Name: Canlı Arabidopsis Köklerinin Epidermal Hücrelerinin Fiziksel Özelliklerini İncelemek için Atomik Kuvvet Mikroskobu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T13:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Keşfedin atomik kuvvet mikroskobu ile Arabidopsis kök epidermal hücrelerinin fiziksel özelliklerini in vivo ölçme yöntemini. Bu teknik, bitki hücre duvarı gelişimini ve stres koşullarındaki değişiklikleri zararsızca analiz eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma CSIC I + D 2018, hibe No. 95 (Mariana Sotelo Silveira) tarafından finanse edilmiştir.; CSIC Grupos (Omar Borsani) ve PEDECIBA.

1. Bitki materyalinin hazırlanması ve büyüme koşulları
<ol><li>Gerekli bitki materyalini üretmek için, Arabidopsis vahşi tipi ve mutant ilgi alanlarının tohumlarını sterilize edin. NOT: Bu protokolde aşağıdakileri kullandık: ttl1: T-DNA ekleme çizgileri Salk_063943 (TTL1 için; AT1G53300) - Columbia-0 (Col-0) vahşi tip; daha önce 10,11'de tanımlandığı gibi, CESA6 genindeki (AT5G64740) bir nakavt mutasyonundan (Q720stop) oluşan Procuste1 (prc1-1) mutant; ve ttl1 x prc1-1 çift mutant.<ol><li>Bir mikrotüpe yaklaşık 50 μL tohum hacmini koyun. Oda sıcaklığında 500 μL% 70 etanol +% 0.01 Ara çözeltisi ekleyin. 7 dakika boyunca karıştırın ve kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Etanol çözeltisini dökün ve 500 μL% 20 sodyum hipoklorit ekleyin. 7 dakika boyunca karıştırın ve kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Sodyum hipoklorit çözeltisini dökün ve tohumları üç ila dört kez steril suyla yıkayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Kaplama<ol><li>Önceden bazal Murashige ve Skoog (MS) ortamı12 +% 1.5 sakkaroz +% 1 agar (pH 5.7) hazırlayın (bkz. Ortamı otoklav edin. Steril bir ortamda çalışmak için laminer bir akış davlumbaz hazırlayın ve deney için gereken kare Petri kaplarını etiketleyin. Ortamı Petri kaplarına dökün ve ortamın katılaşmasına izin verin.</li>
		<li>Steril pipet uçları kullanarak sterilize edilmiş tohumları, ortamı içeren kare Petri kaplarına yerleştirin. Tohumları iki sıra halinde eşit olarak dağıtın. Tohumlar kuruduğunda, kapakları kapatın ve plakaları kapatın. Tohumları 4 gün boyunca karanlıkta 4 ° C'de tabakalaştırın. NOT: Çimlenmeyi senkronize etmek için tabakalaşma gereklidir.</li>
		<li>Plakaları büyüme odasına dikey olarak 25 μmolm2 s−1 ışık yoğunluğu ve 23 °C (gündüz/gece) ile uzun gün rejiminde (16 saat ışık / 8 saat karanlık) yerleştirin. Fideleri 7 gün boyunca büyütün.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Ozmotik stres tedavisi (isteğe bağlı)
NOT: Bu bölüm, krioskopik ozmometre (Malzeme Tablosu) tarafından tahmin edildiği gibi -1.2 MPa'lık ozmotik potansiyelde Arabidopsis köklerinin büyümesi hakkında ayrıntılı bilgi vermektedir. Bu bölüm, eldeki deneysel soruya bağlı olarak çıkarılabilir veya değiştirilebilir.
<ol><li>Bazal MS ortamı +% 1.5 sakkaroz + 400 mM mannitol +% 1 agar (pH 5.7) hazırlayın. Ortamı otoklav edin. Ortamı laminer akış davlumbazındaki kare Petri tabaklarına dökün ve ortamın katılaşmasını bekleyin.</li>
