Name: Escherichia colinin Sürekli Akış-PCR Mikroakışkan Çipinde Amplifikasyonu ve Kapiler Elektroforez Sistemi ile Tespiti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 12 s
Description: Öğrenin, mikroakışkan çip tabanlı sürekli akış-PCR ve kapiler elektroforez sistemleri kurarak Escherichia coli amplifikasyonunu ve tespitini nasıl gerçekleştireceğinizi. Bu yöntem, nükleik asit analizi için hızlı ve güvenilir bir laboratuvar protokolü sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Çin'in Şanghay Belediyesi Bilim ve Teknoloji Komisyonu tarafından desteklenmiştir (No. 19ZR1477500 ve No.18441900400). Şanghay Bilim ve Teknoloji Üniversitesi'nin (No.2017KJFZ049) mali desteğini minnetle kabul ediyoruz.

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve ekipmanlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
1. CF-PCR mikroakışkan çipinin üretimi
<ol><li>Nemi gidermek için silikon gofreti 200 °C'de 25 dakika ısıtın.</li>
	<li>Gofretin inç başına 1 mL SU-8-2075 fotorezist dağıtın. 100 rpm/s ivme ile 5-10 s boyunca 500 rpm'de ve ardından 500 rpm/s hızlanma ile 30 s boyunca 2.000 rpm'de bir spin kaplayıcı kullanarak silikon gofret üzerinde döndürün.</li>
	<li>Silikon gofreti 65 °C'de 3 dakika, ardından 95 °C'de 15 dakika pişirin.</li>
	<li>Fotolitografi makinesi için pozlama enerjisi olarak 150 - 215 mJ/cm² ayarlayın ve tasarlanan deseni bir fotolitografi maskesi ile fotorezist üzerine kazıyın. Silikon gofreti ve maskeyi pozlamaya hazır hale getirin.</li>
	<li>Maruz kaldıktan sonra, silikon gofreti 65 °C'de 2 dakika ve ardından 95 °C'de 7 dakika pişirin.</li>
	<li>Fazla fotorezisti çıkarmak için silikon gofreti geliştirici solüsyonuna daldırın ve mikrokanallar görülebildiğinde çıkarın (Şekil 1). Artık geliştirici solüsyonunu durulamak için izopropanol kullanın.</li>
	<li>Polidimetilsiloksan (PDMS) prepolimerini ve sertleştirici maddeyi 10:1 oranında karıştırın. Karışık PDMS çözeltisini replika kalıba dökün ve 80 °C'de 60 dakika katılaştırın.</li>
	<li>Bir plazma temizleyici kullanarak aktivasyondan sonra PDMS mikroakışkan çipini bir slayt üzerine yapıştırın ve mümkün olan en kısa sürede 80 ° C'de 30 dakika katılaştırın (Şekil 2). NOT: Çipin dış boyutları 80.0 mm × 30.0 mm × 0.4 mm'dir. Mikroakışkan çipte 40 adet serpantin kanalı (100 μm × 1.46 mm × 100 μm, genişlik × uzunluk × derinlik) bulunmaktadır.</li>
</ol>2. PCR çözeltisinin hazırlanması
<ol><li>Yapılandırmadan önce reaktifleri tamamen çözün. Reaktiflerin iyice karıştığından emin olmak için bir vorteks karıştırıcı ve santrifüj kullanın.</li>
	<li>Aşağıdaki bileşenleri bu sırayla ekleyerek bir santrifüj tüpü hazırlayın: 33.75 μL su, 1.0 μL DNA şablonu, 0.5 μL primer, 5.0 μL tampon, 4.0 μL dNTP karışımı, 1.5 μL Tween 20, 3.5 μL PVP ve son olarak 0.25 μL DNA polimeraz. NOT: Burada kullanılan DNA şablonu E. coli'dir. E. coli için primerler ve PCR çözeltisinin bileşenleri sırasıyla Tablo 1 ve Tablo 2'de listelenmiştir.</li>
	<li>Çözeltiyi girdap yaparak karıştırın.</li>
</ol>3. CF-PCR sisteminin yapısı
<ol><li>İki pozitif sıcaklık katsayısı (PTC) seramik ısıtıcı, iki katı hal rölesi, iki PID sıcaklık kontrol cihazı, iki sıcaklık sensörü ve bir güç kablosu hazırlayın. NOT: PTC seramik ısıtıcıların boyutu, mikroakışkan çipin boyutuna bağlıdır; uzunluk çip uzunluğundan büyük olmalıdır - burada kullanılan PTC seramik ısıtıcıların uzunluk-genişlik-yüksekliği 10 cm x 2 cm x 0,4 cm'dir.</li>
	<li>Isıtıcıyı yarıiletken röleye bağlayın.</li>
	<li>Katı hal rölesini PID sıcaklık kontrol cihazına bağlayın.</li>
	<li>Sıcaklık sensörü probunu iki ısıtıcının altına takın ve terminali PID sıcaklık kontrol cihazına bağlayın.</li>
	<li>İki katı hal rölesini seri olarak bağlayın ve güç kablosunu bağlayın.</li>
	<li>3D iki ısıtıcı için bir yuva yazdırın ve ısıtıcıları aynı düzlemde tutun (3D baskı için gereken STL dosyaları için Ek Dosya 1'e bakın). NOT: İki ısıtıcı arasında 12 mm hava boşluğu bırakın.</li>
	<li>Mikroakışkan çipi iki ısıtıcının üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Bir şırınga pompası ve bir şırınga hazırlayın, şırıngayı şırınga pompasına sabitleyin, bir şırınga ile bir silikon boru (0.8 mm iç çap [ID]) bağlayın ve silikon borunun üstüne bir çelik iğne (0.7 mm ID) bağlayın (Şekil 3).</li>
	<li>Çelik iğneyi mikroakışkan çipin girişine yerleştirin.</li>
	<li>PCR ürünlerini toplamak için çipin çıkışına bir pipet ucu yerleştirin.</li>
</ol>4. CE sisteminin inşası
<ol><li>Darbeli alanlı bir elektrik alanı oluşturmak için yüksek voltajlı bir güç kaynağı kullanın; Pozitif ve negatif elektrotlara dikkat edin.</li>
	<li>Işık kaynağı olarak bir cıva lambası kullanın ve cıva lambasından gelen uyarma dalga boyunu bir filtreden geçirin.</li>
	<li>Kılcal damarı mikroskop tablasına yerleştirin.</li>
	<li>Floresan emisyonunu objektifle toplayın ve ardından bir R928 fotoçoğaltıcı tüp (PMT) kullanarak tespit edin. Mikroskobu ve kılcal damarı gözlemleyin. Karanlık oda koşullarında ışığı açın; Uyarma ışığı objektif tarafından toplanır.</li>
	<li>Güç kaynağını kontrol etmek ve veri toplamayı tamamlamak için kendi geliştirdiği LABVIEW yazılımını kullanın (6.3-6.6 adımlarında açıklanmıştır). https://github.com/starliyan/labview/blob/main/CZE20170723.vi bakın. NOT: Tüm deneyler karanlık bir odada gerçekleştirilmiştir ve CE sisteminin şeması Şekil 4'te gösterilmiştir.</li>
</ol>5. PCR çözümünü çalıştırın
<ol><li>CF-PCR sisteminin ısıtıcılarının sıcaklığını 65 °C ve 95 °C'de önceden ayarlayın.</li>
	<li>Mikroakışkan çipi iki ısıtma bloğuna yerleştirin.</li>
	<li>Silikon tüpün ucunu 50 μL PCR solüsyonu içeren bir santrifüj tüpüne yerleştirin (adım 2.3'ten itibaren). Çözeltiyi yavaşça çekmek için şırınga pistonunu çekin. Şırıngayı bir şırınga pompasına sabitleyin. Çelik iğneyi mikroakışkan çipin girişine yerleştirin.</li>
	<li>Pompanın akış hızını 10 μL/dk'ya ayarlayın ve çözeltiyi mikroçipin girişindeki mikrokanala itmek için başlat düğmesine basın.</li>
	<li>PCR ürünlerini mikroakışkan çipin çıkışında toplayın. NOT: Kirleri gidermek için PCR'den önce ve sonra kanalı ultra saf suyla durulayın.</li>
</ol>6. PCR ürünlerinin şirket içinde oluşturulan bu CE sistemi ile tespiti
<ol><li>Toplam uzunluğu 8 cm ve etkili uzunluğu 6 cm olan bir kılcal damar hazırlayın.</li>
	<li>100 μL %1 hidroksietilselüloz (HEC, a/h), 2 μL 100x SYBR Green I ve 98 μL ultra saf suyu karıştırarak 1x SYBR Green I içeren %0,5 HEC (a/h) elde ederek ayırma tamponunu hazırlayın.</li>
	<li>Kılcal damarı bir vakum pompası kullanarak hazırlanan ayırma tamponu ile doldurun.</li>
	<li>Yazılım arayüzünde enjeksiyon voltajını (800 V) ve enjeksiyon süresini (2.0 s) girin, başlat düğmesine tıklayın ve PCR ürünlerinin 100 V/cm'de (2.0 s) elektrodinamik olarak kılcal damara verilmesini bekleyin. NOT: Bu adımda, PCR ürünleri negatif elektrot üzerine yerleştirilir ve tampon pozitif elektrot üzerine yerleştirilir.</li>
	<li>Yazılım arayüzüne DC voltajını (800 V) girin, başlat düğmesine tıklayın ve elektroforezi 100 V/cm elektrik alan gücünde çalıştırın. NOT: Bu adımda, hem pozitif hem de negatif elektrotlar tampon ile yerleştirilir.</li>
	<li>Tüm DNA parçaları kılcal damarda ayrıldıktan sonra durdur düğmesine tıklayın.</li>
	<li>Her çalıştırmadan sonra kılcal damarı 1 dakika sterilize suyla yıkayın.</li>
</ol>

