Name: Riboflavin-5′- Fosfatın Görünür Işık Fotolizi ile Patojenlerin İnaktivasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Keşfedin, flavin mononükleotit fotolizi ile görünür mor ötesi ışık kullanarak patojen bakterileri inaktive etme yöntemini. Staphylococcus aureus ve E.coli üzerinde etkili, güvenli ve düşük maliyetli bir protokoldür.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, deneylere verdikleri destek için Dr. Tak-Wah Wong ve Bay Zong-Jhe Hsieh'e minnettardır.

1. Fotoliz sistemi kurulumu
<ol><li>Bir fotoliz sistemi kurmak için Şekil 1'de gösterildiği gibi opak bir plastik kabın (8 cm x 7 cm) içine altı ışık yayan diyot (LED) (DC 12 V) monte edin31.</li>
	<li>Cam test tüplerine (13 mm çapında ve 100 mm yüksekliğinde) reaktanlar ekleyin (aşağıya bakınız) ve tüpleri Şekil 1'de gösterildiği gibi kabın üstüne sabitleyin. Deney düzeneğini 25 ± 3 °C sabit bir sıcaklığa sahip bir odaya yerleştirin.</li>
	<li>Fotolitik reaksiyonlar boyunca test ünitelerinin sıcaklığını kızılötesi termometre ile izleyin ve kaydedin. NOT: Şekil 2 , kalibre edilmiş bir UV-Vis optik spektrometresi kullanılarak kaydedilen mavi, yeşil, kırmızı ve mor ışıklar için emisyon spektrumlarını göstermektedir. Çalışmada kullanılan mavi, yeşil, kırmızı ve mor LED ışıkları için maksimum absorbansa karşılık gelen dalga boyları sırasıyla 465, 529, 632 ve 405 nm'dir. LED çipleri, ışınlama deneyleri sırasında cihazı ısıtabilir. Bu nedenle, her deneydeki tüm fotoreaksiyon sistemi, sıcaklığın 25 ± 3 ° C'de sabit tutulduğu bir odaya yerleştirildi.</li>
</ol>2. Işık dalga boyunun FMN fotolizi üzerindeki etkisi (Şekil 3)
<ol><li>100 mM potasyum fosfat tamponunda (PB) (pH 7,8) 0,1 mM FMN çözeltisi hazırlayın. FMN numunelerini (her biri 3 mL) 5 dakika boyunca 10 W/m2 yoğunlukta mavi, yeşil, kırmızı veya mor ışığa maruz bırakın. Kontrol olarak 3 mL FMN solüsyonunu karanlıkta tutun.</li>
	<li>Bir UV / Görünür spektrofotometre kullanarak ışınlanmış FMN numunelerinin 250-750 nm aralığındaki emiciliğini kaydedin.</li>
</ol>3. Nitro mavisi tetrazolium (NBT) indirgeme yöntemini tespit <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="font-size: 14px; margin: auto;"> etmek (Şekil 4).
NOT: Burada kullanılan NBT indirgeme yöntemi, riboflavin fotoreaksiyonu için yapılan tahlilden biraz değiştirilmiştir. NBT indirgeme yöntemi, FMN fotolizinden üretilen seviyeyi <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;"> değerlendirmek için kullanılır. Fotokimyasal olarak uyarılmış FMN ilk önce L-metiyonin tarafından bir semikinona indirgenir, daha sonra oksijene bir elektron bağışlayarak 31'e<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;"> yükselir. Üretilen <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;"> NBT, 560 nm 32'de karakteristik bir emilime sahip olan formazan'aindirgenir.
<ol><li>73.3 mL PB'ye (100 mM; pH 7.8) 109.3 mg L-metiyonin ekleyin. L-metiyonini çözmek için çözeltiyi vorteksleyin.</li>
	<li>L-metiyonin tamamen çözüldükten sonra, çözeltiye 10 mg NBT tozu ve 1.53 mL 0.117 mM FMN ekleyin. Uygulanan reaksiyon çözeltisinin her 1 mL'si (yani, FMN, L-metiyonin ve NBT karışımı) için, FMN, metiyonin ve NBT'nin nihai konsantrasyonları sırasıyla 2.4 x 10-6 M, 1.0 x 10-2 M ve 1.6 x 10-4 M'dir.</li>
	<li>Reaksiyon çözeltisini (1 mL) 1-5 dakika boyunca 10 W/m2'de mavi veya mor LED ışık ışınlamasına maruz bırakın.</li>
	<li>NBT'yi azaltan <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;"> ve formazan üreten fotokimyasal reaksiyon tarafından üretilen türleri (560 nm'deki emilimden) tespit edin.</li>
</ol>4. FMN fotolizi sonrası S. aureus canlılığı (Şekil 5)
<ol><li>Bir S. aureus kolonisini (BCRC 10451) kültürlenmiş bir plakadan, 15 mL vidalı kapaklı bir test tüpünde alınan 10 mL Lysogeny suyuna iletin. 16 saat boyunca 37 ° C'de bir çalkalayıcıda kültür.</li>
	<li>Kültürün 0,5 mL'sini 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Kültürü 600 nm'de (OD 600) (~6 x 107 CFU/mL)0,5 optik yoğunluğa seyreltmek için santrifüj tüpüne sterilize edilmiş su ekleyin.</li>
	<li>Kültürün 0,5 mL'sini 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın, 10 dakika boyunca 14.000 x g'de santrifüj yapın ve bir hücre peleti elde etmek için süpernatantı boşaltın.</li>