	<li>Cımbızla (Malzeme Tablosu), bazal MS +% 1.5 sakkaroz besisinde önceden yetiştirilmiş 5 günlük fideleri, 400 mM mannitol ile desteklenmiş ortamı içeren kare Petri kaplarına yerleştirin. Plakaları, büyüme odasına, adım 1.2.3'teki ile aynı koşullarda dikey olarak yerleştirin. Fideleri bu ozmotik stres koşulu altında 7 gün boyunca büyütün. NOT: Şiddetli ozmotik stres sırasında birincil kökün kök büyüme adaptasyonunu değerlendirmek için, kök meristem boyutunun zaten kurulmuş olduğundan emin olmak için kontrollü koşullarda yetiştirilen çimlenmeden 5 gün sonra fidelerin kullanılması önerilir13. Alternatif olarak, analiz, ozmotik stres etkisinin gelişimsel etkisini belirlemek için gelişimin her aşamasında gerçekleştirilebilir.</li>
</ol>3. Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) nanogirinti deneyleri
<ol><li>Nanogirinti deneyleri için numunenin hazırlanması NOT: Bu, AFM'yi canlı biyolojik örneklerin çalışmasına uygulamak için çok önemli bir adımdır. Numune, girinti ölçümleri sırasında mekanik olarak kararlı olması için alt tabakaya sıkıca tutturulmalıdır. Aynı zamanda, örnek yapısal nitelikler korunmalıdır. AFM için büyük bir numuneyi stabilize etmek için etkili bir strateji, yapıştırıcılar kullanmaktır. Yapıştırıcı hızlı bir şekilde kurumalı ve çevredeki ortamla toksik veya reaktif olmamalıdır. Bu protokolde substrat olarak polistiren Petri tabakları, Arabidopsis fidelerinin bağlanması için asidik olmayan silikon yapıştırıcı (Table of Materials) kullanılmıştır.<ol><li>Petri kabına ince bir silikon yapıştırıcı tabakasını, bir örtü parçası ile yayın. Tutkalı 45 s havada bırakın.</li>
		<li>Cımbızla, fideyi tutkalın üzerine yerleştirin ve fidenin çıkıntılı kısımları ile konsol arasındaki teması önleyecek bir yöne yönlendirin. Ardından, sıkıca bağlamak için kökü silikon yapıştırıcı tabakasına hafifçe bastırın. Protokolün sonraki adımlarına devam etmeden önce fideyi tutkalla 45 s temas halinde bırakın.</li>
		<li>Ekli fideleri 2 μg/mL propidium iyodür (PI; Malzeme Tablosu) karanlıkta 5 dakika boyunca ve 1x fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisi (Malzeme Tablosu) ile üç kez dikkatlice yıkayın.</li>
		<li>PI ile inkübe edilmiş fideleri, AFM ile birleştirilmiş ters çevrilmiş bir floresan mikroskobuna yerleştirin. Floresanı gözlemlemek için, uyarma ve emisyon dalga boylarını sırasıyla 572 nm ve 617 nm olarak ayarlayın. Epidermal hücrelerin içinde floresan bulunmaması, köklerin yaşayabilirliğini doğrular.</li>
		<li>Fideyi 1x fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisi ile örtün.</li>
	</ol></li>
	<li>Girinti protokolü NOT: Tüm AFM ölçümlerini, numunenin oda sıcaklığında desteğinde hareketsiz hale getirilmesinden sonra 1 saat içinde gerçekleştirin. AFM'nin bulunduğu oda klima ile 25 °C'de muhafaza edilmelidir. PBS çözeltisi aynı sıcaklıkta olmalıdır.<ol><li>Piramidal uçlu standart bir silikon nitrür konsolunu (bakınız Malzeme Tablosu) sıvı için AFM prob tutucusuna (Malzeme Tablosu) monte edin.</li>
		<li>Konsol üzerindeki lazeri ucun konumuna yakın bir yerde hizalayın. Ardından, lazer noktasını dedektörün merkezine yerleştirmek için fotodiyotu hareket ettirin.</li>
		<li>Sapma hassasiyetini kalibre etmek için, AFM'nin altına 1x PBS'li bir polistiren Petri kabı yerleştirin. NOT: Bu adım, girintiyi hesaplamak için gereklidir. Sert bir yüzeyde bir kuvvet ölçümü yapıldığında, yüzeye girinti girmez, bu nedenle z tarayıcı yer değiştirmesindeki herhangi bir değişiklik, konsol sapmasına karşılık gelir. Bu nedenle, sert bir yüzeyde sapma hassasiyetini kalibre etmek çok önemlidir. Yumuşak bir yüzey kullanmak, sapma hassasiyetini abartacak ve bu da çok düşük yay sabitlerine neden olacaktır.</li>
