Name: CD226 Ekspresyonunu Saptamak için Grup 2 Doğuştan Gelen Lenfoid Hücrelerin Fare Burun Mukozasından İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Keşfedin fare burun mukozasından ILC2 izolasyonunu ve akış sitometrisiyle CD226 ekspresyon analizini. Bu yöntem alerjik rinit ve nazal hastalıklarda doğuştan gelen lenfoid hücrelerin rolünü anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

R.Z., Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 81871258) ve Dördüncü Askeri Tıp Üniversitesi (No.2020rcfczr) tarafından sağlanan fonlar tarafından desteklenmiştir. Y.Z., Shaanxi'nin Doğa Bilimleri Temel Araştırma Programı (No. 2021JM-081) tarafından desteklenmiştir.

Tüm deneyler Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm prosedür ve protokoller Dördüncü Askeri Tıp Üniversitesi Bilimsel Araştırma Etik Kurulu (No. 20211008) tarafından onaylanmıştır.
1. Murine AR model kuruluşu
<ol><li>8-12 haftalık erkek ve dişi vahşi tip (WT) C57BL / 6 fareleri, spesifik patojen içermeyen koşullar altında barındırır ve standart laboratuvar çorbası ve su sağlar.</li>
	<li>Steriliteyi korumak için temiz bir tezgahta 2 mg alüminyum hidroksit içeren 0.2 mL steril PBS içinde 50 μg ovalbümin (OVA) emülsifiye edin. 0, 7 ve 14. günlerde, intraperitoneal olarak dişi veya erkek farelere her biri 50 μg emülsifiye OVA enjekte edilir.</li>
	<li>21, 22, 23, 24 ve 25. günlerde, inhalasyon anestezisi altında 30 μL steril PBS (burun deliği başına 15 μL) içinde çözünmüş 50 μg OVA ile intranazal olarak farelere aşılanır (Oksijen akış hızı veya 0.5 L / dak ile% 2-3 izofluran).</li>
	<li>Son meydan okumadan 24 saat sonra fareleri ötenazi yapın (26. gün).</li>
</ol>2. Mononükleer hücrelerin (ÇUŞ'lar) burun mukozasından izolasyonu
<ol><li>Fareleri derin anestezi altında servikal çıkık ile ötenazi yapın. Farelerin kafasını 5 dakika boyunca% 75 etanol içinde bekletin ve dış burun deliğine etanol girmesini önleyin. Karnı ameliyat masasına aşağı doğru yerleştirin.</li>
	<li>Ön dişleri kesin. Başın orta hattında, bir kesi yapın ve makas kullanarak cildi kesin.</li>
	<li>Alt çeneyi çıkarın, damağın ucu boyunca tüm burnu kesin ve dokuyu 5 mL buz gibi soğuk PBS içeren 60 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin. Makas ve forseps kullanarak, kemiklere yapışan eti ve kasları çıkarın.</li>
	<li>Fare burnunu 5 mL buz gibi PBS içeren yeni bir 60 mm Petri kabına aktarın. Kemikleri iki kez 5 mL buz gibi soğuk PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Burnu 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>Burnu yeterince parçalayın ve 2 mL önceden ısıtılmış sindirim tamponu içeren 15 mL'lik bir tüpe aktarın (1 mg / mL kollajenaz IV ve 10 U / mL DNaz I ile desteklenen RPMI 1640 ortamı).</li>
	<li>Kapağı sabitleyin ve tüpü dikey olarak 37 ° C'de bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin, 40 dakika boyunca 120-150 rpm'de sürekli çalkalama yapın. NOT: En yüksek enzim aktivitesini elde etmek için sindirim tamponunu önceden 37 °C'ye ısıtın.</li>
	<li>Sindirim sürecini durdurmak için% 10 fetal sığır serumu (FBS) içeren 5 mL buz gibi soğuk RPMI 1640 ortamı ekleyin.</li>
	<li>Katı parçaları çıkarmak için 70 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün.</li>
