Name: Lupus Eğilimli MRL/lpr Farelerde Proteinüri, Lökositlerin Renal İnfiltrasyonu ve Proteinlerin Renal Birikimi Analizleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Öğrenin, MRL/lpr farelerinde lupus nefriti ilerlemesini proteinüri, renal lökosit infiltrasyonu ve protein birikimi analizleriyle izleme yöntemlerini. Bu güvenilir ve uygun maliyetli protokol, kronik böbrek inflamasyonunu incelemek için araştırmacılara değerli bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Teknik destek için Flow Cytometry Core Facility, Histopathology Laboratory, Fralin Imaging Center at Virginia Polytechnic Institute ve State University'ye teşekkür ederiz. Bu çalışma çeşitli NIH ve dahili hibelerle desteklenmektedir.

Mevcut protokol, Virginia Tech'teki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Lupus hastalığı kadınlarda daha yüksek bir insidansa sahip olduğundan, sadece dişi MRL / lpr fareleri kullanılmıştır. Numune toplama 4 haftalıkken başlatıldı ve 15 haftada bitirildi. Fareler ticari kaynaklardan elde edildi ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve kurumsal yönergeleri izleyerek belirli bir patojensiz ortamda yetiştirildi ve muhafaza edildi.
1. Proteinüri testi
<ol><li>Aşağıdaki adımları izleyerek idrar toplayın.<ol><li>% 70 etanol püskürterek davlumbazları sterilize edin. Yüzeye steril bir plastik tabaka yerleştirin. Yaklaşık 20 μL sıvı toplamak için uçlar, 1,5 mL tüpler ve bir pipet hazırlayın. NOT: Uçlar ve tüpler steril olmalı ve herhangi bir ön işlem yapılmamalıdır.</li>
		<li>Kafesi alın ve kaputun içine koymadan önce% 70 etanol püskürtün.</li>
		<li>Fareyi bir elinizle tutun ve ventral bölgeye yukarıdan aşağıya nazikçe masaj yapmak için diğer elinizi kullanın.</li>
		<li>İdrarı doğrudan toplamak için 1,5 mL'lik bir tüp veya pipet kullanın veya numune düşerse, plastik tabakadan toplayın. Her numune için yeni eldivenler, çarşaflar ve ipuçları kullanın. NOT: Bu işe yaramazsa, fareyi izole etmek için steril bir beher kullanın, ardından fare idrara çıktıktan sonra idrarı beherden toplayın.</li>
		<li>Fareyi tekrar kafese koyun. Başka bir fare çıkarın ve 1.1.3-1.1.4 arasındaki adımları tekrarlayın. NOT: Her fare için numuneyi topladıktan sonra plastik tabakayı ve beheri daima %70 etanol ile temizleyin. İstatistiksel anlamlılık için grup başına en az beş fare gereklidir. İdrar örnekleri 12 aya kadar kullanılıncaya kadar -80 °C'de saklanabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Bradford yöntemi24 ile proteinleri sayısallaştırın.<ol><li>İdrar örneklerinin, Albümin standardının ve Bradford reaktifinin 10-20 dakika boyunca dondurucunun dışında tutarak oda sıcaklığına (RT) gelmesine izin verin. NOT: Bradford reaktifi ve Albümin standardı, piyasada satılan bir kitte yer almaktadır (bkz. Albümin standardının başlangıç konsantrasyonu 2 mg/mL'dir. Seri seyreltmeler (1:2 altı kez) su ile yapılmalıdır.</li>
		<li>Bradford reaktifini seyreltilmemiş 96 delikli bir plakaya (200 μL / kuyu) ekleyin.</li>
		<li>Kuyucuk başına 5 μL seyreltilmemiş idrar numunesi pipeti alın ve düzgün bir şekilde karıştırmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipet yapmak için ucu kullanın.</li>
		<li>Kopyalar halinde standartlar (400, 200, 100, 50, 25, 12,5 mg/dL) ekleyin. Birkaç kuyuyu boşluk olarak bırakın. NOT: Numunelerin ve standartların eklenmesi hızlı bir şekilde yapılmalıdır.</li>
		<li>RT'de 5-10 dakika bekletin.</li>
		<li>Plakayı, üreticinin protokolüne göre bir plaka okuyucuda 595 nm'de okuyun (bkz.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Böbrek hücrelerinin izolasyonu
<ol><li>Fareyi CO2 (akış hızı: %30-%70 hacim/dak, bilinç kaybı veya ölüm elde etmek için) ile bir odada ötenazi hale getirin ve ardından servikal çıkık elde edin. Her iki böbreği de toplamak için diseksiyona devam edin. Bir buçuk böbreği buz gibi soğuk bir C10 ortamına yerleştirin. Diğer yarım böbreği OCT'ye koyun (adım 3.1.1). NOT: C10, %10 fetal sığır serumu, 1 mM sodyum piruvat, %100x MEM esansiyel olmayan amino asitler, 10 mM HEPES, 55 μM 2-merkaptoetanol ve 100 U/mL penisilin-streptomisin ile desteklenmiş RPMI 1640 ile yapılır (bkz.</li>
	<li>Böbrekleri tane büyüklüğünde (1-2 mm3 adet) kesin ve 1 mg / mL kollajenaz ve 0.2 mg / mL DNaz I içeren 5 mL sindirim tamponunda (bkz. Malzeme Tablosu) RPMI 1640 ortamında 10 mmol / L HEPES içeren 1 saat boyunca 37 ° C'de sürekli hafif sallama ile sindirin. NOT: Steril 2 mL'lik bir tüpe 1 mL sindirim tamponu ekleyin ve böbreği kesmek için steril makas kullanın.</li>
	<li>10 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içeren 10 mL 1x buz gibi soğuk PBS ekleyin ve buz üzerinde 10 dakika kuluçkaya yatırın. Sonra süspansiyonu iki kez vorteksleyin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 100 μM'lik bir süzgeçten süzün ve 10 mL HBSS dolu olarak yıkayın. NOT: HBSS dolu, 5 mM EDTA, %0,1 BSA ve 10 mM HEPES içerir.</li>
	<li>RT'de 10 dakika boyunca 350 x g'de santrifüj.</li>
	<li>%30,% 37 ve% 70 Stok İzotonik Percoll (SIP) çözeltisi hazırlayın. NOT: SIP hazırlamak için 1 parça hacim 10x PBS ve 9 parça Percoll hacmini karıştırın (bkz. SIP'i %30, %37 ve %70 SIP değerlerine kadar seyreltmek için HBSS dolu kullanın.</li>
	<li>Hücreleri %30 SIP'lik 5 mL'lik bir sürede yeniden askıya alın ve 5 mL'nin %37'sini (üstte) ve 5 mL'nin (altta) %70'ini yükleyerek SIP gradyanını yavaşça bir pastör pipetle yapın.</li>
	<li>RT'de 30 dakika boyunca 1000 x g'de Up9 down0 (veya fren 0) ile santrifüj.</li>
	<li>Lökositleri% 37-70% arayüzünden toplayın ve bunları 5 mL C10'da yeniden askıya alın.</li>
	<li>4 °C'de 10 dakika boyunca 350 x g'de santrifüj.</li>
	<li>Hücre peletini 3 mL FACS tamponunda yeniden askıya alın. Hücreler FACS boyaması için hazırdır. NOT: FACS tamponu 1x PBS ve %0,1 Sığır Serum Albümini (BSA) içerir.</li>
	<li>4 ° C'de 5 dakika boyunca 350 x g'de santrifüj yapın ve süpernatantı (SN) atarak yaklaşık 50 μL bırakın. NOT: Süpernatanı çıkarmak için, çözeltiyi dikkatlice katıdan uzağa dökün veya pipetleyin ya da süpernatanı aspire etmek için yarı otomatik bir vakum kullanın.</li>
	<li>Tüp başına 50 μL FcR bloğu ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu) (1x PBS'de önceden seyreltilmiş 1/50); 10 dakika boyunca karanlıkta buz üzerinde karıştırın ve kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Yıkamak için 2 mL FACS tamponu ekleyin.</li>
	<li>4 ° C'de 5 dakika boyunca 350 x g'de santrifüj yapın ve SN'yi atarak yaklaşık 50 μL bırakın.</li>
	<li>Uygun floresan boyadan 20 μL ekleyin (1/100'ü 1x PBS ile seyreltin, Malzeme Tablosuna bakın) ve buz üzerinde 15-30 dakika bekletin.</li>
	<li>Tüp başına 50 μL antikor 15 karışımı ekleyin: CD138-BV711 (1x PBS'de 1/200) ve CD45-AF700 (1x PBS'de 1/200) (bkz.</li>
	<li>Karanlıkta 15-30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatın ve 3 mL FACS tamponu ekleyin.</li>