		<li>Fotodetektörü, temassız sapma 0 V'a yakın olacak şekilde ayarlayın. 3 μm rampa boyutu, 0,6 μm / s girinti ve geri çekme hızı ve 0,5 V tetik eşiği ile bir girinti (kuvvet eğrisi) gerçekleştirerek sapma hassasiyetini kalibre edin.</li>
		<li>Konsol yay sabitini kalibre etmek için, yay sabitleri yaklaşık 5 N/m'den düşük olan problar için önerilen AFM yazılımının (Malzeme Tablosu) Termal Ayar yardımcı programını kullanın veya referans14'te açıklanan yöntemi kullanın. Yazılımda Thermal Tune'u etkinleştirmeden önce, probun numuneyle etkileşime girmediğinden emin olun.<ol><li>Konsol sıcaklığını girin. Termal Ayar &gt; Kalibre Et'e veya NanoScope araç çubuğundaki Termal Ayar simgesine tıklayın. Bir frekans aralığı seçin (1-100 Hz).</li>
			<li>Termal Ayar panelinde Veri Al'a tıklayın. AFM'nin veri almasını bekleyin ve ardından Basit Harmonik Osilatör (Akışkan) düğmesine tıklayın.</li>
			<li>Medyan Filtre Genişliği'ni 3 olarak ayarlayın. Ortalama alarak elde edilen verilerdeki gürültüyü azaltmak için PSD Kutu Genişliği'ni ayarlayın. İlk rezonans zirvesinin etrafına uyum sınırları belirleyin.</li>
			<li>Bahar Sabit K'yı Hesapla'ya tıklayın ve ardından kullanıcının bu değeri kullanmak isteyip istemediğini soran açılır pencerede Evet'e tıklayın.</li>
			<li>Yukarıda açıklanan adımları üç kez tekrarlayın ve manuel olarak yay sabiti değerlerinin ortalamasını alın. Bu ortalama değeri, PicoForce görünümündeki Rampa parametre listesindeki Yay Sabiti kutusuna girin. Kalibrasyon bu noktada sona erer.</li>
		</ol></li>
		<li>Ters çevrilmiş optik mikroskobu 10x, 20x ve 40x göz merceği büyütmede kullanarak, AFM probunu birincil kökün dördüncü uzatılmış epidermal hücresinin yüzeyine yerleştirin ve hücrenin merkezine yerleştirilmesini sağlayın.</li>
		<li>Hesaplanan yay sabiti değeri (adım 3.2.5.5) ile, 3 μm rampa boyutuna, 11 nN tetikleme eşiğine ve seçilen noktalarda 0,6 μm/sn girinti ve geri çekme hızına sahip kuvvet eğrileri elde edin. NOT: Önceki çalışma15,16, düşük girinti ve geri çekilme sıklığının histerezis ve sürükleme kuvvetini en aza indirmeye yardımcı olduğunu bulmuştur.</li>
		<li>Her tedavi için kök başına üç hücreden kuvvet eğrileri elde edin (tedavi başına üç biyolojik replikasyon kullanın). Her kök için en az 150 kuvvet eğrisi yakalayın.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Görünür Young modülünü ölçün
<ol><li>Piramidal girintiler için her kuvvet eğrisini aşağıdaki modele uydurun17: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63533/63533eq01.jpg" style="margin: auto;">E, numunenin görünür Young modülüdür, <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63533/63533eq02.jpg" style="margin: auto;"> numunenin Poisson modülüdür ve α tepe noktasına yarı açıdır. Uyumları 0,99'&lt; bir korelasyon katsayısı (r2) ile atın. Poisson'un tamamen sıkıştırılamaz malzeme için oranını göz önünde bulundurun: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63533/63533eq02.jpg" style="margin: auto;"> = 0.5 ve üreticiler tarafından verilen girintinin geometrisi. NOT: Bağlantı elemanının hücre duvarı mekaniğine mümkün olduğunca duyarlı olması ve turgor basıncının görünür Young modül değerleri8 üzerindeki etkisini azaltmak için yükleme eğrisinin temas noktasından ilk 100 nm'yi kullanın. Montaj, yükleme eğrisinin temas noktasından belirli bir girinti derinliğinin ayarlanmasına izin veren özel bir MATLAB programı (kişisel istek üzerine JC B'ye yazılarak kullanılabilir) kullanılarak yapılmıştır.</li>
	<li><li></ol>