	<li>5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın ve ardından süpernatanı yavaşça atın.</li>
	<li>Peleti buz gibi soğuk RPMI 1640 orta ve santrifüjde 500 x g'de 5 dakika boyunca tekrar askıya alın. Supernatan'ı yavaşça atın.</li>
	<li>Hücre peletini 4 mL'lik %40 yoğunluklu gradyan ortamında (160 μL 10x PBS + 1,44 mL yoğunluk gradyan ortam stok çözeltisi + 2,4 mL RPMI 1640 ortam) yeniden askıya alın.</li>
	<li>Tüpün altına yavaşça bir Pasteur pipet yerleştirin ve yavaşça 2,5 mL %80 yoğunluklu gradyan ortamı ekleyin (200 μL 10x PBS + 1,8 mL yoğunluk gradyanı ortam stok çözeltisi + 0,5 mL RPMI 1640 ortam).</li>
	<li>Santrifüjün hızlanma ve yavaşlama oranını üçüncü vitesten ve santrifüjden daha düşük bir değere ayarlayın ve oda sıcaklığında (RT) 15 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj.</li>
	<li>Potansiyel kontaminasyonu önlemek için arayüzdeki hücreleri boşaltmadan önce üst safsızlık tabakasını temizleyin. %40/%80 yoğunluklu gradyan ortam arabirimindeki mononükleer hücreler (ÇUŞ'lar) katmanını, bir pipet kullanarak 2 mL buz gibi soğuk PBS içeren 15 mL'lik bir tüpe dikkatlice boşaltın. Hücreleri buz gibi PBS ile iki kez yıkayın.</li>
</ol>3. FCM analizi için yüzey boyama
<ol><li>Hücreleri hasat edin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın. Hücre peletini boyama tamponunda (PBS% 2 FBS ve% 0.1 NaN3 ile desteklenmiş) tekrar askıya alın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj. Supernatan'ı atın. DİKKAT: Boyama tamponunu hazırlarken dikkatli olun. NaN3 çok toksiktir ve yutulduğunda, solunduğunda veya ciltle temas ettiğinde organlara zarar verebilir. Ayrıca, çevreye salınımdan kaçının.</li>
	<li>Hücreleri tüp başına 80 μL bloke edici çözelti (boyama tamponunda seyreltilmiş anti-CD16/32 antikoru (1:100)) içinde yeniden askıya alın. Karanlıkta 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Yıkamadan, yüzey lekeleyici antikor kokteylinin uygun seyreltmesinden 20 μL ekleyin (Tablo 1).</li>
	<li>Antikor kokteylini numunelere eklemeden hemen önce 1 μL (test başına) sabitlenebilir canlılık boyası 520 (FVD) ekleyin. Karanlıkta 4 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Negatif kontroller olarak eşleşen izotip antikorları ve floresan eksi bir (FMO) ayarlayın.</li>
	<li>Hücreleri 500 μL boyama tamponunda, 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yaparak yıkayın.</li>
	<li>Hücre peletini 200 μL boyama tamponunda yeniden askıya alın. Lekeli hücrelere 50 μL vorteksli mutlak sayma boncukları ekleyin ve çalkalayın. Onları bir akış sitometrisi (FCM) analizine tabi tutun. NOT: FCM verileri spektral hücre analizörü kullanılarak elde edilmiş ve akış sitometrisi (FCM) analiz yazılımı ile analiz edilmiştir.</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

ILC2'ler, artan sayıda çalışmanın gösterdiği gibi, tip 2 inflamasyon ve inflamatuar bozukluklarla yakından ilişkilidir. Hem fare modelleri hem de insan gözlemi, üst solunum yolundaki işlevinin daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunur. Astım patofizyolojisinde, ILC2'ler çoğunlukla epitel hücreleri tarafından üretilen timik stromal lenfopoietin, IL-25 ve IL-33 yoluyla aktive edilir. Daha sonra Th2 hücrelerini yansıtan ILC2'ler, tip 2 inflamasyonu şiddetlendirmek için IL-4, IL-5 ve IL-13 üretir32. Ayrı...

