Name: Görsel Sistemin Innervasyona Bağlı Büyümesini ve Gelişimini İncelemek için Canlı Zebra Balığı Larvalarında Göz Çıkarılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Öğrenin, canlı zebra balığı larvalarında tek taraflı göz çıkarımı yöntemiyle optik tektum gelişimini ve görsel sistem innervasyonunu nasıl inceleyeceğinizi. Bu teknik sinirsel rejenerasyon ve dejenerasyon mekanizmalarını anlamanıza yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmanın finansmanı öncelikle Reed College'dan KLC'ye, Helen Stafford Research Fellowship fonlarından OLH'ye ve Reed College Science Research Fellowship'ten YK'ya başlangıç fonları ile desteklendi. Bu proje, Steve Wilson'ın laboratuvarında, Wellcome Trust Studentship (2009-2014) tarafından desteklenen İK ile işbirliği içinde başladı. Máté Varga, Steve Wilson ve Wilson laboratuvarının diğer üyelerine bu proje hakkındaki ilk tartışmalar için teşekkür ediyoruz ve özellikle KLC'ye agarozda embriyoların nasıl monte edileceğini ve zebra balığı beyin diseksiyonlarının nasıl yapılacağını öğreten ilk Florencia Cavodeassi ve Kate Edwards'a teşekkür ediyoruz. Ayrıca Greta Glover ve Jay Ewing'e tungsten iğne bileme cihazımızın montajında yardımcı oldukları için teşekkür ederiz.