	<li>4 ° C'de 5 dakika boyunca 350 x g'de santrifüj yapın ve SN'yi vakumlayın, yaklaşık 50 μL. 200 μL 1x PBS'de yeniden askıya alın. Bu şimdi akış sitometrisi ile analiz edilmeye hazırdır.</li>
</ol>3. İmmünofloresan boyama
<ol><li>Örnek toplamayı gerçekleştirin.<ol><li>Yarım böbreği, Optimal Kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği ile küçük plastik kriyomolda yerleştirin (bkz.</li>
		<li>Bir polistiren köpük kutuya kuru buz ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve kriyomoldu dikkatlice kuru buzun üzerine koyun. Kriyokalıpların düz yerleştirildiğinden emin olun. NOT: OCT bileşiğinin katılaşması ve beyaza dönmesi 3-4 dakika sürer.</li>
		<li>Cryomold'u çıkarın ve alüminyum folyoya sarın. Daha fazla kullanana kadar -80 ° C'de saklayın. NOT: Bu, en az 1 yıl boyunca -80 ° C'de saklanabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Numunenin kesitlemesini ve sabitlenmesini gerçekleştirin.<ol><li>Numuneleri 4 μm kesitler halinde kesin, kuruması için en az 2-3 saat bekleyin ve ardından 10 dakika boyunca soğuk asetonla (4 ° C'de) sabitleyin. NOT: Özel bir kimyasal başlık gerektiren aseton kullanırken dikkatli olun.</li>
		<li>Kızakları sabitledikten sonra, 0,5-1 saat boyunca hava kurutun ve -20 ° C'de kısa bir süre veya -80 ° C'de uzun süre saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Örnekleri lekeleyin.<ol><li>Slaytları 5-10 dakika boyunca soğuk asetonda yeniden sabitleyin.</li>
		<li>Bölümlerin RT'ye ısınmasına izin verin. Bölümün etrafında bir PAP kalemi kullanın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve kurumasını bekleyin. NOT: Tırnak minesi de kullanılabilir. Bu adım, antikor seyreltmesinin kızağın her yerinde yüzmesini önler.</li>
		<li>Slaytları 20 dakika boyunca Coplin kavanozunda 1x Tris tamponlu salin (TBS) içine yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakınız), kavanozu çalkalayıcının üzerine koyun ve hafifçe çalkalayın.</li>
		<li>1x TBS dökün ve kavanozu 1x TBS,% 5 BSA ve% 0,1 Ara 20 ile doldurun. Çalkalayıcıda 20 dakika boyunca kuluçkaya yatırın, hafifçe sallayın.</li>
		<li>Slaytları çıkarın ve slaytların alt kısmını kurulayın. Gerekirse, slaytları kuru çalkalayın. Bölüme 100 μL konjuge antikorlar25 C3-FITC (1/100) ve IgG2a-PE (1/100) ekleyin (bkz. RT'de nemlendirilmiş bir odada 1 saat boyunca inkübe edin.</li>
		<li>Bölümü 1x TBS,% 5 BSA ve% 0,1 Aradaki 20'de 3 kez çalkalayıcı üzerinde 10 dakika boyunca yıkayın.</li>
		<li>Slaytları sallayın ve bölümü bir antifade reaktifi (bkz. Malzeme Tablosu) ve ardından bir kapak parçası ile monte edin.</li>
		<li>Slaytları mikroskop altında görüntüleyene kadar 4 ° C'de saklayın (örneğin, konfokal mikroskop veya görüntüleme sistemi mikroskobu). Yazılım kullanarak görüntüleri ölçün ve bölgeler arasındaki floresan yoğunluğunu karşılaştırırken arka plan sinyallerini çıkarın.</li>
		<li>ImageJ yazılımını kullanarak görüntü analizi için (bkz. Malzeme Tablosu), istenen bölgeyi ana hatlarıyla belirtin.</li>
		<li>Analiz Et'e tıklayarak standart parametreleri ayarlayın, ardından sonuçları almak için Ölçümleri ve Ölçüm Alanını Ayarlayın.</li>
		<li>Hesaplama pencerelerinden elde edilen verileri bir elektronik tabloya aktarın. NOT: Görüntüden arka plan olarak küçük bir alan seçilebilir; herhangi bir floresan içermemelidir.</li>
		<li>İşiniz bittiğinde, bölgeyi ölçmek ve verileri önceki e-tabloya tekrar aktarmak için Analiz Et'i tıklayın.</li>
		<li>Birkaç bölge için 3.3.11-3.3.12 arasındaki adımları yineleyin.</li>
		<li>Ortalama floresanı Düzeltilmiş Hücre Floresansı (CCF) = Entegre yoğunluk - (Seçilen hücre bölgesi x Ortalama arka plan floresansı) olarak hesaplayın.</li>
		<li>Her bölge için hesaplama yapın ve grafik ve istatistik yazılımını kullanarak verileri analiz edin (bkz.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Tsokos, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+Lupus+Erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Systemic Lupus Erythematosus.</a> New England Journal of Medicine. 365 (22), 2110-2121 (2011).</li>
<li>Davidson, A., Aranow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lupus+nephritis%3A+lessons+from+murine+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Lupus nephritis: lessons from murine models.</a> Nature Reviews Rheumatology. 6 (1), 13-20 (2010).</li>
<li>Maldonado, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+environmental+antigens+in+the+spontaneous+development+of+autoimmunity+in+MRL-lpr+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The role of environmental antigens in the spontaneous development of autoimmunity in MRL-lpr mice.</a> Journal of Immunology. 162 (11), 6322-6330 (1999).</li>
<li>Lech, M., Anders, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenesis+of+lupus+nephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The pathogenesis of lupus nephritis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1357-1366 (2013).</li>
<li>Bagavant, H., Fu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+kidney+disease+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of kidney disease in systemic lupus erythematosus.</a> Current Opinion in Rheumatology. 21 (5), 489-494 (2009).</li>
<li>Li, Q. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+autoantibody+clusters+that+best+predict+lupus+disease+activity+using+glomerular+proteome+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Identification of autoantibody clusters that best predict lupus disease activity using glomerular proteome arrays.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3428-3439 (2005).</li>
<li>Aragón, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+biomarkers+in+lupus+nephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Urinary biomarkers in lupus nephritis.</a> Journal of Translational Autoimmunity. 3, 100042(2020).</li>
<li>Mu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+lupus+nephritis+by+changes+of+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota.</a> Microbiome. 5 (1), 73(2017).</li>
<li>Lu, T. -S., Yiao, S. -Y., Lim, K., Jensen, R. V., Hsiao, L. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpretation+of+biological+and+mechanical+variations+between+the+Lowry+versus+Bradford+method+for+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22North+American+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Interpretation of biological and mechanical variations between the Lowry versus Bradford method for protein quantification.</a> North American Journal of Medical Sciences. 2 (7), 325-328 (2010).</li>
<li>Lamb, E. J., MacKenzie, F., Stevens, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+should+proteinuria+be+detected+and+measured%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">How should proteinuria be detected and measured.</a> Annals of Clinical Biochemistry. 46, Pt 3 205-217 (2009).</li>