Grup 2 doğuştan gelen lenfoid hücreler (ILC2'ler) ilk olarak farelerin periton boşluğu dokularında keşfedildi ve daha sonra kanda ve akciğerler, deri ve burun boşluğu gibi diğer periferik dokularda mevcut olduğu gösterildi 1,2,3. Dokuda yerleşik hücreler olarak, ILC2'ler esas olarak lokal olarak korunur ve çoğalır ve çok sayıda tip 2 sitokin üreterek ve tip 2 bağışıklığı indükleyerek eksojen zararlı uyaranlara cevap veren ilk muhafızlar olarak işlev görür 4,5,6. ILC2'ler ayrıca enfekte dokulara doğru kaçakçılık yaparak da etkilerini gösterebilirler 7,8.
T-helper 2 (Th2) hücrelerine benzer şekilde, ILC2'lerin karmaşık düzenleyici ağları, hava yolu alerjik hastalıkları 8,9 da dahil olmak üzere çeşitli tip 2 enflamatuar hastalıkların ilerlemesine önemli ölçüde dahil olmalarını sağlar. Astımda, epitel hücresi kaynaklı alarminler, interlökin (IL)-4, IL-5 ve IL-1310 sekresyonu yoluyla pulmoner inflamasyonu daha da teşvik eden ILC2'leri aktive edebilir. Klinik çalışmalar ayrıca, ILC2 düzeylerinin şiddetli astımlı hastaların balgamında ve kanında anlamlı derecede yükseldiğini göstermiştir, bu da ILC2'lerin astım şiddeti ile ilişkisini ve astım progresyonunun bir göstergesi olarak işlevlerini düşündürmektedir11.
Allerjik rinit (AR), her yıl milyonlarca insanı etkileyen yaygın bir kronik inflamatuar hastalıktır ve bu hastalık için etkili tedavilersınırlıdır 12,13. ILC2'ler AR'nin patofizyolojisinde, sensitizasyon fazında veya semptom oluşturma ve inflamasyon fazı14'te önemli roller oynamaktadır. AR'li hastalarda, periferik kandaki ILC2 düzeylerinin hem lokal hem de sistemik olarak yükseldiği bildirilmiştir15. Bununla birlikte, ILC2'lerin AR'nin patofizyolojisi ve progresyonu üzerindeki bazı etkileri ve altta yatan mekanizmaları hala daha fazla araştırma gerektirmektedir.
CD226 - kostimulatör bir molekül olarak işlev gören bir transmembran glikoprotein - öncelikle doğal öldürücü (NK) hücreler, T hücreleri ve diğer enflamatuar monositler üzerinde eksprese edilir16,17. CD226 ve ligandlarının (CD155 ve / veya CD112) veya rakibinin (TIGIT) etkileşimi, çeşitli bağışıklık hücrelerinin biyolojik işlevlerine katılmasına izin verir18. Antijen sunan hücrelerdeki ligandların sitotoksik lenfosit (CTL) üzerindeki CD226'ya bağlanması, her iki hücrenin aynı anda aktivasyonunu teşvik ederken, CTL'nin aktivasyonu, CD226 19,20'nin rakibi olan TIGIT (Ig ve ITIM alanlarına sahip T hücresi immünoreseptörü) tarafından daha da baskılanabilir. Bir insan ex vivo çalışması, T hücreleri üzerindeki CD226 ve CD155'in, Th alt kümeleri 21'i farklı şekilde modüle ederekTh1 / Th17 ve Th2 arasındaki dengeyi düzenlediğini ortaya koymuştur. CD226 da trombosit yapışmasına ve NK tümör öldürme aktivitesinearacılık edebilir 22,23. Bu arada, CD226 çeşitli enfeksiyon hastalıklarının, otoimmün hastalıkların ve tümörlerin patogenezinde iyi çalışılmıştır 18,24,25. Şu anda, CD226 immünoterapi için yeni bir parlak nokta haline gelmiştir. Çalışmalar, hücre dışı veziküllerin, sitotoksik aktivitelerini eski haline getirmek ve akciğer kanserinin ilerlemesine müdahale etmek için NK hücreleri üzerindeki CD226 ekspresyonunu tersine çevirebileceğini bulmuştur26. Son zamanlarda yapılan bir çalışma, CD226'nın doğuştan gelen lenfoid hücre aracılı bağışıklıkta rol oynayabileceğini gösteren tek hücreli RNA dizilimi27 ile yüksek CD226 ekspresyonu ile karakterize fetal bağırsak grubu 3 ILC'lerin bir alt kümesini ortaya koymuştur.
Hava yolu inflamasyonunda ILC2'ler hakkındaki bilgilerimiz öncelikle astım üzerine yapılan çalışmalara dayanmaktadır; Bununla birlikte, burun mukozal bağışıklığındaki işlevleri hakkında çok az şey bilinmektedir. Böylece, ILC2'leri burun mukozasından izole etmek ve tanımlamak için bir protokol oluşturulmuştur. Çalışma, CD226'nın burun dokularındaki ILC2'ler üzerindeki ekspresyonuna ve sağlıklı ve AR fareler arasındaki varyasyonuna odaklanmaktadır. Bu, yerel bağışıklıkta ILC2 aracılı düzenlemenin altında yatan mekanizmalar hakkında yeni bilgiler sağlayabilir ve AR tedavisi için yeni yaklaşımlar geliştirmek için bir temel oluşturabilir.

