Name: Histon Düzeneğinin Moleküler Mekanizmasının DNA Perde Tekniği ile Deşifre Edilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Keşfedin: DNA perde tekniği ile Abo1 ATPazının kromatin dinamiklerindeki rolünü tek molekül görüntüleme yöntemiyle gerçek zamanlı analiz edin. Bu yöntem protein-DNA etkileşimlerini yüksek verimli şekilde inceler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Güney Kore'deki KAIST'ten Profesör Ji-Joon Song, Carol Cho, Ph.D. ve Juwon Jang, Ph.D.'nin Abo1 ve Cy5-H3-H4'e verdiği nazik desteği takdir ediyor. Bu çalışma, Ulusal Araştırma Vakfı Hibesi (NRF-2020R1A2B5B01001792), Ulsan Ulusal Bilim ve Teknoloji Enstitüsü'nün okul içi araştırma fonu (1.210115.01) ve Temel Bilimler Enstitüsü (IBS-R022-D1) tarafından desteklenmektedir.

1. Akış hücresinin hazırlanması
<ol><li>Daha önce yayınlanmış rapor25'i izleyerek nano hendek desenleri içeren temizlenmiş kaynaşmış bir silika lam hazırlayın.<ol><li>Elmas kaplı bir matkap ucu kullanarak temizlenmiş erimiş bir silika slaytta (Şekil 1A) 1 mm çapında iki delik açın (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
		<li>10 mTorr argon gazı ile DC püskürtme32 ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak slayt üzerine 250 nm kalın alüminyum (Al) biriktirin.</li>
		<li>310 nm kalınlığında %4 950K poli(metil metakrilat) (PMMA) (Malzeme Tablosuna bakınız) tabakasını 4.000 rpm'de 1 dakika döndürün ve 180 °C'de sıcak bir plaka üzerinde 3 dakika pişirin.</li>
		<li>80 kV'da 0.724 nA akımla elektron ışını (ebeam) litografisi33 kullanarak iki delik arasındaki PMMA tabakası üzerindeki nano hendek desenlerini çizin. NOT: Nano hendek desenlerinin mimarisi ve boyutları Şekil 1A'da gösterilmiştir.</li>
		<li>Slaytları gelişmekte olan çözeltiye (1:3 oranında metil izobütil keton ve izopropanol, bkz. Malzeme Tablosu) 2 dakika bekleterek ebeam'e maruz kalan PMMA'yı çıkarın.</li>
		<li>Klor (Cl2) ve bor triklorür (BCl 3) gazları kullanılarak endüktif olarak eşleştirilmiş plazma-reaktif iyon aşındırma (ICP-RIE) ile aşındırma Al katmanları. NOT: Bu iki gaz, ışına maruz kalan alanlardan Al'ı çıkarabilir.</li>
		<li>Kükürt tetraflorür (SF4), tetraflorometan (CF4) ve oksijen (O2) gazları kullanarak slaytlar üzerinde nano hendekler açın (bkz.</li>
		<li>Slaytları 10 dakika boyunca Al etchant'ta (AZ 300 MIF geliştirici, Malzeme Tablosuna bakın) bekleterek kalan Al katmanını çıkarın.</li>
		<li>İmalattan sonra, slaytları deiyonize su ile durulayın ve banyo tipi bir sonikatör kullanarak 30 dakika boyunca asetonda sonikat yapın.</li>
		<li>Slaytları %2 Hellmanex III solüsyonunda (Malzeme Tablosuna bakınız) manyetik karıştırma ile en az 1 gün temizleyin.</li>
		<li>Slaytları asetonda 30 dakika ve 1 M NaOH'de art arda 30 dakika sonikleştirin.</li>
		<li>Slaytları deiyonize suyla durulayın ve nitrojen (N2) gazı ile kurulayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Çift taraflı bandın ortasına temiz bir kağıt (5 mm x 35 mm) koyun. İki deliği ve nano desenleri kağıtla kapatmak için bandı slaydın üzerine yapıştırın.</li>
	<li>Temiz bir bıçak kullanarak kağıdı kesin (Şekil 1A).</li>
	<li>Çift taraflı bandın üzerine bir cam lamel koyun ve mikroakışkan bir oda oluşturmak için bir pipet ucu kullanarak lamel ovalayın (Şekil 1A).</li>
	<li>Birleştirilmiş akış hücresini iki mikroskop lamı arasına yerleştirin ve klipsleyin.</li>
	<li>Akış hücresini 120 °C vakumlu fırında 45 dakika pişirin.</li>
	<li>Çip bazlı analizler için sıvı konektörünü (Nanoport) (Malzeme Tablosuna bakın) bir sıcak tutkal tabancası kullanarak her bir açık deliğe takın ve iki sıra Luer kilit borusunu bağlayın.</li>
	<li>3 mL deiyonize su içeren bir Luer kilit şırıngası bağlayın ve hazneyi yıkayın.</li>
	<li>Odayı damla damla bağlantı yoluyla 3 mL lipid tamponu (20 mM Tris-HCl, pH 8.0 ve 100 mM NaCl) ile yıkayın. NOT: Damla damla bağlantı, hazneye hava kabarcıkları enjekte edilmesini önlemek için tüm şırıngaları akış hücresine bağlar.</li>
	<li>Lipid tamponunda 1 mL 0.04x biyotinile lipid lipid enjekte edin, atış başına 5 dakikalık inkübasyon ile iki atışta odaya enjekte edin. NOT: 1x biyotinile lipid stoğunun hazırlanması daha önce yayınlanmış bir rapordaaçıklanmıştır 34.</li>
	<li>Hazneyi 3 mL lipid tamponu ile yıkayın ve lipid çift tabakasının slayt yüzeyinde olgunlaşması için 20 dakika inkübe edin.</li>
	<li>1 mL BSA tamponu (40 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl, 2 mMMgCl2 ve 0.2 mg/mL BSA) ekleyin ve slayt yüzeyini pasifleştirmek için 5 dakika inkübe edin. NOT: Bu adım, proteinlerin slayt yüzeyine spesifik olmayan bağlanmasını azaltabilir.</li>
	<li>İki atış ve atış başına 10 dakika inkübasyon ile 1 mL BSA tamponuna 0.025 mg / mL streptavidin enjekte edin.</li>
	<li>Kalan streptavidini 3 mL BSA tamponu ile yıkayın.</li>
	<li>1 mL BSA tamponunda ~ 300 pM (30 μL) biyotinile lambda faj DNA'sını iki atış ve atış başına 10 dakika inkübasyon ile odaya enjekte edin. NOT: Biyotinile lambda DNA'sının hazırlanması daha önce yayınlanmış bir rapordaaçıklanmıştır 34.</li>