	<li>Adım 4.3'te ve vortekste olduğu gibi elde edilen hücre peletlerine 1 mL FMN tamponlu çözelti (PB'de 30, 60 ve 120 μM FMN) ekleyin. Işınlanmış kontrol için, yalnızca 1 mL PB ekleyin.</li>
	<li>Sadece 30 μM FMN ve PB içeren canlı bakteri hücresi çözeltilerinin her birini 1 mL'lik canlı bakteri hücresi çözeltilerini cam tüplere aktarın ve bunları 30 dakika boyunca 10 W /m2'de mor ışıkla ışınlayın.</li>
	<li>Tek başına 30, 60 ve 120 μM FMN ve PB içeren canlı bakteri hücresi çözeltilerinin her birini 1 mL'lik canlı bakteri hücresi çözeltilerini cam tüplere aktarın ve 120 dakika boyunca 20 W /m2'de mavi ışıkla ışınlayın. 120 μM FMN içeren 1 mL canlı bakteri hücresi çözeltisi içeren başka bir cam tüp kurun ve 60 dakika boyunca 20 W /m2'de mavi ışıkla ışınlayın.</li>
	<li>Test tüplerini adım 4.5 ve 4.6'da açıklandığı gibi ayarlayın ve kalın alüminyum folyolarla örtün. Bu tüpler karanlık kontroller görevi görür.</li>
	<li>Işınlama odasını (karanlık kontrollerin yanı sıra) 30-120 dakikalık ışınlama süresi boyunca 9 ± 1 ° C'de soğuk bir odada tutun. NOT: LED ışıkları tarafından salınan ısı göz ardı edilemez, çünkü bardağın içine yerleştirilen LED çipleri ışınlama deneyleri sırasında fotoreaksiyon sistemini ısıtabilir. Bu nedenle deneyler, 9 ± 1 ° C'de tutulan soğuk bir odada gerçekleştirildi.</li>
	<li>Işınlamadan sonra, reaksiyon çözeltilerinin her birinden 0,2 mL'yi bir Luria agar (LA) plakasına aktarın. Bakterileri L şeklinde bir cam çubukla plakanın üzerine yayın ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>Uygulanabilir plaka sayısını ve S. aureus'un inaktivasyon oranlarını bir gecede büyümeden sonra hesaplayın. NOT: S. aureus'un inaktivasyon oranı, [1 -I / D] ×% 100'e eşit olan yüzde azalma olarak hesaplanır; burada I ve D , sırasıyla, ışınlanmış numunedeki CFU'ların sayısını ve karanlık kontrolü gösterir. Yüzde azalma, inaktivasyon oranının negatif bir değeri olarak tanımlanır.</li>
</ol>5. S. aureus'un<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="font-size: 14px; margin: auto;"> tespiti (Şekil 6) 
<ol><li>S. aureus örneklerini adım 4'te açıklandığı gibi hazırlayın.</li>
	<li>Numunelerin bakteri yoğunluğunu sterilize edilmiş suyla 600 nm'de 0,5 optik yoğunluğa (OD600, ~6 x 10 6 CFU/mL) kadar seyreltin. Kültürün 0,5 mL'sini 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. 10 dakika boyunca 14.000 x g'de santrifüj yapın ve bir hücre peleti elde etmek için süpernatantı boşaltın.</li>
	<li>75 mL PB'ye 0,1093 g L-metiyonin, 0,1 g NBT ve 25 mL FMN (400, 240 veya 120 μM) ekleyin. Uygulanan reaktanların her 1 mL'si için, FMN, metiyonin ve NBT'nin nihai konsantrasyonları sırasıyla 100 (60 veya 30) x 10-6 M, 7.3 x 10-3 M ve 1.2 x 10-3 M'dir.</li>
	<li>Adım 5.2'de olduğu gibi elde edilen hücre peletlerine her bir reaktant çözeltisinden 1 mL (yani, değişen FMN konsantrasyonları ile) ekleyin. Çözeltileri 10 dakika boyunca 10 W/m2'de mor ışıkla ışınlayın.</li>
	<li>Karışımı 10 dakika boyunca 14.000 x g'de santrifüj edin ve süpernatanı boşaltın. İndirgenmiş NBT'yi çıkarmak için peleti 1 mL dimetil sülfoksit (DMSO) içinde yeniden askıya alın. Üretilen <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;"> türleri 560 nm'deki absorbanstan tespit edin.</li>
</ol>6. İstatistiksel analiz
<ol><li>Üç bağımsız testin ortalama ± standart sapması (SD) olarak ekspres veriler.</li>
	<li>İki ölçümün farklı olup olmadığını değerlendirmek için homosedastik iki örneklemli bir t-testi uygulayın. 0.05 &lt; p değerleri istatistiksel olarak anlamlı kabul edilir.</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Bir fotosensitizör, ROS üretmek için kimyasal bileşiklerin fotokimyasal reaksiyonunu arttırır. Patojenik mikroorganizmalar, fotosensitizörlerin varlığında hafif ışınlama ile inaktive edilebilir. Bu çalışma, eksojen bir fotosensitizör olan FMN'nin mor ışık ışınlaması ile üretilen ROS'a bağlı olarak S. aureus'un aPDI değerini belirlemektedir.
Şekil 3'te gösterildiği gibi, FMN için, 444 nm'deki absorbans, mor veya mavi ışık kullanılarak 5 dakikalık ışınlamad...