<table><tbody><tr><td>Alüminyum hidroksit</td><td>Meilun biyolojik Teknoloji</td><td>21645-51-2</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>eBioscience</td><td>11-0112-82</td><td>Antikor kokteylinde kullanılır</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>BioLegend</td><td>117306</td><td>Antikor kokteylinde kullanılır</td></tr><tr><td>CD16/32</td><td>BioLegend</td><td>101302</td><td>Klon: 93; Seyreltme 1:100</td></tr><tr><td>CD226</td><td>BioLegend</td><td>128812</td><td>Antikor kokteylinde kullanılır</td></tr><tr><td>CD3e</td><td>BioLegend</td><td>100306</td><td>Antikor kokteylinde kullanılır</td></tr><tr><td>CD45</td><td>BioLegend</td><td>103128</td><td>Antikor kokteylinde kullanılır</td></tr><tr><td>CD45R</td><td>eBioscience</td><td>11-0452-82</td><td>Antikor kokteylinde kullanılır</td></tr><tr><td>CD90.2</td><td>BD Pharmingen</td><td>553014</td><td>Antikorda kullanılır kokteyl</td></tr><tr><td>Kollajenaz IV</td><td>DIYIBio DY40128</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CountBright mutlak sayma boncukları</td><td>Invitrogen</td><td>C36950</td><td>mutlak sayma boncukları</td></tr><tr><td>Dnase <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/63525/63525eq01v2.jpg" style="margin: auto; "></td><td>Beyotime</td><td>D7076</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Sabitlenebilir Canlılık Boyası eFluor 520 (FITC)</td><td>eBioscience</td><td>65-0867-14</td><td>FVD</td></tr><tr><td>HBSS, kalsiyum, magnezyum</td><td>Servicebio</td><td>G4204-500</td><td></td></tr><tr><td>KLRG1</td><td>eBioscience</td><td>17-5893-81</td><td>Antikor kokteyli</td></tr><tr><td>NaN3</td><td>SIGMA</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>NovoExpress yazılımı</td><td>AgilentTechnologies</td><td>Sürüm 1.5.0</td><td>akış sitometrisi (FCM) analiz yazılımı</td></tr><tr><td>OVA</td><td>SIGMA</td><td>9006-59-1</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x</td><td>Servicebio</td><td>G4202-500</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 10x</td><td>Servicebio</td><td>G4207-500</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Yeasen</td><td>40501ES60</td><td>yoğunluk gradyan ortamı</td></tr><tr><td>RPMI 1640 kültür ortamı</td><td>Corning</td><td>10-040-CVRV</td><td></td></tr><tr><td>Spektral hücre analizörü</td><td>SONY</td><td>SA3800</td><td></td></tr></tbody></table>

cd226 ekspresyonunu saptamak için grup 2 doğuştan gelen lenfoid hücrelerin fare burun mukozasından İzolasyonu