<ol><li>Butler, A. B., Hodos, W. Optic tectum. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aButler%2C+AB+%22Comparative+Vertebrate+Neuroanatomy%3A+Evolution+and+Adaptation%22">Comparative Vertebrate Neuroanatomy: Evolution and Adaptation</a>. , John Wiley & Sons, Inc. 311-340 (2005).</li>
<li>Cang, J., Feldheim, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+mechanisms+of+topographic+map+formation+and+alignment%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Developmental mechanisms of topographic map formation and alignment.</a> Annual Review of Neuroscience. 36 (1), 51-77 (2013).</li>
<li>Basso, M. A., Bickford, M. E., Cang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+circuits+of+visual+perception+and+cognition+through+the+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Unraveling circuits of visual perception and cognition through the superior colliculus.</a> Neuron. 109 (6), 918-937 (2021).</li>
<li>Burrill, J. D., Easter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+retinofugal+projections+in+the+embryonic+and+larval+zebrafish+%28Brachydanio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Development of the retinofugal projections in the embryonic and larval zebrafish (Brachydanio rerio).</a> The Journal of Comparative Neurology. 346 (4), 583-600 (1994).</li>
<li>Nona, S. Regeneration in the goldfish visual system. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-goldfish-visual-system/">https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-goldfish-visual-system/</a> (2021).</li>
<li>Sauve, Y., Gaillard, F. Regeneration in the visual system of adult mammals. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-visual-system-of-adult-mammals/">https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-visual-system-of-adult-mammals/</a> (2021).</li>
<li>Cerveny, K. L., Varga, M., Wilson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continued+growth+and+circuit+building+in+the+anamniote+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Continued growth and circuit building in the anamniote visual system.</a> Developmental Neurobiology. 72 (3), 328-345 (2012).</li>
<li>Lindsey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midbrain+tectal+stem+cells+display+diverse+regenerative+capacities+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4420(2019).</li>
<li>Soares, D., Yamamoto, Y., Strickler, A. G., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lens+has+a+specific+influence+on+optic+nerve+and+tectum+development+in+the+blind+cavefish+Astyanax%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The lens has a specific influence on optic nerve and tectum development in the blind cavefish Astyanax.</a> Developmental Neuroscience. 26 (5-6), 308-317 (2004).</li>
<li>White, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+study+of+the+relationship+between+the+size+of+the+eye+and+the+size+of+the+optic+tectum+in+the+brain+of+the+developing+teleost%2C+Fundulus+heteroclitus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">An experimental study of the relationship between the size of the eye and the size of the optic tectum in the brain of the developing teleost, Fundulus heteroclitus.</a> Journal of Experimental Zoology. 108 (3), 439-469 (1948).</li>
<li>Raymond, P., Easter, S., Burnham, J., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postembryonic+growth+of+the+optic+tectum+in+goldfish.+II.+Modulation+of+cell+proliferation+by+retinal+fiber+input%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Postembryonic growth of the optic tectum in goldfish. II. Modulation of cell proliferation by retinal fiber input.</a> The Journal of Neuroscience. 3 (5), 1092-1099 (1983).</li>
<li>Sato, Y., Yano, H., Shimizu, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+nerve+input-dependent+regulation+of+neural+stem+cell+proliferation+in+the+optic+tectum+of+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Optic nerve input-dependent regulation of neural stem cell proliferation in the optic tectum of adult zebrafish.</a> Developmental Neurobiology. 77 (4), 474-482 (2017).</li>
<li>Hall, Z. J., Tropepe, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+experience+facilitates+BDNF-dependent+adaptive+recruitment+of+new+neurons+in+the+postembryonic+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Visual experience facilitates BDNF-dependent adaptive recruitment of new neurons in the postembryonic optic tectum.</a> The Journal of Neuroscience. 38 (8), 2000-2014 (2018).</li>
<li>Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNusslein-Volhard%2C+C+%22Zebrafish%22">Zebrafish</a>. , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Cold Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marc%27s+modified+Ringer%27s+%28MMR%29+%2810X%2C+pH+7.4%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Marc's modified Ringer's (MMR) (10X, pH 7.4).</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).</li>
<li>Turner, K. J., Bracewell, T. G., Hawkins, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+dissection+of+zebrafish+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Development%22%5BJournal%5D)">Anatomical dissection of zebrafish brain development.</a> Brain Development. 1082, 197-214 (2014).</li>
<li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+making+very+fine%2C+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).</li>
<li>ZFIN Tricaine recipe. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE">https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE</a> (2018).</li>
<li>Zhang, L., Leung, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdissection+of+zebrafish+embryonic+eye+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e2028(2010).</li>
<li>ZFIN protocols. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/overview">https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/overview</a> (2021).</li>
<li>Engerer, P., Plucinska, G., Thong, R., Trovò, L., Paquet, D., Godinho, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+subcellular+structures+in+the+living+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Imaging subcellular structures in the living zebrafish embryo.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53456(2016).</li>
<li>ImageJ with batteries included. Fiji. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://figi.sc/">https://figi.sc/</a> (2021).</li>
<li>O'Brien, J., Hayder, H., Peng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+quantification+and+analysis+of+cell+counting+procedures+using+ImageJ+plugins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Automated quantification and analysis of cell counting procedures using ImageJ plugins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54719(2016).</li>
<li>Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influences+on+neural+lineage+and+mode+of+division+in+the+zebrafish+retina+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo.</a> The Journal of Cell Biology. 171 (6), 991-999 (2005).</li>
<li>Karlstrom, R. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+mutations+affecting+retinotectal+axon+pathfinding%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish mutations affecting retinotectal axon pathfinding.</a> Development. 123 (1), 427-438 (1996).</li>
<li>Harvey, B. M., Baxter, M., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+nerve+regeneration+in+larval+zebrafish+exhibits+spontaneous+capacity+for+retinotopic+but+not+tectum+specific+axon+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Optic nerve regeneration in larval zebrafish exhibits spontaneous capacity for retinotopic but not tectum specific axon targeting.</a> PLOS ONE. 14 (6), 0218667(2019).</li>
<li>Robles, E., Filosa, A., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+lamination+of+retinal+axons+generates+multiple+parallel+input+pathways+in+the+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Precise lamination of retinal axons generates multiple parallel input pathways in the tectum.</a> Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).</li>
<li>Vargas, M. E., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+Is+Wallerian+degeneration+in+the+CNS+so+slow%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Why Is Wallerian degeneration in the CNS so slow.</a> Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 153-179 (2007).</li>
<li>Hughes, A. N., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+phagocytose+myelin+sheaths+to+modify+developmental+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia phagocytose myelin sheaths to modify developmental myelination.</a> Nature Neuroscience. 23 (9), 1055-1066 (2020).</li>
<li>de Calbiac, H., Dabacan, A., Muresan, R., Kabashi, E., Ciura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+and+physiological+analysis+in+a+zebrafish+model+of+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Behavioral and physiological analysis in a zebrafish model of epilepsy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (176), e58837(2021).</li>
<li>Adams, S. L., Zhang, T., Rawson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+external+medium+composition+on+membrane+water+permeability+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">The effect of external medium composition on membrane water permeability of zebrafish (Danio rerio) embryos.</a> Theriogenology. 64 (7), 1591-1602 (2005).</li>
<li>Fredj, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activity+and+activity-dependent+competition+regulates+axon+arbor+maturation%2C+growth+arrest%2C+and+territory+in+the+retinotectal+projection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptic activity and activity-dependent competition regulates axon arbor maturation, growth arrest, and territory in the retinotectal projection.</a> Journal of Neuroscience. 30 (32), 10939-10951 (2010).</li>
<li>Alberio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-gated+potassium+channel+for+sustained+neuronal+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A light-gated potassium channel for sustained neuronal inhibition.</a> Nature Methods. 15 (11), 969-976 (2018).</li>
<li>Kay, J. N., Finger-Baier, K. C., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ganglion+cell+genesis+requires+lakritz%2C+a+zebrafish+atonal+homolog%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Retinal ganglion cell genesis requires lakritz, a zebrafish atonal homolog.</a> Neuron. 30 (3), 725-736 (2001).</li>
<li>Gnuegge, L., Schmid, S., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+activity-deprived+zebrafish+mutant+macho+reveals+an+essential+requirement+of+neuronal+activity+for+the+development+of+a+fine-grained+visuotopic+map%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Analysis of the activity-deprived zebrafish mutant macho reveals an essential requirement of neuronal activity for the development of a fine-grained visuotopic map.</a> The Journal of Neuroscience. 21 (10), 3542-3548 (2001).</li>
<li>Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astyanax+surface+and+cave+fish+morphs%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Astyanax surface and cave fish morphs.</a> EvoDevo. 11 (1), 14(2020).</li>
<li>Sieger, D., Peri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+studying+microglia%3A+The+first%2C+the+popular%2C+and+the+new%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Animal models for studying microglia: The first, the popular, and the new.</a> Glia. 61 (1), 3-9 (2013).</li>
<li>Svahn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+ramified+microglia+from+early+macrophages+in+the+zebrafish+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Development of ramified microglia from early macrophages in the zebrafish optic tectum.</a> Developmental Neurobiology. 73 (1), 60-71 (2013).</li>
<li>Herzog, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+clearance+of+cellular+debris+by+microglia+limits+secondary+neuronal+cell+death+after+brain+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Rapid clearance of cellular debris by microglia limits secondary neuronal cell death after brain injury in vivo.</a> Development. 146 (9), (2019).</li>
<li>Chen, J., Poskanzer, K. E., Freeman, M. R., Monk, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-imaging+of+astrocyte+morphogenesis+and+function+in+zebrafish+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Live-imaging of astrocyte morphogenesis and function in zebrafish neural circuits.</a> Nature Neuroscience. 23 (10), 1297-1306 (2020).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Bu makalede açıklanan teknikler, zebra balıklarında omurgalı görsel sistem gelişimini incelemek için birçok yaklaşımdan birini göstermektedir. Diğer araştırmacılar, embriyonik retinayı incelemek ve gen ekspresyon analizleri yapmak için yöntemler yayınladılar19 veya optik tektum30'daki nöronal aktiviteyi görselleştirdiler. Bu makale, diferansiyel retinal girdinin optik tektumdaki hücre davranışlarını nasıl etkileyebileceğini araştırmak için bir yaklaşım sunmaktadır.
<p c...