Riboflavin-5′-fosfat (FMN), ribityl yan zincirinin riboflavin 5′-pozisyonunda fosforilasyon ile oluşur ve enerji üretmek için çok sayıda hücresel işlem için tüm flavoproteinler tarafından gereklidir. Aynı zamanda insan vücudundaki bazı fonksiyonlar için vitamin rolünü oynar1. FMN, suda riboflavin 2'den yaklaşık200 kat daha fazla çözünür.
Bakterilerin antibakteriyel fotodinamik inaktivasyonu (aPDI), bakteri direncini kontrol etmenin etkili bir yoludur 3,4 çünkü bakteriyel direnç moduna bağlı değildir. Klinik olarak aPDI yumuşak doku enfeksiyonlarını tedavi etmek için çok dirençli bakterilere bağlı hastane derisi enfeksiyonunu azaltmak amacıyla kullanılır 5,6,7,8,9. aPDI ayrıca reaktif oksijen türleri (ROS) üreterek hücre ölümü üretir. Süperoksit radikalleri (), singlet oksijen, hidroksil radikalleri (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;">•OH) ve peroksil radikalleri gibi ROS, reaktif oksijen10,11,12 içeren ve normalde reaktif olan serbest radikaller veya moleküllerdir13. ROS'un neden olduğu DNA hasarına benzer şekilde, membran peroksidasyonu ve endotel hücrelerinin tahrip edilmesi de hücrelerde ROS'a atfedilen olumsuz biyokimyasal reaksiyonlardır12.
Patojenik bakteriler için aPDI kullanımı, metiltioninyum klorür 14, PEI-c e6 konjugat15, porfirin16, titanyum dioksit 17, toluidin mavisi O18 ve çinko oksit nanopartikülleri 19 gibi kimyasal bileşiklerin varlığında mikroorganizmaları inaktive etmek için görünür veya UV ışık kaynağını içerir. Toluidin mavisi O ve metilen mavisi fenotiyazinyum boyalarıdır ve metilen mavisi toksik özelliklere sahiptir. Çinko oksit nanopartikülleri ve UV ışınlaması, olumsuz sağlık ve çevresel etkilerle bağlantılıdır. Bu nedenle, görünür ışınlama altında fotoliz yoluyla güvenilir, güvenli ve basit bir fotosensitizörün kullanılması daha fazla çalışmayı hak etmektedir.
Mikro besin maddesi, riboflavin veya FMN, toksik değildir ve gerçekten de gıda üretimi veya beslenmesi için kullanılır20. Hem FMN hem de riboflavin, ışık ışınlamasına karşı oldukça hassastır2. UV 1,2,21,22,23 ve mavi ışık ışınlaması 10,24 altında, bu iki bileşik uyarılmış bir duruma ulaşır. Fotoliz ile üretilen aktif riboflavin veya FMN, üçlü durumuna terfi ettirilir ve ROS aynı anda2,25 üretilir. Kumar ve ark., UV ışığı tarafından aktive edilen riboflavinin, patojenik mikroorganizmalarda DNA'nın guanin moiety'sinde artmış yaralanmaya neden olduğunu seçici olarak bildirmiştir26. UV ışığı ile ışınlama altında, fotodinamik olarak aktive edilmiş riboflavinin, çift sarmallı DNA27'de oksidatif stres için bir biyobelirteç olan 8-OH-dG'nin üretimini teşvik ettiği gösterilmiştir. S. aureus ve E. coli'nin riboflavin veya FMN fotolizi 10,24,28 sırasında ROS tarafından devre dışı bırakıldığı bildirilmiştir. Yazarlar tarafından yapılan önceki bir çalışma, riboflavin ve FMN içeren fotolitik reaksiyonların kristal menekşe, bir triarilmetan boyası ve üreten <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;">bir antibakteriyel ajanı azalttığını ve kristal menekşe28'in antimikrobiyal kapasitesinin çoğunu ortadan kaldırdığını göstermiştir. Flavin adenin dinükleotid veya FMN mavi ışıkla ışınlandığında, ortaya çıkan ROS, in vitro29 zehirlenmesi için HeLa hücrelerinde apoptoz üretir. Riboflavin varlığında fotokimyasal tedavi kullanarak, Cui ve ark. proliferasyonlarını ve sitokin üretimini inhibe ederek lenfositleri inaktive ettiler30.
Riboflavinin fotolizi, kan patojeninin UV 10,24 tarafından inaktive edilmesi için kullanılır, ancak UV ışık ışınlaması altında kan bileşenleri bozulabilir30. Ayrıca, UV'ye maruz kalan trombositlerin, membranlarındaki P-selectin ve LIMP-CD63 aktivasyon belirteçlerinin performansını giderek arttırdığı bildirilmektedir. UV ve yüksek yoğunluklu ışınlamanın sitotoksisitesinin araştırılması gerekir ve görünür ışığı içeren bir FMN fotoreaksiyonu sırasında karmaşık olmayan ve güvenli bir fotosensitizör çok faydalı olacaktır.
Daha kısa dalga boylarındaki ışık daha fazla enerjiye sahiptir ve hücrelere ciddi zararlar verme olasılığı çok daha yüksektir. Bununla birlikte, uygun bir fotosensitizörün varlığında, düşük yoğunluklu mor ışıkla ışınlama patojenik mikroorganizmaları inhibe edebilir. Mor ışıkla ışınlandığında FMN'nin <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;"> ışığa duyarlı hale getirilmesi ve üretilmesi, FMN fotolizinden ROS'un bakterilerin inaktivasyonunu arttırdığı yolu belirlemek için çalışmak için önemlidir.
Antimikrobiyal kontrol yaygın bir konudur ve yeni antibiyotiklerin geliştirilmesi sıklıkla on yıllar alır. Menekşe ışıkla ışınlamadan sonra, FMN tarafından aracılık edilen fotoinaktivasyon, çevresel patojenik bakterileri yok edebilir. Bu çalışma, FMN fotolizini sürmek ve böylece PDI için üretmek <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;"> için mor ışık kullanan etkili bir antimikrobiyal protokolü in vitro olarak sunmaktadır. S. aureus'un mikrobiyal canlılığı, FMN kaynaklı aPDI'nın fizibilitesini belirlemek için kullanılır.