<ol><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-in-one+microfluidic+device+for+on-site+diagnosis+of+pathogens+based+on+an+integrated+continuous+flow+PCR+and+electrophoresis+biochip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">All-in-one microfluidic device for on-site diagnosis of pathogens based on an integrated continuous flow PCR and electrophoresis biochip.</a> Lab on a Chip. 19 (16), 2663-2668 (2019).</li>
<li>Crews, N., Wittwer, C., Gale, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous-flow+thermal+gradient+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Continuous-flow thermal gradient PCR.</a> Biomedical Microdevices. 10 (2), 187-195 (2008).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+fabrication+of+portable+continuous+flow+PCR+microfluidic+chip+for+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Design and fabrication of portable continuous flow PCR microfluidic chip for DNA replication.</a> Biomedical Microdevices. 22 (1), 5(2019).</li>
<li>Kim, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+and+characterization+of+a+PDMS-glass+hybrid+continuous-flow+PCR+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Engineering+Journal%22%5BJournal%5D)">Fabrication and characterization of a PDMS-glass hybrid continuous-flow PCR chip.</a> Biochemical Engineering Journal. 29 (1-2), 91-97 (2006).</li>
<li>Shen, K., Chen, X., Guo, M., Cheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microchip-based+PCR+device+using+flexible+printed+circuit+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+B%3A+Chemical%22%5BJournal%5D)">A microchip-based PCR device using flexible printed circuit technology.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 105 (2), 251-258 (2005).</li>
<li>Harstad, R. K., Johnson, A. C., Weisenberger, M. M., Bowser, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Capillary Electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 88 (1), 299-319 (2016).</li>
<li>Redman, E. A., Mellors, J. S., Starkey, J. A., Ramsey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+intact+antibody+drug+conjugate+variants+using+microfluidic+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of intact antibody drug conjugate variants using microfluidic capillary electrophoresis-mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 88 (4), 2220-2226 (2016).</li>
<li>Britz-Mckibbin, P., Kranack, A. R., Paprica, A., Chen, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assay+for+epinephrine+in+dental+anesthetic+solutions+by+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Quantitative assay for epinephrine in dental anesthetic solutions by capillary electrophoresis.</a> Analyst. 123 (7), 1461-1463 (1998).</li>
<li>Maeda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+real-time+PCR+using+TaqMan+and+SYBR+Green+for+Actinobacillus+actinomycetemcomitans%2C+Porphyromonas+gingivalis%2C+Prevotella+intermedia%2C+tetQgene+and+total+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative real-time PCR using TaqMan and SYBR Green for Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, tetQgene and total bacteria.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 39 (1), 81-86 (2003).</li>
<li>Hajba, L., Guttman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+column+coatings+for+capillary+electrophoresis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22TrAC+Trends+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recent advances in column coatings for capillary electrophoresis of proteins.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 38-44 (2017).</li>
<li>Kleparnik, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+combination+of+capillary+electrophoresis+with+mass+spectrometry%3A+methodology+and+theory%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Recent advances in combination of capillary electrophoresis with mass spectrometry: methodology and theory.</a> Electrophoresis. 36 (1), 159-178 (2015).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Hem PCR hem de CE, nükleik asitlerin analizinde iki popüler biyoteknolojidir. Bu makale, her ikisi de şirket içinde yerleşik olan CF-PCR ve CE sistemleri kullanılarak E. coli'nin amplifikasyonunu ve PCR ürünlerinin tespitini açıklamaktadır. E. coli'nin hedef geni, yüksek ısı transfer hızları nedeniyle 10 dakika içinde başarılı bir şekilde amplifiye edildi. 1.500 bp'den küçük DNA parçaları 8 dakika içinde ayrıldı (Şekil 5). Bu iki tekniğin en büyük avantajı, geleneksel PCR v...

Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), spesifik DNA fragmanlarını çoğaltmak için kullanılan bir moleküler biyoloji tekniğidir, böylece eser miktarda DNA'yı yüz milyonlarca kez çoğaltır. Klinik tanı, tıbbi araştırma, gıda güvenliği, adli kimlik tespiti ve diğer alanlarda yaygın olarak kullanılmaktadır. PCR işlemi temel olarak üç adımdan oluşur: 90-95 °C'de denatürasyon, 50-60 °C'de tavlama ve 72-77 °C'de uzatma. Termal döngü, PCR sürecinin önemli bir parçasıdır; bununla birlikte, geleneksel PCR termal döngüleyici yalnızca hantal değil, aynı zamanda verimsizdir ve 25 döngüyü tamamlamak için yaklaşık 40 dakika gerektirir. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, şirket içinde mikroakışkan bir çipe dayalı sürekli akışlı bir PCR (CF-PCR) sistemi kuruldu. CF-PCR, PCR solüsyonunu farklı sıcaklıklardaısıtıcılara yerleştirilen mikro kanallara sürerek zamandan büyük ölçüde tasarruf sağlayabilir 1,2,3,4,5.
Kapiler elektroforez (CE), yüksek çözünürlük, yüksek hız ve mükemmel tekrarlanabilirlik 6,7,8,9,10,11 gibi birçok avantaja sahip olduğundan, laboratuvarda nükleik asitlerin ve proteinlerin analizi için popüler bir araç haline gelmiştir. Bununla birlikte, çoğu laboratuvar, özellikle gelişmekte olan dünyadaki laboratuvarlar, CE cihazının yüksek fiyatı nedeniyle bu teknolojiyi karşılayamaz. Burada, CF-PCR mikroakışkan çipinin nasıl üretileceğine ve laboratuvarda çok yönlü bir CE sisteminin nasıl oluşturulacağına ilişkin protokolleri özetledik. Ayrıca, bu CF-PCR sistemi ile E. coli'nin amplifikasyon sürecini ve PCR ürünlerinin CE sistemi tarafından tespit edilmesini de gösteriyoruz. Bu protokolde açıklanan prosedürleri izleyerek, kullanıcılar mikroakışkan çipler üretebilmeli, PCR çözeltileri hazırlayabilmeli, nükleik asit amplifikasyonu için bir CF-PCR sistemi oluşturabilmeli ve DNA parçalarını ayırmak için sınırlı kaynaklarla bile basit bir CE sistemi kurabilmelidir.

<table><tbody><tr><td>100 bp DNA merdiveni</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>3422A</td><td></td></tr><tr><td>10x Hızlı Tampon I</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>RR070A</td><td></td></tr><tr><td>10x TBE</td><td>Pekin Solarbio Bilim &amp; Teknoloji Co., Ltd.</td><td>T1051</td><td></td></tr><tr><td>geliştirici çözümü</td><td>Alfa Aesar, ABD</td><td>L15459</td><td></td></tr><tr><td>dNTP karışımı (2.5 μ M)</td> <td>Takara Biyo A.Ş.</td><td>RR070A</td><td></td></tr><tr><td>EC-F</td><td>Sangon Biotech, Şangay, Çin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EC-R</td><td>Sangon Biotech, Şangay, Çin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEC, 1300K</td><td>Sigma-Aldrich, ABD</td><td>9004-62-0</td><td></td></tr><tr><td>izopropanol</td><td>Aladdin, Şangay, Çin</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>mikroskop</td><td>Olympus, Japonya</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>fotolitografi ve nbsp;</td><td>SUSS MicroTec, Almanya</td><td>MJB4</td><td></td></tr><tr><td>fotoçoğaltıcı tüp </td><td>Hamamatsu Photonics, Japonya</td><td>R928</td><td></td></tr><tr><td>fotorezist</td><td>MicroChem, ABD</td><td>SU-8 2075</td><td></td></tr><tr><td>PID sıcaklık kontrol cihazları </td><td>Şangay, Çin</td><td>XH-W2023</td><td></td></tr><tr><td>plazma temizleyici </td><td>Harrick Plazma</td><td>PDC-32G-2</td><td></td></tr><tr><td>polivinil pirolidon (PVP)</td><td>Aladdin, Şangay, Çin</td><td>P110608</td><td></td></tr><tr><td>pompası</td><td>Harvard</td><td>Aparatı PHD2000</td><td></td></tr><tr><td>silikon boru ve nbsp;</td><td>BIO-RAD, ABD</td><td></td><td></td></tr> 7318210 <tr><td>katı hal röleleri</td><td>KZLTD, Çin</td><td>KS1-25LA</td><td></td></tr><tr><td>SpeedSTAR HS DNA Polimeraz </td><td>Takara Biyo A.Ş.</td><td>RR070A</td><td></td></tr><tr><td>çelik iğne</td><td>zhongxinqiheng, Suzhou, Çin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYBR YEŞİL <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/63523/63523eq01.jpg" style="margin: auto; "></td><td>Solarbio, Pekin, Çin</td><td>SY1020</td><td></td></tr><tr><td>sıcaklık sensörleri</td><td>EasyShining Technology, Chengdu, Çin</td><td>TCM-M207</td><td></td></tr><tr><td>Şablon (E. coli)</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>AK601</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Aladdin, Şangay, Çin</td><td>T104863</td><td></td></tr><tr><td>gerilim güç kaynağı </td><td>Medine, NY, ABD</td><td>TREK MODEL 610E</td><td></td></tr></tbody></table>

escherichia coli'nin sürekli akış-pcr mikroakışkan Çipinde amplifikasyonu ve kapiler elektroforez sistemi ile tespiti

Amplification of Escherichia coli in a Continuous-Flow-PCR Microfluidic Chip and Its Detection with a Capillary Electrophoresis System

Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), biyomoleküler tanıda önemli bir rol oynayan bir hedef genin amplifikasyonu için kullanılan geleneksel bir yöntemdir. Bununla birlikte, geleneksel PCR, düşük sıcaklık varyasyon verimliliği nedeniyle çok zaman alıcıdır. Bu çalışma, mikroakışkan bir çipe dayalı bir sürekli akış-PCR (CF-PCR) sistemi önermektedir. Amplifikasyon süresi, PCR solüsyonunun farklı sıcaklıklara ayarlanmış ısıtıcılara yerleştirilen bir mikro kanala çalıştırılmasıyla büyük ölçüde azaltılabilir. Ayrıca, kapiler elektroforez (CE), pozitif ve yanlış pozitif PCR ürünlerini ayırt etmenin ideal bir yolu olduğundan, DNA fragmanlarının verimli bir şekilde ayrılmasını sağlamak için bir CE sistemi inşa edilmiştir. Bu makale, Escherichia coli'nin (E. coli) şirket içinde oluşturulan CF-PCR sistemi ile amplifikasyon sürecini ve PCR ürünlerinin CE ile tespitini açıklamaktadır. Sonuçlar, E. coli'nin hedef geninin 10 dakika içinde başarılı bir şekilde amplifiye edildiğini göstermektedir, bu da bu iki sistemin nükleik asitlerin hızlı amplifikasyonu ve tespiti için kullanılabileceğini göstermektedir.

Şekil 5, PCR ürünlerinin elektroferogramını ve DNA belirteçlerini temsil etmektedir. İz (Şekil 5A), CF-PCR ile çoğaltılmış ürünün CE sonucudur, iz (Şekil 5B), termal döngü ile çoğaltılan ürünün CE sonucudur ve iz (Şekil 5C), 100 bp DNA merdiveninin CE sonucudur. İlk olarak CF-PCR sisteminde E. coli'nin hedef genini çoğalttık; PCR çözeltisi, çipin girişinden çıkışına kadar ~ 10 dakika, 30 saniye...

Bu protokol, bir mikroakışkan çipe dayalı bir sürekli akışlı polimeraz zincir sisteminin nasıl oluşturulacağını ve laboratuvarda bir kapiler elektroforez sisteminin nasıl oluşturulacağını açıklar. Laboratuvarda nükleik asitlerin analizi için basit bir yöntem sunar.

Escherichia coli'nin Sürekli Akış-PCR Mikroakışkan Çipinde Amplifikasyonu ve Kapiler Elektroforez Sistemi ile Tespiti

Polymerase chain reaction (PCR) is a traditional method employed for the amplification of a target gene that has played an important role in biomolecular ...