Bu yöntemin amacı, retinal girdinin zebra balığı beynindeki görsel işlem merkezi olan optik tektumun büyümesini ve gelişimini nasıl etkilediğini araştırmaktır. Bir gözün çıkarılması ve ardından optik tektumun iki tarafının karşılaştırılmasıyla, aynı numunedeki tektal değişiklikler gözlemlenebilir ve normalleştirilebilir, böylece birden fazla örnek arasında karşılaştırma yapılabilir. Bu teknikle birleştirilen modern moleküler yaklaşımlar, görsel sistem büyümesi ve gelişiminin altında yatan mekanizmaların yanı sıra aksonal dejenerasyon ve rejenerasyon hakkında fikir verecektir.
Duyusal sistemler - görsel, işitsel ve somatosensoriyel - dış organlardan bilgi toplar ve bu bilgiyi merkezi sinir sistemine iletir, orta beyindeki dış dünyanın "haritalarını" oluşturur 1,2. Görme, birçok balık da dahil olmak üzere neredeyse tüm omurgalılar için baskın duyusal modalitedir. Gözdeki nöral doku olan retina, öncelikle retinanın projeksiyon nöronları olan fotoreseptörler, bipolar hücreler ve retinal ganglion hücrelerinden (RGC'ler) oluşan nöronal bir devre ile bilgi toplar. RGC'ler, retinanın iç yüzeyinden optik sinir kafasına giden yolu bulan uzun aksonlara sahiptir, burada beyinde büyülenir ve birlikte hareket ederler, sonuçta dorsal orta beyindeki görsel işlem merkezinde sona ererler. Bu yapıya balıklarda ve diğer memeli olmayan omurgalılarda optik tektum denir ve memelilerdeki üstün kollikulusa homologdur3.
Optik tektum, dorsal orta beyinde bilateral simetrik çok katmanlı bir yapıdır. Zebra balıklarında ve diğer balıkların çoğunda, optik tektumun her bir lobu yalnızca kontralateral gözden görsel girdi alır, böylece sol optik sinir sağ tektal lobda sona erer ve sağ optik sinir sol tektallobda sona erer 4 (Şekil 1). Memeli meslektaşı olan üstün kollikulus gibi, optik tektum da görsel bilgiyi seçmeler ve somatosensation dahil olmak üzere diğer duyusal girdilerle bütünleştirir, görsel dikkatteki kaymaları ve sakkadlar 1,5,6 gibi göz hareketlerini kontrol eder. Bununla birlikte, memeli superior kollikulusundan farklı olarak, optik tektum, tektal proliferasyon bölgesi7 olarak adlandırılan tektal lobların medial ve kaudal kenarlarının yakınındaki özel bir kök hücre nişinden sürekli olarak yeni nöronlar ve glia üretir. Optik tektumda ve merkezi sinir sisteminin diğer bölgelerinde proliferatif progenitörlerin bakımı, kısmen, zebra balığı8'de belgelenen olağanüstü rejeneratif kapasiteye katkıda bulunur.
Kör veya tek gözlü balıkların beyinlerini inceleyen önceki çalışmalar, optik tektum büyüklüğünün aldığı retinal innervasyon miktarıile doğru orantılı olduğunu ortaya koymuştur 9,10,11. Gözleri erken embriyogenezde dejenere olan yetişkin mağara balıklarında, optik tektum, yakından ilişkili, gören yüzey balıklarından belirgin şekilde daha küçüktür9. Mağara balık gözü dejenerasyonu, embriyogenez sırasında endojen lensin yüzey balığından bir mercekle değiştirilmesiyle engellenebilir. Bu tek gözlü mağara balıkları yetişkinliğe yetiştirildiğinde, innerve tektal lob, innerve edilmemiş tektal lobdan yaklaşık% 10 daha fazla hücre içerir9. Benzer şekilde, aynı birey içinde farklı boyutlarda gözler üretmek için kimyasal işlemlerle inkübe edilen larva killifish'te, tektumun daha fazla innervasyona sahip tarafı daha büyüktü ve daha fazla nöron içeriyordu10. Yetişkin akvaryum balıklarında optik sinir ezme deneylerinden elde edilen kanıtlar, innervasyonun proliferasyonu desteklediğini, innervasyon bozulduğunda tektal hücre proliferasyonunun azaldığını göstermektedir11.
Bu klasik çalışmaları doğrulayan ve genişleten birkaç yeni rapor, innervasyona yanıt olarak proliferasyonun, en azından kısmen, BDNF-TrkB yolu12,13 tarafından modüle edildiğini gösteren veriler sunmaktadır. Gelişmekte olan bir duyusal sistemin yaralanma ve akson dejenerasyonu ile nasıl başa çıktığı, hangi hücresel ve moleküler sinyallerin retina girişinin optik tektum büyümesini düzenlemesini sağladığı, bu mekanizmaların ne zaman aktif hale geldiği ve innervasyona bağlı proliferasyon ve farklılaşmanın retina ve hedef dokusunun büyüme oranlarını koordine etmesini ve doğru retinotopik haritalamayı sağlamasını sağlayıp sağlamadığı da dahil olmak üzere optik tektum büyümesi ve gelişimi hakkında birçok açık soru devam etmektedir. Ek olarak, zebra balığı görsel sistemini aşağıda tarif edilenler gibi cerrahi yaklaşımlarla sorgulayarak ele alınabilecek aktiviteye bağlı gelişim hakkında çok daha büyük sorular vardır.
