Histon Düzeneğinin Moleküler Mekanizmasının DNA Perde Tekniği ile Deşifre Edilmesi
9 Mart 2022
Yüksek verimli tek moleküllü bir görüntüleme tekniği olan DNA perdesi, çeşitli protein-DNA etkileşimlerinin gerçek zamanlı görselleştirilmesi için bir platform sağlar. Mevcut protokol, bir Schizosaccharomyces pombe bromodomain içeren AAA+ ATPaz olan Abo1'in biyolojik rolünü ve moleküler mekanizmasını araştırmak için DNA perdesi tekniğini kullanmaktadır.
Bu protokol, kromatin dinamiklerini incelemek, özellikle histon şaperonlarının moleküler fonksiyonunu araştırmak için DNA perdesi tekniğinin nasıl kullanıldığını gösterir. Yüksek verimli tek moleküllü görüntüleme tekniği DNA perdesi, toplu deneylerin sınırlamalarının üstesinden gelir ve Gerçek Zamanlı görüntülemeyi kolaylaştırarak Biyomolekül etkileşimlerinin ayrıntılı karakterizasyonunu sağlar. Çift taraflı bandın ortasına 5 x 35 milimetre boyutlarında temiz bir kağıt koyun.
İki deliği ve nano desenleri kağıtla kapatmak için bandı slaydın üzerine yapıştırın. Ardından temiz bir bıçak kullanarak kağıdı kesin. Çift taraflı bandın üzerine bir cam kapak kılıfı koyun ve mikroakışkan bir oda oluşturmak için bir pipet ucu kullanarak kapak fişini ovalayın.
Birleştirilmiş akış hücresini iki mikroskop lamı arasına yerleştirin ve klipsleyin. Akış hücresini 120 santigrat derece vakumlu fırında 45 dakika pişirin. Çip bazlı analiz için sıvı konektörünü sıcak tutkal tabancası kullanarak her açık deliğe takın.
Ve iki sıra yem kilit borusunu bağlayın. Üç mililitre deiyonize su içeren bir yem kilitli şırınga bağlayın ve hazneyi yıkayın. Hazneyi damla damla bağlantı yoluyla üç mililitre lipit tamponu ile tekrar yıkayın.
Lipid tamponunda bir mililitre 0.04x biyotinillenmiş lipidi, atış başına beş dakikalık bir inkübasyonla iki atışta odaya enjekte edin. Bir mililitre BSA'da mililitre başına 0.025 miligram streptavidin enjekte edin, iki atış ve atış başına 10 dakikalık bir inkübasyon. Bir mililitre BSA tamponunda yaklaşık 30 pikomolar biyotinillenmiş lambda faj DNA'sını, iki atış ve atış başına 10 dakikalık inkübasyonlarla odaya enjekte edin.
10 mililitre görüntüleme tamponu içeren bir şırıngayı bir şırınga pompasına bağlayın ve mikroakışkan sistemdeki tüm boru hatlarındaki kabarcıkları çıkarın. Akış hücresine kabarcık enjeksiyonunu önlemek için hazırlanan akış hücresini damladan damlaya bağlantı yoluyla mikroakışkan sistemle birleştirin. Akış hücresini ve akış hücresi tutucularını birleştirin ve düzeneği özel olarak yapılmış, toplam yansıma floresan mikroskobuna monte edin.
Lambda DNA moleküllerini boyamak için 100 mikrolitre numune döngüsünden görüntüleme tamponuna 200 mikrolitre YOYO-1 boyası enjekte edin. Görüntüleme yazılımını çalıştırın ve DNA perdelerinin iyi biçimlendirilip biçimlendirilmediğini kontrol etmek için 488 nanometre lazeri açın. YOYO-1 boyası çıkarıldıktan sonra, önceden inkübe edilmiş protein örneğini enjekte edin.
Proteinler DNA perdesine ulaştığında, şırınga pompasını kapatın, kapatma valfini kapatın ve Abo1 ile histon yüklemesi için 15 dakika inkübe edin. Bağlanmamış Abo1 ve histon proteinlerini beş dakika boyunca yıkayın. Histon proteinlerinin DNA'ya yüklenip yüklenmediğini kontrol etmek için tampon akışını geçici olarak kapatın.
