaklı kolit 1989 yılında tanıtıldı ve o zamandan beri Crohn hastalığının deneysel bir modeli olarak kullanıldı 19,20,23. Kemirgenlerde bu modelin önemli özellikleri, insan Crohn hastalığında geliştirilen histopatolojik lezyonlara çok benzeyen bir transmural inflamasyonun gelişmesini içerir19,20. Model üzerinde yapılan önceki çalışmalar, esas olarak görünür inflam...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63499">A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn&#39;s Disease</a>. The Introduction and Protocol were updated.
The first sentence of the Introduction was updated from:
Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn&#39;s disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,00,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.
to:
Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn&#39;s disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,000,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.
Step 1.3 in the Protocol was updated from:
Prepare fresh TNBS solution according to body weights. 
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 &#181;L of 40% ethanol was used.
to:
Prepare fresh TNBS solution according to body weights. 
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 &#181;L of 40% ethanol/saline was used.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63499">A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn&#39;s Disease</a>. The Introduction and Protocol were updated.

Erratum: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease

Ülseratif kolit (UC) ve Crohn hastalığı (CD) dahil olmak üzere inflamatuar barsak hastalığı (IBD), gastrointestinal (GI) sistemde kronik inflamasyon ile karakterizedir. ~ 1-2 milyon Amerikalıyı etkiler1. ABD'de IBD bakımı için tahmini yıllık maliyetler 11,8 milyar dolardır. UC'den farklı olarak, CD transmural inflamasyon ve striktür oluşumu 2,3 ile karakterizedir. Darlık oluşumu (darlık) ÇH hastalarının %70'inde görülür 3 ve transmural inflamasyondan (inflamatuar stenoz) veya intestinalfibrozdan (fibrotik stenoz) kaynaklanabilir4,5. İntestinal fibrozis, aşırı kollajen birikimi ve proseste yer alan ana mezenkimal hücre tiplerinden biri olarak düz kas hücreleri (SMC) ile diğer hücre dışı matrisler (ECM) ile karakterizedir 3,4. Hipertrofi ile ilişkili düz kas hiperplazisi, CD6'da fibrotik stenozda bir diğer önemli histolojik değişikliktir. ÇH'de darlık oluşumu kronik inflamasyon ile ilişkili olmasına rağmen, cerrahi tedavi dışında hiçbir antienflamatuar tedavi etkili değildir 2,6. Ancak ameliyat sonrası nüksler yeterli süre verildiğinde neredeyse %100'dür 2,7. Enflamatuar bir yanıt olarak, fibroz ve SMC hiperplazisi bağırsakta enflamatuar olmayan durumlarda (yani bağırsak tıkanıklığı) da gelişebilir 8,9; striktür oluşumunda hem inflamasyona bağımlı hem de bağımsız mekanizmaların rol oynadığı düşünülmektedir 3,4. Enflamasyona bağımlı mekanizmalara yönelik kapsamlı araştırmaların striktür oluşumu için etkili bir tedaviye dönüşmediği göz önüne alındığında, bağırsak fibrozisinde inflamasyondan bağımsız mekanizmaların olası rolüne ilişkin çalışmalara ihtiyaç vardır.
Non-inflamatuar bir faktör olarak ödem, inflamatuar hücre infiltrasyonu, doku deformasyonu, fibrozis ve darlık ile ilişkili mekanik stres (MS)10,11,12,13 İBH'de, özellikle transmural inflamasyon ile karakterize ÇH'de sık rastlanmaktadır. Mekanik stres en çok inflamasyon bölgesindeki darlığın (inflamatuar veya fibrotik) lokal dokuda mekanik stres oluşturduğu ve obstrüksiyon bölgesine yakın segmentte lümen distansiyonuna yol açtığı stenotik CD'de dikkat çekicidir10,14. Önceki in vitro çalışmalar, mekanik stresin gastrointestinal dokularda, özellikle bağırsak düz kas hücrelerinde (SMC) spesifik inflamatuar mediatörlerin (yani, COX-2, IL-6) 8,14,15 ve büyüme faktörlerinin (yani TGF-β) gen ekspresyonunu değiştirdiğini göstermiştir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar ayrıca, bağ dokusu büyüme faktörü (CTGF) gibi spesifik pro-fibrotik mediatörlerin ekspresyonunun mekanik strese karşı oldukça duyarlı olduğunu bulmuştur17,18. Mekanik stresin CD ile ilişkili inflamasyon, fibroz ve doku yeniden şekillenmesinde bağımsız bir patojenik rol oynayabileceği varsayılmıştır. Bununla birlikte, bağırsak iltihabı, fibroz ve CD'deki düz kas hiperplazisinde mekanik stresin patojenik önemi büyük ölçüde keşfedilmemiştir. Bunun nedeni kısmen inflamasyonun mekanik stresten daha görünür ve daha iyi çalışılmış bir süreç olması olabilir. Daha da önemlisi, mekanik stresin etkisini inflamasyonunkinden ayırt etmek için iyi tanımlanmış bir hayvan modeli yoktur.
Mevcut çalışma, CD'deki mekanik stresin rolünü incelemek amacıyla hizmet edebilecek hapten reaktifi 2,4,6-trinitrobenzen sülfonik asit (TNBS)19,20'nin intrakolonik enjeksiyonu ile indüklenen Crohn benzeri kolitin kemirgen modelini tanımlamaktadır. TNBS instilasyonunun distal kolonda lümen daralması (darlık) ile lokalize (~2 cm uzunluğunda) transmural inflamasyona neden olduğu bulundu. Darlık, belirgin barsak distansiyonuna (mekanik stres) yol açar14,15 ancak damlatma bölgesine proksimal kolon segmentinde gözle görülmeyen inflamasyona yol açar. Aksine, darlık bölgesine distal olan kolon segmenti ne inflamasyon ne de mekanik stres göstermez. Üç farklı bölgede gen ekspresyonu, inflamasyon, fibroz ve SMC hiperplazisinde bölgeye özgü önemli değişiklikler gözlendi. Sonuçlar, mekanik stresin, özellikle mekanik strese bağlı gen ekspresyonunun, Crohn kolitinde fibroz ve hiperplazi gelişiminde kritik bir rol oynayabileceğini düşündürmektedir.