Nöral aktivitenin, özellikle görsel girdiden, hücre sağkalımını ve proliferasyonunu değiştirdiği hücresel ve moleküler mekanizmaları araştırmak için, tarif edilen yaklaşım, bireysel zebra balığı larvaları içindeki innerve ve denervated tektal lobları (Şekil 1) doğrudan karşılaştırmaktadır. Bu yöntem, optik tektumdaki RGC akson dejenerasyonunun belgelenmesine ve mitotik hücrelerin sayısının innervasyon ile ilişkili olduğunun doğrulanmasına izin verir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63509/63509fig01.jpg"> Şekil 1: Zebra balığı larvalarının tek taraflı göz çıkarılmasından önce ve sonra çizikleri . (A) Diseksiyon mikroskobu altında görüldüğü gibi 5 dpf larvasının çizimi. Her larva, düşük erime noktalı agaroza gömülür ve gözü yukarı bakacak şekilde çıkarmak için keskin, kancalı bir ucu olan bir tungsten iğnesi kullanılmadan önce yanal olarak yönlendirilir (bu örnekte sol göz). (B) A'da tasvir edilen ameliyattan kaynaklanan 9 dpf larvanın dorsal görünümünün çizilmesi. Sağ gözden sadece üç yüksek şematize RGC aksonunun defasciculating olduğu ve sol tektal lobdaki nöronlarla bağlandığı gösterilmiştir. Kısaltmalar: dpf = döllenmeden sonraki günler; dps = ameliyat sonrası günler; RGC = retinal ganglion hücreleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63509/63509fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table><tbody><tr><td>< güçlü > Ekipman ve malzemeler: < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Yetiştirme kutuları</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning yüksek vakumlu gres</td><td>Sigma veya eşdeğer tedarikçi</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer şişeleri (125 mL)</td><td></td><td></td> <td>Ameliyat sonrası inkübasyon için antibiyotikli Marc'ın Modifiye Halkalarını (MMR) yapmak için.</td></tr><tr><td>İnce forseps - Dumont #5</td><td>Güzel Bilim Araçları (FST)</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Cam Pastör pipetleri</td><td>DWK Lifescience</td><td>63A53 & 63A53WT</td><td>Embriyoları ve larvaları pipetlemek için.</td></tr><tr><td>Mikroskopi VWR veya eşdeğer tedarikçi</td> <td>için cam slaytlar</td><td>48311-703</td><td>Standart cam mikroskop slaytları birçok farklı laboratuvar tedarikçisinden sipariş edilebilir.</td></tr><tr><td>Dereceli şişeler ve dereceli silindirler dahil olmak üzere cam eşyalar</td><td></td><td></td><td>Çözümler yapmak ve depolamak için.</td></tr><tr><td>2 parçalı epoksi reçine</td><td>ACE Donanım veya Gorilla Glue veya eşdeğeri</td><td>0.85 oz şırınga</td><td>tedarikçisi https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpü (1.7 mL)</td> <td>VWR veya eşdeğer tedarikçi</td><td>22234-046</td><td></td></tr><tr><td>Nikel kaplama pim tutucu (17 cm uzunluk)</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>26018-17</td><td>Bileme ve ameliyatlar/diseksiyonlar yaparken tungsten telini tutmak.</td></tr><tr><td>Naylon örgü çay süzgeci veya eşdeğeri</td><td>Ali Express veya eşdeğeri</td><td></td><td>Yumurtlamadan sonra zebra balığı yumurtalarını hasat etmek için; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html</td></tr><tr><td>Ataş</td><td></td><td></td><td>Tungsten iğne bileme cihazı için.</td></tr><tr><td>Petri kapları 100 mm</td><td>Fischer Scientific veya eşdeğeri tedarikçi</td><td>50-190-0267</td><td></td></tr><tr><td>Petri kapları 35 mm</td><td>Fischer Scientific veya eşdeğeri tedarikçi</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>Pipet pompası</td><td>SP Bel-Art veya eşdeğeri</td><td>F37898-0000</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum hidroksit (KOH)</td><td>Sigma</td><td>909122</td><td>Tungsten iğne bileme cihazı için. Deiyonize suya peletler ekleyerek davlumbazda% 10 w / v KOH çözeltisi yapın.</td></tr><tr><td>Güç kaynağı (değişken voltaj)</td><td></td><td></td> <td>Tungsten iğne bileme cihazı için. Değişken voltajlı herhangi bir güç kaynağı çalışacaktır (jel elektroforezi için kullanılan biri bile).</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Elastomer kiti</td><td>Dow Corning</td><td>3097358</td><td></td></tr><tr><td>Tungsten tel (0,125 mm çap)</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>TGW0515</td><td>Gözü çıkarmak ve larvaları incelemek için keskinleştirin.</td></tr><tr><td>Değişken sıcaklıklı ısı bloğu</td><td>Laboratuvar Deposu veya eşdeğer tedarikçi</td><td>BSH1001 veya BSH1002</td><td>40-42 dereceye ayarlanmış; C deneylerden önce.</td></tr><tr><td>Tungsten iğne bileme cihazı için</td> <td>kapaklı geniş ağızlı cam kavanoz (örneğin, temiz reçel veya salsa kavanozu).</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tungsten iğne bileme cihazı için</td> <td>timsah klipsli</td><td></td><td></td> teller.</tr><tr><td>< güçlü > Mikroskoplar: < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td></td><td></td><td>Herhangi bir tip işe yarayacaktır, ancak aynalı bir taban üzerinde ayarlanabilir iletilen ışığın olması tercih edilir.</td></tr><tr><td>Lazer taramalı konfokal mikroskop</td><td></td><td></td><td>Yüksek NA, 20-25x suya daldırma objektif lens önerilir. Burada mikroskop kontrolü ve görüntü yakalama yazılımı (NIS-Elements by Nikon) kullanılır, ancak herhangi bir konfokal mikroskop işe yarayacaktır.