<ol><li>Anderson, C. T., Kieber, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+construction%2C+perception%2C+and+remodeling+of+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls.</a> Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).</li>
<li>Roeder, A. H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fifteen+compelling+open+questions+in+plant+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Fifteen compelling open questions in plant cell biology.</a> The Plant Cell. 34 (1), 72-102 (2022).</li>
<li>Zhang, B., Gao, Y., Zhang, L., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plant+cell+wall%3A+Biosynthesis%2C+construction%2C+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Integrative+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">The plant cell wall: Biosynthesis, construction, and functions.</a> Journal of Integrative Plant Biology. 63 (1), 251-272 (2021).</li>
<li>Hamant, O., Haswell, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+behind+the+wall%3A+Sensing+mechanical+cues+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Life behind the wall: Sensing mechanical cues in plants.</a> BMC Biology. 15 (59), 1-9 (2017).</li>
<li>Scheres, B., Benfey, P., Dolan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Arabidopsis+Book%22%5BJournal%5D)">Root development.</a> The Arabidopsis Book. 1, 0101(2002).</li>
<li>Cuadrado-Pedetti, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+arabidopsis+tetratricopeptide+thioredoxin-like+1+gene+is+involved+in+anisotropic+root+growth+during+osmotic+stress+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">The arabidopsis tetratricopeptide thioredoxin-like 1 gene is involved in anisotropic root growth during osmotic stress adaptation.</a> Genes. 12 (2), 236(2021).</li>
<li>Milani, P., Braybrook, S. A., Boudaoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shrinking+the+hammer%3A+micromechanical+approaches+to+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Shrinking the hammer: micromechanical approaches to morphogenesis.</a> Journal of Experimental Botany. 64 (15), 4651-4662 (2013).</li>
<li>Braybrook, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+elasticity+of+plant+cells+with+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring the elasticity of plant cells with atomic force microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 125, 237-254 (2015).</li>
<li>Bidhendi, A. J., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+quantify+primary+plant+cell+wall+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Methods to quantify primary plant cell wall mechanics.</a> Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).</li>
<li>Desnos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procuste1+mutants+identify+two+distinct+genetic+pathways+controlling+hypocotyl+cell+elongation%2C+respectively+in+dark-+and+light-grown+Arabidopsis+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Procuste1 mutants identify two distinct genetic pathways controlling hypocotyl cell elongation, respectively in dark- and light-grown Arabidopsis seedlings.</a> Development. 122 (2), 683-693 (1996).</li>
<li>Fagard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procuste1+encodes+a+cellulose+synthase+required+for+normal+cell+elongation+specifically+in+roots+and+dark-grown+hypocotyls+of+arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Procuste1 encodes a cellulose synthase required for normal cell elongation specifically in roots and dark-grown hypocotyls of arabidopsis.</a> The Plant Cell. 12 (12), 2409-2423 (2000).</li>
<li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bio+assays+with+tobacco+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Physiologia+Plantarum%22%5BJournal%5D)">A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures.</a> Physiologia Plantarum. 15 (3), 473-497 (1962).</li>
<li>Perilli, S., Sabatini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+root+meristem+size+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of root meristem size development.</a> Methods in Molecular Biology. 655, Clifton, N.J. 177-187 (2010).</li>
<li>Sader, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+virtual+instrument+to+standardise+the+calibration+of+atomic+force+microscope+cantilevers%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">A virtual instrument to standardise the calibration of atomic force microscope cantilevers.</a> Review of Scientific Instruments. 87 (9), 093711(2016).</li>
<li>Collinsworth, A. M., Zhang, S., Kraus, W. E., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apparent+elastic+modulus+and+hysteresis+of+skeletal+muscle+cells+throughout+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Apparent elastic modulus and hysteresis of skeletal muscle cells throughout differentiation.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 283 (4), 1219-1227 (2002).</li>
<li>Mathur, A. B., Collinsworth, A. M., Reichert, W. M., Kraus, W. E., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial%2C+cardiac+muscle+and+skeletal+muscle+exhibit+different+viscous+and+elastic+properties+as+determined+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Endothelial, cardiac muscle and skeletal muscle exhibit different viscous and elastic properties as determined by atomic force microscopy.</a> Journal of Biomechanics. 34 (12), 1545-1553 (2001).</li>
<li>Sirghi, L., Ponti, J., Broggi, F., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+elasticity+and+adhesion+of+live+cells+by+atomic+force+microscopy+indentation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Probing elasticity and adhesion of live cells by atomic force microscopy indentation.</a> European Biophysics Journal. 37 (6), 935-945 (2008).</li>
<li>Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM-based+mapping+of+the+elastic+properties+of+cell+walls%3A+At+tissue%2C+cellular%2C+and+subcellular+resolutions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">AFM-based mapping of the elastic properties of cell walls: At tissue, cellular, and subcellular resolutions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51317(2014).</li>
<li>Peaucelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pectin-induced+changes+in+cell+wall+mechanics+underlie+organ+initiation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis.</a> Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).</li>
<li>Fernandes, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+epidermal+cells+of+whole+living+roots+of+Arabidopsis+thaliana%3A+An+atomic+force+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+E%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of epidermal cells of whole living roots of Arabidopsis thaliana: An atomic force microscopy study.</a> Physical Review E. 85 (2), 21916(2012).</li>
</ol>