Bu protokol, mikroakışkan çipe dayalı bir sürekli akışlı polimeraz zincir sisteminin nasıl oluşturulacağını ve laboratuvarda bir kapiler elektroforez sisteminin nasıl oluşturulacağını açıklar. Laboratuvarda nükleik asitlerin analizi için basit bir yol sunar. Polimeraz zincir reaksiyonu, hedef genin amplifikasyonu için kullanılan geleneksel bir yöntemdir.Bununla birlikte, geleneksel PCR, düşük sıcaklık varyasyon verimliliği nedeniyle çok zaman alıcıdır. Bu çalışma, mikroakışkan çipe dayalı bir sürekli akış-PCR sistemi önermektedir. Amplifikasyon süresi, PCR solüsyonunun farklı sıcaklıklara ayarlanmış ısıtıcılara yerleştirilen bir mikro kanala çalıştırılmasıyla büyük ölçüde azaltılabilir.CE, yüksek çözünürlük, yüksek hız ve mükemmel tekrarlanabilirlik gibi birçok avantaja sahip olduğundan, laboratuvarda nükleik asitlerin ve proteinlerin analizi için popüler bir araç haline geldi. Bununla birlikte, çoğu laboratuvar, özellikle gelişmekte olan dünyadaki laboratuvarlar, CE cihazının yüksek fiyatı nedeniyle bu teknolojiyi karşılayamamaktadır. Burada, CF-PCR mikroakışkan çipinin nasıl üretileceğine ve laboratuvarda çok yönlü bir CE sisteminin nasıl oluşturulacağına ilişkin protokolleri özetledik.Ayrıca Escherichia coli'nin CF-PCR sistemi ile amplifikasyon sürecini ve PCR ürünlerinin CE sistemi tarafından tespit edilmesini de gösteriyoruz. Bu protokolde açıklanan prosedürleri izleyerek, kullanıcılar mikroakışkan çipler üretebilmeli, PCR çözeltisi hazırlayabilmeli, nükleik asit amplifikasyonu için bir CF-PCR sistemi oluşturabilmeli ve DNA parçalarını ayırmak için sınırlı kaynaklarla bile basit bir CE sistemi kurabilmelidir. Nemi gidermek için silikon gofreti 200 santigrat derecede 25 dakika ısıtın.Gofretin inç başına bir mililitre SU-8 2075 fotorezist dağıtın. Saniyede 100 rpm'lik bir ivme ile 5 ila 10 saniye boyunca 500 rpm'de ve ardından saniyede 500 rpm'lik bir ivme ile 30 saniye boyunca 2.000 rpm'de bir sıkma kaplayıcı kullanarak silikon gofret üzerinde döndürün. 65 santigrat derecede üç dakika ve 95 santigrat derecede 15 dakika pişirin.Fotolitografi makinesi için pozlama enerjisi olarak santimetre kare başına 150 ila 215 milijoule ayarlayın ve tasarlanan deseni bir fotolitografi maskesi ile fotorezist üzerine kazıyın. Silikon gofret ve maskeyi pozlamaya hazır hale getirin. Maruz kaldıktan sonra, gofreti 65 santigrat derecede iki dakika ve 95 santigrat derecede yedi dakika pişirin.Fazla fotorezisti çıkarmak için silikon gofreti geliştirici solüsyonuna daldırın ve mikrokanallar görülebildiğinde çıkarın. Ardından, kalan geliştirici çözeltisini durulamak için izopropanol kullanın. Polidimetilsiloksan prepolimerini ve sertleştirici maddeyi 10 ila 1 oranında karıştırın.Karışık PDMS çözeltisini replika kalıba dökün ve 80 santigrat derecede 60 dakika katılaştırın. PDMS mikroakışkan çipini bir plazma temizleyici kullanarak aktivasyondan sonra bir slayt üzerine yapıştırın ve mümkün olan en kısa sürede 30 dakika boyunca 80 santigrat derecede katılaştırın. Reaktiflerin iyice karıştığından emin olmak için bir vorteks karıştırıcı ve santrifüj kullanın.Bir santrifüj tüpü hazırlayın. İlk önce santrifüj tüpüne su ekleyin. Ardından DNA şablonunu, primeri, tamponu, dNTP karışımını, Tween 20'yi, PVP'yi ekleyin ve son olarak DNA polimerazı ekleyin.Son olarak, çözeltiyi girdap ile karıştırın. İki PTC seramik ısıtıcı, iki katı hal rölesi, iki sıcaklık kontrol cihazı, iki sıcaklık sensörü ve bir güç kablosu hazırlayın. Isıtıcıyı yarıiletken röleye bağlayın.Katı hal rölesini PID sıcaklık kontrol cihazına bağlayın. Ardından sıcaklık sensörü probunu iki ısıtıcının altına takın ve terminali PID sıcaklık kontrol cihazına bağlayın. Son olarak, iki katı hal rölesini seri olarak bağlayın ve güç kablosunu bağlayın.