Isolation of Group 2 Innate Lymphoid Cells from Mouse Nasal Mucosa to Detect the Expression of CD226

Yıllar içinde yayınlanan grup 2 doğuştan gelen lenfoid hücreler (ILC2'ler) üzerine yapılan çok sayıda araştırma ile ILC2'lerin, anti-helmint bağışıklığı, doku onarımı, termogenez ve astım ve alerjik rinit (AR) gibi otoimmün hastalıklar dahil olmak üzere çeşitli patolojik süreçlerin düzenlenmesinde rol oynadığı yaygın olarak bilinmektedir. ILC2'ler cilt, bağırsak, akciğerler ve burun boşluğu gibi periferik dokularda kalıcı olarak bulunur; Bununla birlikte, burun mukozal bağışıklığındaki kesin işlevleri hakkında sınırlı bilgi vardır. CD226, esas olarak doğal öldürücü (NK) hücreler, T hücreleri ve enflamatuar monositler üzerinde eksprese edilen aktive edici bir kostimülatör moleküldür. Bununla birlikte, ILC2'lerin CD226'yı eksprese edip etmediği veya ILC2'lerle ilişkili hastalıkların patogenezinde rol oynayıp oynamadığı bilinmemektedir. Burada, ILC2'leri burun mukozasından izole etmek ve tanımlamak için bir yöntem oluşturduk ve sağlıklı ve AR farelerden elde edilen ILC2'lerde CD226 ekspresyonunu tespit ettik. Burada, ILC2'lerin fare burun mukozasından izole edilmesi ve tanımlanması için bu protokolü açıklıyoruz, bu da burun mukozası hastalıklarında immünolojik bozuklukların iç patolojik mekanizmasını keşfetmeye yardımcı olacaktır.

ILC2'lerin AR'deki rolünü araştırmak için OVA kaynaklı bir murin modeli geliştirilmiştir. AR murin modelinin yapımı, 28,29,30,31 küçük değişikliklerle önceki çalışmalara dayanıyordu. Son burun meydan okumasından sonra hapşırma ve burun kaşınma sıklığını ölçmek için 10 dakikalık bir video çekildi. OVA-indüklenmiş-AR farelerin allerjik semptomları Şekil 1'de sunulmuş...

Tip 2 inflamasyonda rol oynayan Grup 2 doğuştan gelen lenfoid hücreler (ILC2'ler), esas olarak helmint enfeksiyonuna, alerjik hastalıklara, metabolik homeostaza ve doku onarımına yanıt olarak katılır. Bu çalışmada, ILC2'leri murin burun mukozasından izole etmek ve CD226 ekspresyonunu saptamak için bir prosedür gösterilmiştir.

CD226 Ekspresyonunu Saptamak için Grup 2 Doğuştan Gelen Lenfoid Hücrelerin Fare Burun Mukozasından İzolasyonu

With abundant research on group 2 innate lymphoid cells (ILC2s) published over the years, ILC2s are widely known to be implicated in regulating various ...