</ol>2. Akış hücresinin mikroakışkan sisteme bağlanması ve mikroskoba yüklenmesi
<ol><li>Abo1 görüntüleme tamponu hazırlayın (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 2 mM MgCl2,% 1.6 glikoz ve 0.1x gloksi, Malzeme Tablosuna bakınız). NOT: Gloxy, floresan boyaların fotoağartmasını azaltan bir oksijen temizleme sistemidir. Glikoz oksidaz ve katalaz ile 100x gloksi stoğunun hazırlanması Referans35'te açıklanmıştır.</li>
	<li>10 mL görüntüleme tamponu içeren bir şırıngayı bir şırınga pompasına bağlayın ve mikroakışkan sistemdeki tüm boru hatlarındaki kabarcıkları çıkarın.</li>
	<li>Akış hücresine kabarcık enjeksiyonunu önlemek için hazırlanan akış hücresini damladan damlaya bağlantı yoluyla mikroakışkan sistemle birleştirin (Şekil 1B).</li>
	<li>Akış hücresini ve akış hücresi tutucularını birleştirin ve düzeneği özel yapım bir TIRF mikroskobuna monte edin (Şekil 1C). DİKKAT: Akış hücresi mikroskop altına alındığında, objektif merceğin yüksekliğini dikkatlice ayarlayın. Akış hücresi objektif merceğe temas etmemelidir. Bu, lense zarar verebilir.</li>
	<li>Akış hücresinin ortasına indeks eşleşen yağı damlatın ve yağ damlasının üzerine özel yapım bir güvercin prizması (Malzeme Tablosuna bakın) koyun.</li>
</ol>3. DNA perdesi kullanılarak Abo1 tarafından histon montajı
<ol><li>150 μL görüntüleme tamponunda 5 nM Abo1 ve 12.5 nM Cy5 etiketli H3-H4 histon dimer (Cy5-H3-H4) (Malzeme Tablosuna bakınız) karıştırın. Tüm proteinler daha önce yayınlanmışrapor 17'ye göre hazırlanmıştır.</li>
	<li>Karışımı buz üzerinde 15 dakika inkübe edin. NOT: Cy5'in foto ağartılmasını önlemek için, inkübasyon karanlıkta yapılmalıdır.</li>
	<li>Lambda DNA moleküllerini boyamak için 100 μL'lik bir numune döngüsünden görüntüleme tamponuna ~20 pM (2 μL) YOYO-1 boya enjekte edin.</li>
	<li>Görüntüleme yazılımını çalıştırın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve DNA perdelerinin iyi biçimlendirilip biçimlendirilmediğini kontrol etmek için 488 nm lazeri açın. NOT: DNA perdeleri iyi biçimlendirilmişse, YOYO-1 ile boyanan DNA molekülleri, akış varlığında bir bariyerde hizalanmış çizgiler olarak gösterilir. Gerilmiş hatlar geri teper ve akış kapatıldığında bariyerden uzaklaşır.</li>
	<li>YOYO-1 boyasını DNA'dan çıkarmak için 2 mL yüksek tuz tamponu (200 mM NaCl ve 40 mM MgCl2) enjekte edin.</li>
	<li>YOYO-1 boyası çıkarıldıktan sonra, önceden inkübe edilmiş protein örneğini enjekte edin.</li>
	<li>Proteinler DNA perdesine ulaştığında, şırınga pompasını kapatın, kapatma vanasını kapatın ve Abo1 ile histon yüklemesi için 15 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Bağlanmamış Abo1 ve histon proteinlerini 5 dakika boyunca yıkayın.</li>
	<li>Kapatma vanasını açın ve akış enjeksiyonuna devam edin.</li>
	<li>637 nm lazeri açın ve tampon akışı açıkken floresan proteinleri görüntüleyin.</li>
	<li>Histon proteinlerinin DNA'ya yüklenip yüklenmediğini kontrol etmek için tampon akışını geçici olarak kapatın (Şekil 2C).</li>
	<li>Bir görüntü elde etme programı ile DNA perdesi görüntülerini toplayın (bkz. NOT: Tampon akışı geçici olarak durduğunda, DNA toplam iç yansımanın geçici alanından geri çekilir ve DNA'ya bağlı floresan etiketli proteinler kaybolur.</li>
</ol>4. Veri analizi
<ol><li>Görüntü alma programı tarafından çekilen görüntüleri, görüntü dizileri olarak TIFF formatına dönüştürün. NOT: Tüm veriler, Referans20'de açıklandığı gibi Resim J (NIH) kullanılarak analiz edilmiştir.</li>
	<li>Görüntü dizilerinden tek bir DNA molekülü seçin ve bir kimografi çizin. NOT: Kimografi, zamanın bir fonksiyonu olarak tek bir DNA molekülüne bağlı her histon proteininin floresan yoğunluğundaki değişimi gösterebilir.</li>
	<li>Kimografiden floresan yoğunluk profilini oluşturun ve birden fazla Gauss işleviyle eşleştirin.</li>
	<li>Floresan yoğunluk profilinden tepe noktalarının merkez koordinatlarını toplayın. Bu adımda, minimum histon floresan yoğunluğu elde edilebilir.</li>
	<li>Profillerden toplanan tüm tepe yoğunluklarını minimum yoğunluğa bölün. Bu adımda DNA'ya bağlı H3-H4 dimerlerinin sayısı tahmin edilir.</li>
	<li>Diğer DNA molekülleri için 4.2-4.5 adımlarını uygulayın.</li>
	<li>1 kbp bölme boyutuna sahip H3-H4 dimerlerinin bağlanma dağılımı için bir histogram oluşturun. Analiz edilen molekül sayısı en az 300'dür.</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Tek moleküllü bir görüntüleme tekniği olarak DNA perdesi, DNA metabolik reaksiyonlarını araştırmak için yaygın olarak kullanılmıştır43. DNA perdesi, lipid akışkanlığını, mikroakışkanları ve TIRFM'yi birleştiren hibrit bir sistemdir. Diğer tek moleküllü tekniklerin aksine, DNA perdesi, protein-DNA etkileşimlerinin yüksek verimli gerçek zamanlı görselleştirilmesini sağlar. Bu nedenle, DNA perdesi tekniği, diziye özgü ilişki, DNA ile birlikte protein hareketi ve DNA 17,20,26<sup class="xre...