<table><tbody><tr><td>Mavi, yeşil ve kırmızı LED ışıklar</td><td>Vita LED Technologies Co., Tainan, Tayvan</td><td></td><td>DC 12 V 5050</td></tr><tr><td>Dimetil Sülfoksit</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>190186</td><td></td></tr><tr><td>Kızılötesi termometre</td><td>Raytek Co. Santa Cruz, CA</td><td>MT4</td><td></td></tr><tr><td>LB et suyu</td><td>Difco Co., NJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Methionine</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>1.05707</td><td></td></tr><tr><td>NBT</td><td>Bio Basic, Inc. Markham, Ontario, Kanada</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Güç kaynağı</td><td>China tech Co., New Taipei City, Tayvan</td><td>YP30-3-2</td><td></td></tr><tr><td>Riboflavin 5 & prime; -fosfat</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>R7774</td><td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>New England BioLabs, Inc. Ipswich, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Güneş enerjisi ölçer</td><td>Tenmars Electronics Co., Taipei, Tayvan</td><td>TM-207</td><td></td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus subsp. aureus</td><td>Biyokaynak Toplama ve Araştırma Merkezi (BCRC), Hsinchu, Tayvan</td><td>10451</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis optik spektrometresi</td><td>Okyanus Optiği, Dunedin, FL</td><td>USB4000</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis spektrofotometresi</td><td>Hitachi High-Tech Science Corporation, Tokyo, Japonya</td><td>U-2900</td><td></td></tr><tr><td>Menekşe LED</td><td>Long-hui Electronic Co., LTD, Dongguan, Çin</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

