Name: Fare Primer Mikrogliasının Hayvan Demiyelinasyon Modellerinde Manyetik-Aktif Hücre Sıralama ile İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 53 s
Description: Öğrenin, fare beynindeki demiyelinasyon lezyonlarından manyetik-aktif hücre sıralama ile primer mikroglia izolasyonunu. Bu yöntem, nöroinflamasyon ve merkezi sinir sistemi hastalıklarında mikroglia davranışlarını in vivo çalışmak için optimize edilmiştir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Çalışma, Tongji Hastanesi (HUST) Mükemmel Genç Bilim İnsanı Vakfı (Hibe No. 2020YQ06) tarafından desteklenmiştir.

Tüm hayvan prosedürleri, Tongji Tıp Koleji, Huazhong Bilim ve Teknoloji Üniversitesi, Çin Hayvan Bakım Komitesi Enstitüsü tarafından onaylanmıştır.
1. Malzemeler
<ol><li>Protokole başlamadan önce aşağıdaki çözümleri hazırlayın.<ol>
<li>Fosfat tamponlu saline (PBS) fetal sığır serumu (FBS,% 2) ekleyerek yükleme tamponunu hazırlayın.</li>
		<li>PBS'ye nötr kırmızı (NR) boya (son %1) ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ticari olarak temin edilebilen Yetişkin Beyin Ayrışma Kitini kullanarak aşağıdaki çözümleri hazırlayın ( bkz.<ol>
<li>Enzim karışımı 1'i hazırlamak için, 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne 1,9 mL Tampon Z ve 50 μL Enzim P pipetin.</li>
		<li>Enzim karışımı 2'yi hazırlamak için, 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne 20 μL Tampon Y ve 10 μL Enzim A pipetin.</li>
		<li>Enkaz kaldırma çözeltisini hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Farelerin perfüzyonu ve diseksiyonu
<ol><li>İntraperitoneal olarak (i.p.) anesteziden önce fareye PBS'de 500 μL% 1 NR boya enjekte edin. NOT: Demiyelinizan fare modellerinde intraperitoneal NR enjeksiyonu lezyonların ayırt edilmesine yardımcı olur (Şekil 1).</li>
	<li>Pentobarbital (50 mg/kg, yani 50 mg) ile fareyi uyuşturun ve ağrı yanıtlarını inceleyerek farenin başarılı bir şekilde uyuşturulduğundan emin olun.</li>
	<li>Farenin göğüs boşluğunu açın ve kalbi açığa çıkarın.</li>
	<li>Sağ atriyumun küçük bir köşesini dikkatlice kesin ve fareyi sol ventrikülden 20-30 mL soğuk PBS ile intrakardiyal olarak perfüze edin.</li>
	<li>Farenin kafasını anestezi altında kesin.</li>
	<li>Farenin kafatasını açın ve beyni kafatasından dikkatlice kurtarın.</li>
	<li>Beyni fare beyin dilimi kalıbına aktarın ve beyni 0,1 cm'lik dilimler halinde kesin.</li>
	<li>Beyin dilimlerini çıkarın ve bir Petri kabında (60/15 mm) soğuk PBS'ye yerleştirin. Korpus kallozumun etrafındaki NR boyası ile etiketlenmiş lezyonları mikrocerrahi forseps kullanarak stereomikroskop altında mikrodiseke eder. NOT: Parçalanmış dokunun, sonraki transferi kolaylaştırmak için mümkün olduğunca eksiksiz olduğundan emin olun; toplam diseksiyon ilerlemesi 2 saat içinde tamamlanmalıdır.</li>
	<li>Disseke edilen dokuyu uygun miktarda soğuk yükleme tamponu içeren 15 mL santrifüj tüplerine aktarın. NOT: 2-3 fareden korpus kallozum dokusunu tek bir tüp içinde tek bir örnek olarak bir araya getirin.</li>
</ol>3. Doku ayrışması
<ol><li>Tüpün dibinde numune toplamak için disseke edilmiş dokuyu 300 ×g'de 30 s boyunca (bu hıza ulaştıktan sonra) santrifüj edin.</li>
	<li>Bir inkübatörde enzim karışımı 1 ve enzim karışımı 2 ila 37 ° C'yi önceden ısıtın.</li>
	<li>Bir numuneye 1.950 μL önceden ısıtılmış enzim karışımı 1 ekleyin ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de bir inkübatörde sindirin.</li>