Ökaryotik DNA, kromatin 1,2 olarak bilinen daha yüksek dereceli bir yapıda paketlenir. Nükleozom, oktamerik çekirdek histonları 3,4 etrafına sarılmış yaklaşık 147 bp DNA'dan oluşan kromatinin temel birimidir. Kromatin, ökaryotik hücrelerde kritik bir rol oynar; örneğin, kompakt yapı DNA'yı endojen faktörlerden ve dışsal tehditlerdenkorur 5. Kromatin yapısı, hücre siklus fazına ve çevresel uyaranlara göre dinamik olarak değişir ve bu değişiklikler, replikasyon, transkripsiyon ve onarım gibi DNA işlemleri sırasında protein erişimini kontrol eder6. Kromatin dinamiği, genomik stabilite ve epigenetik bilgi için de önemlidir.
Kromatin, histon kuyruğu modifikasyonları ve kromatin yeniden şekillendiriciler, policomb grubu proteinleri ve histon şaperonları7 gibi kromatin düzenleyicileri dahil olmak üzere çeşitli faktörler tarafından dinamik olarak düzenlenir. Histon şaperonları, çekirdek histonlarınınbirikmesi veya ayrılması yoluyla nükleozomların birleştirilmesini ve sökülmesini koordine eder 8,9. Histon şaperonlarındaki kusurlar genom kararsızlığına neden olur ve gelişimsel bozukluklara ve kansere neden olur 9,10. Çeşitli histon şaperonları, nükleozomları 9,11,12,13 birleştirmek veya sökmek için ATP hidrolizi gibi kimyasal enerji tüketimine ihtiyaç duymaz. Son zamanlarda araştırmacılar, bromodomain içeren AAA + (çeşitli hücresel aktivitelerle ilişkili ATPaz) ATPazların, histon şaperonları 14,15,16,17 olarak kromatin dinamiklerinde rol oynadığını bildirdi. İnsan ATAD2 (ATPase ailesi AAA alanı içeren protein 2), gen ekspresyonunu geliştirmek için kromatin erişilebilirliğini teşvikeder 18. Transkripsiyonel bir yardımcı düzenleyici olarak ATAD2, onkojenik transkripsiyonel faktörlerin14 kromatinini düzenler ve ATAD2'nin aşırı ekspresyonu birçok kanser türünde kötü prognozile ilişkilidir 19. ATAD2'nin Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) homoloğu olan Yta7, kromatin15'teki nükleozom yoğunluğunu azaltır. Buna karşılık, ATAD2'nin Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) homoloğu olan Abo1, nükleozom yoğunluğunuarttırır 16. Benzersiz bir tek moleküllü görüntüleme tekniği olan DNA perdesi kullanılarak, Abo1'in nükleozom montajına veya sökülmesine katkıda bulunup bulunmadığıele alınmaktadır 17,20.
Geleneksel olarak, biyomoleküllerin biyokimyasal özellikleri, çok sayıda molekülün incelendiği elektroforetik hareketlilik kaydırma testi (EMSA) veya ko-immünopresipitasyon (co-IP) gibi toplu deneylerle incelenmiştir ve ortalama özellikleri karakterize edilmiştir21,22. Toplu deneylerde, moleküler alt durumlar, topluluk ortalaması etkisi ile örtülür ve biyomoleküler etkileşimlerin araştırılması kısıtlanır. Buna karşılık, tek moleküllü teknikler, toplu deneylerin sınırlamalarını ortadan kaldırır ve biyomoleküler etkileşimlerin ayrıntılı karakterizasyonunu sağlar. Özellikle, tek moleküllü görüntüleme teknikleri, DNA-protein ve protein-protein etkileşimlerini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır23. Böyle bir teknik, mikroakışkanlara ve toplam iç yansıma floresan mikroskobuna (TIRFM) dayanan benzersiz bir tek moleküllü görüntüleme tekniği olan DNA perdesidir24,25. Bir DNA perdesinde, yüzlerce ayrı DNA molekülü, lipid akışkanlığı nedeniyle DNA moleküllerinin iki boyutlu hareketine izin veren lipid çift tabakasına bağlanır. Hidrodinamik akış uygulandığında, DNA molekülleri çift tabaka üzerindeki akış boyunca hareket eder ve hizalandıkları ve gerildikleri bir difüzyon bariyerinde sıkışırlar. DNA, interkalasyon ajanları ile boyanırken, floresan etiketli proteinler enjekte edilir ve TIRFM, protein-DNA etkileşimlerini tek molekül seviyesinde gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için kullanılır23. DNA perde platformu, difüzyon, translokasyon ve çarpışma gibi protein hareketlerinin gözlemlenmesini kolaylaştırır 26,27,28. Ayrıca, DNA perdesi, tanımlanmış konumlar, yönelimler ve topolojiler ile DNA üzerinde protein haritalaması için kullanılabilir veya protein ve nükleik asitlerin faz ayrımı çalışmasına uygulanabilir 29,30,31.
Bu çalışmada, DNA perdesi tekniği, spesifik proteinlerin doğrudan görselleştirilmesi yoluyla şaperonların işlevine kanıt sağlamak için kullanılmıştır. Ayrıca, DNA perdesi yüksek verimli bir platform olduğundan, istatistiksel güvenilirlik için yeterli miktarda veri toplamayı kolaylaştırır. Burada, S. pombe bromodomain içeren AAA+ ATPaz Abo1'in moleküler rolünü araştırmak için DNA perdesi testinin nasıl yapılacağı ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