riboflavin-5′- fosfatın görünür işık fotolizi ile patojenlerin İnaktivasyonu

Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5&#8242;-Phosphate

Riboflavin-5'-fosfat (veya flavin mononükleotid; FMN) görünür ışığa duyarlıdır. Reaktif oksijen türleri (ROS) de dahil olmak üzere çeşitli bileşikler, görünür ışıkla ışınlama üzerine FMN fotolizinden üretilebilir. FMN fotolizinden üretilen ROS, Staphylococcus aureus (S. aureus) gibi patojenik bakteriler de dahil olmak üzere mikroorganizmalara zararlıdır. Bu makale, örnek olarak, görünür ışık ışınlaması altında FMN'yi içeren fotokimyasal reaksiyonlar yoluyla S. aureus'u devre dışı bırakmak için bir protokol sunmaktadır. FMN fotolizi sırasında üretilen süperoksit radikal anyonu (), nitro mavi tetrazolyum (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01v3.png" style="margin: auto;">NBT) indirgemesi ile değerlendirilir. Reaktif <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01v3.png" style="margin: auto;"> türlere atfedilen S. aureus'un mikrobiyal canlılığı, sürecin etkinliğini belirlemek için kullanılmıştır. Bakteriyel inaktivasyon oranı FMN konsantrasyonu ile orantılıdır. Mor ışık, S. aureus'u inaktive etmede mavi ışık ışınlamasından daha etkilidir, kırmızı veya yeşil ışık ise FMN fotolizini tetiklemez. Bu makalede, FMN fotolizi sıhhi işlemler için basit ve güvenli bir yöntem olarak gösterilmektedir.

Işık dalga boyunun FMN üzerine etkisi Mavi, yeşil, kırmızı ve mor LED'ler kullanılarak ışınlanan 0.1 mM FMN'nin absorbans spektrumları Şekil 3'te gösterilmiştir. Karanlık kontrol için FMN için iki tepe noktası (372 nm ve 444 nm) vardır. Yeşil ve kırmızı ışığın hiçbir etkisi yoktur, çünkü spektrumdaki değişiklikler önemsizdir. Öte yandan, FMN'nin 444 nm'deki ilgili emilimi, 5 dakika boyunca 10 W /m2'de mavi ve mor ışık ışınlamasından sonra sırasıyla% 19 ve% 34 o...

Burada, düşük yoğunluklu mavi ve mor ışık ışınlaması altında flavin mononükleotidin (FMN) fotolizi sırasında üretilen reaktif oksijen türleri ile patojenik bakterileri inaktive etmek için bir protokol sunuyoruz. FMN fotolizinin sıhhi işlemler için basit ve güvenli bir yöntem olduğu gösterilmiştir.

Riboflavin-5′- Fosfatın Görünür Işık Fotolizi ile Patojenlerin İnaktivasyonu

Riboflavin-5&#39;-phosphate (or flavin mononucleotide; FMN) is sensitive to visible light. Various compounds, including reactive oxygen species (ROS), can ...