	<li>30 μL önceden ısıtılmış enzim karışımı 2 ekleyin ve yavaşça karıştırın.</li>
	<li>37 ° C'de bir inkübatörde 15 dakika boyunca sindirin ve her 5 dakikada bir hafifçe karıştırın.</li>
	<li>Sindirimden sonra tüpe 4 mL soğuk PBS ekleyin ve hafifçe çalkalayın.</li>
	<li>50 mL santrifüj tüplerine 70 μm filtre yerleştirin ve filtreleri 500 μL soğuk PBS ile önceden ıslatın. Sindirilmiş doku örneklerini filtrelerden geçirerek ayrışmış dokuyu filtreleyin ve 50 mL santrifüj tüpündeki filtrelenmiş süspansiyonu 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. NOT: Doku miktarı çok küçükse bu adımı atlayın.</li>
	<li>Filtrelenmiş doku örneklerini 300 × g'de 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatantı yavaşça ve tamamen aspire edin. NOT: Enzimatik sindirim hariç tüm adımlar buz üzerinde yapılmalıdır.</li>
</ol>4. Enkaz kaldırma
<ol><li>Hücre peletini 1.550 μL soğuk PBS ile nazikçe yeniden askıya alın.</li>
	<li>Enkaz giderimi için 450 μL soğuk çözelti ekleyin ve iyice karıştırın.</li>
	<li>Yukarıdaki karışımı 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak 2 x 1 mL soğuk PBS ile çok yavaş ve nazik bir şekilde kaplayın. NOT: Santrifüj tüpünü 45° eğin ve pipetle birlikte tüp duvarı boyunca PBS'yi yavaşça ekleyin.</li>
	<li>Tüpü yavaşça ve nazikçe bir santrifüje aktarın ve 10 dakika boyunca 4 ° C ve 3.000 × g'da döndürün.</li>
	<li>Santrifüjlemeden sonra üç katman arayın. 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak iki üst katmanı tamamen aspire edin (Şekil 2).</li>
	<li>Tüpü 5 mL'ye kadar soğuk yükleme tamponuyla doldurun ve tüpü yavaşça üç kez ters çevirin.</li>
	<li>10 dakika boyunca 4 °C'de ve 1.000 × g'de santrifüj. Süpernatantı tamamen aspire edin ve hücre peletini bozmaktan kaçının.</li>
</ol>5. Mikroglial hücrelerin manyetik olarak ayrılması
<ol><li>Hücre peletini 90 μL yükleme tamponu ile yeniden askıya alın ve 10 μL CD11b (Microglia) boncukları ekleyin.</li>
	<li>İyice karıştırın ve 4 ° C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>1 mL yükleme tamponu ekleyin ve inkübasyondan sonra hücreleri yıkamak için sıvıyı 1.000 μL'lik bir pipetle yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücreleri 4 ° C ve 300 × g'da 10 dakika boyunca santrifüj edin ve bağlanmamış boncukları çıkarmak için süpernatantı tamamen aspire edin.</li>
	<li>Hücreleri 500 μL yükleme tamponunda yeniden askıya alın.</li>
	<li>Manyetik alanda pozitif seçim için MS sütununu ayırıcısıyla birlikte yerleştirin.</li>
	<li>Hücreleri korumak ve üreticinin protokolüne göre manyetik sıralamanın verimliliğini sağlamak için sütunu 500 μL yükleme tamponu ile durulayın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu MS sütununa uygulayın ve etiketsiz hücreler içeren akışı atın.</li>
	<li>Kolon duvarına yapışan hücreleri yıkamak ve akışı atmak için sütuna üç kez 500 μL yükleme tamponu ekleyin. NOT: Yalnızca kolon haznesi tamamen boşaldığında yıkamak için yeni yükleme tamponu ekleyin.</li>
	<li>Kolonu yıkadıktan sonra kolonu ayırıcıdan çıkarın ve 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin.</li>
	<li>Sütuna 1 mL yükleme tamponu ekleyin ve manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri temizlemek için pistonu sütunun altına itin. Manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri tamamen toplamak için bu adımı üç kez yineleyin.</li>
</ol>