<table><tbody><tr><td>1 mL luer kilitli şırınga</td><td>BecktonDickinson</td><td>301321</td><td></td></tr><tr><td>1' x 3' kaynaşmış silca sürgülü cam</td><td>G. Finkenbeiner</td><td></td><td>1 inç x 3 inç dikdörtgen ve 1 mm kalınlık</td></tr><tr><td>10 mL luer kilitli şırınga</td><td>BecktonDickinson</td><td>302149</td><td></td></tr><tr><td>18:1 (&Delta; 9-Cis) PC (DOPC)</td><td>Avanti</td><td>850375</td><td>Bu, biyotinile lipid stoğunun bir bileşenidir</td></tr><tr><td>18:1 Biyotinil kapağı PE</td><td>Avanti</td><td>870273</td><td>Bu, biyotinile lipid stoğunun bir bileşenidir</td></tr><tr><td>18:1 PEG2000 PE</td><td>Avanti</td><td>880130</td><td>Bu, biyotinile lipid stoğunun bir bileşenidir</td></tr><tr><td>3 mL luer kilitli şırınga</td><td>BecktonDickinson</td><td>302832</td><td></td></tr><tr><td>6 numune enjeksiyon valfi</td><td>IDEX</td><td>MX serisi II</td><td></td></tr><tr><td>950K PMMA</td><td>All-resist</td><td>671.04</td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>SAMCHUN</td><td>A1759</td><td></td></tr><tr><td>Adenozin 5'-trifosfat disodyum tuzu hidrat (ATP)</td> <td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Alüminyum (Al)</td> <td>TASCO, Güney Kore</td><td>LT50AI414</td><td>Çap 4 inç, kalınlık 1/4 inç</td></tr><tr><td>Amicon Ultra santrifüj filtre, MWCO 10 kDa</td><td>Millipore</td><td>Z648027</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Mbcell</td><td>MB-A4128</td><td>Antibiyotikler</td></tr><tr><td>AZ 300 MIF geliştirici</td><td>Merck</td><td>10454110521</td><td>Alüminyum Bıçağı çıkarmak için kullanılır</td></tr><tr><td></td><td>DORCO</td><td>DN52</td><td>12 mm x 6 m</td></tr><tr><td>Bor triklorür (BCl3)</td><td>UNIONGAS</td><td></td><td>Saflık: % >99.99</td></tr> <tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Katalaz</td><td>Sigma</td><td>C40-1g</td><td>Bu, 100x gloxy stoğunun bir bileşenidir</td></tr><tr><td>Klor (Cl2)</td><td>UNIONGAS</td><td></td><td>Saflık: >99.99</td></tr>% <tr><td>Şeffaf çift taraflı bant</td><td>3M</td><td>313770</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glikoz</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>DC püskürtme</td><td>Sorona</td><td>SRM-120</td><td>Bir kızak üzerinde alüminyum biriktirmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Elmas kaplı matkap ucu</td><td>Eurotool</td><td>DIB-211.00</td><td>Fusced silika slaytta delik açmak için kullanılır</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Dove-prizma</td><td>Korea Electro-Optics Co., Ltd.</td><td>1906-106</td><td>Yansıma önleyici kaplamalı ısmarlama erimiş silika güvercin prizması</td></tr><tr><td>Matkap</td><td>Dremel</td><td>Dremel 3000</td><td>Fusced silika slaytta delik açmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Elektron Fasulyesi Litografisi</td><td>Nanobeam Ltd.</td><td>NB3</td><td></td></tr><tr><td>Etilen-diamin-tetraasetik asit (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>EDS-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Parmak geçirmez bağlantı parçaları</td><td>IDEX</td><td>F-300</td><td>Luer kilitli boru oluşturmak için "PFA Tubing Natural" ile bağlanır</td></tr><tr><td>Flanşsız erkek somun</td><td>IDEX</td><td>P-235</td><td>Luer kilitli boru oluşturmak için "PFA Tubing Natural" ile bağlanır</td></tr><tr><td>Dondurarak Kurutucu, HyperCOOL</td><td>Labogene</td><td>HC3110</td><td>Sıvı proteinleri liyofilize etmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Glikoz oksidaz</td><td>Sigma</td><td>G2133-50KU</td><td>Bu, 100x gloksi stoğunun bir bileşenidir</td></tr><tr><td>Guanidinyum hidroklorür</td><td>Acros Organics</td><td>364790025</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton şırınga</td><td>Hamilton Company</td><td>80065</td><td>Bu şırınga numune enjeksiyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td></td><td>Sigma Z805939</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pg</td><td>Cytiva</td><td>28-9893-36</td><td>FPLC için kullanılır (boyut hariç)</td></tr><tr><td>Sıcak plaka karıştırıcı</td><td>Corning</td><td>PC-420D</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>Sigma</td><td>H1759</td><td>Tris-HCl</td></tr><tr><td>İndeksi eşleştirme yağı</td> için kullanılır <td>ZEISS</td><td>444970-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>Endüktif olarak eşleştirilmiş plazma-reaktif iyon aşındırma</td><td>Top Technology Ltd.