<table><tbody><tr><td>ACT-1 Kontrol Yazılımı Ver2.63</td><td>Nikon</td><td>DXM1200F</td><td></td></tr><tr><td>C1000 96 Kuyulu Hızlı Reaksiyon Modüllü Dokunmatik Termal Döngüleyici</td> Gerçek Zamanlı PCR Sistemleri için <td>BIO-RAD</td><td>1851196</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Optik Reaksiyon Modülü</td><td>BIO-RAD</td><td>1845097</td><td></td></tr><tr><td>Dako Agilent Artisan Link Pro Özel boyayıcı</td><td>Dako</td><td>AR310</td><td></td></tr><tr><td>Dako-Agilent Masson's Trikrom Kiti ref# AR173</td><td>Dako</td><td>AR173</td><td></td></tr><tr><td>DXM1200 Dijital Renkli HR Kamera</td><td>Nikon</td><td>DXM1200</td><td></td></tr><tr><td>Ökaryotik 18S rRNA Endojen Kontrol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4352930E</td><td></td></tr><tr><td>EZ Anestezi</td><td>EZ Sistemleri A.Ş.</td><td>EZ-155</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 9</td><td>GraphPad</td><td>9.0.2 (161)</td><td></td></tr><tr><td>Sert Kabuklu 96 Kuyulu PCR Plakaları, düşük profilli, ince duvarlı, etekli, beyaz/şeffaf</td><td>BIO-RAD</td><td>HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Corning Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi, 1x kalsiyum ve magnezyum içermez)</td><td>CORNING</td><td>21-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>HM 325</td><td>Mikrotom Termo Bilimsel</td><td>23-900-667</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-017-10</td><td></td></tr><tr><td>LI-COR Odyssey Dijital Görüntüleme Sistemi</td><td>LI-COR</td><td>9120</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler epGradient Kontrol Panelli Termal Döngüleyici 5340 Termal Döngüleyici</td><td>Eppendorf</td><td>5341</td><td></td></tr><tr><td>Tıbbi sınıf açık uçlu poliüretan kateter</td><td>Covidien</td><td>8890703013</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c Spektrofotometreler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND2000CLAPTOP</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse E800 Dik Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>E800</td><td></td></tr><tr><td>Nitroselüloz/Filtre Kağıdı Sandviçler 50, 0.45 & mu; m, 7 x 8,5 cm</td><td>BIO-RAD</td><td>1620215</td><td></td></tr><tr><td>Polietilen Glikol 3350, Ozmotik Müshil</td><td>Miralax</td><td>C8175</td><td>Doz: 226 mL su içinde 17g</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit (250) 250 RNeasy Mini Spin Kolonları, Toplama Tüpleri (1,5 mL ve 2 mL), RNaz İçermeyen Reaktifler ve Tamponlar</td><td>QIAGEN</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Birinci İplikli Sentez Sistemi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>CTGF Probu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Rn00573960_g1</td> TaqMan Gen Ekspresyon Testleri 4331182 <td></td></tr><tr><td>TaqMan Gen Ekspresyon Testleri Rn99999011_m1 IL6 Probu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4444557</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Prisma H& E Leke Seti #1</td><td>Sakura</td><td>6190</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Prizma Plus Otomatik Slayt Boyayıcı</td><td>Sakura</td><td>6171</td><td></td></tr><tr><td>TNBS (Pikrilsülfonik asit çözeltisi)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>92822</td><td></td></tr></tbody></table>

