Fare Primer Mikroglia'sının Hayvan Demiyelinasyon Modellerinde Manyetik-Aktif Hücre Sıralama ile İzolasyonu
April 5th, 2022
Burada, kolumnar manyetik aktive hücre sıralamayı kullanarak, demiyelinizan hastalıkların hayvan modellerinde birincil mikrogliayı izole etmek ve saflaştırmak için bir protokol sunuyoruz.
Bu protokol, mikroglia'yı yetişkin fare beyninin mikrodisseke demiyelinasyon lezyonlarından izole etmeye yardımcı olur ve mikroglial özellikleri in vivo olarak inceler. Bu teknik zamandan tasarruf sağlar ve hem deneyciler hem de ekipmanlar için daha düşük gereksinimlere sahiptir. Bu yöntem, mikroglia'yı hayvanın beyninden, özellikle de çeşitli hastalık durumlarındaki mikrodisseke dokuları izole etmeye yardımcı olur.
Korpus kallozumun etrafındaki nötr boya ile etiketlenmiş lezyonların stereomikroskop altında mikrodiseksiyonu ile başlayın. Tüpün dibindeki numuneyi toplamak için disseke edilmiş dokuyu 30 saniye boyunca 300 kez g'de santrifüj yapın. Bir inkübatörde bir enzim karışımını önceden ısıtın ve enzim iki ila 37 santigrat derece karıştırın.
Daha sonra, 1.950 mikrolitre önceden ısıtılmış enzim karışımı bir numuneye ekleyin ve beş dakika boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatörde sindirim. 30 mikrolitre önceden ısıtılmış enzim karışımı iki ekleyin ve yavaşça karıştırın. Sindirimden sonra, tüpe dört mililitre soğuk PBS ekleyin ve yavaşça çalkalayın.
Doku örneklerini dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 300 kez g'de santrifüj yapın ve süpernatantı yavaşça ve tamamen aspire edin. Hücre peletini 1.550 mikrolitre soğuk PBS ile nazikçe yeniden askıya alın. Enkaz giderme için 450 mikrolitre soğuk çözelti ekleyin ve iyice karıştırın.
Karışımı çok yavaş ve nazikçe iki mililitre soğuk PBS ile kaplamak için 1.000 mikrolitrelik bir pipet kullanın. Karışımı santrifüj edin ve ardından üç katmanı arayın. Üst iki katmanı tamamen aspire etmek için 1.000 mikrolitrelik bir pipet kullanın ve tüpü beş mililitreye kadar soğuk yükleme tamponuyla doldurun.
Tüpü yavaşça üç kez ters çevirin. Daha sonra, süpernatanın santrifüjlenmesi ve aspirasyonundan sonra, hücre peletini 90 mikrolitre yükleme tamponu ile yeniden askıya alın ve 10 mikrolitre CD11b boncuk ekleyin. İyice karıştırın ve dört santigrat derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra, bir mililitre yükleme tamponu ekleyin ve sıvıyı 1.000 mikrolitrelik bir pipetle yukarı ve aşağı doğru hafifçe pipetleyerek hücreleri yıkayın. Hücreleri dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 300 kez g'de santrifüj edin ve bağlanmamış boncukları çıkarmak için süpernatantı tamamen aspire edin. Hücreleri yükleme tamponunun 500 mikrolitresinde yeniden askıya alın ve manyetik alanda pozitif seçim için MS sütununu ayırıcısıyla birlikte yerleştirin.
Hücreleri korumak ve üreticinin protokolüne göre manyetik sıralamanın verimliliğini sağlamak için kolonu 500 mikrolitre yükleme tamponu ile durulayın. Hücre süspansiyonunu MS sütununa uygulayın ve etiketsiz hücreleri içeren akışı atın. Kolonu yıkamak için yükleme tamponundan 500 mikrolitre ekleyin ve ayırıcıdan çıkarın.
Sütunu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve sütuna bir mililitre yükleme tamponu ekleyin. Son olarak, manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri temizlemek için pistonu sütunun altına doğru itin. Manyetikle aktive olmuş hücre sıralamasından önce ve sonra yetişkin farelerin demiyelinizasyon lezyonlarından izole edilen mikroglia'nın akış sitometri analizinde kullanılan geçit stratejisinin şematik bir temsili burada gösterilmiştir.
Grafik görüntüler, hücreleri seçmek için ileri saçılma yüksekliğini ve yan saçılma yüksekliğini, tek hücreleri seçmek için ileri saçılma alanını ve ileri saçılma yüksekliğini ve miyeloid hücreleri ve mikrogliayı seçmek için CD11b-FITC ve CD45-APC'yi temsil eder. Mikroglia oranı, manyetik aktive hücre sıralamadan sonra önemli ölçüde artmıştır. Grafik görüntü, manyetik aktive edilmiş hücre sıralamadan sonra canlı ve ölü tek hücreler için akış sitometrisi analizinde kullanılan geçit stratejisini temsil eder.