</td><td>FabStar</td><td></td></tr><tr><td>İzopropil &beta;-D-1-tiyokalaktopiranosit (IPTG)</td><td>Glentham Yaşam Bilimleri</td><td>GC6586-100g</td><td>&beta;-galaktosidaz aktivitesinin indüksiyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>Lambda faj DNA'sı</td><td>NEB</td><td>N0311</td><td></td></tr><tr><td>LB et suyu</td><td>BD difco</td><td>244610</td><td>E.coli hücre büyümesi için ortam</td></tr><tr><td>Luer adaptörü 10-32</td><td>IDEX</td><td>P-659</td><td>Bu, luer-lock'u bağlar şırınga ve hortum</td></tr><tr><td>Magnezyum klorür hekzahidrat</td><td>fisher biyoreaktifleri</td><td>BP214</td><td></td></tr><tr><td>Metil izobütil keton (MIBK)</td><td>KAYAKU GELİŞMİŞ MALZEMELER</td><td></td><td>Çözelti geliştirmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Mikroskop (Eclipse Ti2)</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti2</td><td>Ters floresan mikroskobu</td></tr><tr><td>Mikroskop cam lamel</td><td>MARIENFELD</td><td>101142</td><td>22 x 50 mm (No. 1)</td></tr><tr><td>Mikroskop lamı</td><td>DURAN GROUP</td><td>DU.2355013</td><td>Sürgülü cam zemin kenarı 45 derece, düz 26 x 76 mm</td></tr><tr><td>Nanoport</td><td>IDEX</td><td>N-333-01</td><td></td></tr><tr><td>Objektif lens</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apochromat VC 60XC WI</td><td>Daldırma tipi: su, büyütme: 60x, düzeltme: 18, çalışma mesafesi: 0.29 (0.31-0.28)</td></tr> <tr><td>One Shot BL21 (DE3) pLysS Kimyasal Olarak Yetkin E. coli</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C6060-03</td><td>Proteinleri aşırı eksprese etmek için yetkili hücre</td></tr><tr><td>Oksijen (O2)</td><td>NOBLEGAS, Güney Kore</td><td></td><td>Saflık: >% 99,99</td></tr> <tr><td>PFA boru doğal</td><td>IDEX</td><td>1512L</td><td>Luer kilitli boru oluşturmak için "Parmak Geçirmez Bağlantı Parçaları" ile bağlanır</td></tr><tr><td>Fenilmetilsülfonil florür (PMSF)</td> <td>Roche</td><td>11359061001</td><td>Proteaz inhibitörü</td></tr><tr><td>Sephacryl S-200 Yüksek Çözünürlüklü</td><td>Cytiva</td><td>17-0584-01</td><td>FPLC için kullanılır (boyut hariç)</td></tr><tr><td>Kapatma vanası</td><td>IDEX</td><td>P-732</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum asetat</td><td>Sigma</td><td>791741</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit (NaOH)</td><td>Sigma</td><td>s5881</td><td></td></tr><tr><td>Spectra / Por moleküler gözenekli membran boru, MWCO 6-8 kDa</td><td>Spektrum laboratuvarları</td><td>132660</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S888</td><td></td></tr><tr><td>Kükürt tetraflorür (SF4)</td> <td>NOBLEGAS, Güney Kore</td><td></td><td>Saflık: % >99.99</td></tr> <tr><td>Şırınga pompası</td><td>KD Scientific</td><td>78-8210</td><td></td></tr><tr><td>Tetraflorometan (CF < alt > 4< / alt >)</td> <td>NOBLEGAS, Güney Kore</td><td></td><td>Saflık: % >99.99</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Trizma tabanı</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>Tris-HCl</td></tr><tr><td>TSKgel SP-5PW</td><td>için kullanılır TOSOH</td><td>14715</td><td>FPLC (iyon değişimi) için kullanılır</td></tr> <tr><td>Birlik montajı</td><td>IDEX</td><td>P-760</td><td>Bu boruları birbirine bağlar</td></tr><tr><td>Üre</td><td>Sigma</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Vakumlu fırın</td><td>Jeio Tech</td><td>OV-11</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Y3601</td><td>Bu interkalasyon boyası, DMSO</td></tr> <tr><td>ve beta; -merkaptoetanol (BME)</td> <td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr> içinde seyreltilir</tbody></table>.