<ol><li>Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGinhoux%2C+F+%22Science%22">Science</a>. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).</li>
<li>Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchulz%2C+C+%22Science%22">Science</a>. 336 (6077), New York, N.Y. 86-90 (2012).</li>
<li>Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaolicelli%2C+RC+%22Science%22">Science</a>. 333 (6048), New York, N.Y. 1456-1458 (2011).</li>
<li>Squarzoni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+modulate+wiring+of+the+embryonic+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain.</a> Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).</li>
<li>Ueno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer+V+cortical+neurons+require+microglial+support+for+survival+during+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Layer V cortical neurons require microglial support for survival during postnatal development.</a> Nature Neuroscience. 16 (5), 543-551 (2013).</li>
<li>Cunningham, C. L., Martínez-Cerdeño, V., Noctor, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+regulate+the+number+of+neural+precursor+cells+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (10), 4216-4233 (2013).</li>
<li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+function+in+the+central+nervous+system+during+health+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration.</a> Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).</li>
<li>Benmamar-Badel, A., Owens, T., Wlodarczyk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+microglial+subset+in+development%2C+aging%2C+and+disease%3A+Lessons+from+transcriptomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protective microglial subset in development, aging, and disease: Lessons from transcriptomic studies.</a> Frontiers in Immunology. 11, 430(2020).</li>
<li>Yıldızhan, K., Nazıroğlu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+its+role+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Neuroscience+and+Oxidative+Stress%22%5BJournal%5D)">Microglia and its role in neurodegenerative diseases.</a> Journal of Cellular Neuroscience and Oxidative Stress. 11 (2), 861-873 (2019).</li>
<li>Gutmann, D. H., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%2Fbrain+macrophages+as+central+drivers+of+brain+tumor+pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia/brain macrophages as central drivers of brain tumor pathobiology.</a> Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).</li>
<li>Hammond, T. R., Robinton, D., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+the+brain%3A+Complementary+partners+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Microglia and the brain: Complementary partners in development and disease.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 523-544 (2018).</li>
<li>Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+dynamics+during+human+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglial dynamics during human brain development.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1014(2018).</li>
<li>Masuda, T., Sankowski, R., Staszewski, O., Prinz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+heterogeneity+in+the+single-cell+era%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Microglia heterogeneity in the single-cell era.</a> Cell Reports. 30 (5), 1271-1281 (2020).</li>
<li>Ni, M., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+rat+primary+microglia%3A+isolation%2C+culturing%2C+and+selected+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications.</a> Current Protocols in Toxicology. , Chapter 12, Unit 12.17 (2010).</li>
<li>Yildizhan, K., Naziroglu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+depletion+and+parkinsonian+neurotoxin+MPP%28%2B%29-induced+TRPM2+channel+activation+play+central+roles+in+oxidative+cytotoxicity+and+inflammation+in+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Glutathione depletion and parkinsonian neurotoxin MPP(+)-induced TRPM2 channel activation play central roles in oxidative cytotoxicity and inflammation in microglia.</a> Molecular Neurobiology. 57 (8), 3508-3525 (2020).</li>
<li>Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of microglia.</a> Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70(2019).</li>
<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).</li>
<li>Gordon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+magnetic+separation+method+for+high-yield+isolation+of+pure+primary+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia.</a> Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 287-296 (2011).</li>
<li>Pan, J., Wan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+comparison+of+FACS+and+MACS+isolation+of+enriched+microglia+and+astrocytes+from+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain.</a> Journal of Immunological Methods. 486, 112834(2020).</li>
<li>Baydyuk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+evolution+of+CNS+remyelinating+lesion+in+mice+with+neutral+red+dye%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).</li>
<li>Sahel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+synaptic+connectivity+of+oligodendrocyte+precursor+cells+following+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Alteration of synaptic connectivity of oligodendrocyte precursor cells following demyelination.</a> Frontiers in Cell Neuroscience. 9, 77(2015).</li>
<li>Schroeter, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+brain-all+cells%3A+A+comprehensive+protocol+to+isolate+all+principal+CNS-resident+cell+types+from+brain+and+spinal+cord+of+adult+healthy+and+EAE+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice.</a> Cells. 10 (3), 651(2021).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+microdissected+mouse+brain+tissue+for+artifact+free+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100590(2021).</li>
<li>Marsh, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+sequencing+reveals+glial+specific+responses+to+tissue+processing+%26+enzymatic+dissociation+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Single cell sequencing reveals glial specific responses to tissue processing & enzymatic dissociation in mice and humans.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Holt, L. M., Olsen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+applications+of+magnetic+cell+sorting+to+analyze+cell-type+specific+gene+and+protein+expression+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system.</a> PLoS One. 11 (2), 0150290(2016).</li>
<li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing+analysis+reveals+quiescent+microglia+isolation+methods+from+postnatal+mouse+brains+and+limitations+of+BV2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing analysis reveals quiescent microglia isolation methods from postnatal mouse brains and limitations of BV2 cells.</a> Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 153(2018).</li>
</ol>

