Escherichia coli'nin Sürekli Akış-PCR Mikroakışkan Çipinde Amplifikasyonu ve Kapiler Elektroforez Sistemi ile Tespiti

Bu protokol, mikroakışkan çipe dayalı bir sürekli akışlı polimeraz zincir sisteminin nasıl oluşturulacağını ve laboratuvarda bir kapiler elektroforez sisteminin nasıl oluşturulacağını açıklar. Laboratuvarda nükleik asitlerin analizi için basit bir yol sunar. Polimeraz zincir reaksiyonu, hedef genin amplifikasyonu için kullanılan geleneksel bir yöntemdir.

Bununla birlikte, geleneksel PCR, düşük sıcaklık varyasyon verimliliği nedeniyle çok zaman alıcıdır. Bu çalışma, mikroakışkan çipe dayalı bir sürekli akış-PCR sistemi önermektedir. Amplifikasyon süresi, PCR solüsyonunun farklı sıcaklıklara ayarlanmış ısıtıcılara yerleştirilen bir mikro kanala çalıştırılmasıyla büyük ölçüde azaltılabilir.

CE, yüksek çözünürlük, yüksek hız ve mükemmel tekrarlanabilirlik gibi birçok avantaja sahip olduğundan, laboratuvarda nükleik asitlerin ve proteinlerin analizi için popüler bir araç haline geldi. Bununla birlikte, çoğu laboratuvar, özellikle gelişmekte olan dünyadaki laboratuvarlar, CE cihazının yüksek fiyatı nedeniyle bu teknolojiyi karşılayamamaktadır. Burada, CF-PCR mikroakışkan çipinin nasıl üretileceğine ve laboratuvarda çok yönlü bir CE sisteminin nasıl oluşturulacağına ilişkin protokolleri özetledik.

Ayrıca Escherichia coli'nin CF-PCR sistemi ile amplifikasyon sürecini ve PCR ürünlerinin CE sistemi tarafından tespit edilmesini de gösteriyoruz. Bu protokolde açıklanan prosedürleri izleyerek, kullanıcılar mikroakışkan çipler üretebilmeli, PCR çözeltisi hazırlayabilmeli, nükleik asit amplifikasyonu için bir CF-PCR sistemi oluşturabilmeli ve DNA parçalarını ayırmak için sınırlı kaynaklarla bile basit bir CE sistemi kurabilmelidir. Nemi gidermek için silikon gofreti 200 santigrat derecede 25 dakika ısıtın.

Gofretin inç başına bir mililitre SU-8 2075 fotorezist dağıtın. Saniyede 100 rpm'lik bir ivme ile 5 ila 10 saniye boyunca 500 rpm'de ve ardından saniyede 500 rpm'lik bir ivme ile 30 saniye boyunca 2.000 rpm'de bir sıkma kaplayıcı kullanarak silikon gofret üzerinde döndürün. 65 santigrat derecede üç dakika ve 95 santigrat derecede 15 dakika pişirin.

Fotolitografi makinesi için pozlama enerjisi olarak santimetre kare başına 150 ila 215 milijoule ayarlayın ve tasarlanan deseni bir fotolitografi maskesi ile fotorezist üzerine kazıyın. Silikon gofret ve maskeyi pozlamaya hazır hale getirin. Maruz kaldıktan sonra, gofreti 65 santigrat derecede iki dakika ve 95 santigrat derecede yedi dakika pişirin.

Fazla fotorezisti çıkarmak için silikon gofreti geliştirici solüsyonuna daldırın ve mikrokanallar görülebildiğinde çıkarın. Ardından, kalan geliştirici çözeltisini durulamak için izopropanol kullanın. Polidimetilsiloksan prepolimerini ve sertleştirici maddeyi 10 ila 1 oranında karıştırın.

Karışık PDMS çözeltisini replika kalıba dökün ve 80 santigrat derecede 60 dakika katılaştırın. PDMS mikroakışkan çipini bir plazma temizleyici kullanarak aktivasyondan sonra bir slayt üzerine yapıştırın ve mümkün olan en kısa sürede 30 dakika boyunca 80 santigrat derecede katılaştırın. Reaktiflerin iyice karıştığından emin olmak için bir vorteks karıştırıcı ve santrifüj kullanın.

Bir santrifüj tüpü hazırlayın. İlk önce santrifüj tüpüne su ekleyin. Ardından DNA şablonunu, primeri, tamponu, dNTP karışımını, Tween 20'yi, PVP'yi ekleyin ve son olarak DNA polimerazı ekleyin.

Son olarak, çözeltiyi girdap ile karıştırın. İki PTC seramik ısıtıcı, iki katı hal rölesi, iki sıcaklık kontrol cihazı, iki sıcaklık sensörü ve bir güç kablosu hazırlayın. Isıtıcıyı yarıiletken röleye bağlayın.

Katı hal rölesini PID sıcaklık kontrol cihazına bağlayın. Ardından sıcaklık sensörü probunu iki ısıtıcının altına takın ve terminali PID sıcaklık kontrol cihazına bağlayın. Son olarak, iki katı hal rölesini seri olarak bağlayın ve güç kablosunu bağlayın.

İki ısıtıcı için bir yuvayı 3D yazdırın ve ısıtıcıları aynı düzlemde tutun. Mikroakışkan çipi iki ısıtıcının üzerine yerleştirin. Bir şırınga pompası ve bir şırınga hazırlayın, ardından şırıngayı şırınga pompasına sabitleyin.