crohn hastalığında mekanik stresin patojenik rolünü İncelemek için tnbs kaynaklı bir kemirgen modeli

A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease

Crohn hastalığı (CD) gibi inflamatuar bağırsak hastalıkları (IBD), Avrupa ve ABD'de 1.00.000'de yaklaşık 20'yi etkileyen gastrointestinal sistemin kronik enflamatuar hastalıklarıdır. ÇH transmural inflamasyon, intestinal fibroz ve luminal stenoz ile karakterizedir. Anti-inflamatuar tedaviler inflamasyonu kontrol etmeye yardımcı olsa da, CD'de fibroz ve darlık üzerinde hiçbir etkinliği yoktur. ÇH'nin patogenezi tam olarak anlaşılamamıştır. Mevcut çalışmalar esas olarak düzensiz bağırsak immün yanıt mekanizmalarını tanımlamaya odaklanmaktadır. CD ile ilişkili transmural inflamasyon, intestinal fibroz ve luminal stenozun hepsi bağırsak duvarına mekanik stresi temsil ederken, mekanik stresin CD'deki rolü iyi tanımlanmamıştır. Mekanik stresin CD'de bağımsız bir patojenik rol oynayıp oynamadığını belirlemek için, kemirgenlerde TNBS kaynaklı CD benzeri kolit modelinin bir protokolü geliştirilmiştir. TNBS ile indüklenen bu transmural inflamasyon ve fibroz modeli, kolondaki ÇH'nin patolojik özelliklerine benzemektedir. TNBS'nin yetişkin Sprague-Dawley sıçanlarının distal kolonuna intrakolonik damlatılması ile indüklenir. Bu modelde transmural inflamasyon TNBS damlatma bölgesinde darlığa yol açar (Site I). Mekanik distansiyon, damlatma bölgesine (Site P) proksimal kısımda gözlenir, mekanik stresi temsil eder, ancak görünür inflamasyonu temsil etmez. Enflamasyona distal kolonik kısım (Site D) ne inflamasyon ne de mekanik stres göstermez. Farklı bölgelerde (P, I ve D) gen ekspresyonu, immün yanıt, fibroz ve düz kas büyümesinde belirgin değişiklikler gözlendi ve mekanik stresin derin bir etkisi vurgulandı. Bu nedenle, bu CD benzeri kolit modeli, CD'nin patojenik mekanizmalarını, özellikle mekanik stresin ve mekanik strese bağlı gen ekspresyonunun immün disregülasyon, bağırsak fibrozu ve CD'deki doku yeniden şekillenmesindeki rolünü daha iyi anlamamıza yardımcı olacaktır.