Yazarların çıkar çatışması yoktur. Verileri sığdırmak için kullanılan MATLAB betiği, kişisel talep üzerine J. C. B'ye yazılarak kullanılabilir.

Hücre ve hücre duvarı mekaniği, mekaniğin büyüme süreçlerini nasıl etkilediğine dair fikir edinmek için giderek daha alakalı hale geliyor. Fiziksel kuvvetler katı dokularda önemli mesafelere yayıldıkça, hücre duvarının fiziksel özelliklerindeki değişikliklerin ve bunların bitkinin büyümesini nasıl algıladıkları, kontrol edildikleri, ayarlandıkları ve etkiledikleri üzerine yapılan çalışmalar önemli bir çalışma alanı haline gelmektedir 2,3,8.</sup...

Bitki hücreleri, hücre tipine ve büyüme evresi 1,2'ye bağlı olarak kalınlığı 0.1 ila birkaç μm arasında değişen polisakkaritler, proteinler, metabolitler ve su ağlarından oluşan karmaşık bir yapı olan bir hücre duvarı ile çevrilidir. Hücre duvarı mekanik özellikleri bitkilerin büyümesinde önemli bir rol oynar. Hücre duvarının düşük sertlik değerleri, hücre büyümesi ve hücre duvarı genişlemesi için bir ön koşul olarak önerilmiştir ve tüm hücrelerin işlevlerini yerine getirmek için mekanik kuvvetler algıladığına dair kanıtlar artmaktadır. Bununla birlikte, hücre duvarının fiziksel özelliklerindeki değişikliklerin hücre kaderini belirleyip belirlemediği hala tartışılmaktadır 2,3,4. Bitki hücreleri gelişim sırasında hareket etmediğinden, bir organın son şekli, bir hücrenin ne kadar uzağa ve hangi yönde genişlediğine bağlıdır. Bu nedenle, Arabidopsis kökü, hücre duvarının fiziksel özelliklerinin hücre genişlemesindeki etkisini incelemek için iyi bir modeldir, çünkü kökün farklı bölgelerinde farklı genişleme türleri meydana gelir. Örneğin, anizotropik genişleme uzama bölgesinde ve özellikle epidermal hücrelerde belirgin şekilde belirgindir5.
Burada açıklanan yöntem, epidermal hücrelerin hücre duvarının fiziksel özelliklerini, ters çevrilmiş bir floresan faz mikroskobu6 ile birleştirilmiş bir Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) kullanarak canlı Arabidopsis köklerinin nano ölçeğinde karakterize etmek için kullanılmıştır. AFM tekniğinin kapsamlı bir revizyonu için 7,8,9'u okuyun.
Bu protokol, temel bir numune hazırlama yöntemini ve bitki hücre duvarlarının AFM tabanlı elastikiyetini ölçmek için genel bir yöntemi özetlemektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63533/63533fig01v2.jpg"> Şekil 1: Arabidopsis köklerinde atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanılarak yapılan kuvvet-girinti deneyine şematik genel bakış. Şema, kök örneğini sıkıca hareketsiz hale getirmek için substratın hazırlanmasından (1-2), propidium iyodür boyama yoluyla kök canlılığının doğrulanmasından (3), birincil kökün uzatılmış bir epidermal hücresinin yüzeyinde konsol konumlandırmasından (4-5), kuvvet eğrileri ölçümünden (6) ve görünür Young modülünü hesaplamak için kuvvet eğrisi işlemesinden (7-8) bir Kuvvet-Girinti deneyinin adımlarına genel bir bakış sunar. EZ: uzama bölgesi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63533/63533fig01largev2.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table><tbody><tr><td>1 x Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)</td><td></td><td></td> <td>Sodyum klorür ve fosfat tamponu içerir ve canlı hücrelerde ozmotik şoku önlemek ve su dengesini korumak için formüle edilmiştir.</td></tr><tr><td>AFM yazılımı</td><td>Bruker, Billerica, MA, ABD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Atomik kuvvet mikroskobu (AFM)</td><td>BioScope Catalyst, Bruker, Billerica, MA, ABD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Katalizör Prob tutucu-sıvı</td><td>Bruker, Billerica, MA, ABD</td><td>CAT-FCH</td><td>Biyoskop Katalizörü için bir prob tutucu, temas veya Kılavuz Çekme Modunda sıvı çalışması için tasarlanmıştır. Havada çalışma ile de uyumludur.</td></tr><tr><td>Kriyoskopik ozmometre; model OSMOMAT 030</td><td>Gonotech, Berlin, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige & Skoog Medium</td><td>Duchess Biochemie</td><td>M0221</td><td>Orijinal konsantrasyon, (1962)</td></tr><tr>AFM <td>Olympus IX81, Miami, FL, ABD</td><td></td><td></td>PEGAMIL ANAEROBICOS S.R.L., Buenos Aires, <td>Arjantin'e bağlı optik ters mikroskop</td></tr><tr><td></td><td></td><td>100429</td><td>Nötr, asidik olmayan silikon yapıştırıcı</td></tr><tr><td>Petri kapları</td><td>Deltalab</td><td>200201.B</td><td>Polistiren, 55 x 14 mm, radyasyon steril.</td></tr><tr><td>Propidium iyodür</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td>Kök canlılık testi için.</td></tr><tr><td>Silisyum nitrür probu, DNP-10, konsol A</td><td>Bruker, Billerica, MA, ABD</td><td>DNP-10/A</td><td>Sıvı işleminde kuvvet modülasyon mikroskobu için. Prob ucu yarıçapı 20-60 nm. 175-&mu; m-uzunluğunda üçgen konsol,&nbsp; 0,35 N/m yay sabiti ile.</td></tr><tr><td>Cımbız</td><td>Sigma</td><td>T4537</td><td></td></tr></tbody></table>

canlı arabidopsis köklerinin epidermal hücrelerinin fiziksel Özelliklerini İncelemek için atomik kuvvet mikroskobu