Bu protokol, flavin mononükleotid fotolizini indüklemek için görünür mor ışık ışınlaması kullanır. Bu, Staphylococcus aureus ve E.coli gibi patojenik bakterileri inhibe eden çok miktarda serbest radikal üretir. Flavin mononükleotidi uygun bir fotosensitizör olarak test ettik.Bu protokolde, güvenli ve pahalı ekipman gerektirmeyen görünür mor ışık kullanıyoruz. Bu yöntem, aydınlatma için bir optik fiber yerleştirilerek yaralı cildin veya enfekte olmuş deri altı dokularının tedavisinde kullanılabilir. Gıda endüstrisindeki sanitasyon uygulamasına da uygulanabilir.Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi Tang-Yu Chen olacak Başlamak için, opak bir plastik kabın içine her biri 12 voltluk altı ışık yayan diyot monte edin. 13 milimetre çapında ve 100 milimetre yüksekliğinde bir cam test tüpü alın ve reaktanları tüpe ekleyin. Tüpleri kabın üstüne sabitleyin ve bu kurulumu 25 üç santigrat derece sabit bir sıcaklığa yerleştirin.Fotolitik reaksiyonlar boyunca test ünitelerinin sıcaklığını kızılötesi termometre ile izleyin ve kaydedin. Daha sonra, pH 7.8'de 100 milimolar potasyum fosfat tamponunda 0.1 milimolar FMN çözeltisi hazırlayın. Her biri üç mililitre FMN örneğini beş dakika boyunca mavi, yeşil, kırmızı veya mor ışığa maruz bırakın.Paralel olarak, kontrol olarak karanlıkta üç mililitre FMN çözeltisi bulundurun. Numuneyi UV tarafından görülebilen bir spektrofotometreye yerleştirin ve ışınlanmış numunelerin emilimini 250 ila 750 nanometre aralığında kaydedin. Süperoksit radikallerinin tespitine hazırlanmak için, önce pH 7.8'de 73.3 mililitre 100 milimolar fosfat tamponuna 109.3 miligram L-metiyonin ekleyin.Çözeltiye 10 miligram NBT tozu ve 1.5 mililitre 0.117 milimolar FMN ekleyin. Reaksiyon çözeltisinin bir mililitresini bir ila beş dakika boyunca mavi veya mor LED ışığa maruz bırakın. NBT'nin fotokimyasal reaksiyonu tarafından üretilen formazan'ı tespit etmek için 516 nanometrenin emiciliğini kaydedin.Bir Staphylococcus aureus kolonisini, 15 mililitrelik vidalı kapaklı bir test tüpünde 10 mililitre lizojen et suyuna aşılayın. Kültürü bir çalkalayıcıda 16 saat boyunca 37 santigrat derecede büyütün. Kültürün 0,5 mililitresini 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.Sterilize su ekleyerek kültürü 600 nanometrede 0,5 optik yoğunluğa kadar seyreltin. Daha sonra, kültürün 0,5 mililitresini 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. 10 dakika boyunca 14.000 G'de santrifüj yapın ve süpernatanı boşaltın.Hücre peletine ve girdabına bir mililitre FMN tamponlu çözelti ekleyin. Işınlanmış kontrol için, bir mililitre fosfat tamponu ekleyin. 30 mikromolar FMN ve fosfat tamponu içeren bir mililitre bakteri hücresi çözeltisini cam tüplere aktarın.Onları 30 dakika boyunca metrekare başına 10 watt'ta mor ışık altında bir radyasyon için yerleştirin. Daha sonra, cam tüplerde 30-60 ve 120 mikromolar FMN ve fosfat tamponu içeren bir mililitre bakteri hücresi çözeltisi aktarın. Metrekare başına 20 watt'ta 120 dakika boyunca mavi ışıkla ışınlayın.Ayrıca, 60 dakika boyunca bir mililitre 120 mikromolar FMN içeren bir tüpü ışınlayın. Işınlamadan sonra, bir luria agar plakasına 0.2 mililitre reaksiyon çözeltisi ekleyin. Çözeltiyi L şeklinde bir cam çubuk kullanarak yayın ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Ertesi gün, Staphylococcus aureus'un canlı plaka sayısını ve inaktivasyon oranını hesaplayın. Bir hücre peleti elde etmek için staphylococcus aureus örneklerini daha önce açıklandığı gibi hazırlayın. 75 mililitre fosfat tamponuna 0.1093 gram L-metiyonin, 0.1 gram NBT ve 25 mililitre FMN çözeltisi ekleyin.Hücre peletlerine ve vortekse değişen FMN konsantrasyonlarına sahip her bir reaktant çözeltisinden bir mililitre ekleyin. Çözeltileri mor ışık altında 10 dakika boyunca metre kare başına 10 watt'ta ışınlayın. Karışımı 10 dakika boyunca 14.000 G'de santrifüj edin ve süpernatanı boşaltın.İndirgenmiş NBT'yi çıkarmak için peleti bir mililitre dimetil sülfoksit içinde yeniden askıya alın. Absorbansı 560 nanometrede kaydedin. FMN'nin yeşil ve kırmızı ışıkla ışınlanması, karanlık kontrole kıyasla 372 ve 444 nanometredeki zirveler üzerinde hiçbir etki göstermezken, FMN'nin 444 nanometrede emilimindeki azalma, mavi ve mor ışık altında gözlendi ve bu da fotolizin arttığını gösterdi.FMN fotolizi sırasında mavi veya mor ışık altında oluşan süperoksit radikallerinin tespiti NBT indirgemesi kullanılarak yapıldı. FMN'nin fotokimyasal etkisi ışınlama süresine bağlıydı. Mavi veya mor ışık ışınlaması kullanılarak yapılan FMN fotolizi, Staphylococcus aureus'un önemli ölçüde inaktivasyonu ile sonuçlandı.Mavi ışık ışınlaması için doza bağımlı inaktivasyon gözlendi ve 120-mikromolar FMN için% 97 inaktivasyon elde edildi. Mor ışık altında, staphylococcus aureus için% 96'lık bir inaktivasyon oranı elde edildi, 30-mikromolar FMN bakteriyel inaktivasyon için daha yüksek etkinlik gösterdi. NBT azalması, Staphylococcus aureus'ta mor ışık altında FMN'nin fotolitik etkisinin FMN konsantrasyonu ile orantılı olduğunu göstermiştir.İşlenmemiş koşullarda, 560 nanometrede düşük absorbans ile daha düşük bir süperoksit radikali bolluğu belirtilirken, FMN muamelesindeki daha yüksek absorbans değerleri, bol miktarda süperoksit radikali üretimi gösterdi ve bu da fotokimyasal etkinin artmasına neden oldu. İyi bir LED ışık kaynağına sahip olmak çok önemlidir. Mor ışık rejiminin spektral genişliği, UV radyasyonu tehlikeli olabileceğinden, UV emilimi ile herhangi bir örtüşmeyi önlemek için dar olmalıdır.İşlemi takiben, tetrasiklin, doksisiklin, kateşin gibi diğer kimyasal bileşikler ve FMN'ye benzer fotoliz için test edilebilir.