İki ısıtıcı için bir yuvayı 3D yazdırın ve ısıtıcıları aynı düzlemde tutun. Mikroakışkan çipi iki ısıtıcının üzerine yerleştirin. Bir şırınga pompası ve bir şırınga hazırlayın, ardından şırıngayı şırınga pompasına sabitleyin.Bir şırınga ile bir silikon boru bağlayın ve silikon borunun üstüne çelik bir iğne bağlayın. Çelik iğneyi mikroakışkan çipin girişine yerleştirin. PCR ürünlerini toplamak için çipin çıkışına bir pipet ucu yerleştirin.Darbeli alanlı bir elektrik alanı oluşturmak için yüksek voltajlı bir güç kaynağı kullanın. Bakın, bu yüksek voltajlı bir güç kaynağı. Bunlar pozitif ve negatif elektrotlardır.Işık kaynağı olarak bir cıva lambası kullanın ve cıva lambasından gelen uyarma dalga boyunu bir filtreden geçirin. Kılcal damarı mikroskop tablasına yerleştirin. Floresan emisyonunu objektifle toplayın ve ardından bir fotoçoğaltıcı tüp ile tespit edin.Bu bizim mikroskobumuz ve bu bizim kılcal damarımız. Şimdi karanlık oda koşullarında ışığı açıyoruz. Uyarma ışığı objektif tarafından toplanır.Güç kaynağını kontrol etmek ve veri toplamayı tamamlamak için kendi geliştirdiği LABVIEW yazılımını kullanın. CF-PCR sisteminin ısıtıcılarının sıcaklığını 65 santigrat derece ve 95 santigrat derece olarak önceden ayarlayın. Mikroakışkan çipi iki ısıtma bloğuna yerleştirin.Silikon tüpün ucunu 50 mikrolitre PCR solüsyonu içeren bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Çözeltiyi yavaşça çekmek için şırınga pistonunu çekin. Şırıngayı bir şırınga pompasına sabitleyin.Çelik iğneyi mikroakışkan çipin girişine yerleştirin. Pompanın akış hızını dakikada 10 mikrolitreye ayarlayın ve çözeltiyi mikroçipin girişindeki mikrokanala itmek için başlat düğmesine basın. PCR ürünlerini mikroakışkan çipin çıkışında toplayın.Toplam uzunluğu 8 santimetre ve etkili uzunluğu 6 santimetre olan bir kılcal damar hazırlayın. 100 mikrolitre %1 HEC, iki mikrolitre 100x SYBR Green ve 98 mikrolitre ultra saf suyu karıştırarak 1x SYBR Green içeren %0,5 HEC elde ederek ayırma tamponunu hazırlayın. Kılcal damarı bir vakum pompası kullanarak hazırlanan ayırma tamponu ile doldurun.Yazılım arayüzüne enjeksiyon voltajını ve enjeksiyon süresini girin, başlat düğmesine tıklayın ve PCR ürünlerinin elektrodinamik olarak kılcal damara girmesini bekleyin. Yazılım arayüzüne DC voltajını girin, başlat düğmesine tıklayın ve elektroforezi elektrik alan şiddetinin santimetresi başına 100 voltta çalıştırın. Tüm DNA parçaları kılcal damarda ayrıldıktan sonra durdur düğmesine tıklayın.Kılcal damarı her çalıştırmadan sonra bir dakika sterilize suyla yıkayın. Bu resim, PCR ürünlerinin ve DNA belirteçlerinin elektroferogramını temsil etmektedir. İlk olarak Escherichia coli'nin hedef genini CF-PCR sisteminde çoğalttık ve PCR solüsyonu çipin girişinden çıkışına kadar yaklaşık 10 dakika 30 saniye sürdü.Escherichia coli'nin hedef amplikonunun büyüklüğü 544 bp idi. Daha sonra amplifiye edilmiş PCR ürünlerini kapiler elektroforez sisteminde analiz ettik. Ayrıca 100 bp'lik DNA merdiveninin kapiler elektroforezini de aynı deney koşullarında gerçekleştirdik.PCR ürününün boyutu, DNA merdiveninin elektroferogramına göre değerlendirilebilir. Tekrarlanabilirlik için her deney üç kez gerçekleştirildi. Bu resimdeki veriler, Escherichia coli'nin PCR ürünlerine karşılık gelen pik değerin ayrılmadan sonra gözlendiğini ve mikroakışkan çipteki PCR ürünlerinin migrasyon süresinin bir termal döngüleyicideki ile tutarlı olduğunu göstermektedir.Hem PCR hem de CE, nükleik asitlerin analizinde iki popüler biyoteknolojidir. Bu makale, Escherichia coli'nin amplifikasyonunu ve her ikisi de şirket içinde yerleşik olan CF-PCR ve CE sistemleri kullanılarak PCR ürünlerinin tespitini açıklamaktadır. Escherichia coli'nin hedef geni 10 dakika içinde başarılı bir şekilde amplifiye edildi ve 1.500 bp'den küçük DNA fragmanları sekiz dakika içinde ayrıldı.Ayrıca, mikroakışkan çipe dayanan CF-PCR sistemi ve bu çalışmada tanıtılan CE sisteminin üretilmesi kolaydır ve laboratuvarda nükleik asitlerin analizi için basit bir yol sunabilir. Bir seferde yalnızca bir numuneyi büyütebilir ve tespit edebilir, bu da geniş uygulamasını sınırlar. Bu nedenle, patojenlerin yüksek verimli tespiti için entegre bir CF-PCR ve CE mikroakışkan çip dizisinin geliştirilmesi hala yoldadır.