histon düzeneğinin moleküler mekanizmasının dna perde tekniği ile deşifre edilmesi

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Kromatin, ökaryotik DNA'yı paketleyen daha yüksek dereceli bir yapıdır. Kromatin, hücre döngüsü fazına göre ve çevresel uyaranlara yanıt olarak dinamik değişikliklere uğrar. Bu değişiklikler genomik bütünlük, epigenetik düzenleme ve replikasyon, transkripsiyon ve onarım gibi DNA metabolik reaksiyonları için gereklidir. Kromatin düzeneği, kromatin dinamiği için çok önemlidir ve histon şaperonları tarafından katalize edilir. Kapsamlı çalışmalara rağmen, histon şaperonlarının kromatin montajını mümkün kıldığı mekanizmalar belirsizliğini koruyor. Ayrıca, histon şaperonları tarafından düzenlenen nükleozomların küresel özellikleri tam olarak anlaşılamamıştır. Bu sorunları ele almak için, bu çalışma, histon şaperonları tarafından nükleozom düzeneğinin moleküler ayrıntılarının araştırılmasını kolaylaştıran DNA perdesi adı verilen benzersiz bir tek moleküllü görüntüleme tekniğini açıklamaktadır. DNA perdesi, çeşitli protein-DNA etkileşimlerinin gerçek zamanlı görüntülenmesi için evrensel bir platform sağlamak üzere lipid akışkanlığını, mikroakışkanları ve toplam iç yansıma floresan mikroskobunu (TIRFM) birleştiren hibrit bir tekniktir. DNA perdesi kullanılarak, Schizosaccharomyces pombe bromodomain içeren AAA + ATPaz olan Abo1'in histon şaperon fonksiyonu araştırılır ve Abo1'in histon düzeneğinin altında yatan moleküler mekanizma ortaya çıkarılır. DNA perdesi, kromatin dinamiklerini incelemek için benzersiz bir yaklaşım sağlar.

Bu çalışma, DNA perdesi testi için akış hücresi hazırlama prosedürünü açıklar (Şekil 1A). DNA perdesi testi, Abo1 ile DNA üzerinde histon H3-H4 dimer düzeneğinin incelenmesini kolaylaştırdı. İlk olarak, DNA molekülleri interkalasyon boyası olan YOYO-1 ile boyanarak DNA perdesi oluşumu kontrol edildi. Yeşil çizgiler paralel dizilerde gösterildi, bu da YOYO-1'in hidrodinamik akış altında bir difüzyon bariyerinde iyi hizalanmış ve gerilmiş DNA moleküllerine interkalasyon yaptığını gösteriyor (<...

Yüksek verimli tek moleküllü bir görüntüleme tekniği olan DNA perdesi, çeşitli protein-DNA etkileşimlerinin gerçek zamanlı görselleştirilmesi için bir platform sağlar. Mevcut protokol, bir Schizosaccharomyces pombe bromodomain içeren AAA+ ATPaz olan Abo1'in biyolojik rolünü ve moleküler mekanizmasını araştırmak için DNA perdesi tekniğini kullanmaktadır.

Histon Düzeneğinin Moleküler Mekanizmasının DNA Perde Tekniği ile Deşifre Edilmesi

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...