<li>Viswanathan, G., Upadhyay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+proteinuria%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Chronic+Kidney+Disease%22%5BJournal%5D)">Assessment of proteinuria.</a> Advances in Chronic Kidney Disease. 18 (4), 243-248 (2011).</li>
<li>Hsieh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+outcomes+of+lupus+nephritis+with+tubulointerstitial+inflammation+and+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Care+%26+Research%22%5BJournal%5D)">Predicting outcomes of lupus nephritis with tubulointerstitial inflammation and scarring.</a> Arthritis Care & Research. 63 (6), 865-874 (2011).</li>
<li>Hill, G. S., Delahousse, M., Nochy, D., Mandet, C., Bariéty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteinuria+and+tubulointerstitial+lesions+in+lupus+nephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Proteinuria and tubulointerstitial lesions in lupus nephritis.</a> Kidney International. 60 (5), 1893-1903 (2001).</li>
<li>Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+B+cell-mediated+immune+responses+and+tubulointerstitial+inflammation+in+human+lupus+nephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">In situ B cell-mediated immune responses and tubulointerstitial inflammation in human lupus nephritis.</a> Journal of Immunology. 186 (3), 1849-1860 (2011).</li>
<li>Schrezenmeier, E., Jayne, D., Dörner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+B+Cells+and+plasma+cells+in+glomerular+diseases%3A+translational+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Targeting B Cells and plasma cells in glomerular diseases: translational perspectives.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 29 (3), 741(2018).</li>
<li>Fitzgibbons, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+analytic+validation+of+immunohistochemical+assays%3A+Guideline+from+the+college+of+American+pathologists+pathology+and+laboratory+quality+center%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Principles of analytic validation of immunohistochemical assays: Guideline from the college of American pathologists pathology and laboratory quality center.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 138 (11), 1432-1443 (2014).</li>
<li>Lewis, M. J., Botto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+deficiencies+in+humans+and+animals%3A+links+to+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Complement deficiencies in humans and animals: links to autoimmunity.</a> Autoimmunity. 39 (5), 367-378 (2006).</li>
<li>Watanabe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+renal+disease+in+MRL%2Flpr+mice+genetically+deficient+in+the+alternative+complement+pathway+factor+B%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Modulation of renal disease in MRL/lpr mice genetically deficient in the alternative complement pathway factor B.</a> Journal of Immunology. 164 (2), 786-794 (2000).</li>
<li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-10+regulates+murine+lupus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-10 regulates murine lupus.</a> Journal of Immunology. 169 (4), 2148-2155 (2002).</li>
<li>Singh, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+contribution+of+IL-4+and+STAT6+vs+STAT4+to+the+development+of+lupus+nephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Differential contribution of IL-4 and STAT6 vs STAT4 to the development of lupus nephritis.</a> Journal of Immunology. 170 (9), 4818-4825 (2003).</li>
<li>van Bavel, C. C., Fenton, K. A., Rekvig, O. P., vander Vlag, J., Berden, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+targets+of+nephritogenic+autoantibodies+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">Glomerular targets of nephritogenic autoantibodies in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis & Rheumatism. 58 (7), 1892-1899 (2008).</li>
<li>Zuniga, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+IgG+subclasses+and+C-reactive+protein+in+lupus+nephritis%3A+the+relationship+between+the+composition+of+immune+deposits+and+FCgamma+receptor+type+IIA+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">Identification of IgG subclasses and C-reactive protein in lupus nephritis: the relationship between the composition of immune deposits and FCgamma receptor type IIA alleles.</a> Arthritis & Rheumatism. 48 (2), 460-470 (2003).</li>
<li>Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+creatinine+clearance+in+lupus+nephritis+patients+with+normal+creatinine%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine.</a> International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1), 248-254 (1976).</li>
<li>Cabana-Puig, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+drift+in+lupus-prone+MRL%2Flpr+Mice%3A+potential+roles+of+micrornas+and+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Immunohorizons%22%5BJournal%5D)">Phenotypic drift in lupus-prone MRL/lpr Mice: potential roles of micrornas and gut microbiota.</a> Immunohorizons. 6 (1), 36-46 (2022).</li>
<li>Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+creatinine+clearance+in+lupus+nephritis+patients+with+normal+creatinine%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine.</a> International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).</li>
<li>Kienzle, N., Young, D., Zehntner, S., Bushell, G., Sculley, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNaseI+treatment+is+a+prerequisite+for+the+amplification+of+cDNA+from+episomal-based+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">DNaseI treatment is a prerequisite for the amplification of cDNA from episomal-based genes.</a> Biotechniques. 20 (4), 612-616 (1996).</li>
<li>Park, J. G. -, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+composition+in+normal+human+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Immune cell composition in normal human kidneys.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15678(2020).</li>
<li>Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+performing+immunofluorescence+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An introduction to performing immunofluorescence staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).</li>
<li>Okutucu, B., Dınçer, A., Habib, Ö, Zıhnıoglu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+five+methods+for+determination+of+total+plasma+protein+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Biophysical+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of five methods for determination of total plasma protein concentration.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (5), 709-711 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