Burada, canlı hücreleri seçmek için 7-aminoaktinomisin D ve yan saçılma yüksekliği kullanılmıştır. Bu prosedürü denerken, nötr kırmızı işaretlere dayanan bir stereomikroskop altında demiyelinizan lezyonları tam olarak mikrodisseke etmeyi unutmayın.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, yetişkin fare beyinlerindeki demiyelinizasyon lezyonlarından primer mikroglianı izole etmek ve saflaştırmak için bir protokol sunar. Kolonlu manyetik-aktive hücre sıralama kullanarak, yöntem, mikroglial özelliklerinin in vivo çalışılmasını sağlarken zamanı ve kaynak gereksinimlerini optimize eder.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre biyolojisi
- Nöropatoloji
Arka Plan
- Mikroglia, nöroiltihap ve merkezi sinir sistemi hastalıklarında kritik roller oynar.
- Demiyelinizan durumlarda işlevlerini anlamak, hastalık mekanizmalarını anlamak için esastır.
- Spesifik patolojik durumlarla karakterize mikroglialarla ilgili çalışmalar için etkili izolasyon tekniklerine ihtiyaç vardır.
- Sunulan yöntem, bu hücrelerin izole edilmesindeki verimliliği artırmaya odaklanmaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Beynin hedeflenen bölgelerindeki mikrogliaların izolasyonu için güvenilir bir protokol geliştirmek.
- Mikroglial davranışı ve demiyelinizan hastalıklar bağlamındaki rollerini incelemeyi kolaylaştırmak.
- İzolasyon süreci boyunca kaynak kullanımını optimize etmek.
Kullanılan Yöntemler
- Demiyelinizasyon lezyonlarından stereomikroskop altında doku mikrodiseksiyonu.
- Mikroglia izolasyonu için kolonlu manyetik-aktive hücre sıralama kullanımı.
- Adımlar, etkili hücre izolasyonu için doku sindirimi, santrifüjleme ve hafif yeniden süspansiyonu içerir.
- Ana adımlar, enzim hazırlığı, çoklu santrifüj sıralamaları ve mikroglial örneklerin dikkatli işlenmesini içerir.
Ana Sonuçlar
- Protokol, izole edilen mikroglia oranını önemli ölçüde artırır.
- Akış sitometri analizi, miyeloidlerin başarılı sıralanmasını ve mikrogliaların spesifik tanımlanmasını göstermiştir.
- Hücre canlılığının değerlendirilmesi ve başarılı sıralamaların doğrulanması için canlı-ölü hücre boyaması yapılmıştır.
- Yöntem, demiyelinizan koşullarda mikroglial tepkilerinin daha kapsamlı bir anlayışını sağlar.
Sonuçlar
- Bu çalışma, nörolojik hastalıklardaki rolleri üzerine gelecekteki araştırmaları kolaylaştıran etkili bir mikroglia izolasyon yöntemi göstermiştir.
- İzolasyon tekniği, mikroglial davranışı üzerine in vivo bilgiyi geliştirmeye katkıda bulunarak, çeşitli hastalık modelleri için uygulanabilir kılar.
- Bu protokol, nörodejeneratif hastalıklarda mikroglial fonksiyonu hedef alan terapötik müdahalelerle ilgili çalışmaları geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Efficient isolation of primary microglia from demyelinated mouse brain tissue enables precise investigation of innate immune responses in disease-relevant CNS models. This capability supports mechanistic de-risking and target validation for neuroinflammatory and demyelinating disease pipelines. High-purity microglial preparations facilitate translational continuity from discovery through preclinical research in neuroimmunology portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of microglial activation states and phenotypic heterogeneity in disease-relevant CNS tissue.
- Supports functional target validation by preserving molecular characteristics of microglia from pathological lesions.
- Facilitates mechanistic de-risking for neuroinflammatory targets by isolating primary cells from in vivo models.
Screening & Assay Development
- Provides validated primary microglia for downstream functional assays and compound screening.
- Improves assay reproducibility and standardization by delivering high-purity, viable cell populations.
- Enables quantitative flow cytometry readouts for cell identity and viability, supporting robust assay development.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for translational biomarker discovery in demyelinating conditions.
- Maintains continuity from in vivo discovery to preclinical validation by preserving microglial molecular profiles.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by enabling direct study of microglial responses in pathological CNS environments.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum for neuroinflammatory and demyelinating disease research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on microglial activation and heterogeneity in CNS lesions.
- Screening: Delivers reproducible, high-purity microglia for functional and phenotypic assays.
- Analytics: Enables quantitative flow cytometry analysis of cell identity, viability, and population shifts.
- Translational Research: Preserves disease-relevant molecular features for biomarker and mechanistic studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for isolating primary CNS immune cells across models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in neuroimmune target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Streamlines cell isolation with lower equipment and expertise requirements.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision quality by enabling direct study of primary microglia from disease models.
- Portfolio Impact: Reduces late-stage biological risk and supports risk-adjusted prioritization in neuroinflammation pipelines.
Implementation Considerations
- Requires proficiency in microdissection and handling of CNS tissue under a stereomicroscope.
- Needs access to magnetic-activated cell sorting instrumentation and flow cytometry for validation.
- Demands cross-team standardization of tissue processing and gating strategies for reproducibility.
- Adaptation may be needed for different CNS regions or disease models to maintain cell purity and viability.
- Careful lesion identification and sample handling are critical to preserve molecular characteristics.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:42
Mice Dissection and Tissue Dissociation
1:35
Debris Removal and Magnetic Separation of Microglial Cells
3:26
Results: Gating Strategy Used in Flow Cytometry Analysis Before and After MACS and Gating Strategy for Living/Dead Single Cells After MACS
4:27
Conclusion