Bu protokol, iki doğuştan gelen lenfoid hücreyi murin burun mukozasından izole etmek ve tanımlamak ve ILC ikisinin burun hastalıklarında belirli etkilerini ve altta yatan mekanizmalarını araştırmak için kurulmuştur. Bu teknik, araştırmacıların ILC ikisini lokal mezotelyalden izole etmelerini ve yüzey antijeninin ekspresyonunu akış sitometrisi ile ortaya çıkarmalarını sağlar. Tekniğimiz karmaşık işlemleri içermez.Bununla birlikte, önemli bir şey, yakındaki diğer dokuların etkisinden kaçınmak için küçük kemiklere yapışan eti tamamen çıkarmaya çalışmaktır Deneye başlamadan önce, 8 ila 12 haftalık vahşi tip C57 siyah altı erkek ve dişi fareyi, standart laboratuvar chow ve su ile sağlanan spesifik patojen içermeyen koşullar altında barındırın. Alerjik rinit modelini oluşturmak için, iki miligram alüminyum hidroksit içeren 0.2 mililitre steril PBS'de 50 mikrogram ovalbümini emülsifiye edin ve intraperitoneal olarak sıfır, yedi ve 14 günde her fareye 50 mikrogram emülsifiye ovalbümin enjekte edin. 21, 22, 23, 24 ve 25. günlerde, 30 mikrolitre steril PBS içinde çözünmüş 50 mikrogram ovalbümin ile intranazal olarak farelere aşılanır, ardından son meydan okumadan 24 saat sonra fareleri ötenazi yapar.Ötanazi farenin başını beş dakika boyunca% 75 etanol içinde bekletin ve etanolün dış burun deliğine girmesini önleyin. Karnı ameliyat masasına aşağı doğru yerleştirin. Dört dişi kesin ve başın orta hattında bir kesi yapın ve makas kullanarak cildi kesin.Ardından, alt çeneyi çıkarın, damağın ucu boyunca tüm burnu kesin ve dokuyu beş litre buz gibi PBS içeren 60 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Makas ve forseps kullanarak, kemiklere yapışan eti ve kasları çıkarın. Ardından, fare burnunu beş mililitre buz gibi PBS içeren yeni bir 60 milimetrelik Petri kabına aktarın ve kemikleri yıkayın.İkinci yıkamadan sonra, burnu 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Dokuyu yeterince parçalayın ve iki mililitre önceden ısıtılmış sindirim tamponu içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Kapağı sabitleyin ve tüpü 40 dakika boyunca 37 santigrat derece ve 120 ila 150 RPM'de bir yörüngesel çalkalayıcıya dikey olarak yerleştirin.Ardından, sindirimi durdurmak için% 10 fetal sığır serumu içeren beş mililitre buz gibi RPMI 1640 ortamı ekleyin. Ardından, katı parçaları çıkarmak için içeriği 70 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirin. Filtratı beş dakika boyunca 500 G'de santrifüj ettikten sonra, süpernatantı yavaşça atın ve peleti buz gibi soğuk RPMI 1640 ortamında yeniden askıya alın.Santrifüjlemeyi daha önce gösterildiği gibi tekrarlamak için, hücre peletini dört mililitre% 40 yoğunluklu gradyan ortamında yeniden askıya alın. Ardından, 2,5 mililitre %80 yoğunluklu gradyan ortamı eklemek için tüpün altına yavaşça bir Pasteur pipet yerleştirin. Hızlanma ve yavaşlama oranı üçüncü vitesten daha düşük olacak şekilde tüpü oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 400 G'de santrifüj edin.Arayüzdeki hücreleri boşaltmadan önce, potansiyel kontaminasyonu önlemek için üst safsızlık tabakasını temizleyin. Ardından, mononükleer hücrelerin katmanını% 40 ila% 80 yoğunluklu gradyan ortam arayüzünde, iki mililitre buz gibi soğuk içeren 15 mililitrelik bir tüpe boşaltmak için bir pipet kullanın. Hücreleri buz gibi PBS ile iki kez yıkayın.Hücreleri hasat edin ve dört santigrat derecede 500 G'de beş dakika boyunca santrifüj edin. Hücre peletini boyama tamponunda tekrar askıya alın ve 500 G'de beş dakika boyunca tekrar santrifüj yapın. Hücreleri 80 mikrolitre bloke edici çözelti içinde karanlık durumda dört santigrat derecede 30 dakika boyunca yeniden askıya alın ve inkübe edin.Numuneye uygun seyreltmenin 20 mikrolitre yüzey boyama antikor kokteylini eklemeden hemen önce bir mikrolitre sabitlenebilir canlılık boyası 520 ekleyin. Ayrıca, eşleşen izotip antikorlarını ve floresan eksi birini negatif kontroller olarak ayarlayın. Daha sonra, hücreleri 500 mikrolitre boyama tamponunda, dört santigrat derecede beş dakika boyunca 500 kez G'de santrifüj yaparak yıkayın.Daha sonra hücre peletini 200 mikrolitre boyama tamponunda yeniden askıya alın. Son olarak, lekeli hücrelere 50 mikrolitre vorteksli mutlak sayma boncuğu ekleyin. Ajite edin ve onları bir akış sitometri analizine tabi tutun.İki doğuştan gelen lenfoid hücre grubunun rolünü araştırmak için geliştirilen ova kaynaklı bir murin modeli, alerjik rinit farelerinde burun sürtünme ve hapşırma sıklığının kontrol grubuna göre anlamlı derecede yüksek olduğunu göstermiştir. Sağlıklı kontrol farelerinin burun mukozasında, soy negatif ve CD 45 pozitif hücrelerin yaklaşık% 2 ila 3'ü tanımlanmıştır. Grup iki doğuştan gelen lenfoid hücrenin mutlak sayısı 2.000 ila 4.000 arasında değişmiştir.Akım sitometri analizi, alerjik rinit burun mukozasındaki grup iki doğuştan gelen lenfoid hücrelerin toplam sayısında, sağlıklı kontrol farelerine kıyasla kayda değer bir artış olduğunu göstermiştir. Allerjik rinit farelerinde iki doğuştan gelen lenfoid hücrenin grubunda kontrol farelerine göre daha yüksek CD 226 ekspresyonu tespit edildi. Ek olarak, CD 226'nın ortalama floresan yoğunluğu, AR farelerde önemli ölçüde yukarı regüle edildi.Burun kemiğine yapışan etin çıkarılması, ortamın santrifüj edilmesi ve mononükleer hücrelerin boşaltılması sırasında hızlanma ve yavaşlama oranının ayarlanması adımlarının farkında olun. Tanımlanan ILC ikilileri, hücre kültürü için sıralanmış veya in vitro olarak uyarılmış akış sitometri karakterizasyonu için bir stand olabilir, bu da burun dokusunda ILC ikililerinin spesifik riskini keşfetmeye yardımcı olur. Özellikle burun mukozasındaki doğuştan gelen lenfatik hücrelerde lenfositi izole etme ve karakterize etme prosedürü, bu protokolü yerel nazal bağışıklık ortamını araştıran araştırmacılar için bir ön referans haline getirir.