Atomic Force Microscopy to Study the Physical Properties of Epidermal Cells of Live Arabidopsis Roots

Burada, canlı Arabidopsis köklerinin epidermal hücrelerinin hücre duvarının fiziksel özelliklerini, optik ters çevrilmiş floresan mikroskobu ile birleştirilmiş bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ile nanogirintiler yoluyla karakterize etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntem, deformasyonunu ölçerken numuneye kontrollü kuvvetler uygulamaktan oluşur ve hücre altı çözünürlüklerde görünür Young hücre duvarı modülü gibi parametrelerin nicelleştirilmesine izin verir. Numunenin dikkatli bir mekanik immobilizasyonunu ve girintilerin ve girinti derinliklerinin doğru seçimini gerektirir. Sadece dış dokularda kullanılabilmesine rağmen, bu yöntem gelişim sırasında bitki hücre duvarlarındaki mekanik değişikliklerin karakterize edilmesine izin verir ve bu mikroskobik değişikliklerin tüm organın büyümesiyle korelasyonunu sağlar.

Kuvvet-Girinti deneyleri Aşağıdaki metinde, protokol iyi yürütüldüğünde beklenen tipik çıktıyı göstermek için bir kuvvet girinti deneyi yapıldığında beklenen bazı sonuçlar sunulmaktadır.
Kuvvet-yer değiştirme eğrileri Canlı örneklerin kök uzama bölgesinin hücresinin merkezine yerleştirilen bir konumda girintili girinti elde edilen temsili kuvvet girinti grafikleri Şekil 2'de sunulmuştur. AFM ucu hücre duvarının yüzeyini giri...

Atomik kuvvet mikroskobu girinti protokolü, normal veya kısıtlı büyüme sırasında (yani su açığı altında) bir doku veya organın belirli bir hücresinin hücre duvarının fiziksel özelliklerinin rolünü inceleme imkanı sunar.

Canlı Arabidopsis Köklerinin Epidermal Hücrelerinin Fiziksel Özelliklerini İncelemek için Atomik Kuvvet Mikroskobu

A method is described here to characterize the physical properties of the cell wall of epidermal cells of living Arabidopsis roots through ...