Bu protokol, kromatin dinamiklerini incelemek, özellikle histon şaperonlarının moleküler fonksiyonunu araştırmak için DNA perdesi tekniğinin nasıl kullanıldığını gösterir. Yüksek verimli tek moleküllü görüntüleme tekniği DNA perdesi, toplu deneylerin sınırlamalarının üstesinden gelir ve Gerçek Zamanlı görüntülemeyi kolaylaştırarak Biyomolekül etkileşimlerinin ayrıntılı karakterizasyonunu sağlar. Çift taraflı bandın ortasına 5 x 35 milimetre boyutlarında temiz bir kağıt koyun.İki deliği ve nano desenleri kağıtla kapatmak için bandı slaydın üzerine yapıştırın. Ardından temiz bir bıçak kullanarak kağıdı kesin. Çift taraflı bandın üzerine bir cam kapak kılıfı koyun ve mikroakışkan bir oda oluşturmak için bir pipet ucu kullanarak kapak fişini ovalayın.Birleştirilmiş akış hücresini iki mikroskop lamı arasına yerleştirin ve klipsleyin. Akış hücresini 120 santigrat derece vakumlu fırında 45 dakika pişirin. Çip bazlı analiz için sıvı konektörünü sıcak tutkal tabancası kullanarak her açık deliğe takın.Ve iki sıra yem kilit borusunu bağlayın. Üç mililitre deiyonize su içeren bir yem kilitli şırınga bağlayın ve hazneyi yıkayın. Hazneyi damla damla bağlantı yoluyla üç mililitre lipit tamponu ile tekrar yıkayın.Lipid tamponunda bir mililitre 0.04x biyotinillenmiş lipidi, atış başına beş dakikalık bir inkübasyonla iki atışta odaya enjekte edin. Bir mililitre BSA'da mililitre başına 0.025 miligram streptavidin enjekte edin, iki atış ve atış başına 10 dakikalık bir inkübasyon. Bir mililitre BSA tamponunda yaklaşık 30 pikomolar biyotinillenmiş lambda faj DNA'sını, iki atış ve atış başına 10 dakikalık inkübasyonlarla odaya enjekte edin.10 mililitre görüntüleme tamponu içeren bir şırıngayı bir şırınga pompasına bağlayın ve mikroakışkan sistemdeki tüm boru hatlarındaki kabarcıkları çıkarın. Akış hücresine kabarcık enjeksiyonunu önlemek için hazırlanan akış hücresini damladan damlaya bağlantı yoluyla mikroakışkan sistemle birleştirin. Akış hücresini ve akış hücresi tutucularını birleştirin ve düzeneği özel olarak yapılmış, toplam yansıma floresan mikroskobuna monte edin.Lambda DNA moleküllerini boyamak için 100 mikrolitre numune döngüsünden görüntüleme tamponuna 200 mikrolitre YOYO-1 boyası enjekte edin. Görüntüleme yazılımını çalıştırın ve DNA perdelerinin iyi biçimlendirilip biçimlendirilmediğini kontrol etmek için 488 nanometre lazeri açın. YOYO-1 boyası çıkarıldıktan sonra, önceden inkübe edilmiş protein örneğini enjekte edin.Proteinler DNA perdesine ulaştığında, şırınga pompasını kapatın, kapatma valfini kapatın ve Abo1 ile histon yüklemesi için 15 dakika inkübe edin. Bağlanmamış Abo1 ve histon proteinlerini beş dakika boyunca yıkayın. Histon proteinlerinin DNA'ya yüklenip yüklenmediğini kontrol etmek için tampon akışını geçici olarak kapatın.DNA perdesi oluşumu, DNA moleküllerinin enterpolasyonlu bir boya ile boyanmasıyla kontrol edildi. Paralel dizilerde gösterilen yeşil çizgiler, DNA moleküllerine interkalasyonlu YOYO1'in hidrodinamik akış altında bir difüzyon bariyerinde iyi hizalandığını ve gerildiğini gösterdi. Abo1'in yokluğunda DNA perdesine Cy5-H3-H4 dimerleri enjekte edildiğinde, Cy5-H3-H4 DNA'ya bağlanmadı, bu da H3-H4 dimerlerinin DNA'ya kendiliğinden bağlanmadığını gösterir.Cy5-H3-H4'e Abo1 enjekte edildiğinde, DNA molekülleri üzerinde kırmızı floresan punkta görüldü, bu da Abo1'in H3-H4 dimerlerini DNA'ya yüklediğini düşündürdü. Floresan sinyalleri, tampon akışının yokluğunda kayboldu ve akış yeniden başlatıldığında yeniden ortaya çıktı, bu da H3-H4 dimerlerinin DNA'ya bağlandığını düşündürdü. H3-H4 dimerlerinin DNA'ya bağlanması, akış kapatıldığında floresan sinyallerinin kaybolduğu kimografi ile de doğrulandı.DNA perdesinde, nükleotid yokluğunda veya ADP varlığında çok az floresan punkta ortaya çıktı, bu da H3-H4 dimerlerinin Apo durumunda veya ADP varlığında nadiren DNA'ya bağlandığını gösteriyor. Kantitatif analiz, ATP varlığında DNA'ya bağlı H3-H4 dimerlerinin sayısının arttığını göstermektedir. Sonuçlar, ATP hidrolizinin, Abo1 tarafından DNA'ya H3-H4 yüklemesi için gerekli olduğunu göstermektedir.Akış hücresine kabarcık enjeksiyonundan kaçınmak, tüm adımlar için en kritik olanıdır. Yani bu protokolde, damla damla bağlantıları vurguluyoruz. DNA perdesi tahlili, çift nano desenli çift bağlı DNA perdelerine genişletilebilir.Ek olarak, tek sarmallı DNA, RNA veya aktin filamentleri ile başka bir DNA perdesi türü yapabiliriz. DNA perdesi, DNA üzerindeki protein hareketinin görselleştirilmesini sağlar ve hedef arama mekanizmasının incelenmesini kolaylaştırır. DNA perdesi, replikasyon ve transkripsiyon dahil olmak üzere DNA metabolizmasını incelemek için uzatılabilir.

deciphering-molecular-mechanism-histone-assembly-dna-curtain

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Hi-C yöntemi kromatin etkileşimler (1) tarafsız, genom kimlik sağlar. Hi-C çiftler yakınlık ligasyonu ve güçlü paralel sıralama. Ortaya çıkan veriler farklı ölçeklerde genomik mimarlık eğitimi için kullanılabilir: ilk sonuçlar, kromozom toprakları, segregasyon, açık ve kapalı kromatin ve megabase ölçekte kromatin yapısı gibi özellikleri tespit.

