Görsel Sistemin Innervasyona Bağlı Büyümesini ve Gelişimini İncelemek için Canlı Zebra Balığı Larvalarında Göz Çıkarılması

Bu yüzden laboratuvarım göz ve beynin birlikte nasıl büyüdüğünü anlamakla ilgileniyor. Bu teknik, retinal girdinin beyin büyümesini ve gelişimini nasıl etkilediğini incelememizi sağlar. Bir gözün canlı larva zebra balığından cerrahi olarak çıkarılması, ardından optik tektumun gözlemlenmesi, aynı hayvan içindeki ve hayvanlar arasındaki innerve ve denervated tektal lobları karşılaştırmamızı sağlar.

Bu tekniği modern moleküler yaklaşımlarla birleştirmek, nöral gelişim, rejenerasyon ve dejenerasyonun altında yatan mekanizmalar hakkında yeni bilgiler verebilir. Başlamak için, katot ve anot tellerini güç kaynağına bağlayın. Katot telinin ucundaki timsah klipsini kısmen düzleştirilmiş bir ataşa takın ve ataşı kavanozun yanına takarak potasyum hidroksit çözeltisine yerleştirin.

Anot telinin timsah klipsini iğne tutucunun boynuna takın. Gücü yaklaşık 20 volta çevirin ve tungsten telini potasyum hidroksit çözeltisine batırın, teli elektrolitik olarak ince bir uca keskinleştirmek için teli çözeltiden bir açıyla çekin. Yeterince keskin olduğundan emin olmak için iğnenin ucunu diseksiyon mikroskobu altında kontrol edin.

Eğri iğne ucu, keskin iğne Petri kabına hafifçe dokunularak büküldüğünde ortaya çıkar. Ameliyat gününde, 10 ila 15 larvayı taze E3 ile doldurulmuş 35 milimetrelik bir Petri kabına aktarmak için geniş delikli bir cam mera pipeti kullanın. Larvaya üç ila beş damla anestezik ekleyin. Larvaların yeterince uyuşturulup uyuşturulmadığını belirlemek için, dokunma yanıtı eksikliğini arayın.

Larvalar üç dakika sonra dokunmaya hala duyarlıysa iki ila üç damla daha anestezik ekleyin ve yeniden değerlendirin. Larvaları ameliyat için hareketsiz hale getirmek için, bir larvayı sadece az miktarda E3 içeren dar delikli bir cam mera pipetine alın. Daha sonra, larvayı içeren pipete yaklaşık 200 mikrolitre erimiş% 1 düşük erime noktası veya LMP agarozu alın ve larvaların LMP agarozunda asılı kalmasını sağlamak için karıştırın. 35 milimetrelik bir Petri kabının kapağını disseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin, ardından larva ve agarozu baş aşağı Petri kabı kapağına fışkırtın.

Agarozu larva damlanın merkezinde olacak şekilde yayın. Donuk bir tungsten iğnesi kullanarak, larvaları hızlı ama nazikçe manevra yapın, böylece bir gözü yukarı bakacak şekilde yanal olur. Agarozun ayarlanması için birkaç dakika bekleyin.

Göz yörüngesinin kenarını takiben, göz çevresindeki cildi delmek için ince elektrolitik olarak keskinleştirilmiş bir tungsten iğnesinin ucunu kullanın. Daha sonra iğnenin kenarını gözün altından gözün zamansal-ventral tarafından kaydırın. Gözü soketten çıkarmak için kontrollü basınç kullanın.

Gözü iğnenin yan tarafıyla dorsal ve ön olarak bastırmaya devam edin, sonunda optik sinirden dilimleyin ve gözü serbest bırakın. Alternatif olarak, optik siniri sıkıştırarak ve gözü medialden laterale iterek gözü çıkarmak için çok ince cerrahi forseps kullanabilirsiniz. Başarılı bir göz çıkarılmasından sonra, agarozu MMR çözeltisi ile örtün, Petri kabı kapağını forsepslerle stabilize ederken, başlarının etrafına ve daha sonra vücutlarının etrafına bir tungsten iğnesini hafifçe fırçalayarak her larvayı agarozdan serbest bırakın.