Bu yöntem, gelişim sırasında bitki hücre duvarının fiziksel özelliklerindeki değişiklikleri ölçmeye ve bu mikroskobik değişiklikleri tüm organın büyümesiyle ilişkilendirmeye izin verir. Bu tekniğin temel avantajı, invaziv olmaması ve hücre duvarının fiziksel özelliklerinin in vivo nicelleştirilmesine izin veren herhangi bir tedavi gerektirmemesidir. Başlamak için, Petri kabına ince bir silikon yapıştırıcı tabakası bir kapak kayması ile yayın ve 45 saniye boyunca havada bırakın.Cımbız kullanarak, fideyi tutkalın üzerine yerleştirin ve fidenin çıkıntılı kısımları ile konsol arasındaki teması önlemek için yönünü yönlendirin. Daha sonra sıkıca bağlamak için kökü silikon yapıştırıcı tabakasına hafifçe bastırın. 45 saniye bekletin ve 1X PBS çözümünü ekleyin.Piramidal uçlu standart silikon nitrür konsolunu sıvı için AFM prob tutucusuna monte edin ve konsol üzerindeki lazeri ucun konumuna yakın bir yere hizalayın. Ardından, lazer noktasını dedektörün merkezine yerleştirmek için fotoğraf diyotunu hareket ettirin. 3 mikrometre rampa boyutunda bir girinti, saniyede 0,6 mikrometre girinti ve geri çekme hızı ve 0,5 voltluk bir tetikleme eşiği gerçekleştirerek sapma hassasiyetini kalibre edin.Probun numuneyle etkileşime girmediğinden emin olun ve konsol yay sabitini kalibre edin. Termal ayar yardımcı programını kullanarak, kalibre et ve ardından termal ayar veya nano kapsam araç çubuğundaki termal ayar simgesine tıklayın ve konsol sıcaklığını girin. Bir frekans aralığı seçtikten sonra, numune harmonik osilatör sıvısı düğmesine tıklayın.Ardından, termal ayar panelinde alınan verilere tıklayın. Şimdi, medyan filtre genişliğini üçe ayarlayın. Alınan verilerdeki gürültüyü azaltmak için PSD binwidth'i ortalama alarak ayarlayın ve ilk rezonans tepe noktasının etrafına sığdırma sınırlarını ayarlayın.Yay sabiti K'yı hesapla'ya tıklayın ve ardından kullanıcının bu değeri kullanmak isteyip istemediğini sorarak açılır pencerede evet'e tıklayın. Ters çevrilmiş optik mikroskobu 10, 20 ve 40 kat göz merceği büyütmede kullanarak, AFM probunu birincil kökün dördüncü uzatılmış epidermal hücresinin yüzeyine yerleştirin ve hücrenin merkezine yerleştirmeyi sağlayın. Daha önce hesaplanan yay sabiti değeri ile 3 mikrometre rampa boyutuna, 11 nanonewton tetikleme eşiğine ve seçilen noktalarda saniyede 0,6 mikrometre girinti ve geri çekme oranına sahip kuvvet eğrileri elde edilir.Her işlem için kök başına üç hücreden kuvvet eğrileri elde edin ve her kök için en az 150 kuvvet eğrisi yakalayın. Bu grafik, kök uzama bölgesinin hücresinin merkezine yerleştirilmiş canlı örnekler üzerinde bir kuvvet girinti deneyi yapıldığında beklenen bir sonucu göstermektedir. AFM ucu hücre duvarının yüzeyi girintilenmeye başladığında, hücre duvarının iftiraya karşı çıkması nedeniyle kuvvet artmaya başlar.Kuvvet artışı, maksimum kuvvet değerine ulaşılana kadar devam eder. Bu noktadan sonra, girintinin boşaltma kısmı başlar. Kuvvet, girinti kısmındaki bir parabolün ardından büyür, bu da her eğriyi hesaplamalar için kullanılan piramidal girintiler için tahmin modeline uydurmak için önemlidir.Bir montaj parametresi olarak, temas noktası konumu girintiden önce hücre duvarı yüzeyine karşılık gelmelidir ve AFM uç yer değiştirmesinin kaynağı olarak kabul edilir. Girinti atılmadan önce temas noktasını tespit etmenin imkansız olduğu kuvvet eğrileri. Ayrıca, kuvvet girinti deneyinin yükleme ve boşaltma eğrisi gürültüden yoksun olmalıdır.Her kuvvet eğrisini modele uydurduktan sonra, görünür Young modülünün elde edilen değerlerinin frekansının dağılımını gösteren histogramlar elde edildi. Bu histogram, kontrol koşullarında yetiştirilen üç farklı Columbia Zero bitkisinin dokuz farklı hücresi üzerinde 201 başarılı girinti seti ile elde edilen frekansı göstermektedir. Kökün morfolojisi nedeniyle bazı genotipler için girinti zor olabilir.Örneğin, TTL 1 PRC 1-1 çift mutantı şiddetli ozmotik streste büyüdü. Bu histogramlar, dokuz farklı hücreden görünen Young modülünün elde edilen değerlerinin olasılık dağılımını gösterir. Sadece bir hücreye karşılık gelen histogram H, Gauss dağılımına takılabilir.Burada sunulan metal, büyüme hızı çalışmaları veya hücre duvarının kimyasal bileşiminin analizi gibi diğer tekniklerle birleştirilebilir. Bu diğer teknikler, hücre duvarının fiziksel özellikleri üzerindeki kimyasal bileşimin bir organın büyümesini nasıl etkilediğini anlamak için bilgiyi tamamlayacaktır.

atomic-force-microscopy-to-study-physical-properties-epidermal-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz stoma farklılaşma belgeleyen, gelişme birkaç gün içinde epidermis konfokal görüntüleme için bitki kotiledon hareketsiz odası slaytlar ve medya kullanarak bir protokol açıklar. Fluorofor etiketli proteinlerin hücre bölünmesi ve hücre tipi farklılaşması esnasında olası rollerini anlamayı arttırıyor, ifade ve hücre içi lokalizasyonu dinamik izlenebilir.

Uzun süreli, yüksek çözünürlüklü Konfokal Time Lapse Görüntüleme<em&gt; Arabidopsis Kotiledon</emÇimlenme sırasında&gt; Epidermis

Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanarak bitki dokularının mekanik özelliklerini haritalamak için bir yöntem açıklıyoruz. Bitki gelişimi sırasında hücre duvarlarında meydana gelen mekanik değişikliklerin geniş alan orta ölçeğinde nasıl kaydedileceğine odaklanıyoruz ve bu değişikliklerin büyüme ve morfogenez ile ilişkilendirilmesini sağlıyoruz.

Hücre Duvarları Elastik Özelliklerinin AFM-tabanlı Haritalama: doku, hücresel ve Subselüler Çözünürlüklerde

Bu protokolün amacı stoma kompleksinin hücre korteks içinde, GFP etiketli PATROL1, bir membran kaçakçılığı protein noktalar yanıp sönen gösteren değişken açılı Epifloresans mikroskobu ile bitki hücre yüzeylerinde floresan etiketli protein dinamikleri izlemek için nasıl göstermek için Arabidopsis thaliana.