DNA perdesi oluşumu, DNA moleküllerinin enterpolasyonlu bir boya ile boyanmasıyla kontrol edildi. Paralel dizilerde gösterilen yeşil çizgiler, DNA moleküllerine interkalasyonlu YOYO1'in hidrodinamik akış altında bir difüzyon bariyerinde iyi hizalandığını ve gerildiğini gösterdi. Abo1'in yokluğunda DNA perdesine Cy5-H3-H4 dimerleri enjekte edildiğinde, Cy5-H3-H4 DNA'ya bağlanmadı, bu da H3-H4 dimerlerinin DNA'ya kendiliğinden bağlanmadığını gösterir.
Cy5-H3-H4'e Abo1 enjekte edildiğinde, DNA molekülleri üzerinde kırmızı floresan punkta görüldü, bu da Abo1'in H3-H4 dimerlerini DNA'ya yüklediğini düşündürdü. Floresan sinyalleri, tampon akışının yokluğunda kayboldu ve akış yeniden başlatıldığında yeniden ortaya çıktı, bu da H3-H4 dimerlerinin DNA'ya bağlandığını düşündürdü. H3-H4 dimerlerinin DNA'ya bağlanması, akış kapatıldığında floresan sinyallerinin kaybolduğu kimografi ile de doğrulandı.
DNA perdesinde, nükleotid yokluğunda veya ADP varlığında çok az floresan punkta ortaya çıktı, bu da H3-H4 dimerlerinin Apo durumunda veya ADP varlığında nadiren DNA'ya bağlandığını gösteriyor. Kantitatif analiz, ATP varlığında DNA'ya bağlı H3-H4 dimerlerinin sayısının arttığını göstermektedir. Sonuçlar, ATP hidrolizinin, Abo1 tarafından DNA'ya H3-H4 yüklemesi için gerekli olduğunu göstermektedir.
Akış hücresine kabarcık enjeksiyonundan kaçınmak, tüm adımlar için en kritik olanıdır. Yani bu protokolde, damla damla bağlantıları vurguluyoruz. DNA perdesi tahlili, çift nano desenli çift bağlı DNA perdelerine genişletilebilir.
Ek olarak, tek sarmallı DNA, RNA veya aktin filamentleri ile başka bir DNA perdesi türü yapabiliriz. DNA perdesi, DNA üzerindeki protein hareketinin görselleştirilmesini sağlar ve hedef arama mekanizmasının incelenmesini kolaylaştırır. DNA perdesi, replikasyon ve transkripsiyon dahil olmak üzere DNA metabolizmasını incelemek için uzatılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
DNA perdesi tekniği, protein-DNA etkileşimlerinin gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesine olanak tanıyan yüksek verimli bir tek molekül görüntüleme yöntemidir. Bu protokol, Schizosaccharomyces pombe'de bromodomain içeren bir AAA+ ATPase olan Abo1'in biyolojik rolünü ve moleküler mekanizmasını araştırmak için DNA perdesinin kullanımına odaklanmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Moleküler Biyoloji
Arka Plan
- DNA perde tekniği, biyomolekül etkileşimlerinin ayrıntılı karakterizasyonuna olanak tanır.
- Bu teknik, toplu deneylerin kısıtlamalarını aşar.
- Gerçek zamanlı görüntüleme, kromatin dinamiklerinin çalışılmasını kolaylaştırır.
- Histon şaperonları, kromatin yeniden şekillenmesinde kritik bir rol oynar.
Çalışmanın Amacı
- Abo1'in moleküler fonksiyonunu incelemek.
- Protein-DNA etkileşimlerini gerçek zamanlı olarak anlamak.
- Kromatin dinamikleri konusundaki bilgileri artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Çift taraflı bant ve lamlar kullanılarak mikroakışkan bir bölmenin hazırlanması.
- Görüntüleme için DNA perdesi tekniğinin uygulanması.
- Yüksek verimli tek molekül görüntüleme.
- Protein-DNA etkileşimlerinin gerçek zamanlı gözlemi.
Temel Sonuçlar
- Abo1'in DNA ile etkileşimlerinin başarılı bir şekilde görselleştirilmesi.
- Abo1'in kromatin dinamiklerindeki rolüne dair yeni bilgiler.
- DNA perdesi tekniğinin etkinliğinin gösterilmesi.
- Gerçek zamanlı görüntüleme, ayrıntılı etkileşim verileri sağlamıştır.
Sonuçlar
- DNA perdesi tekniği, protein-DNA etkileşimlerini incelemek için güçlü bir araçtır.