Yazarlar, rakip çıkarların olmadığını ilan etmişlerdir.

Protokol, demiyelinizan lezyonların etrafındaki mikrogliayı izole etmek için bir yöntem önermektedir, bu da inflamatuar demiyelinizan hastalıklarda mikroglianın fonksiyonel özelliklerini incelemeye yardımcı olabilir. CD11b boncukları kullanılarak yakalanan mikroglia, yüksek saflık ve canlılık gösterir. Protokoldeki kritik adımlar, odakların hassas lokalizasyonunu ve optimal mikroglial saflaştırmayı içerir. Protokol adım 2.1'de, lezyonların doğru bir şekilde görüntülenebilmesini sağlamak için fareyi feda etmeden önce NR s...

Mikroglia, embriyonik beyne çok erken ulaşan ve CNS 1,2'nin gelişimine katılan yumurta sarısı kesesi progenitörlerinden kaynaklanır. Örneğin, sinaptik budama3 ve aksonal büyümeyi düzenleyen4'te rol oynarlar. Nöronal sağkalımı destekleyen ve nöronal lokalizasyona yardımcı olan faktörleri salgılarlar5. Aynı zamanda, normal beyin gelişimini sağlamak için anormal hücrelerin ve apoptotik hücrelerin çıkarılmasında rol oynarlar6. Ek olarak, beynin bağışıklık yetkin hücreleri olarak, mikroglia ölü hücreleri, işlevsiz sinapsları ve hücresel kalıntıları temizlemek için beyin parankimini sürekli olarak izler7. Mikroglial aktivasyonun, inflamatuar demiyelinizan hastalıklar, nörodejeneratif hastalıklar ve beyin tümörleri de dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Multipl sklerozda (MS) aktive mikroglia, oligodendrosit öncü hücrelerinin (OPC'ler) farklılaşmasına ve miyelin kalıntılarını yutarak miyelinin rejenerasyonuna katkıda bulunur8.
Alzheimer hastalığında (AD), amiloid beta (Aβ) birikimi, mikroglia9'un fagositik ve enflamatuar fonksiyonlarını etkileyen mikroglia'yı aktive eder. Glioma ile ilişkili mikroglia (GAM) adı verilen glioma dokusundaki aktif mikroglia, gliomun ilerlemesini düzenleyebilir ve sonuçta hastaların prognozunu etkileyebilir10. Aktivasyon mikroglial transkriptomu derinden değiştirir, morfolojik değişikliklere, immün reseptörlerin ekspresyonuna, fagositik aktivitenin artmasına ve sitokin sekresyonunun artmasına neden olur11. Nörodejeneratif hastalıklarda hastalıkla ilişkili mikroglia (DAM), aktif yanıt mikroglia (ARM) ve mikroglial nörodejeneratif fenotip (MGnD)8 gibi farklı aktif mikroglia alt kümeleri vardır.
Benzer şekilde, mikroglia'nın çoklu dinamik fonksiyonel alt kümeleri de enflamatuar demiyelinizan hastalıklarda beyinde bir arada bulunur12. Mikroglia'nın farklı alt kümeleri arasındaki heterojenitenin anlaşılması, inflamatuar demiyelinizan hastalıkların patogenezini araştırmak ve potansiyel tedavi stratejilerini bulmak için gereklidir. Mikroglia'nın heterojenliği esas olarak moleküler özgüllüğe bağlıdır8. Heterojenliğin incelenmesi için mikroglia'nın moleküler değişikliklerini doğru bir şekilde tanımlamak esastır. Tek hücreli RNA dizileme (RNA-seq) teknolojisindeki ilerlemeler, patolojik koşullarda aktive mikroglianın moleküler özelliklerinin tanımlanmasını sağlamıştır13. Bu nedenle, hücre popülasyonlarını izole etme yeteneği, bu hedef hücrelerin belirli koşullar altında daha fazla araştırılması için kritik öneme sahiptir.