amplification-escherichia-coli-continuous-flow-pcr-microfluidic-chip

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Kaynak: Pioli, R., ve diğerleri, Sıralı Kılcallık Destekli Montaj Yoluyla Mikroorganizmaların ve Mikropartiküllerin Modellenmesi. J. Vis. Uzm. (2021)Bu video, karbonsuz bir süspansiyon ve kontrollü akış kullanarak mikroakışkan tuzaklarda tek floresan etiketli Escherichia coli (E. coli) hücrelerini yakalama yöntemini ve ardından mikrokolonilerin büyümesini ve floresan görüntülemesini tetiklemek için besin ilavesini göstermektedir.

Tek Hücreli Bakteri Büyümesinin Mikroakışkan Desenleme ve Floresan Tabanlı İzlenmesi

Öncelikle E. coli dahil olmak üzere fekal koliform barındırma ihtimali olan kontamine su örneğiyle başlayın.Bulanıklığı ve mikrobiyal yükü azaltmak için distile suda seri seyreltme işlemi yapılabilir.İstediğiniz seyreltilmiş örneği besin ortamıyla karıştırın ve mikrofluidik bir çipe yükleyin.Vakum filtreleme kullanarak çipin serpantin kanalındaki bir membranda bakterileri yakalayın.Üst odaya besin ortamı ekleyin ve bakteriyel iyileşmeyi artırmak için kuluçka yapın.Ortamı, lusiferaz genini...

Su Örneklerinde Canlı E. coli Tespit Etmek İçin Tabanlı Mikrofluidik Analiz

Bu videoda, boyutlarına göre çeşitli örneklerden elde edilen floresan etiketli PCR amplikonları analiz etmek için kılcal elektroforez tekniği açıklanmaktadır. Her parçadaki etiketli floresan boya yardımıyla parçaların baz çifti uzunluklarını belirleyen bir göç modeli oluşturur.

Kılcal Elektroforez: Floresan Etiketli Polimeraz Zincir Reaksiyonu Amplikonlarını Analiz Etmek İçin Bir Teknik

Bu videoda, PCR amplikonları boyutlarına göre ayırmak için kullanılan mikroakışkan kılcal elektroforez tekniği açıklanmaktadır. Bu teknik, floresan boyalar ve standart moleküler boyut belirteçleri kullanılarak parça boyutlandırmaya yardımcı olur.