LN, SLE hastalarında mortalitenin önde gelen nedenlerinden biridir ve hastalığı şiddetlendiren faktörler belirsizliğini korumaktadır. Bu protokolün uygulanması, proteinüri ölçümü, izole böbrek lökositlerinin FACS analizi ve donmuş böbrek bölümlerinin immünofloresan boyanması dahil olmak üzere çoklu yöntemler kullanarak böbrek fonksiyonunu karakterize etmektir.
İdrar toplarken göz önünde bulundurulması gereken önemli bir nokta, günün saati ve idrar toplama yeri ile tutarlı olması gerektiğidir. ...

Böbreğin birincil işlevi, su ve tuzların homeostazını korurken idrar yoluyla toksik maddelerin elimine edilmesidir1. Bu fonksiyon, sistemik lupus eritematozuslu (SLE) hastalarda tehdit altındadır ve lupus nefritine (LN) yol açar. LN, bağışıklık sisteminin böbreğe saldırmasının bir sonucudur, bu da kalıcı böbrek iltihabına yol açar, bu nedenle atıkları kandan temizleme ve tuz ve sıvı konsantrasyonlarını düzenleme yeteneğini kaybeder. Bu sonunda ölümcül olabilen böbrek yetmezliğine yol açacaktır. Nefritik süreç sırasında, dolaşımdaki B hücreleri, T hücreleri ve monositler böbreğe alınır, kemokinler, sitokinler ve immün kompleks oluşturan otoantikorlar salgılanır. Bu sonuçta endotel hücre hasarı, membranöz yaralanmalar, renal tübüler atrofi ve fibroz2 ile sonuçlanır.
MRL / Mp-Fas lpr (MRL / lpr) lupus eğilimli fareler, insan SLE3'e benzeyen lupus benzeri klinik bulgular sergileyen klasik bir fare modelidir. Bu model, SLE hastalarında mortalitenin önde gelen nedenlerinden biri olan lupus nefritinin (LN)4 anlaşılmasında etkili olmuştur. Hem insan hem de fare SLE'sinde LN, immün komplekslerin renal birikimi ile tetiklenen kademeli inflamasyon, ardından kompleman aktivasyonu, enflamatuar hücrelerin işe alınması ve böbrek fonksiyon kaybı ile karakterizedir5. İmmün kompleks birikimi, intrinsik böbrek hücreleri tarafından kemokin ve sitokin üretimini indüklemek için ilk adımdır ve bu da immün hücreleri işe alarak enflamatuar yanıtı genişletir6. Mevcut protokol, böbrek hastalığı progresyonunu takip etmek için hücre infiltrasyonunu ve immün kompleks birikimini analiz eden çeşitli teknikler sunmaktadır.
Her hafta toplanan idrar, lupus başlangıcından önce, sırasında ve sonrasında proteinürinin zaman seyrinin tespit edilmesini ve görselleştirilmesini sağlar. Bir biyobelirteç olarak proteinüri, LN'nin biyolojik ilerlemesini belirleyebilir. Bu tekniğin diğer avantajları, invaziv olmayan, uygun maliyetli ve uygulanması kolayolmasıdır 7. Böbrek mükemmel çalıştığında, proteinüri seviyesi sürekli olarak düşüktür; Bununla birlikte, MRL / lpr farelerinde, 8-9 haftalıktan sonra, proteinüri seviyesinde, sonunda böbrek yetmezliğine neden olacak kadar yüksek olan kademeli bir artış gözlenir8. Sorunu izlemek için çok sayıda reaktif şeridi ve kolorimetrik reaktifler ticari olarak temin edilebilir. Bununla birlikte, Bradford testi, proteinürinin başlangıcını ve lupus nefritinin seyrini belirlemede ucuz ve çok doğrudur. Bu tahlil hızlıdır ve reaktif, numunenizde bulunabilecek çözücülerin, tamponların, indirgeyici ajanların ve metal şelatlama ajanlarının varlığından etkilenmez 9,10,11.
Dikkate alınması gereken önemli bir husus, böbrekte hücre infiltrasyonudur. Bu infiltrasyonlar, inflamasyonu kötüleştirmek için sitokinler gibi çözünür faktörlerin salgılanmasını tetikleyerek patogenezi teşvik eder12. Sızıntılarda hangi hücre popülasyonlarının bulunduğunu daha iyi anlamak için, yararlı bir yöntem lökositleri izole etmektir13. Burada, B hücrelerinin renal infiltrasyonunun tespiti örnek olarak kullanılmıştır. Prosedür, deoksiribonükleaz (DNaz) ve kollajenaz içeren bir sindirim işlemi ile başlar, ardından döküntüleri, kırmızı kan hücrelerini ve yoğun granülositleri gideren yoğunluk gradyanı ayrımı ile devam eder. B hücrelerini (CD19+) ve plazma hücrelerini (CD138+) izole etmenin nedeni, lupus böbreklerinin bu hücreleri konsantre edebilmesidir14. Böbrekteki küçük agregalarda B hücrelerinin varlığının klonal genişlemeyi ve dolayısıyla immünoglobulin (Ig) üretimini gösterebileceği öne sürülmektedir. Plazma hücrelerinin bu agregalarda da mevcut olduğu iyi bilinmektedir15. Lökositler izole edildikten sonra, floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS), farklı floresan konjuge antikorlarla boyandıktan sonra ilgili hücreleri analiz etmek için kullanılabilir.
İmmünofloresan, 4 μm kalınlığındaki böbrek dokusu örneklerinde proteinlerin floresan olarak görüntülenmesini sağlayan immünohistokimya (IHC) tespit yöntemlerinden biridir. Diğer IHC tespit yöntemleri, analitlerin doğasına, bağlayıcı kimyaya ve diğer faktörlere bağlıdır16. İmmünofloresan, antijeni spesifik bir florokrom (veya floresan boya) ile etiketlenmiş muadili antikora maruz bırakan hızlı bir tanımlama yöntemidir. Heyecanlandığında, floresan mikroskobun tespit edebileceği ışık üretir. Bu teknik, kompleman C3 ve IgG2a17'nin birikimini gözlemlemek için kullanılabilir. Aşırı kompleman kaskad aktivasyonu, kontrolsüz bir immün yanıt ve fonksiyon kaybı ile ilişkili olabilir18. Böbrekte anti-çift sarmallı DNA (anti-dsDNA) otoantikorlarının immün birikimi, IgG2a izotipine sahip olanların LN20 ile ilişkili olduğu büyük bir endişe kaynağıdır19. Spesifik olarak, anti-dsDNA antikorları, nükleer materyallere daha fazla patojenite ve afinite göstererek bağışıklık kompleksleri oluşturur21. IgG2a mevcut olduğunda, bağışıklık komplekslerini temizlemek için C3 dahil olmak üzere kompleman kaskadı aktive edilir22. C3 ve IgG2a belirteçleri ayrı ayrı ölçülebilir veya korelasyonlarını oluşturmak için üst üste bindirilebilir.
Özellikle, serum kreatinin ölçümü, LN23'ü teşhis etmek için mikroskobik hematüri ve böbrek biyopsileri ile birlikte kullanılabilecek başka bir güvenilir tekniktir. Bununla birlikte, proteinüri varlığı glomerüler hasarın güçlü bir göstergesidir. Bu anlamda, lupus sırasında proteinüri seviyesinin izlenmesi, hastalığın başlangıcını tespit edebilir ve lupus tanısı için diğer yöntemleri tamamlayabilir. Ek olarak, glomerüllerde biriken bağışıklık kompleksleri enflamatuar bir yanıtı indükleyebilir, kompleman sistemini aktive edebilir ve daha fazla enflamatuar hücre alabilir. Bu protokolün dikkat çeken bir diğer noktası da böbrekte B hücresi infiltrasyonudur. Bu, infiltre edilmiş T hücreleri ile birlikte, organ hasarını tetikleyen lokal bağışıklık tepkilerini arttırır. Daha da önemlisi, LN'nin sınıflandırılması sadece mikroskopide görülen glomerüler morfolojik değişikliklere değil, aynı zamanda immünofloresan ile gözlenen immün birikintilere de dayanmaktadır. Bu nedenle, bu protokolde, laboratuvar ortamlarında böbrek fonksiyonlarının analizi için doğru ve uygun maliyetli yöntemler sunulmaktadır.