</td></tr><tr><td>< güçlü > Ameliyatlar ve diseksiyonlar için reaktifler: < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Kalsiyum klorür dihidrat</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>Marc'ın Modifiye Halkaları (MMR) ve embriyo ortamı (E3) için.</td></tr><tr><td>Marc'ın Modifiye Zil Makineleri (MMR) için</td> <td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H7006</td>.</tr><tr><td>Düşük erime noktalı agaroz</td><td>Invitrogen</td><td>16520-050</td><td>Embriyo ortamında (E3) veya Marc'ın Modifiye Halkalarında (MMR) %1 yapın.</td></tr><tr><td>Magnezyum klorür hekzahidrat</td><td>Sigma</td><td>1374248</td><td>Embriyo ortamı (E3) için.</td></tr><tr><td>Marc'ın Modifiye Zil Makineleri (MMR) için</td> <td>magnezyum sülfat</td><td>Sigma</td><td>M7506</td>.</tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>19210</td><td>%8 (a/h) stoğu 2x konsantre PBS ile seyreltin (10x PBS stoğundan seyreltilmiş).</td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Sigma</td><td>P4333-20ML</td><td>Marc'ın modifiye halkalarında 1:100 oranında seyreltin.</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) tabletleri</td><td>Diagnostic BioSystems</td><td>DMR E404-01</td><td>Deiyonize suda 10x stok yapın, otoklavlayın ve oda sıcaklığında saklayın. 1x çalışma konsantrasyonuna seyreltin.</td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td>Marc'ın Modifiye Halkaları (MMR) ve embriyo ortamı (E3) için.</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>Marc'ın Modifiye Halkaları (MMR) ve embriyo ortamı (E3) için.</td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td>10 M yapın ve MMR'nin pH'ını 7.4'e ayarlamak için kullanın.</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>Pentair</td><td>100G #TRS1</td><td>Tarifi: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE</td></tr><tr><td><güçlü>İmmünohistokimya için reaktifler: < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Alexafluor 568 etiketli Tavşan IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11011'i</td> tespit etmek için ikincil antikor <td>Wholemount için 1:500 seyreltmede kullanın immünohistokimya.</td></tr><tr><td>DAPI veya ToPro3</td><td>Invitrogen</td><td>1306 veya T3605</td><td>DMSO'da 1 mg / mL çözelti oluşturun; Karşı boyama için 1: 5.000 seyreltme.</td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>İmmünoblok tamponunun bir bileşeni.</td></tr><tr><td>Metanol (MeOH)</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td>MeOH'yi PBST gibi sulu çözeltilerle karıştırmak ekzotermiktir. MeOH/PBST çözeltilerini kullanmadan önce en az birkaç saat önceden yapın veya buz üzerinde soğutun.</td></tr><tr><td>Normal keçi serumu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50-062Z</td><td>İmmünoblok tamponunun bir bileşeni. 1-10 mL'lik hacimlerde alıntılanabilir ve -20 ° C'de saklanabilir.</td></tr><tr><td>Fosfohistonu tespit etmek için birincil antikor: H3</td><td>Millipore</td><td>06-570</td><td>Tam mount immünohistokimya için 1:300 seyreltmede kullanın.</td></tr><tr><td>Kırmızı Floresan Proteini tespit etmek için birincil antikor (RFP; dsRed türevlerini tespit eder)</td><td>MBL International</td><td>PM005</td><td>Tam montaj immünohistokimyası için 1:500 seyreltmede kullanın.</td></tr><tr><td>Proteinaz K (PK)</td> <td>Sigma</td><td>P2308-10MG</td><td>PBS'de 10 mg / mL stok çözeltileri oluşturun ve 10 & mikro'da kullanın; g/mL'dir.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>PBS'de %20 (h/h) stok çözeltisi yapmak için kullanışlıdır.</td></tr><tr><td>Veri analizi için yazılım</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ (Fiji)</td><td></td><td></td><td>Görüntü analizi için ücretsiz yazılım; https://imagej.net/software/fiji/</td></tr> <tr><td>RStudio</td><td></td><td></td><td>İstatistiksel analiz ve veri görselleştirme için ücretsiz yazılım; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td></tr> <tr><td>Adobe Photoshop veya GIMP</td><td></td><td></td><td>Tescilli görüntü işleme yazılımı (Adobe Photoshop ve Illustrator) genellikle şekilleri oluşturmak için kullanılır). Ücretsiz bir alternatif Gnu Görüntü İşleme Programıdır (GIMP; https://www.gimp.org/)</td></tr><tr><td>Zebrafish türleri. Bu çalışmada AB, TU, Tg[atoh7:RFP] suşları kullanılmıştır.</td><td></td><td></td><td>Şuradan edinilebilir:&nbsp; ABD'de (https://zebrafish.org/home/guide.php) veya Avrupa'da (https://www.ezrc.kit.edu/) zebra balığı uluslararası kaynak merkezleri. Henüz her iki kaynak merkezinde de depolanmamış olan özel transgenik suşlar, yayınlandıktan sonra bireysel laboratuvarlardan talep edilebilir.</td></tr></tbody></table>