TNBS'nin intrakolonik instilasyonu ile indüklenen Crohn benzeri kolitin makroskopik görünümü Şekil 1'de gösterildiği gibi, sıçanlarda TNBS'nin intrakolonik damlatılması, distal kolonda damlatma bölgesinde kalınlaşmış bağırsak duvarı ve daralmış lümen (stenoz) ile lokalize bir transmural inflamasyona (~ 2 cm uzunluğunda) neden olmuştur (Şekil 1A). TNBS damlatma yeri site I olarak adlandırılır. Transmural inflamasyon ve darlığın bir sonucu olar...

Mevcut protokol, kemirgenlerde Crohn benzeri bir kolit modelinin gelişimini açıklamaktadır. Transmural inflamasyon TNBS damlatma bölgesinde darlığa yol açar ve darlığa yakın segmentte mekanik genişleme gözlenir. Bu değişiklikler kolitte mekanik stresin incelenmesine izin verir.

Crohn Hastalığında Mekanik Stresin Patojenik Rolünü İncelemek için TNBS Kaynaklı Bir Kemirgen Modeli

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn&#39;s disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting ...

Bu nedenle protokolümüzde, TNBS'nin intrakolonik instilasyonu, damlatma bölgesinde transmural inflamasyona ve inflamasyona yakın segmentte mekanik distansiyona yol açmaktadır. Yani bu stenotik Crohn hastalığını taklit eder. Proksimal segment mekanik olarak şişkin olduğu ancak görünür bir inflamasyon göstermediği için, proksimal segmentin ve inflamasyon bölgesinin karşılaştırmalı bir çalışması, mekanik stresin Crohn kolitinde rol oynayıp oynamadığını belirlemeye yardımcı olur.Önceki çalışmalar sadece inflamasyon bölgesine odaklanmaktadır. Modeldeki farklı bölgelerde çalışan protokolümüz, Crohn hastalığında, özellikle stenotik Crohn hastalığında mekanik stresin kritik bir rolünü vurgulamaktadır. Başlamak için, sıçanları anestezi masasına sırtüstü pozisyonda yerleştirin.Koliti indüklemek için, anal vergeden yaklaşık yedi ila sekiz santimetre boyunca anüs boyunca tıbbi dereceli, açık uçlu, poliüretan bir kateter yerleştirin ve TNBS'yi kolona nazikçe aşılayın. Sahte kontrol sıçanlarını 250 mikrolitre salin ile uygulayın. TNBS veya salinin dağılımına yardımcı olmak ve dökülmeleri önlemek için, sıçanları başları aşağı bakacak şekilde yaklaşık 30 derecelik bir açıyla sırtüstü pozisyonda tutun ve anüs iki dakika boyunca kapalı tutun.Cerrahi sınıf makas ve forseps kullanarak sıçan karnını açın. Anal kanalın üzerindeki tüm kolonu dikkatlice çıkarın ve kolonu hemen buz gibi soğuk 1x HBSS tamponuna aktarın. Arabellekteki iki noktayı düzeltin ve bir cetvel kullanarak iki nokta üst üste uzunluğunu ölçün.Naylon bir iplik alın ve kontroldeki kolon segmentlerinin ve TNBS ile tedavi edilen sıçanların dış çevresini ölçmek için kolonun etrafında daire içine alın. Histoloji için tam kalınlıkta dokular alın. Kolonu mezenterik tahta boyunca kesin ve kolonu HBSS tamponu ile iyice temizleyin.Makroskopik inflamasyon skoru için kolonu, minimum modifikasyonlarla önceden tanımlanmış kriterlere göre değerlendirin. TNBS ile tedavi edilen sıçanlardan P, I ve D.Site P bölgelerindeki kolonik doku örneklerini toplayın, iltihaplanma bölgesinin oral marjından iki ila üç santimetre önceki kısımdır. Site I, TNBS'nin aşılandığı iltihaplanma bölgesidir, tipik olarak kolonun ucundan dört ila altı santimetre uzaklıktadır.Son olarak, D bölgesi, inflamasyon bölgesinin aboral marjına bir ila iki santimetre distal olan kısımdır. Sıçanlarda TNBS'nin intrakolonik instilasyonu, kalınlaşmış bağırsak duvarı ve distal kolonda damlatma bölgesinde daralmış lümen ile yaklaşık iki santimetre uzunluğunda lokalize bir transmural inflamasyona neden oldu. TNBS damlatma bölgesi bölge I.As transmural inflamasyon ve darlık sonucu bölge I olarak adlandırıldı, hem inflamasyon hem de mekanik stres vardı I. Bölgedeki darlık, TNBS damlatma bölgesine yakın segmentte belirgin lümen distansiyonuna yol açtı, site P ve I'de kolon çevresi ssahte kontrol kolonuna kıyasla anlamlı olarak artmıştır.Mekanik olarak şişkin olmasına rağmen, P bölgesi görünür inflamasyon göstermedi. Aksine, D bölgesi olarak adlandırılan TNBS instilasyonuna distal kolonik segment ne inflamasyon ne de mekanik distansiyon göstermedi. TNBS ile tedavi edilen sıçanlarda Alan I'deki makroskopik inflamasyon skoru, kolit sıçanlarının P ve D bölgelerindeki sahte kontrollere kıyasla çarpıcı bir şekilde artmıştır.P ve D bölgelerindeki inflamasyon skorları sahte ile karşılaştırıldığında anlamlı olarak artmadı. Bu nedenle, modelde sadece site I değil, aynı zamanda P ve D bölgelerini incelemek önemlidir, çünkü bu, Crohn hastalığında mekanik stresin patojenik önemini tanımaya yardımcı olur. Mekanik stresin bağırsak iltihabında patojenik bir faktör olup olmadığını daha da belirlemek için, hayvanları yalnızca sıvı diyetle besleyerek mekanik distansiyonu serbest bırakmaya çalışabilir ve bunun iltihaplanma ve bağırsak fonksiyonuna yardımcı olup olmadığını görebilir.