<table><tbody><tr><td>10x Tris-Tamponlu Tuzlu Su (TBS)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J60764. K2</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Anti-İnsan / Fare C3</td><td>Sedir</td><td>CL7632F</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare CD138 BV711</td><td>Biolegend</td><td>142519</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare CD45 AF700</td><td>Biolegend</td><td>103127</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu</td><td>Albümini Sigma-Aldrich</td><td>A9418-100G</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal Mikroskop LSM 880</td><td>Zeiss</td><td>LSM 880</td><td></td></tr><tr><td>Coplin kavanoz</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-212-281</td><td></td></tr><tr><td>Cryomold</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9511236</td><td></td></tr><tr><td>Yoğunluk gradyan ortamı</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>Percoll</td></tr><tr><td>DEPC-Arıtılmış su</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>AM9906</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>dsDNA-EC</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-ecdna</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik Asit</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>EVOS M5000 Mikroskop görüntüleme sistemi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMF5000</td><td></td></tr><tr><td>FACS Füzyon Hücre sıralayıcı</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Fusion</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu - Premium, Isıyla İnaktive Edilmiş</td><td>R& D sistemleri</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 96 Kuyulu Polistiren Plakalar</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-501</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad prizma</td><td>GraphPad</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Dengeli Tuz Çözeltisi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14175-079</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ yazılımı</td><td>Ulusal Sağlık Enstitüleri</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Lactobacillus reuteri Kandler et al.</td><td>ATCC</td><td>23272</td><td></td></tr><tr><td>MEM esansiyel olmayan amino asitler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>MRL/MpJ-Fas lpr /J Fareler (MRL/lpr)</td><td>Jackson Lab</td><td>485</td><td></td></tr><tr><td>Tırnak minesi</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Herhangi bir geleneksel mağaza</td></tr><tr><td>OCT bileşiği</td><td>Tisse-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>PAP kalemi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way Tek Kullanımlık Gömme Kalıpları</td><td>Polysciences</td><td>R-30</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011069</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 20x TBS Tampon</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28358</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Coomassie Plus (Bradford) Tahlil kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23236</td><td>Albümin standardı dahildir</td></tr><tr><td>ProLon Altın Antifade Mountant</td><td>ThermoFisher</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Saflaştırılmış Sıçan Anti-Fare CD16/CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td>FcR blok</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M5</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>N/A</td><td>SoftMax Pro 6.1 yazılımı</td></tr><tr><td>Steril hücreli Süzgeçler 100 ve mikro; M</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Vankomisin Hidroklorür</td><td>Goldbio</td><td>V-200-1</td><td></td></tr><tr><td>Zombie Aqua</td><td>Biolegend</td><td>423102</td><td>akış sitometrisi analizi için floresan boya</td></tr></tbody></table>