- Abo1, kromatin dinamiğinde önemli bir rol oynar.
- Bu yöntem diğer biyomoleküler çalışmalara da uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Sektör Uygunluğu
Tek moleküllü DNA perdesi teknolojisi, histon şaperon aracılı nükleozom montajının yüksek verimli ve gerçek zamanlı görselleştirilmesine olanak tanıyarak, ilaç keşfi için kromatin biyolojisindeki kritik bir darboğazı giderir. Bu platform, protein-DNA etkileşimleri üzerine mekanistik bir açıklık sağlayarak, hedef doğrulama sürecindeki öngörülebilir güveni destekler ve erken keşif portföylerindeki riskleri azaltır. ATP bağımlı montaj basamaklarını ayrıştırma yeteneği, hem hedef sorgulamasını hem de kromatin modifiye eden terapötikler için assay geliştirmeyi bilgilendirir.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Histon şaperon aktivitesinin ve nükleozom kurulum dinamiklerinin doğrudan gözlemlenmesini sağlar.
- Kromatin kurulumundaki ATP bağımlılığını açıklayarak, epigenetik hedeflerin mekanistik risk azaltma süreçlerini destekler.
- Hastalıkla ilgili sistemlerde kromatin düzenleyicilerinin fonksiyonel validasyonunu kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Protein-DNA etkileşimlerinin kantitatif ölçümü için valide edilmiş bir tek molekül platformu sağlar.
- Kromatin dizilimi çalışmaları için deney standardizasyonunu ve tekrarlanabilirliğini destekler.
- Histon şaperon fonksiyonu modülatörleri için yüksek kapasiteli tarama hazırlığına olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Kromatin biyolojisindeki mekanistik içgörüleri, translasyonel biyobelirteç stratejileriyle hizalar.
- Epigenetik hedefler için moleküler mekanizmadan preklinik model doğrulamasına kadar olan sürekliliği destekler.
- Kromatin modifiye edici ajanların riskle uyumlu şekilde geliştirilmesine bilgi sağlar.
İş Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
DNA perde tekniği, özellikle kromatin ve epigenetik hedefler için, erken dönem mekanistik çalışmalardan assay geliştirmeye ve preklinik doğrulamaya kadar uzanan keşif sürekliliğine entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Nükleozom oluşumundaki ATP bağımlılığının ve histon şaperon fonksiyonunun hipotez testlerini gerçekleştirmeyi sağlar.
- Tarama: Protein-DNA bağlanması ve oluşum olayları için tekrarlanabilir, kantitatif okumalar sunar.
- Analitik: Koşulları karşılaştırmak ve istatistiksel analizi desteklemek için gerçek zamanlı, tek molekül ölçümleri sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Mekanistik bulguları, hastalıklarla ilgili kromatin durumları ve biyobelirteç geliştirme ile ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Ar-Ge programları genelinde çeşitli protein-DNA etkileşim çalışmalarına uyarlanabilir, evrensel bir platform sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Kromatin hedef doğrulamasında öngörüsel güveni artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Kromatin araştırmalarında tekrarlanabilirlik ve ölçeklenebilirlik için tek moleküllü iş akışlarını standartlaştırır.
- Stratejik Değer: Hedef mekanizmaları erkenden açıklığa kavuşturarak devam/durdur kararlarını ve sermaye verimliliğini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Epigenetik ve kromatin modifiye edici terapötik programların riske göre ayarlanmış önceliklendirmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Tek molekül görüntüleme ve mikroakışkan sistem kurulumu konusunda uzmanlık gerektirir.
- TIRF mikroskobuna ve özel akış hücresi altyapısına erişim gereklidir.
- Tekrarlanabilir veri üretimi için ekipler arası titiz bir standardizasyon gereklidir.
- Protokol modifikasyonları ile çeşitli DNA substratlarına ve protein komplekslerine uyarlanabilir.
- Analiz bütünlüğü için akış hücresi hazırlığı sırasında hava kabarcığı oluşumundan kaçınılması kritik öneme sahiptir.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:28
Preparation of the Flow Cell
2:16
Connecting Flow Cell to the Microfluidic System and Loading on Microscope
2:49
Histone Assembly by Abo1 Using DNA Curtain
3:46
Results: Visualization of Histone Loading by Abo1 Using Single‐Molecule DNA Curtain
5:46
Conclusion