PCR Ürünlerinin Parça Boyutlandırması için Mikroakışkan Kılcal Elektroforez: DNA Parçalarını Boyuta Göre Ayırmak için Mikroçip Tabanlı Bir Elektroforetik Ayırma Tekniği

Entegre mikroakışkan termoplastik çip bir moleküler tanı olarak kullanılmak üzere geliştirilmiştir. Çip nükleik asit ekstraksiyon, ters transkriptaz ve PCR gerçekleştirir. Imalatı ve yonga çalıştırmak için yöntemler tarif edilmiştir.

Mikroakışkan Chip İmalat ve İnfluenza Algılama Yöntemi

H7 benzersiz bir genetik işaretleyici, Z3276 hedefleme: A QPCR tahlil Escherichia coli O157 tespiti için geliştirilmiştir. QPCR canlı hücre algılaması için propidyum monoazide (PMA), tedavi ile kombine edilmiştir. Bu protokol, çok sayıda numune, kolay ve uygun kullanım için bir 96 oyuklu plaka formatı değiştirilmiş ve uyarlanmıştır...

Live Algılama<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: PMA-qPCR H7 Hücreler

Biz DNA hibridizasyon tespiti için mikroakışkan tabanlı elektrokimyasal Bioçip sunuyoruz. SsDNA probu fonksiyonlandırmalar ardından, özgüllük, duyarlılık ve algılama limiti tamamlayıcı ve non-ssDNA hedefleri ile incelenmiştir. Sonuçlar 3.8 nM'lik bir algılama sınırı ile, elektro-kimyasal sistemine DNA hibridizasyonu olaylarının etkisini göstermektedir.

Etiket-serbest DNA Hibridizasyon Analiz için mikroakışkan tabanlı Elektrokimyasal Biochip

Bu iletişim kuralı birden fazla Nükleik asitlerin kullanımı kolay bir tek, testinde görsel algılama için uygulanan küçük, kullanıma hazır bir kaset imalatı açıklar. Bu yaklaşım, kılcal bir dizi GDO hedefleri çok katmanlı ve yüksek verimli tespiti için kullanıldı.

Birden çok nükleik asit kapiller bir dizi görsel algılama

Elektrowetting tabanlı dijital mikroakışkan, manipülasyonunu kolaylaştırmak için mikrolitre hacimli damlacıkların görünür temas açısında voltaj güdümlü bir değişiklik kullanan bir tekniktir. Bunu fonksiyonel manyetik boncuklarla birleştirmek, enzime bağlı İmmünosorbent Test (ELISA) kullanılarak numune hazırlama ve patojenlerin tanımlanması için birden fazla laboratuvar ünitesi operasyonunun entegrasyonunu sağlar.

Otomatik Enzimbağlantılı İmmünosorbent Assay için Elektrowetting tabanlı Dijital Mikroakışkanplatformu

Bu protokol, çip üzerinde laboratuvar, mikroakışkan elektroporasyon cihazı oluşturmak için gereken mikrofabrikasyon tekniklerini açıklar. Deney düzeneği, sürekli bir akışta kontrollü, tek hücre düzeyinde transfeksiyonlar gerçekleştirir ve popülasyon tabanlı kontrol ile daha yüksek verimlere genişletilebilir. Hücre zarı geçirgenliğinin derecesini gerçek zamanlı olarak elektriksel olarak izleme yeteneğini gösteren bir analiz sağlanmıştır.

Sürekli akışlı, permeabilizasyon algılamalı mikro-elektroporasyon sisteminin imalatı ve işletilmesi

Çeşitli bakteriyel patojenler, doğru bir şekilde tespit edilmez ve derhal tedavi edilmezse solunum yolu enfeksiyonlarına neden olabilir ve ciddi sağlık sorunlarına yol açabilir. Döngü aracılı izotermal amplifikasyon yoluyla bu patojenlerin hızlı ve doğru tespiti, klinik ortamlarda solunum yolu enfeksiyonlarının etkili bir şekilde yönetilmesini ve kontrol edilmesini sağlar.

Mikroakışkan çip bazlı döngü aracılı izotermal amplifikasyon yoluyla alt solunum yolu enfeksiyonlarına neden olan bakteriyel patojenlerin hızlı tespiti

Öğrenin, mikroakışkan çip tabanlı sürekli akış-PCR ve kapiler elektroforez sistemleri kurarak Escherichia coli amplifikasyonunu ve tespitini nasıl gerçekleştireceğinizi. Bu yöntem, nükleik asit analizi için hızlı ve güvenilir bir laboratuvar protokolü sunar.

Escherichia coli'nin Sürekli Akış-PCR Mikroakışkan Çipinde Amplifikasyonu ve Kapiler Elektroforez Sistemi ile Tespiti

Daha fazla video keşfet