a-tnbs-induced-rodent-model-to-study-pathogenic-role-mechanical

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Içme suyu uygulanan dekstran sülfat sodyum (DSS), akut kolit kurulmuş bir fare inflamatuar yaralanma modeli. Bu protokol, DSS tedavi ve dokuların hazırlanması için yöntemi özetlemektedir.

Dekstran Sülfat Sodyum (DSS) kullanarak murin Kolit Modelleme

Citrobacter rodentium enfeksiyonu enterik bakteriyel enfeksiyonlar çalışma yanı sıra farelerde bağışıklık yanıtları ve kolit barındırmak için değerli bir model sunar. Bu protokol bariyer bütünlüğünü, patojen yük ve murin infeksiyöz kolit patojen ve konak katkıların tam karakterizasyonu izin histolojik hasar ölçümü özetliyor.

<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Mouse Model: Bulaşıcı Kolit için çalışılması Patojen ve Host Katılımlar

DNBS / TNBS indüksiyonlu kolit bir alternatif ve iltihabik barsak hastalığı patobiyolojisini incelemek için pahalı olmayan yöntemi sunmaktadır. Bu yazıda tartışılan protokolü farelerde ve sıçanlarda kolit başlatmak için DNBS başarılı uygulama özetliyor ve bir iyice konak-aracılı bağırsak yanıtları çalışma sağlar.

DNBS / TNBS kolit Modelleri: Koliti içine Trendleri ve Diyet Yağ Etkileri sağlanması

Hayvan modelleri kronik inflamasyon gelişimine katkıda konak ve patojen spesifik mekanizmaları tanımlarken paha biçilmez araçlardır olduğu kanıtlanmıştır. Burada, lokal ve sistemik inflamasyon bölgelerinde ilerlemesini değerlendirmek için insan patojeni Porphyromonas gingivalis ve detay metodolojileri ile ağızdan enfeksiyondan bir fare modeli tarif eder.

Lokal ve sistemik Yer de patojen kaynaklı kronik enflamasyon Fare Modeli

Burada, sinjeneik CD4 + CD45RByüksek T hücrelerinin T ve B hücresi eksikliği olan alıcılara evlat edinici transferi yoluyla farelerde kolon iltihabını indüklemek için bir protokol sunuyoruz. Klinik ve histopatolojik özellikleri insan inflamatuar barsak hastalıklarını taklit eder. Bu yöntem, kolon iltihabının başlaması ve hastalığın ilerlemesinin incelenmesine izin verir.