lupus eğilimli mrl/lpr farelerde proteinüri, lökositlerin renal İnfiltrasyonu ve proteinlerin renal birikimi analizleri

Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice

Sistemik lupus eritematozus (SLE), tedavisi bilinmeyen otoimmün bir hastalıktır ve böbrekler de dahil olmak üzere birçok organda kalıcı inflamasyon ile karakterizedir. Bu koşullar altında, böbrek atıkları kandan temizleme ve tuz ve sıvı konsantrasyonlarını düzenleme yeteneğini kaybeder ve sonunda böbrek yetmezliğine yol açar. Kadınlar, özellikle doğurganlık çağındakiler, erkeklerden dokuz kat daha sık teşhis edilir. SLE hastalarında böbrek hastalığı önde gelen mortalite nedenidir. Mevcut protokol, toplanan idrarda atılan protein seviyelerini ölçmek ve zaman içinde lupus ilerlemesini izlemek için hızlı ve basit bir yöntem tanımlamaktadır. Ek olarak, lökositlerin renal infiltrasyonunu araştırmak için boyut ve yoğunluk seçimine dayalı olarak böbrek mononükleer hücrelerini izole etmek için bir yaklaşım sağlanmıştır. Ayrıca, glomerüllerde protein birikimini ve tübülointerstisyel boşlukta lökosit infiltrasyonunu karakterize etmek için immünohistokimyasal bir yöntem geliştirilmiştir. Birlikte, bu yöntemler lupus eğilimli MRL / lpr farelerinin böbrekleri ile ilişkili kronik inflamasyonun ilerlemesini araştırmaya yardımcı olabilir.

Protokol, lupus nefriti için MRL / lpr farelerini değerlendirmek için birden fazla yöntem kullanır. İlk olarak, zamanla böbrek fonksiyon bozukluğuna bağlı olarak artan proteinüri seviyelerini incelemek için bir prosedür tanımlanmıştır. Şekil 1'de gösterildiği gibi, dişi fareler kontrol grubu olarak 200 μL fosfat tamponlu salin (1x PBS) oral gavajı ve tedavi grubu olarak probiyotik Lactobacillus reuteri ile haftada iki kez 109 cfu / mL konsantrasyonunda tedavi edildi. Teda...

Mevcut protokol, farelerde lupus ilerlemesini izlemek için bir yöntem açıklamaktadır. Böbreklerde hücre infiltrasyonu ve protein birikimine bağlı lupus nefritini karakterize etmek için iki ek prosedür sunulmuştur.

Lupus Eğilimli MRL/lpr Farelerde Proteinüri, Lökositlerin Renal İnfiltrasyonu ve Proteinlerin Renal Birikimi Analizleri

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disorder with no known cure and is characterized by persistent inflammation in many organs, including ...