Mikroglia'nın özelliklerini ve işlevlerini anlamak için yapılan çalışmalar genellikle in vitro çalışmalardır, çünkü kültür şişelerine bağlanan ve plastik yüzeyde diğer karışık glial hücrelerle birlikte büyüyen fare yavrusu beyinlerinden (1-3 günlük) çok sayıda birincil mikroglianın hazırlanabileceği ve kültürlenebileceği bulunmuştur. Daha sonra, saf mikroglia, karışık glial hücrelerin farklı yapışkanlığına dayanarak izole edilebilir14,15. Bununla birlikte, bu yöntem sadece mikroglia'yı perinatal beyinden izole edebilir ve birkaç hafta sürer. Hücre kültüründeki potansiyel değişkenler, moleküler ekspresyon16 gibi mikroglial özellikleri etkileyebilir. Dahası, bu yöntemlerle izole edilen mikroglia, yalnızca CNS hastalıklarının koşullarını simüle ederek in vitro deneylere katılabilir ve in vivo hastalık durumlarında mikroglia'nın özelliklerini ve işlevlerini temsil edemez. Bu nedenle, mikroglia'yı yetişkin fare beyninden izole etmek için yöntemler geliştirmek gerekir.
Floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) ve manyetik ayırma, kendi farklı sınırlamalarına sahip olmalarına rağmen, yaygın olarak kullanılan iki yöntemdir16,17,18,19. İlgili avantaj ve dezavantajları tartışma bölümünde karşılaştırılacaktır. MACS teknolojisinin olgunlaşması, hücreleri hızla saflaştırma imkanı sunar. Huang ve ark. beyinlerdeki demiyelinizan lezyonları etiketlemek için uygun bir yöntem geliştirmişlerdir20. Bu iki teknik yaklaşımı birleştirerek, yetişkin fare beyinlerinde demiyelinizan lezyonlar etrafındaki mikrogliayı izole etmek ve mikroglia'nın moleküler özelliklerini korumak için adım adım bir açıklama sağlayan hızlı ve verimli bir sütunlu CD11b manyetik ayırma protokolü öneriyoruz. Fokal demiyelinizan lezyonlara, protokol 21'e başlamadan 3 gün önce korpus kallozuma 2 μL lizositin çözeltisinin (%0.9 NaCl'de %1 LPC) stereotaktik enjeksiyonu neden oldu. Bu protokol, in vitro deneylerde bir sonraki adımı gerçekleştirmek için temel oluşturur. Dahası, bu protokol zamandan tasarruf sağlar ve çeşitli deneylerde yaygın kullanım için uygun olmaya devam eder.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL Mikro Santrifüj Tüpleri</td><td>BIOFIL</td><td>CFT001015</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Santrifüj Tüpleri</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011150</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Santrifüj Tüpleri</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011500</td><td></td></tr><tr><td>70 & mikro; m Filtre</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>Yetişkin Beyin Ayrışma Kiti, fare ve sıçan</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-107-677</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J Fareler</td><td>SJA Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11b (Microglia) Boncuklar, insan ve fare</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-634</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>BOSTER</td><td>PYG0001</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>BD Biosciences</td><td>V10</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS Ayırıcı</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MS sütunları</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Nötr Kırmızı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1013690025</td><td></td></tr><tr><td>NovoCyte Akış Sitometresi</td><td>Agilent</td><td></td><td>A sisteminden oluşan bir sistem çeşitli parçaların</td></tr><tr><td>NovoExpress</td><td>Agilent</td><td>1.4.1</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>BOSTER</td><td>PYG0021</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-010</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>MshOt</td><td>MZ62</td><td></td></tr></tbody></table>

fare primer mikroglia'sının hayvan demiyelinasyon modellerinde manyetik-aktif hücre sıralama ile İzolasyonu

Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination

Beyindeki yerleşik doğuştan gelen bağışıklık hücreleri olan mikroglia, merkezi sinir sistemindeki (CNS) iltihaplanma veya yaralanmaya birincil yanıt verenlerdir. Mikroglia dinlenme durumuna ve aktif duruma ayrılabilir ve beynin mikro ortamına yanıt olarak durumu hızla değiştirebilir. Mikroglia farklı patolojik koşullar altında aktive olacak ve farklı fenotipler sergileyecektir. Ek olarak, aktif mikroglianın birçok farklı alt grubu ve farklı alt gruplar arasında büyük heterojenlik vardır. Heterojenlik esas olarak mikroglia'nın moleküler özgüllüğüne bağlıdır. Çalışmalar, mikroglia'nın aktive olacağını ve inflamatuar demiyelinizasyonun patolojik sürecinde önemli bir rol oynayacağını ortaya koymuştur. Multipl skleroz ve nöromiyelit optika spektrum bozukluğu gibi inflamatuar demiyelinizan hastalıklarda mikroglianın özelliklerini daha iyi anlamak için perilezyonel primer mikroglial sıralama protokolü öneriyoruz. Bu protokol, yüksek oranda saflaştırılmış primer mikroglia elde etmek ve mikroglia'nın moleküler özelliklerini korumak için kolumnar manyetik aktive hücre sıralamayı (MACS) enflamatuar demiyelinizan hastalıklarda mikroglia'nın potansiyel etkilerini araştırmak için kullanır.

CD11b boncukları kullanılarak izole edilen mikroglia yüksek saflığa sahiptir Demiyelinasyon fare modellerinde lezyonların etrafındaki mikroglial hücreler yukarıda belirtilen protokol kullanılarak izole edildi ve akım sitometrisi ile test edildi. Hücreler, üreticinin talimatlarına göre akış sitometrisinde mikrogliayı belirlemek için CD11b-floresein izotiyosiyanat (FITC) ve CD45-allofikosiyanin (APC) ile floresan olarak etiketlenir. CD11b ve CD45 antikorlarının izole mikroglia 19,22'nin<sup c...

Burada, kolumnar manyetik aktive hücre sıralamayı kullanarak, demiyelinizan hastalıkların hayvan modellerinde birincil mikrogliayı izole etmek ve saflaştırmak için bir protokol sunuyoruz.

Fare Primer Mikroglia'sının Hayvan Demiyelinasyon Modellerinde Manyetik-Aktif Hücre Sıralama ile İzolasyonu

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). ...