Hi-C: genomların Üç boyutlu Mimari Eğitim Bir Yöntem.

3DNA yazılım paketi, analiz inşa ve üç boyutlu nükleik asit yapıları görselleştirmek için yetenekleri ile popüler ve çok yönlü biyoinformatik bir araçtır. Bu makale bireysel yapıları ve ilgili yapıların toplulukları hem de uygulanabilir 3DNA mevcut yeni ve popüler özellikler, bir alt kümesi için ayrıntılı protokoller sunar.

3DNA ile Nükleik Asit Yapıları analiz ve Yapı

Bu videoda, tek moleküllü görüntüleme kullanarak belirli lokuslarda DNA molekülleri üzerinde füzyon proteini yoğunlaşmalarının montajını görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu kondensatlar, RNA polimeraz II'nin işe alınmasına ve gelişmiş gen transkripsiyonuna izin veren LCD-LCD ve LCD-DBD etkileşimleri nedeniyle oluşur.

DNA perdeleri üzerinde füzyon proteini kondensatlarının montajını görselleştirmek için tek moleküllü görüntüleme

Bir yöntem olup, yeniden birleştirici çekirdek histon ikinci modeli nükleozomal dizilerin sulandırma ve tandem tekrar nükleozom konumlandırma DNA için sunulmuştur. Biz de analitik ultrasantrifüjdeki sedimantasyon hızı deneyleri, ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM) hazırlandıktan sonra nucleosomal dizi doygunluk düzeyini izlemek için nasıl kullanıldığını açıklar.

Rekombinant çekirdek histon nükleozomal Diziler ve Nükleozom Konumlandırma DNA Meclisi

Hedeflenen DNA hasarı, DNA'ya zarar veren bir ajanın tripleks oluşturan bir oligonükleotite (TFO) bağlanmasıyla elde edilebilir. Modifiye TFO'lar kullanılarak, DNA hasarına özgü protein ilişkisi ve DNA topolojisi modifikasyonu, burada açıklanan modifiye kromatin immünopresipitasyon testleri ve DNA süper sarma testlerinin kullanılmasıyla insan hücrelerinde incelenebilir.

Araçlar Helix bozan, site-spesifik DNA içi çapraz bağlantılar işlenmesi Mimari Protein HMGB1 Rolü Eğitim için

Burada, nucleosome parçacıklar, statik ve hızlandırılmış atomik kuvvet mikroskobu (AFM) görüntüleme teknikleri kullanılarak tek molekül düzeyinde karakterize etmek için bir iletişim kuralı mevcut. Yakalama yapısı ve dinamik oluşturarlar içinde olan yüzey functionalization yöntemi sağlar nano, yüksek çözünürlüklü.

Atomik kuvvet mikroskobu Imaging'i kullanma oluşturarlar dinamikleri ve yapısını sondalama

Burada, DNA üzerinde birleşen EWS-FLI1 kondensatlarının biyofiziksel mekanizmasını incelemek için tek moleküllü görüntüleme yöntemi olan DNA Perdeleri'nin kullanımını açıklıyoruz.

DNA Üzerine Birleştirilen EWS-FLI1 Kondensatlarının Tek Moleküllü Görüntülenmesi

ATP'ye bağımlı kromatin remodeler'in DNA ligand ile etkileşimi CD spektroskopisi kullanılarak açıklanmaktadır. Üretilen zirveler tarafından analiz edilen bir gen promotöründeki indüklenen konformasyon değişiklikleri transkripsiyonal regülasyon mekanizmasını anlamak için kullanılabilir.

DNA-Protein Etkileşimlerini İncelemek için CD Spektroskopisi

Bu protokol, topolojik olarak ilişkili alanların (TAD'ler) sınırları ve düzenleyici ve diğer DNA dizisi elemanları arasındaki uzun menzilli kromatin etkileşimleri de dahil olmak üzere, mega tabanlı boyutlu hedeflenen genomik bölgelerin 3D organizasyonunu yüksek çözünürlükte karakterize etmek için kullanılan Capture Hi-C yöntemini açıklar.

Yüksek Çözünürlüklü 3D Kromatin Organizasyonunun Capture Hi-C ile Deşifre Edilmesi

Bu makale, tek moleküllü korelasyon kuvveti ve floresan mikroskobu için nükleozom içeren DNA bağlarının yeniden yapılandırılması için ayrıntılı bir deneysel prosedür sunmaktadır. Ayrıca, kromatin ile etkileşime giren proteinlerin bağlanma davranışını görselleştirmek ve nükleozomların fiziksel özelliklerindeki değişiklikleri analiz etmek için yapılabilecek birkaç aşağı akış deneyini açıklar.

Tek moleküllü korelasyon kuvveti ve floresan mikroskobu için yerinde nükleozom düzeneği

Keşfedin: DNA perde tekniği ile Abo1 ATPazının kromatin dinamiklerindeki rolünü tek molekül görüntüleme yöntemiyle gerçek zamanlı analiz edin. Bu yöntem protein-DNA etkileşimlerini yüksek verimli şekilde inceler.

Histon Düzeneğinin Moleküler Mekanizmasının DNA Perde Tekniği ile Deşifre Edilmesi

Daha fazla video keşfet