Bir şırınga ile bir silikon boru bağlayın ve silikon borunun üstüne çelik bir iğne bağlayın. Çelik iğneyi mikroakışkan çipin girişine yerleştirin. PCR ürünlerini toplamak için çipin çıkışına bir pipet ucu yerleştirin.

Darbeli alanlı bir elektrik alanı oluşturmak için yüksek voltajlı bir güç kaynağı kullanın. Bakın, bu yüksek voltajlı bir güç kaynağı. Bunlar pozitif ve negatif elektrotlardır.

Işık kaynağı olarak bir cıva lambası kullanın ve cıva lambasından gelen uyarma dalga boyunu bir filtreden geçirin. Kılcal damarı mikroskop tablasına yerleştirin. Floresan emisyonunu objektifle toplayın ve ardından bir fotoçoğaltıcı tüp ile tespit edin.

Bu bizim mikroskobumuz ve bu bizim kılcal damarımız. Şimdi karanlık oda koşullarında ışığı açıyoruz. Uyarma ışığı objektif tarafından toplanır.

Güç kaynağını kontrol etmek ve veri toplamayı tamamlamak için kendi geliştirdiği LABVIEW yazılımını kullanın. CF-PCR sisteminin ısıtıcılarının sıcaklığını 65 santigrat derece ve 95 santigrat derece olarak önceden ayarlayın. Mikroakışkan çipi iki ısıtma bloğuna yerleştirin.

Silikon tüpün ucunu 50 mikrolitre PCR solüsyonu içeren bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Çözeltiyi yavaşça çekmek için şırınga pistonunu çekin. Şırıngayı bir şırınga pompasına sabitleyin.

Çelik iğneyi mikroakışkan çipin girişine yerleştirin. Pompanın akış hızını dakikada 10 mikrolitreye ayarlayın ve çözeltiyi mikroçipin girişindeki mikrokanala itmek için başlat düğmesine basın. PCR ürünlerini mikroakışkan çipin çıkışında toplayın.

Toplam uzunluğu 8 santimetre ve etkili uzunluğu 6 santimetre olan bir kılcal damar hazırlayın. 100 mikrolitre %1 HEC, iki mikrolitre 100x SYBR Green ve 98 mikrolitre ultra saf suyu karıştırarak 1x SYBR Green içeren %0,5 HEC elde ederek ayırma tamponunu hazırlayın. Kılcal damarı bir vakum pompası kullanarak hazırlanan ayırma tamponu ile doldurun.

Yazılım arayüzüne enjeksiyon voltajını ve enjeksiyon süresini girin, başlat düğmesine tıklayın ve PCR ürünlerinin elektrodinamik olarak kılcal damara girmesini bekleyin. Yazılım arayüzüne DC voltajını girin, başlat düğmesine tıklayın ve elektroforezi elektrik alan şiddetinin santimetresi başına 100 voltta çalıştırın. Tüm DNA parçaları kılcal damarda ayrıldıktan sonra durdur düğmesine tıklayın.

Kılcal damarı her çalıştırmadan sonra bir dakika sterilize suyla yıkayın. Bu resim, PCR ürünlerinin ve DNA belirteçlerinin elektroferogramını temsil etmektedir. İlk olarak Escherichia coli'nin hedef genini CF-PCR sisteminde çoğalttık ve PCR solüsyonu çipin girişinden çıkışına kadar yaklaşık 10 dakika 30 saniye sürdü.

Escherichia coli'nin hedef amplikonunun büyüklüğü 544 bp idi. Daha sonra amplifiye edilmiş PCR ürünlerini kapiler elektroforez sisteminde analiz ettik. Ayrıca 100 bp'lik DNA merdiveninin kapiler elektroforezini de aynı deney koşullarında gerçekleştirdik.

PCR ürününün boyutu, DNA merdiveninin elektroferogramına göre değerlendirilebilir. Tekrarlanabilirlik için her deney üç kez gerçekleştirildi. Bu resimdeki veriler, Escherichia coli'nin PCR ürünlerine karşılık gelen pik değerin ayrılmadan sonra gözlendiğini ve mikroakışkan çipteki PCR ürünlerinin migrasyon süresinin bir termal döngüleyicideki ile tutarlı olduğunu göstermektedir.

Hem PCR hem de CE, nükleik asitlerin analizinde iki popüler biyoteknolojidir. Bu makale, Escherichia coli'nin amplifikasyonunu ve her ikisi de şirket içinde yerleşik olan CF-PCR ve CE sistemleri kullanılarak PCR ürünlerinin tespitini açıklamaktadır. Escherichia coli'nin hedef geni 10 dakika içinde başarılı bir şekilde amplifiye edildi ve 1.500 bp'den küçük DNA fragmanları sekiz dakika içinde ayrıldı.

Ayrıca, mikroakışkan çipe dayanan CF-PCR sistemi ve bu çalışmada tanıtılan CE sisteminin üretilmesi kolaydır ve laboratuvarda nükleik asitlerin analizi için basit bir yol sunabilir. Bir seferde yalnızca bir numuneyi büyütebilir ve tespit edebilir, bu da geniş uygulamasını sınırlar. Bu nedenle, patojenlerin yüksek verimli tespiti için entegre bir CF-PCR ve CE mikroakışkan çip dizisinin geliştirilmesi hala yoldadır.