Bu protokol, mikroglia'yı yetişkin fare beyninin mikrodisseke demiyelinasyon lezyonlarından izole etmeye yardımcı olur ve mikroglial özellikleri in vivo olarak inceler. Bu teknik zamandan tasarruf sağlar ve hem deneyciler hem de ekipmanlar için daha düşük gereksinimlere sahiptir. Bu yöntem, mikroglia'yı hayvanın beyninden, özellikle de çeşitli hastalık durumlarındaki mikrodisseke dokuları izole etmeye yardımcı olur.Korpus kallozumun etrafındaki nötr boya ile etiketlenmiş lezyonların stereomikroskop altında mikrodiseksiyonu ile başlayın. Tüpün dibindeki numuneyi toplamak için disseke edilmiş dokuyu 30 saniye boyunca 300 kez g'de santrifüj yapın. Bir inkübatörde bir enzim karışımını önceden ısıtın ve enzim iki ila 37 santigrat derece karıştırın.Daha sonra, 1.950 mikrolitre önceden ısıtılmış enzim karışımı bir numuneye ekleyin ve beş dakika boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatörde sindirim. 30 mikrolitre önceden ısıtılmış enzim karışımı iki ekleyin ve yavaşça karıştırın. Sindirimden sonra, tüpe dört mililitre soğuk PBS ekleyin ve yavaşça çalkalayın.Doku örneklerini dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 300 kez g'de santrifüj yapın ve süpernatantı yavaşça ve tamamen aspire edin. Hücre peletini 1.550 mikrolitre soğuk PBS ile nazikçe yeniden askıya alın. Enkaz giderme için 450 mikrolitre soğuk çözelti ekleyin ve iyice karıştırın.Karışımı çok yavaş ve nazikçe iki mililitre soğuk PBS ile kaplamak için 1.000 mikrolitrelik bir pipet kullanın. Karışımı santrifüj edin ve ardından üç katmanı arayın. Üst iki katmanı tamamen aspire etmek için 1.000 mikrolitrelik bir pipet kullanın ve tüpü beş mililitreye kadar soğuk yükleme tamponuyla doldurun.Tüpü yavaşça üç kez ters çevirin. Daha sonra, süpernatanın santrifüjlenmesi ve aspirasyonundan sonra, hücre peletini 90 mikrolitre yükleme tamponu ile yeniden askıya alın ve 10 mikrolitre CD11b boncuk ekleyin. İyice karıştırın ve dört santigrat derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra, bir mililitre yükleme tamponu ekleyin ve sıvıyı 1.000 mikrolitrelik bir pipetle yukarı ve aşağı doğru hafifçe pipetleyerek hücreleri yıkayın. Hücreleri dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 300 kez g'de santrifüj edin ve bağlanmamış boncukları çıkarmak için süpernatantı tamamen aspire edin. Hücreleri yükleme tamponunun 500 mikrolitresinde yeniden askıya alın ve manyetik alanda pozitif seçim için MS sütununu ayırıcısıyla birlikte yerleştirin.Hücreleri korumak ve üreticinin protokolüne göre manyetik sıralamanın verimliliğini sağlamak için kolonu 500 mikrolitre yükleme tamponu ile durulayın. Hücre süspansiyonunu MS sütununa uygulayın ve etiketsiz hücreleri içeren akışı atın. Kolonu yıkamak için yükleme tamponundan 500 mikrolitre ekleyin ve ayırıcıdan çıkarın.Sütunu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve sütuna bir mililitre yükleme tamponu ekleyin. Son olarak, manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri temizlemek için pistonu sütunun altına doğru itin. Manyetikle aktive olmuş hücre sıralamasından önce ve sonra yetişkin farelerin demiyelinizasyon lezyonlarından izole edilen mikroglia'nın akış sitometri analizinde kullanılan geçit stratejisinin şematik bir temsili burada gösterilmiştir.Grafik görüntüler, hücreleri seçmek için ileri saçılma yüksekliğini ve yan saçılma yüksekliğini, tek hücreleri seçmek için ileri saçılma alanını ve ileri saçılma yüksekliğini ve miyeloid hücreleri ve mikrogliayı seçmek için CD11b-FITC ve CD45-APC'yi temsil eder. Mikroglia oranı, manyetik aktive hücre sıralamadan sonra önemli ölçüde artmıştır. Grafik görüntü, manyetik aktive edilmiş hücre sıralamadan sonra canlı ve ölü tek hücreler için akış sitometrisi analizinde kullanılan geçit stratejisini temsil eder.Burada, canlı hücreleri seçmek için 7-aminoaktinomisin D ve yan saçılma yüksekliği kullanılmıştır. Bu prosedürü denerken, nötr kırmızı işaretlere dayanan bir stereomikroskop altında demiyelinizan lezyonları tam olarak mikrodisseke etmeyi unutmayın.

isolation-mouse-primary-microglia-magnetic-activated-cell-sorting

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu videoda, manyetik olarak aktive edilmiş hücre sıralaması kullanarak fare yavrusu beyinlerinden mikroglia da dahil olmak üzere CD11b hücrelerini izole etmek için bir protokol açıklıyoruz. Beyin dokuları, anti-CD11b antikor kaplı mikro boncuklarla inkübe edilen tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için homojenize edilir, ardından CD11b+ hücre popülasyonunu saflaştırmak için manyetik sütun bazlı bir ayırma yapılır.

Mikroglia'nın Fare Yavrusu Beyinlerinden Manyetik İzolasyonu

Bu video, manyetik ayırma kullanılarak bir fare yavrusundan elde edilen bir nöral hücre süspansiyonundan birincil oligodendrosit hücrelerini izole etmek için bir yöntemi göstermektedir. Teknik, oligodendrosit antijenlerine özgü antikorlarla kaplanmış manyetik boncuklar kullanır ve bu hücrelerin seçici izolasyonunu sağlar.

Murin Primer Oligodendrositlerinin İmmünomanyetik Boncuklar Kullanılarak İzole Edilmesi

Bu video, manyetik hücre sıralama kullanarak fare beyinlerindeki demiyelinizan lezyonlardan mikroglial hücrelerin çıkarılması için bir protokolü göstermektedir. Protokol, mikroglial hücreler içeren lezyonlu beyin dokusunun diseksiyonunu, tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için dokunun spesifik enzimlerle tedavi edilmesini ve mikroglial hücreleri izole etmek için mikroglial reseptöre özgü manyetik boncukların kullanılmasını içerir.