inactivation-pathogens-via-visible-light-photolysis-riboflavin-5

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Sürekli veya atımlı görebilir lazer esaslı muamele içeren gelişmiş bir biyomedikal cihaz antibiyotik tedavisi (kadaverin), canlılığı bir azalmaya yol açan bir istatistiksel olarak belirgin bir sinerjistik etki sonuçları ile birlikte olduğunu...

Üzerinde görebilir Işık ve Gentamisin en Sinerjik Etkisi<em&gt; Pseudomona aeruginosa</em&gt; Mikroorganizmalar

Kaynak: Cheng, C., ve diğerleri. riboflavin-5′-fosfatın görünür ışık fotolizi yoluyla patojenlerin inaktivasyonu. J. Vis. Uzm. (2022)Bu video, flavin mononükleotidinin (FMN) patojenik bakteriler üzerindeki fototoksik etkilerini değerlendirmek için bir yöntem göstermektedir. Bakteri kültürleri, artan FMN konsantrasyonlarına maruz bırakılır ve hücresel bileşenlere zarar veren reaktif oksijen türleri (ROS) üretmek için görünür ışıkla aydınlatılır. Hayatta kalan bakteriler daha sonra canlılıktaki...

Işıkla Aktive Olan Flavin Mononükleotid Kullanılarak Bakterilerin İnaktivasyonu

Kaynak: Cheng, C., ve diğerleri. riboflavin-5′-fosfatın görünür ışık fotolizi yoluyla patojenlerin inaktivasyonu. J. Vis. Uzm. (2022).Bu videoda, L-metiyonin, nitro mavi tetrazolyum (NBT) ve flavin mononükleotidi (FMN) içeren tamponlu bir reaksiyon karışımı, reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimini indüklemek için mor ışıkla ışınlanır. Bu, bakteriyel inaktivasyona ve spektrometrik olarak saptanabilir formazan oluşumuna yol açar.

Reaktif Oksijen Türlerinin Üretimi Yoluyla Işık Kaynaklı Bakteriyel İnaktivasyonun Miktarının Belirlenmesi

Kaynak: Zhao, K. ve diğerleri. 5-aminolevulinik asit aracılı fotodinamik tedavinin Staphylococcus aureus biyofilmi üzerindeki etkisini incelemek için in vitro model. J. Vis. Exp. (2018)Video, Gram-pozitif bakteriyel biyofilmler üzerindeki antibakteriyel etkileri değerlendirmek için fotodinamik bir tedavi protokolünü gösteriyor. Biyofilmler dört gruba ayrılır: ikisi fotosensitator öncül alır, ikisi ise bir tampon alır. Hepsi karanlıkta kuluçka yapılır, ardından bir öncül işlenmiş gruba ve bir...

Fotosensitator öncüsü kullanılarak bakteriyel biyofilmlerin ışıkla aktif tedavisi

Bu video, insan trombosit ürünlerinde yüksek titreli bakteriyel kontaminasyona karşı riboflavin ve UV ışık bazlı patojen azaltma sürecini göstermektedir. Bu işlem, bakteriyel kontaminasyon ile ilişkili ciddi advers transfüzyon olayları riskini azaltmaya yardımcı olabilir.

