Canlı Arabidopsis Köklerinin Epidermal Hücrelerinin Fiziksel Özelliklerini İncelemek için Atomik Kuvvet Mikroskobu

Bu yöntem, gelişim sırasında bitki hücre duvarının fiziksel özelliklerindeki değişiklikleri ölçmeye ve bu mikroskobik değişiklikleri tüm organın büyümesiyle ilişkilendirmeye izin verir. Bu tekniğin temel avantajı, invaziv olmaması ve hücre duvarının fiziksel özelliklerinin in vivo nicelleştirilmesine izin veren herhangi bir tedavi gerektirmemesidir. Başlamak için, Petri kabına ince bir silikon yapıştırıcı tabakası bir kapak kayması ile yayın ve 45 saniye boyunca havada bırakın.

Cımbız kullanarak, fideyi tutkalın üzerine yerleştirin ve fidenin çıkıntılı kısımları ile konsol arasındaki teması önlemek için yönünü yönlendirin. Daha sonra sıkıca bağlamak için kökü silikon yapıştırıcı tabakasına hafifçe bastırın. 45 saniye bekletin ve 1X PBS çözümünü ekleyin.

Piramidal uçlu standart silikon nitrür konsolunu sıvı için AFM prob tutucusuna monte edin ve konsol üzerindeki lazeri ucun konumuna yakın bir yere hizalayın. Ardından, lazer noktasını dedektörün merkezine yerleştirmek için fotoğraf diyotunu hareket ettirin. 3 mikrometre rampa boyutunda bir girinti, saniyede 0,6 mikrometre girinti ve geri çekme hızı ve 0,5 voltluk bir tetikleme eşiği gerçekleştirerek sapma hassasiyetini kalibre edin.

Probun numuneyle etkileşime girmediğinden emin olun ve konsol yay sabitini kalibre edin. Termal ayar yardımcı programını kullanarak, kalibre et ve ardından termal ayar veya nano kapsam araç çubuğundaki termal ayar simgesine tıklayın ve konsol sıcaklığını girin. Bir frekans aralığı seçtikten sonra, numune harmonik osilatör sıvısı düğmesine tıklayın.

Ardından, termal ayar panelinde alınan verilere tıklayın. Şimdi, medyan filtre genişliğini üçe ayarlayın. Alınan verilerdeki gürültüyü azaltmak için PSD binwidth'i ortalama alarak ayarlayın ve ilk rezonans tepe noktasının etrafına sığdırma sınırlarını ayarlayın.

Yay sabiti K'yı hesapla'ya tıklayın ve ardından kullanıcının bu değeri kullanmak isteyip istemediğini sorarak açılır pencerede evet'e tıklayın. Ters çevrilmiş optik mikroskobu 10, 20 ve 40 kat göz merceği büyütmede kullanarak, AFM probunu birincil kökün dördüncü uzatılmış epidermal hücresinin yüzeyine yerleştirin ve hücrenin merkezine yerleştirmeyi sağlayın. Daha önce hesaplanan yay sabiti değeri ile 3 mikrometre rampa boyutuna, 11 nanonewton tetikleme eşiğine ve seçilen noktalarda saniyede 0,6 mikrometre girinti ve geri çekme oranına sahip kuvvet eğrileri elde edilir.

Her işlem için kök başına üç hücreden kuvvet eğrileri elde edin ve her kök için en az 150 kuvvet eğrisi yakalayın. Bu grafik, kök uzama bölgesinin hücresinin merkezine yerleştirilmiş canlı örnekler üzerinde bir kuvvet girinti deneyi yapıldığında beklenen bir sonucu göstermektedir. AFM ucu hücre duvarının yüzeyi girintilenmeye başladığında, hücre duvarının iftiraya karşı çıkması nedeniyle kuvvet artmaya başlar.

Kuvvet artışı, maksimum kuvvet değerine ulaşılana kadar devam eder. Bu noktadan sonra, girintinin boşaltma kısmı başlar. Kuvvet, girinti kısmındaki bir parabolün ardından büyür, bu da her eğriyi hesaplamalar için kullanılan piramidal girintiler için tahmin modeline uydurmak için önemlidir.

Bir montaj parametresi olarak, temas noktası konumu girintiden önce hücre duvarı yüzeyine karşılık gelmelidir ve AFM uç yer değiştirmesinin kaynağı olarak kabul edilir. Girinti atılmadan önce temas noktasını tespit etmenin imkansız olduğu kuvvet eğrileri. Ayrıca, kuvvet girinti deneyinin yükleme ve boşaltma eğrisi gürültüden yoksun olmalıdır.

Her kuvvet eğrisini modele uydurduktan sonra, görünür Young modülünün elde edilen değerlerinin frekansının dağılımını gösteren histogramlar elde edildi. Bu histogram, kontrol koşullarında yetiştirilen üç farklı Columbia Zero bitkisinin dokuz farklı hücresi üzerinde 201 başarılı girinti seti ile elde edilen frekansı göstermektedir. Kökün morfolojisi nedeniyle bazı genotipler için girinti zor olabilir.

Örneğin, TTL 1 PRC 1-1 çift mutantı şiddetli ozmotik streste büyüdü. Bu histogramlar, dokuz farklı hücreden görünen Young modülünün elde edilen değerlerinin olasılık dağılımını gösterir. Sadece bir hücreye karşılık gelen histogram H, Gauss dağılımına takılabilir.

Burada sunulan metal, büyüme hızı çalışmaları veya hücre duvarının kimyasal bileşiminin analizi gibi diğer tekniklerle birleştirilebilir. Bu diğer teknikler, hücre duvarının fiziksel özellikleri üzerindeki kimyasal bileşimin bir organın büyümesini nasıl etkilediğini anlamak için bilgiyi tamamlayacaktır.