Efektör CD4 Evlatlık transferi ile Kemirgen Bağırsak Enflamasyon indüksiyonu<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Yüksek</sup&gt; Bağışık yetmezliği olan farelere içine T Hücreleri

Bu çalışmada, Crohn fibrozisi ile karşılaştırılabilir patofizyoloji sergileyen TNBS aracılı intestinal fibrozisin ayrıntılı bir prosedürünü açıklıyoruz. Biz de rapamisin bağırsak fibrozis üzerinde inhibitör etkileri kolaylaştırılan ışığında bu yaklaşımı tartışmak.

TNBS Aracılı Intestinal Fibrozis Gelişimi ve Rapamisin Inhibitör Etkilerinin Değerlendirilmesi Üzerine Mekanistik Bakış

Bu protokol, transmural inflamasyon ve fibrozis de dahil olmak üzere Crohn hastalığının önemli patolojik işaretleri benzer Salmonella tahrikli bağırsak fibrozis bir fare modeli açıklar. Bu yöntem, C57Bl/6 genetik arka planda tutulan mutant fareler kullanılarak fibrotik sonuçları değiştiren konak faktörlerinin değerlendirilmesi için kullanılabilir.

Kronik Salmonella EnfeksiyonuNa Bağlı Bağırsak Fibrozisi

Protokol, Crohn hastalığının tam doğrulanmış TNBS kaynaklı murine modelini ve parafine gömülü formalin-sabit kolon bölümlerinin immünororesansını kullanarak immünohistokimya ile östrojen reseptörlerinin görüntülenmesi için kullanılan yöntemleri sunar.

İmmünofluoresans kullanarak TNBS'ye Bağlı Crohn Hastalığı olan Farelerin Kolonlarında Östrojen Reseptörlerinin Görüntülenmesi

Bu protokolde bağırsak mikrobiyota antijenine özgü T hücreli benimseyen transfer kolit modeli tanımlanmıştır. CD4+ T hücreleri CBir1 TCR transgenik farelerden izole edilmiştir. Bunlar, alıcı Rag1/- farelere aktarılan ve bağırsak iltihabına yol açan immünodominant bağırsak mikrobiyota antijeni CBir1 flagellin için özeldir.

CBir1 TCR Transgenik CD4+ T Hücrelerinin İmmün Yetmezlikçi Farelere Benimsenen Transferi ile Bağırsak İltihabının İndüksiyonu

Bu protokol, bir sıçan poşit modeli oluşturma yöntemini açıklar. İleal poş modeli, mikrocerrahi teknikler kullanılarak ileal poş-anal anastomoz (IPAA) ameliyatı yapılarak oluşturuldu. Ameliyattan sonra, sıçan 4 gün boyunca% 4 dekstran sülfat sodyum (DSS) ile tedavi edildi.

Dekstran sülfat sodyum kullanılarak proktokolektomi ve ileal poş-anal anastomoz sonrası bir sıçan kroşe modeli

Bu protokol, Crohn hastalığı (CD) benzeri ileal inflamasyon ve fibrozun Src homoloji 2 alanı içeren 5'-inositol fosfataz (SHIP) eksikliği olan fare modelinin, CD için yeni terapötikleri test etmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Crohn Hastalığı Benzeri İleit ve Fibrozisin SHIP Eksikliği Olan Fare Modelinde Terapötik Müdahalelerin Değerlendirilmesi

Keşfedin, Crohn hastalığında mekanik stresin patojenik rolünü incelemek için TNBS kaynaklı bir kemirgen modeli kullanarak transmural kolit geliştirme protokolünü. Bu yöntem, stenotik koşullarda mekanik değişiklikleri araştırmaya yardımcı olur.

Crohn Hastalığında Mekanik Stresin Patojenik Rolünü İncelemek için TNBS Kaynaklı Bir Kemirgen Modeli

Daha fazla video keşfet