Bakterileri ortadan kaldırmak için trombosit ürünlerinin riboflavin ve UV ışığı tedavisi

Trombosit ürünlerinin saklama koşulları, bakteriyel kontaminantların tehlikeli seviyelere çoğalması için ideal bir ortam yaratır.  Bu çalışmanın amacı, insan trombosit ürünlerinde yüksek titreli bakteriyel kontaminasyona karşı riboflavin bazlı bir patojen azaltma sürecini değerlendirmek için bir koloni oluşturma testi kullanmaktı.

Riboflavin ile Trombosit Ürünleri ve UV Işık Tedavisi: Yüksek Titre Bakteriyel Kontaminasyon Karşı Etkinliği

Çok ilaca dirençli (MDR) bakteri suşlarının neden olduğu enfeksiyonlar, halk sağlığı için ciddi bir tehdit olarak ortaya çıkmış ve alternatif terapötiklerin geliştirilmesini gerektirmiştir. Biyolüminesans görüntüleme kullanarak fare yanıklarında MDR Acinetobacter baumannii enfeksiyonları için antimikrobiyal mavi ışık (aBL) tedavisinin etkinliğini değerlendirmek için bir protokol sunuyoruz.

Çok ilaca dirençli için Antimikrobiyal Mavi Işık Tedavisinin Vivo İncelenmesinin Acinetobacter baumannii Biyoparlaklık ımaging&#39;i kullanarak Enfeksiyonlar Yanık

İlaca dirençli Candida albicans'ın artan insidansı dünya çapında ciddi bir sağlık sorunudur. Antimikrobiyal fotodinamik tedavi (aPDT), ilaca dirençli mantar enfeksiyonlarına karşı savaşmak için bir strateji sunabilir. Bu protokol, in vitro olarak çoklu ilaca dirençli C. albicans suşu üzerinde Gül bengal aracılı aPDT etkinliğini tanımlamaktadır.

Candida albicans'ı İnhibe Etmek için Gül Bengal Aracılı Fotodinamik Terapi

Mevcut protokol, bir ışık aydınlatma sistemi ile iletim elektron mikroskobu (TEM) modifikasyonlarını, sıvı hücrelerin üretimini ve bakteri hücreleri ile bir fotosensitizör arasındaki ışık kaynaklı etkileşimlerin yerinde TEM gözlemlerini açıklamaktadır. Numune hazırlama yöntemleri, elektron ışını hasarı ve görüntüleme de tartışılmaktadır.

Sıvı-Yumuşak Madde Etkileşiminin Gözlemlenmesi için Işık Kaynaklı In Situ İletim Elektron Mikroskobu

Bu protokol, bir LED panel ışık kaynağı ile birleştirilmiş 96 oyuklu bir plaka formatı kullanarak, antibakteriyel fotodinamik inaktivasyonda (aPDI) potansiyel ışığa duyarlılaştırıcıların etkinliğini değerlendirmek için basit ve ekonomik bir yöntemi açıklar. Bu yaklaşım, farklı konsantrasyonlar, bileşikler ve bakteri suşları dahil olmak üzere birden fazla deneysel koşulun aynı anda test edilmesini sağlar.

Bakteriyel Fotodinamik İnaktivasyonda Fotoaktif Moleküllerin Değerlendirilmesi için LED Tabanlı İn Vitro Tarama

405 nm mavi ışık LED cihazı, kolajen bazlı sentetik cilt modelinde değerlendirildiğinde geniş bir yara patojenlerine karşı antimikrobiyal etkinlik göstermektedir. Bu basitleştirilmiş in vitro yaklaşım, ışık temelli antimikrobiyal tedavilerin erken aşama değerlendirmesi için tekrarlanabilir ve etik açıdan uygulanabilir bir alternatif sunar.

Kolajen Bazlı Sentetik Cilt Modeli Kullanarak Yara Patojenlerini Bastırmak İçin Mavi Tışık LED Cihazının Araştırılması

Keşfedin, flavin mononükleotit fotolizi ile görünür mor ötesi ışık kullanarak patojen bakterileri inaktive etme yöntemini. Staphylococcus aureus ve E.coli üzerinde etkili, güvenli ve düşük maliyetli bir protokoldür.

Riboflavin-5′- Fosfatın Görünür Işık Fotolizi ile Patojenlerin İnaktivasyonu

Daha fazla video keşfet