Bu yöntemler, lupus hastalarında böbreklerle ilişkili kronik inflamasyonun ilerlemesini araştırmaya yardımcı olabilir. Lupusta hastalığın seyrini izlemek için kullanılabilecek güvenilir ve uygun maliyetli bir alternatif sunuyoruz. % 70 etanol püskürterek davlumbazın sterilize edilmesine başlayın ve yüzeye steril bir plastik tabaka yerleştirin.Daha sonra yaklaşık 20 mikrolitre idrar toplamak için uçlar, 1,5 mililitrelik tüpler ve bir pipet hazırlayın. Kafesi alın ve kaputun içine yerleştirmeden önce% 70 etanol püskürtün. Daha sonra, fareyi bir elinizle tutun ve ventral bölgeye yukarıdan aşağıya nazikçe masaj yapmak için diğer elinizi kullanın.1,5 mililitrelik bir tüp veya pipet kullanarak idrarı doğrudan toplayın. Veya numune düşerse plastik tabakadan toplayın. Sonra fareyi tekrar kafese koyun.Disseke edilmiş böbrekleri tane büyüklüğüne kesin ve HEPES içeren RPMI 1640 ortamında Kollajenaz ve DNaz 1 içeren beş mililitre sindirim tamponunda bir saat boyunca 37 santigrat derecede sürekli hafifçe sallanarak sindirim. 10 milimolar EDTA içeren 10 mililitre buz gibi soğuk PBS ekleyin ve buz üzerinde 10 dakika kuluçkaya yatırın. Sonra süspansiyonu iki kez vorteksleyin.Daha sonra, hücre süspansiyonunu 100 mikrometrelik bir süzgeçten süzün ve 10 mililitre HBSS dolu olarak yıkayın. Daha sonra, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 350 kez G'de santrifüj yapın. % 30, 37 ve% 70'lik bir stok izotonik Percoll çözeltisi hazırlayın ve% 70'lik çözeltinin üzerine% 37'lik bir Percoll çözeltisi tabakası ekleyin.Re, hücreleri beş mililitre% 30 stok izotonik Percoll içinde askıya alın. Bir Pasteur pipet kullanarak üstten beş mililitrenin %37'sini ve alttan beş mililitrenin %70'ini yavaşça yükleyerek stok izotonik Percoll gradyanı oluşturur. Daha sonra, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 1000 kez G'de dokuz numaraya kadar ve sıfır numaraya kadar santrifüjleyin.Daha sonra, lökositleri% 37 ila% 70 arayüzünden toplayın ve bunları beş mililitre C 10'da yeniden askıya alın. Yine, dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 350 kez G'de santrifüj. Daha sonra hücre peletini üç mililitre faks tamponunda yeniden askıya alın ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca 350 kez G'de santrifüj yapın.Ardından, toplam hacmin yaklaşık 50 mikrolitresini bırakarak süpernatantı atın. Tüp başına 50 mikrolitre FC reseptör bloğu ekleyin. Bu karışımı takiben karanlıkta buz üzerinde 10 dakika kuluçkaya yatırın.Daha sonra, yıkamak için iki mililitre faks arabelleği ekleyin. Daha sonra, dört santigrat derecede beş dakika boyunca 350 kez G'de santrifüj yapın ve toplam hacmin yaklaşık 50 mikrolitresini bırakarak süpernatenti atın. Daha sonra, 20 mikrolitre uygun floresan boya ekleyin ve buz üzerinde 15 ila 30 dakika bekletin.CD 138 parlak menekşe yedi 11 ve CD 45 Alexa Fluor 700 içeren tüp başına 50 mikrolitre antikor karışımı ekleyin ve karanlıkta 15 ila 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatın. Daha sonra, üç mililitre faks arabelleği ekleyin. Dört santigrat derecede beş dakika boyunca 350 kez G'de santrifüj.Süpernatantı toplam hacmin yaklaşık 50 mikrolitresini bırakarak vakumla çıkarın. Daha sonra, hücre peletini 200 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın. Numuneyi toplamak için yarım böbreği en uygun kesme sıcaklığı bileşiği ile küçük plastik kriyomolda gömün.Daha sonra bir polistiren köpük kutusuna kuru buz ekleyin ve kriyomoldu dikkatlice kuru buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, kriyokalıbı çıkarın, alüminyum folyoya sarın ve daha fazla kullanana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Daha sonra kuruyu 10 dakika boyunca soğuk asetonla dört mikrometrelik bölüme sabitleyin.Slaytları sabitledikten sonra, 0,5 ila bir saat boyunca hava kurutun ve kısa bir süre eksi 20 santigrat derecede veya uzun süre eksi 80 santigrat derecede saklayın. Numuneleri lekelemek için, slaytları beş ila 10 dakika boyunca soğuk asetonda yeniden sabitleyin ve bölümlerin oda sıcaklığına ısınmasına izin verin. Daha sonra, bir pat kalemi kullanarak, bölümün etrafına hidrofobik bir daire çizin ve kurumasını bekleyin.Daha sonra slaytları TBS'ye 20 dakika boyunca Copeland kavanozuna yerleştirin ve kavanozu çalkalayıcının üzerine koyarak hafifçe çalkalayın. Daha sonra, TBS'yi dökün ve kavanozu TBS% 5 BSA ve% 0.1 TW 20 ile doldurun. Daha sonra, çalkalayıcı üzerinde hafifçe sallayarak kavanozu 20 dakika boyunca inkübe edin.Ardından, slaytları çıkarın ve slaytların alt kısmını silin. Bölüme 100 mikrolitre konjuge antikor C3 fit C ve IgG2 APE ekleyin ve oda sıcaklığını nemlendirilmiş bir odada bir saat boyunca inkübe edin. Kesiti çalkalayıcıda 10 dakika boyunca PBS% 5 BSA ve% 0.1 TW 20'de üç kez yıkayın ve ardından slaytları kurulayın.Bölümü bir solma önleyici reaktifle ve ardından bir kapak kaymasıyla monte edin. Ardından, mikroskop altında görüntülenene kadar slaytları dört santigrat derecede saklayın. Görüntü J yazılımını kullanarak görüntü analizi için, istenen bölgeyi ana hatlarıyla belirtin.Daha sonra, analiz et'e tıklayarak standart parametreleri ayarlayın, ardından sonuçları almak için ölçümleri ve ölçüm alanını ayarlayın. Ardından, hesaplama pencerelerinden elde edilen verileri bir e-tabloya aktarın. İşiniz bittiğinde, bölgeyi ölçmek ve verileri tekrar önceki e-tabloya aktarmak için analiz et'e tıklayın.MRL LPR farelerinin idrarındaki protein düzeyleri zamanla tespit edildi ve kontrol grubu olarak fosfat tamponlu salin ve tedavi grubu olarak lactobacillus reuteri ile tedavi edildi. L.reuteri ile tedavi edilen fare grubu, kontrol grubundan daha agresif bir proteinüri progresyonunda. İzole böbrek lökositlerinin plazma hücrelerini analiz etmesi için faks analizi yapıldı.Ayrıca, fareler Escherichia coli çift sarmallı DNA ile birlikte vankomisin veya vankomisin ile tedavi edildi. Escherichia coli çift sarmallı DNA'nın renal infiltrasyonu tetiklemesi beklenmesine rağmen, plazma hücrelerinin yüzdesinde anlamlı bir fark bulunamadı. Kompleman C3 ve IgG2a, kadın MRL IPR böbrek kesitlerinde immünofloresan boyama ile saptandı.C3 ve IgG2a'nın böbrek birikimi üzerindeki etkili çevresel faktörler, hayvan tesisindeki kurum içi fare ekmeği ve bir satıcıdan satın alınanlar için karşılaştırılmıştır. İmmünohistokimyasal analiz iki grup arasında herhangi bir fark göstermedi. ISO 20 Percoll çözümünün her bir katmanını stok yüzdesinin her bir katmanını eklemek zor olabilir ve eğer karışırlarsa yeniden başlamanız gerekir.Bu prosedür akış sitometresine ve in vitter deneylere yardımcı olur, bu nedenle farklı böbrek hücresi tipi popülasyonlarını inceleyemezsiniz. Bu prosedür, böbreklere sızan B hücrelerini incelememize izin verir ve literatürde çok fazla bilgi yoktur.