Manyetik Aktif Hücre Sıralaması Kullanılarak Fare Beyni Demiyelinizan Lezyonlarından Mikroglia'nın İzole Edilmesi

Burada, in vitro deneyler için doğum sonrası fare yavrularından mikroglia izole etmek için bir protokol (gün 1) sunulmuştur. izolasyon Bu doğaçlama yöntem hem de yüksek verim ve saflıkta, mikroglial biyoloji açıklık amacıyla geniş bir aralık deney sağlar alternatif yöntemler üzerinde önemli bir avantaj oluşturur.

Geliştirilmiş Saflık ve Çok Yönlü İlköğretim mikroglia hızlı ve Rafine CD11 Manyetik İzolasyon

Bir iletişim kuralı üzerinden fare beyni birincil microglia yalıtım için sunulmaktadır. Bu teknik nörolojik koşullar geçerli anlayışı sürdürmek yardımcı olur. Yoğunluk gradient Santrifüjü ve manyetik ayırma son derece saf bir örnek yeterli verim üretmek için birleştirilmiştir. Ayrıca, biz microglia karakterizasyonu için adımlar verilmiştir.

Karakterizasyonu ve yoğunluk Gradient Santrifüjü tarafından fare birincil Microglia izolasyonu

Birincil fare oligodendrocytes, immunomagnetic izolasyonu vitro kültür için hücreleri hızlı ve spesifik yalıtım sağlar açıklar.

Fare birincil Oligodendrocytes hızlı ve spesifik Immunomagnetic izolasyonu

Biz yetişkin bir fare beyin yarımkürenin farklı parçalanmış bölgelerinden mikroglia izolasyoniçin bir protokol sağlamak, tam uzunlukta transkripsiyon derin tek hücreli RNA sıralama için yarı otomatik kütüphane hazırlık izledi. Bu yöntem, sağlık ve hastalık mikroglia fonksiyonel heterojenite açıklığa kavuşturmak için yardımcı olacaktır.

Derin Tek Hücreli RNA Sıralamaiçin Bir Yetişkin Fare Beyin Yarımküre'den Bölgeye Özgü MikrogliaNın İzolasyon

Primer mikroglia kültürleri, yeni anti-enflamatuar molekülleri değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır. Mevcut protokol, mikroglia'yı yenidoğan yavrulardan manyetik olarak izole etmek için tekrarlanabilir ve ilgili bir yöntemi tanımlamaktadır.

Birincil Hücre Kültürleri için Yenidoğan Fareden Mikroglial Hücrelerin Manyetik İzolasyonu

Manyetik olarak aktive edilmiş hücre sınıflandırması (MACS) kullanarak fare hipotalamusundan (veya eşdeğer küçük beyin yapılarından) mikroglial hücreleri nispeten kısa sürede izole etmek için bir protokol açıklıyoruz. MACS ile sıralanan hipotalamik mikroglia, ex vivo analiz için kullanılabilir ve in vitro testler yapmak üzere kaplanabilir.

Hipotalamik Mikroglia'nın Manyetik Olarak Aktive Edilmiş Hücre Ayıklama ile Yeni Perfüze Edilmiş Yetişkin Fare Beyninden İzolasyonu  

Biz periventriküler lökomalazi (PVL), prematüre bebeklerde periventriküler beyaz cevher lezyonları ile karakterize baskın beyin hasarı fare modelleri kurdu. Hipoksi / iskemi / sistemik enfeksiyon olmadan PVL birincil nedenleri. Tek taraflı karotis ligasyonu ve / lipopolisakkarid enjeksiyon olmadan hipoksi maruz P6 fareler PVL benzeri lezyonlar oluşturur.

Periventriküler lökomalazi Fare Modelleri

Öğrenin, fare beynindeki demiyelinasyon lezyonlarından manyetik-aktif hücre sıralama ile primer mikroglia izolasyonunu. Bu yöntem, nöroinflamasyon ve merkezi sinir sistemi hastalıklarında mikroglia davranışlarını in vivo çalışmak için optimize edilmiştir.

Fare Primer Mikroglia'sının Hayvan Demiyelinasyon Modellerinde Manyetik-Aktif Hücre Sıralama ile İzolasyonu

Daha fazla video keşfet