Ameliyatlardan sonra, larvaları ertesi güne kadar antibiyotiklerle desteklenmiş MMR çözeltisine yerleştirin, ardından larvaları E3'e geri döndürün ve deneyin son noktasına kadar geri getirin. Larvalar ölümcül anestezi uygulandıktan sonra,% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. PBS damlacıklarındaki sabit larvaları, diseksiyon mikroskobu altında bir sızdırmazlık plakası üzerinde askıya alın.

İki tungsten pimi notokorddan geçirerek, bir pim arka tarafını AGM bölgesini kaplayan pigmentli alana ve diğeri yumurta sarısı uzantısının sonuna uygun olarak yerleştirerek yanal olarak sabitleyin. Gözü keskin bir tungsten iğne ve ince forseps ile çıkarın. Bazen iğneyi çene içinden karşı tarafa sokmak ve diğer gözü çıkarmak mümkündür.

Zamansaldan kulağın ventral tarafına çizmek için tungsten iğnesini kullanın. Hareket halindeki aynı eylemde, iğneyi arka tarafa çeneye getirin ve kulak ve çene çıkarılana kadar yavaşça önden çekin. İğneyi çeneden geçirerek diğer gözü ve kulağı çıkarın.

Ventral organları ve kalan yumurta sarısını çıkarmak için forseps kullanın. Son olarak, arka beyin ve omurilik arasındaki kavşağın yakınındaki dorsal kraniyal deride sığ bir kesi yapın. Cildi forseps ile kaldırın ve önden ve telensefalonun etrafına çekin.

Forseps ile kalan dokuları çıkarın. Larvaları çıkarın ve PBS'ye 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Odacıklı bir sürgüyü vakum gresi ile 100 milimetrelik Petri kabının kapağına sabitleyin.

İmmün boyalı ve işlenmiş larvaları, diseksiyon mikroskobu ile görüntülemek için bir kuyu plakasına veya depresyon slaytına aktarın. Larvaları odacıklı slayta% 1 LMP agaroz sütunlarına monte edin. Pipetinizin yanından geçen bir bardak kullanarak, odacıklı slayda bir larva koyun ve mümkün olduğunca az PBS biriktirin.

Larvaları aynı pipeti kullanarak erimiş ve sıcak% 1 LMP agarozu ile örtün. LMP'yi pipet bir sütuna agaroz eder ve ardından larvayı dorsal yüzey görünür olacak şekilde mümkün olduğunca simetrik olarak konumlandırır. Göz çıkarılmasından sonra optik tektum nöropilinde retinal aksonların progresif dejenerasyonu gözlendi.

Ameliyattan iki gün sonra, RFP etiketli aksonlar, blabbing ve parçalanma gibi hızlı Wallerian dejenerasyonunun özelliklerini sergiledi. RFP pozitif punkta, oklarla gösterildiği gibi tektumun sağ tarafındaki nöropilin hem içinde hem de dışında kaydedildi. Ameliyattan dört gün sonra, parçalanmış aksonlar ve RFP etiketli aksonal enkaz, sağ tektal lobda önemli ölçüde azaldı, bu da ölmekte olan ve dejenere olan aksonların nispeten hızlı bir şekilde temizlendiğini gösterdi.

Beyin, gözleri, çeneyi, kulakları ve cildin ve bağ dokularının kafatası kapağını parçalara ayırarak açığa çıkarıldı. İdeal olarak, beyin bu prosedür sırasında bozulmadan kalır. Bununla birlikte, ön beynin parçaları, özellikle koku alma ampulü, cildin veya çenenin kafatası kapağı çıkarıldığında muhtemelen hasar görmüş veya tamamen çıkarılmıştır.

Dahası, bazen tektumun yanal çıkıntısı, beyni çıkarmak için cildi delerken veya sıkıştırırken dilimlenir. Hiçbir örnek aynı değildir. Bu nedenle, gerektiğinde göz çıkarma ve beyin diseksiyonu yoluyla ince adaptasyonlar yapabilmeniz gerekir.

Hastalar ve keskin aletler başarı için şarttır. Bu teknik, optik tektum büyümesi ve gelişiminin moleküler ve hücresel mekanizmaları hakkında yeni bilgiler edinmek için in vivo canlı hücre görüntüleme veya RNA dizilimi gibi hücresel ve moleküler yaklaşımlarla takip edilebilir.