Değişken açılı Epifloresans Mikroskopi ile Bitki Hücre Yüzey Dynamics Gerçek zamanlı Görüntüleme

Kristalin selüloz, bitki hücre duvarının önemli bir bileşenidir. Bununla birlikte, hücresel bir çözünürlükte nicelleştirilmesi teknik olarak zordur.  Burada, uzay-zamansal bir çözünürlükte hücre duvarı bileşimi hakkında bilgi elde etmek için polarize ışık teknolojisinin ve kök kesitlerinin kullanımını rapor ediyoruz.

Kristalin Selüloz Birikimin Yüksek Çözünürlüklü Niceleme<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Kökler Doku spesifik Hücre Duvarı Değişiklikler Monitör

Bu makalede, ana kök ve kök tüyleri tek bir optik uçağı için confines bir iki katlı mikrosıvısal platformda Arabidopsis thaliana fidan kültür gösterilmiştir. Bu platform iyi kök morfolojisi de yüksek çözünürlüklü görüntüleme gelince gerçek zamanlı optik görüntüleme için başka araçlar tarafından kullanılabilir.

Kök saç Morfoloji Arabidopsis fidan bir iki katlı mikrosıvısal platformda görüntüleme

Burada, hücre ve dokularda nano ve mikro girinti aracı olarak işletilen atomik kuvvet mikroskobu (AFM) sunuyoruz. Cihaz, numunenin 3D yüzey topografisini ve hücre duvarı Young 'ın modüllerinin yanı sıra Turgor basıncını da içeren mekanik özelliklerini eşzamanlı olarak satın almayı sağlar.

Santral hücreleri ve bitki dokularının mekanik özelliklerini ve Turgor basıncını ölçmek için Atomic Force Microkopi kullanımı

Burada, ateş apikal meristem'deki kortikal mikrotübül sitoiskeletinin canlı hücre görüntülemesi ve fiziksel kuvvetlerdeki değişikliklere tepkisini izleme protokolünü anlatıyoruz.

Mikrotübül Sitoiskeletinin Canlı Hücre Görüntülemesi ve Arabidopsis Shoot Apikal Meristem'in Mikromekanik Manipülasyonu

Hücre duvarı biyomekaniği çalışmaları, bitki büyümesini ve morfogenezini anlamak için gereklidir. Aşağıdaki protokol, atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak genç bitki organlarının iç dokularındaki ince primer hücre duvarlarının araştırılması için önerilmiştir.

Canlı Bitki Organlarında Primer Hücre Duvarının Mekanik Özelliklerinin Atomik Kuvvet Mikroskobu Kullanılarak Karakterize Edilmesi

Bu yazıda stoma gelişimini kontrol eden genleri karakterize etmek için epidermal peeling kullanılmadan iki fenotipleme yöntemi anlatılmaktadır. İlk yöntem, toluidin mavisi O-boyalı bitki epidermisi kullanılarak stoma fenotipinin nasıl analiz edileceğini göstermektedir. İkinci yöntem, stoma ligandlarının nasıl tanımlanacağını ve biyolojik aktivitelerinin nasıl izleneceğini açıklar.

Stomatal Gelişimde Rol Oynayan Genlerin Epidermal Fenotip Skorlaması ile Tanımlanması

Bir plazma membran reseptörü kinazının membran kaçakçılığı olaylarını incelemek için burada yaygın olarak kullanılan birkaç yöntem tanıtılmaktadır. Bu yazıda bitki materyali hazırlama, farmakolojik tedavi ve konfokal görüntüleme kurulumu dahil olmak üzere ayrıntılı protokoller açıklanmaktadır.

Stoma Soy Hücrelerinde Membran Kaçakçılığı Olaylarını İncelemek için Görüntü Tabanlı Yöntemler

Bu süreç, Arabidopsis thaliana'da floresan etiketlenmiş çekirdek ve kromatin işaretleyici çizgisi ile birlikte konfokal mikroskopi kullanarak Arabidopsis köklerinde çekirdek ve kromatin dinamiklerini aynı anda kaydeder ve gelişimsel ile çevresel ipuçlarına yanıt olarak bu dinamiklerdeki değişiklikleri araştırır.

Arabidopsis thaliana Kökünde Gelişim Sırasında Nükleer Şekil ve Kromatin Dinamiklerinin Nicel Canlı Hücre Görüntülemesi ve Çevresel Stres

Keşfedin atomik kuvvet mikroskobu ile Arabidopsis kök epidermal hücrelerinin fiziksel özelliklerini in vivo ölçme yöntemini. Bu teknik, bitki hücre duvarı gelişimini ve stres koşullarındaki değişiklikleri zararsızca analiz eder.

Canlı Arabidopsis Köklerinin Epidermal Hücrelerinin Fiziksel Özelliklerini İncelemek için Atomik Kuvvet Mikroskobu

Daha fazla video keşfet