görsel sistemin innervasyona bağlı büyümesini ve gelişimini İncelemek için canlı zebra balığı larvalarında göz Çıkarılması

Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System

Zebra balığı, yaşam boyu olağanüstü büyüme ve rejeneratif yetenekler sergiler. Örneğin, embriyogenez sırasında kurulan özel kök hücre nişleri, hem gözde hem de beyinde tüm görsel sistemin sürekli büyümesini destekler. Retina ve optik tektum arasındaki koordineli büyüme, gözlere ve beyne yeni nöronlar eklendikçe doğru retinotopik haritalamayı sağlar. Retinal aksonların hayatta kalma, proliferasyon ve / veya farklılaşma gibi tektal kök ve progenitör hücre davranışlarını düzenlemek için önemli bilgiler sağlayıp sağlamadığını ele almak için, aynı hayvan içindeki ve hayvanlar arasındaki innerve ve denervated tektal lobları karşılaştırabilmek gerekir. 
Canlı larva zebra balığından bir gözün cerrahi olarak çıkarılması ve ardından optik tektumun gözlemlenmesi bu amaca ulaşır. Eşlik eden video, larvaların nasıl anestezi altına alınacağını, tungsten iğnelerinin elektrolitik olarak keskinleştirileceğini ve bir gözü çıkarmak için nasıl kullanılacağını göstermektedir. Daha sonra beyinlerin sabit zebra balığı larvalarından nasıl disseke edileceğini gösterir. Son olarak, video immünohistokimya protokolüne genel bir bakış ve mikroskopi için düşük erime noktalı agarozda boyalı embriyoların nasıl monte edileceğine dair bir gösteri sunmaktadır.

Göz çıkarmanın tamamlanıp tamamlanmadığını doğrulamak ve optik tektumun nasıl değiştiğini değerlendirmek için, tüm RGC'leri membran hedefli bir RFP ile etiketleyen Tg [atoh7: RFP] suşunda ameliyatlar yapıldı ve böylece retinadan yansıyan ve optik sinir24'ü oluşturan tüm aksonlar yapıldı. Bu suşun kullanılması kesinlikle gerekli olmasa da, optik tektum nöropilindeki optik sinir termininin doğrudan gözlemlenmesini ve görselleştirilmesini sağlar. Lipofilik DiI veya DiO boyaları 25,26</s...

Makale, retinal girdinin optik tektum büyümesini ve gelişimini nasıl etkilediğini araştırmaya yönelik ilk adım olarak canlı zebra balığı larvalarından gözlerin cerrahi olarak nasıl çıkarılacağını açıklamaktadır. Ek olarak, makale larva anesteziizasyonu, fiksasyon ve beyin diseksiyonu, ardından immünohistokimya ve konfokal görüntüleme hakkında bilgi vermektedir.

Görsel Sistemin Innervasyona Bağlı Büyümesini ve Gelişimini İncelemek için Canlı Zebra Balığı Larvalarında Göz Çıkarılması

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis ...