isolation-group-2-innate-lymphoid-cells-from-mouse-nasal-mucosa-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Miltenyi MAC kiti kullanılarak lenfositlerin İzolasyon tüm lenfoid doku homojenatlarında hücreleri arındırmak için güvenilir bir yol. Miltenyi sistemini kullanarak saflaştırılmış Hücreler genellikle ≥% 96 saf. Burada, CD4 + T hücreleri, Miltenyi tarafından sunulan birçok kitleri biri izole etmek için atılan adımları göstermektedir.

CD4 İzolasyon Miltenyi MACS Arıtma Fare lenf düğümleri + T hücreleri

Intranazal aşılara farelerin burun ve sistemik immün yanıtlar için nazofaringeal ilişkili lenforetiküler dokular (NALT) katkılarını incelemek için Yöntemler açıklanmıştır. Biz NALT bağımlı fare modeli kurmak için bir cerrahi prosedür göstermek...

Aşılar Fare yanıtlar içinde Nazofaringeal ilişkili lenforetiküler Doku (NALT) Rolü incelenmesi

Fare genital lenfosit yalıtmak için verimli bir şekilde tarif edilmiştir. Bu yöntem verimli izolasyonu sağlamak için enzim sindirim ve Percoll degrade ayrılık yararlanır. Bu teknik, diğer tür kullanım için de...