analyses-proteinuria-renal-infiltration-leukocytes-renal-deposition

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

BM12 lenfositlerinin bir C57BL/6 alıcısına transferi, sistemik lupus eritematozusun yerleşik bir modelidir. Burada, bu modeli kullanarak hastalığın nasıl başlatılacağını ve T foliküler yardımcı hücrelerin, germinal merkez B hücrelerinin ve plazma hücrelerinin akış sitometrisi ile nasıl karakterize edileceğini açıklıyoruz.

C57BL / 6 FARELERDE SLE bm12 İndüklenebilir Modeli (SLE)

Burada, 129S1/SvImJ farelerde deneysel Nefrotik sendromda indüksiyon doksorubisin hızlı retrobulbar enjeksiyonu ile açıklayın. Ayrıca Nefrotik fareler sürekli yayın granül içeren aprotinin idrar serin proteaz aktivitesi inhibe ve sodyum saklama önlemek için tedavi ediyoruz.

Doksorubisin Retrobulbar enjeksiyon ve Önleme Birimi kalıcılık tarafından sürekli yayın Aprotinin farelerde Nefrotik sendromda indüksiyon

Bu iletişim kuralı bir tam böbrek iş-up glomerular hastalığı fare modellerinde yürütülmesi gereken açıklar. Yöntemler glomerular hastalığı tüm fare modelleri uygulanabilir glomerular işlevinin ayrıntılı işlevsel, yapısal ve mekanik analiz için olanak sağlar.

Fare modelleri Glomerular hastalığı böbrek fonksiyonlarının değerlendirilmesi

Burada nötrofil göçünü ve infiltrasyonu hem in vivo hem de in vitro olarak değerlendirmek için üç yöntem sayılmaktadır. Bu yöntemler nötrofil göç hedefleyen umut verici terapötik keşfetmek için kullanılabilir.

Farelerde Nötrofillerin Göçü ve İnfiltrasyonunun Saptanması

mikroRNA'lar IgA nefropatisinin patogenezinde rol oynarlar. Bir IgA nefropati fare modelinin (HIGA fareleri) böbreklerindeki mikroRNA ekspresyon seviyelerini tespit etmek için güvenilir bir yöntem geliştirdik. Bu yeni yöntem, IgA nefropatisinde miRNA tutulumunu kontrol etmeyi kolaylaştıracaktır.

İmmünoglobulin A Nefropatik Farelerin Böbreklerinde MikroRNA Ekspresyonunun Tespiti

Burada, uzun süreli üreter tıkanıklığının glomerüler dinamikler ve fonksiyon üzerindeki etkilerini ölçmek için Münih Wistar Fromter sıçanlarında yüzey glomerüllü 2-foton mikroskobu kullanan bir protokol sunuyoruz.

Kronik Tek Taraflı Üreter Tıkanıklığının Glomerüler Prosesler Üzerindeki Etkilerini Ölçmek için 2-Foton Mikroskobu Kullanılması

Bu protokol, otoimmün hastalığın gelişimi sırasında murin bağırsak mikrobiyota değişikliklerinin analizi için basit, uygun maliyetli bir DNA izolasyon yöntemi sağlar.

Lupus Eğilimli Farelerde Fekal Mikrobiyota Dinamiğinin Basit, Uygun Maliyetli Bir DNA İzolasyon Yöntemi Kullanılarak Analizi

Bu protokol, obstrüktif nefropatide doku fibrozunun ilerlemesini incelemek için farelerde tek taraflı üreter tıkanıklığını (UUO) indüklemek için bir yöntemi tanımlar. Cerrahi prosedürleri, ameliyat sonrası bakımı ve fibroz değerlendirmesi için yöntemleri içerir.

Böbrek İnterstisyel Fibrozisinin Araştırılmasında Tek Taraflı Üreter Obstrüksiyon Modeli

Burada, tüm böbrek, izole kortikal tübül ve medüller proteomların proteomik analizi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Çalışma ayrıca diyabetik bir fare modelinde ve diyabetik olmayan farelerde bölgesel proteomları karşılaştırır.

Farelerde Böbrek Hasarının Diyabetik Patogenezinde Tüm Böbrek, Medulla ve Kortikal Tübüllerin Karşılaştırmalı Proteomik Analizi

Bu protokol, güvenli ve iyi tolere edilen fare çift taraflı böbrek lenfadenektomisi için bir hayatta kalma prosedürünü tanımlar.

Sırın İki Taraflı Renal Lenfadenektomisi

Öğrenin, MRL/lpr farelerinde lupus nefriti ilerlemesini proteinüri, renal lökosit infiltrasyonu ve protein birikimi analizleriyle izleme yöntemlerini. Bu güvenilir ve uygun maliyetli protokol, kronik böbrek inflamasyonunu incelemek için araştırmacılara değerli bir araç sunar.

Lupus Eğilimli MRL/lpr Farelerde Proteinüri, Lökositlerin Renal İnfiltrasyonu ve Proteinlerin Renal Birikimi Analizleri

Daha fazla video keşfet