Bu yüzden laboratuvarım göz ve beynin birlikte nasıl büyüdüğünü anlamakla ilgileniyor. Bu teknik, retinal girdinin beyin büyümesini ve gelişimini nasıl etkilediğini incelememizi sağlar. Bir gözün canlı larva zebra balığından cerrahi olarak çıkarılması, ardından optik tektumun gözlemlenmesi, aynı hayvan içindeki ve hayvanlar arasındaki innerve ve denervated tektal lobları karşılaştırmamızı sağlar.Bu tekniği modern moleküler yaklaşımlarla birleştirmek, nöral gelişim, rejenerasyon ve dejenerasyonun altında yatan mekanizmalar hakkında yeni bilgiler verebilir. Başlamak için, katot ve anot tellerini güç kaynağına bağlayın. Katot telinin ucundaki timsah klipsini kısmen düzleştirilmiş bir ataşa takın ve ataşı kavanozun yanına takarak potasyum hidroksit çözeltisine yerleştirin.Anot telinin timsah klipsini iğne tutucunun boynuna takın. Gücü yaklaşık 20 volta çevirin ve tungsten telini potasyum hidroksit çözeltisine batırın, teli elektrolitik olarak ince bir uca keskinleştirmek için teli çözeltiden bir açıyla çekin. Yeterince keskin olduğundan emin olmak için iğnenin ucunu diseksiyon mikroskobu altında kontrol edin.Eğri iğne ucu, keskin iğne Petri kabına hafifçe dokunularak büküldüğünde ortaya çıkar. Ameliyat gününde, 10 ila 15 larvayı taze E3 ile doldurulmuş 35 milimetrelik bir Petri kabına aktarmak için geniş delikli bir cam mera pipeti kullanın. Larvaya üç ila beş damla anestezik ekleyin. Larvaların yeterince uyuşturulup uyuşturulmadığını belirlemek için, dokunma yanıtı eksikliğini arayın.Larvalar üç dakika sonra dokunmaya hala duyarlıysa iki ila üç damla daha anestezik ekleyin ve yeniden değerlendirin. Larvaları ameliyat için hareketsiz hale getirmek için, bir larvayı sadece az miktarda E3 içeren dar delikli bir cam mera pipetine alın. Daha sonra, larvayı içeren pipete yaklaşık 200 mikrolitre erimiş% 1 düşük erime noktası veya LMP agarozu alın ve larvaların LMP agarozunda asılı kalmasını sağlamak için karıştırın. 35 milimetrelik bir Petri kabının kapağını disseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin, ardından larva ve agarozu baş aşağı Petri kabı kapağına fışkırtın.Agarozu larva damlanın merkezinde olacak şekilde yayın. Donuk bir tungsten iğnesi kullanarak, larvaları hızlı ama nazikçe manevra yapın, böylece bir gözü yukarı bakacak şekilde yanal olur. Agarozun ayarlanması için birkaç dakika bekleyin.Göz yörüngesinin kenarını takiben, göz çevresindeki cildi delmek için ince elektrolitik olarak keskinleştirilmiş bir tungsten iğnesinin ucunu kullanın. Daha sonra iğnenin kenarını gözün altından gözün zamansal-ventral tarafından kaydırın. Gözü soketten çıkarmak için kontrollü basınç kullanın.Gözü iğnenin yan tarafıyla dorsal ve ön olarak bastırmaya devam edin, sonunda optik sinirden dilimleyin ve gözü serbest bırakın. Alternatif olarak, optik siniri sıkıştırarak ve gözü medialden laterale iterek gözü çıkarmak için çok ince cerrahi forseps kullanabilirsiniz. Başarılı bir göz çıkarılmasından sonra, agarozu MMR çözeltisi ile örtün, Petri kabı kapağını forsepslerle stabilize ederken, başlarının etrafına ve daha sonra vücutlarının etrafına bir tungsten iğnesini hafifçe fırçalayarak her larvayı agarozdan serbest bırakın.Ameliyatlardan sonra, larvaları ertesi güne kadar antibiyotiklerle desteklenmiş MMR çözeltisine yerleştirin, ardından larvaları E3'e geri döndürün ve deneyin son noktasına kadar geri getirin. Larvalar ölümcül anestezi uygulandıktan sonra,% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. PBS damlacıklarındaki sabit larvaları, diseksiyon mikroskobu altında bir sızdırmazlık plakası üzerinde askıya alın.İki tungsten pimi notokorddan geçirerek, bir pim arka tarafını AGM bölgesini kaplayan pigmentli alana ve diğeri yumurta sarısı uzantısının sonuna uygun olarak yerleştirerek yanal olarak sabitleyin. Gözü keskin bir tungsten iğne ve ince forseps ile çıkarın. Bazen iğneyi çene içinden karşı tarafa sokmak ve diğer gözü çıkarmak mümkündür.Zamansaldan kulağın ventral tarafına çizmek için tungsten iğnesini kullanın. Hareket halindeki aynı eylemde, iğneyi arka tarafa çeneye getirin ve kulak ve çene çıkarılana kadar yavaşça önden çekin. İğneyi çeneden geçirerek diğer gözü ve kulağı çıkarın.Ventral organları ve kalan yumurta sarısını çıkarmak için forseps kullanın. Son olarak, arka beyin ve omurilik arasındaki kavşağın yakınındaki dorsal kraniyal deride sığ bir kesi yapın. Cildi forseps ile kaldırın ve önden ve telensefalonun etrafına çekin.Forseps ile kalan dokuları çıkarın. Larvaları çıkarın ve PBS'ye 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Odacıklı bir sürgüyü vakum gresi ile 100 milimetrelik Petri kabının kapağına sabitleyin.İmmün boyalı ve işlenmiş larvaları, diseksiyon mikroskobu ile görüntülemek için bir kuyu plakasına veya depresyon slaytına aktarın. Larvaları odacıklı slayta% 1 LMP agaroz sütunlarına monte edin. Pipetinizin yanından geçen bir bardak kullanarak, odacıklı slayda bir larva koyun ve mümkün olduğunca az PBS biriktirin.Larvaları aynı pipeti kullanarak erimiş ve sıcak% 1 LMP agarozu ile örtün. LMP'yi pipet bir sütuna agaroz eder ve ardından larvayı dorsal yüzey görünür olacak şekilde mümkün olduğunca simetrik olarak konumlandırır. Göz çıkarılmasından sonra optik tektum nöropilinde retinal aksonların progresif dejenerasyonu gözlendi.Ameliyattan iki gün sonra, RFP etiketli aksonlar, blabbing ve parçalanma gibi hızlı Wallerian dejenerasyonunun özelliklerini sergiledi. RFP pozitif punkta, oklarla gösterildiği gibi tektumun sağ tarafındaki nöropilin hem içinde hem de dışında kaydedildi. Ameliyattan dört gün sonra, parçalanmış aksonlar ve RFP etiketli aksonal enkaz, sağ tektal lobda önemli ölçüde azaldı, bu da ölmekte olan ve dejenere olan aksonların nispeten hızlı bir şekilde temizlendiğini gösterdi.Beyin, gözleri, çeneyi, kulakları ve cildin ve bağ dokularının kafatası kapağını parçalara ayırarak açığa çıkarıldı. İdeal olarak, beyin bu prosedür sırasında bozulmadan kalır. Bununla birlikte, ön beynin parçaları, özellikle koku alma ampulü, cildin veya çenenin kafatası kapağı çıkarıldığında muhtemelen hasar görmüş veya tamamen çıkarılmıştır.Dahası, bazen tektumun yanal çıkıntısı, beyni çıkarmak için cildi delerken veya sıkıştırırken dilimlenir. Hiçbir örnek aynı değildir. Bu nedenle, gerektiğinde göz çıkarma ve beyin diseksiyonu yoluyla ince adaptasyonlar yapabilmeniz gerekir.Hastalar ve keskin aletler başarı için şarttır. Bu teknik, optik tektum büyümesi ve gelişiminin moleküler ve hücresel mekanizmaları hakkında yeni bilgiler edinmek için in vivo canlı hücre görüntüleme veya RNA dizilimi gibi hücresel ve moleküler yaklaşımlarla takip edilebilir.

eye-removal-living-zebrafish-larvae-to-examine-innervation-dependent

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu videoda, biz gelişmekte olan omurgalı beyin konfokal mikroskobu ile tek bir hücre çözünürlükte canlı zebrafish embriyolar analiz edildiği bir yöntem gösteriyor. Bu, tek hücreli zebrafish embriyo enjekte ve daha sonra gelişmekte olan beyin montaj ve görüntü hangi yöntemi içerir.

Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

Lens geliştirme, diğer dokuları ile etkileşimleri içerir. Çeşitli zebrafish göz mutantlar anormal küçük bir lens boyutuna göre karakterize edilir. İşte biz bu fenotip içsel nedenler veya objektif çevreleyen dokuların arızalı etkileşimler nedeniyle olup olmadığını belirlemek için bir lens nakli deney göstermektedir.