Fare Genital Sistemlerinin Mukozanin gelen Lenfosit İzolasyonu

Peyer plaklarında hücrelerin belirli altgrupları (PPs), gut-ilişkili lenfoid dokuların primer endüktif sitelerin immünolojik işlevlerini anlamak giderek artan bir ilgi var. Burada akım sitometri analizi ve immun için PP cryosections için tek hücre hazırlıkları PP hazırlamak için paralel protokolleri anahat.

Lenfositler ve mürin Peyer en Yamalar itibaren Dendritik Hücreler İzolasyon Ve immün

Lenf nodu stromal hücrelerinin izolasyonu, fibroblastik retiküler hücreler, lenfatik ve kan endotel hücreleri elde etmek için enzimatik sindirim ve mekanik ayrıştırmayı içeren çok aşamalı bir prosedürdür. Tarif edilen prosedürde, canlı lenf nodu stromal hücrelerinin yüzey işaretleyici bozulmasını en aza indirmek için kısa bir sindirim otomatik mekanik ayrıştırma ile birleştirilir.

Kemirgen Lenf Düğümü Stromal Hücrelerinin İzolasyonu

Aşıların nasıl çalıştığı hakkında genel bir bilgi eksikliği var. Burada, dendritik hücrelere ve T hücresi bağışıklığına özel olarak odaklanarak, aşılara karşı erken konak bağışıklık tepkileri hakkında fikir edinmek için ters genetik ve kemik iliği kimerik farelerin birlikte kullanılmasını öneriyoruz.

Kimerik fare modellerinde Rekombinant Grip aşıların burun içinde yoluyla mukozal bağışıklık Okumak

Burada, Plasmodium sporozoitlerinin intradermal enjeksiyonunu takiben fare derisinden miyeloid hücreleri izole etmek ve lenf düğümünü boşaltmak için bir protokol açıklıyoruz. Toplanan hücrelerin akış sitometrisi, cildi karakterize etmek ve parazite karşı drenaj lenf nodu inflamatuar yanıtını karakterize etmek için güvenilir bir test sağlar.

Canlı zayıflatılmış intradermal aşılama sonrasında Fare Deri ve akan lenf düğümü gelen Myeloid Hücre İzolasyonu<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoitler

Burada biz lenfositler gut ilişkili lenfoid doku Peyer's yamalar ve boşaltma Mezenterik lenf düğümleri de dahil olmak üzere İndüktif sitelerinden ve lamina propria dahil efektör mekanları ekran koruyucu yalıtım için detaylı bir protokol tanımlamak ve bağırsak epitel küçük bağırsak bağışıklık sisteminin.

Lenfositler fare küçük bağırsak bağışıklık sistemi yalıtma

Bu protokolde, kısmi cerrahi tonsillektomi uygulanan sağlıklı insanlardan bademcikler mononükleer hücrelerin invazyon asyonunu inceleyip mukozal dokularda viral enfeksiyonu taklit etmek için nasıl kolayca işleyip kültürlendirilebileceğimizi açıklıyoruz.

Bademcikler Mononükleer Hücrelerin İzolasyon Ex Vivo Doğuştan Gelen Bağışıklık Yanıtları Bir İnsan Mukozal Lenfoid Doku Çalışma

Burada, insan limbal niş hücrelerini izole etmek ve tanımlamak için bir protokol sunuyoruz.

Limbal Niş Hücrelerin İzolasyonu ve Tanımlanması

Keşfedin fare burun mukozasından ILC2 izolasyonunu ve akış sitometrisiyle CD226 ekspresyon analizini. Bu yöntem alerjik rinit ve nazal hastalıklarda doğuştan gelen lenfoid hücrelerin rolünü anlamaya yardımcı olur.

CD226 Ekspresyonunu Saptamak için Grup 2 Doğuştan Gelen Lenfoid Hücrelerin Fare Burun Mukozasından İzolasyonu

Daha fazla video keşfet