Zebra balığı Lens Nakli ve Göz Mutants Analizi Uygulaması

VisioTracker göz hareketlerinin kayıt dayalı larva ve küçük yetişkin balık görsel performans kantitatif analizi için otomatik bir sistemdir. Bu tür görsel sistem gelişimi ve işlevi, farmakoloji, nöral devre çalışmaları ve sensorimotor entegrasyon gibi alanlarda yüksek verimli araştırma sağlayarak, görsel uyarana özellikleri ve gerçek zamanlı analiz üzerinde tam denetime sahiptir.

VisioTracker, Okülomotor Analizi Yenilikçi Otomatik Yaklaşım

Kaynak: Schramm, P.  et al. Uyanık Zebra Balığı Larvalarında ve Yavrularında Tam Aktif Beyin Dokusunun Kafatası ve Deri Çıkarma ile İn vivo Görüntülenmesi. J. Vis. Uzm. (2021)Bu video, Purkinje nöronlarında floresan proteinleri eksprese eden transgenik zebra balığı larvalarındaki serebellar nöronların in vivo görüntülemesini göstermektedir. İşlem, larvaların uyuşturulmasını, agarozda hareketsiz hale getirilmesini ve ışık penetrasyonunu ve floresan yoğunluğunu artırmak için pigmentli cildin...

Serebellar Nöronları Görselleştirmek için Zebra Balığı Larva Beyninin İn Vivo Görüntülenmesi

Zebra balığı larvalarının mikromanipülasyon ve elektroretinografi tekniklerini kullanarak elektroretinografik (ERG) analizi için bir yöntem sunuyoruz. Bu, zebra balığı larvalarının in vivo görsel işlevini test etmek için basit ve anlaşılır bir yöntemdir.

Zebra balığı Larva Görsel Tepki Elektroetinogram Analizi

Işık tabakası floresan mikroskobu, embriyonik gelişimi görüntülemek için mükemmel bir araçtır. Yakın fizyolojik koşullarda canlı embriyoların uzun hızlandırılmış filmlerinin kaydedilmesine izin verir. Geniş uzaysal-zamansal ölçeklerde zebra balığı gözü gelişimini görüntüleme uygulamasını gösteriyoruz ve çok görüntülü veri kümelerinin füzyonu ve evrişiminin çözülmesi için bir boru hattı sunuyoruz.

Görüntü Zebra balığı Göz Geliştirme Işık Sac floresan mikroskobu kullanarak

Lazer ile uzun dalga boyu çok foton Floresans uyarma mikroskobu tarama gelişmiş optik teknikleri bir arada Tg (sox10:EGFP) ve Tg (foxd3:GFP) Zebra balığı embriyo nöral crest göçün yüksek çözünürlüklü, üç boyutlu, gerçek zamanlı görüntüleme yakalamak için uygulanmıştır.

Geliştirme gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için çoklu foton zaman atlamalı görüntüleme: nöral Crest hücrelerde geçirme Zebra balığı embriyo görselleştirme

Burada, larva Zebra balığı ışık çatışmaya electroretinogram tepkiler ölçüm kolaylaştırır bir iletişim kuralı mevcut. Bir roman koni şeklindeki sünger-uç elektrot larva Zebra balığı electroretinogram ERG güvenilir sonuçlar ve daha düşük maliyet ile elde etmek için daha kolay kullanılmasını görsel geliştirme çalışma yapmak yardımcı olabilir.

Larva A roman koni şeklindeki sünger-uç elektrot kullanarak Zebra balığı Electroretinogram kayıt

Bu protokol, zebra balığının erken göz gelişiminin toto etiketlemesi ve çok boyutlu görüntülenmesi için bir yaklaşımı açıklar. Lazer tarama konfokal mikroskopisi kullanarak etiketleme, gömme ve dört boyutlu (4D) görüntülemeyi ve optik bardak morfogenezinin diseksiyon mekanizmaları için veri kümelerinin alımını optimize etmek için dikkat edilmesi gereken noktaları açıklıyoruz.

Zebra Balığı Optik Kupası Morfogenezinin 4 Boyutlu Görüntülenmesi

Burada zebra balığı embriyonik beynini larva ve çocuk evrelerine kadar in vivo olarak görüntüleyen bir yöntem sunuyoruz. Elektrofizyolojik yaklaşımlardan uyarlanan bu mikroinvaziv prosedür, olgun nöronun hücresel ve hücre altı ayrıntılarına erişim sağlar ve beyin fonksiyonu ve ilaç müdahalesini karakterize etmek için optogenetik ve nörofarmakolojik çalışmalarla birleştirilebilir.

Kafatası ve Deri Temizleme ile Uyanık Zebra Balığı Larvaları ve Yavrularında Tam Aktif Beyin Dokusunun In vivo Görüntülemesi

Burada, elde edilen verileri analiz etmek için ticari olarak temin edilebilen bir ışık tabakası mikroskobu ve bir görüntü işleme iş istasyonu kullanılarak oküler morfogenezin hızlandırılmış görüntülenmesi için bir protokol sağlanmaktadır. Bu protokol, embriyo anestezisi, düşük erime sıcaklığında agaroza gömülme, görüntüleme odasında süspansiyon, görüntüleme parametrelerinin ayarlanması ve son olarak görüntü analiz yazılımı kullanılarak görüntüleme verilerinin analiz edilmesi prosedürlerini...

Oküler Morfogenezi Lightsheet Microscopy ile rx3:GFP Transgenik Zebra Balığı Kullanarak Görselleştirme

Öğrenin, canlı zebra balığı larvalarında tek taraflı göz çıkarımı yöntemiyle optik tektum gelişimini ve görsel sistem innervasyonunu nasıl inceleyeceğinizi. Bu teknik sinirsel rejenerasyon ve dejenerasyon mekanizmalarını anlamanıza yardımcı olur.

Görsel Sistemin Innervasyona Bağlı Büyümesini ve Gelişimini İncelemek için Canlı Zebra Balığı Larvalarında Göz Çıkarılması

Daha fazla video keşfet