Hedefler Altında Ultra Düşük Giriş Bölünmesi ve Nükleaz Kullanarak Salınım Kullanılarak Kromatin Üzerinde Tek Hücreli Faktör Lokalizasyonu

CUT&RUN, kromatin üzerinde protein lokalizasyonunu belirlemek için güçlü bir tekniktir ve burada bu tekniğin tek hücreli bir versiyonunu manuel 96 kuyucuklu bir biçimde açıklıyoruz. ChIP-seq gibi çoğu protein lokalizasyon tekniği, yüksek hücre girişi gerektirir ve tamamlanması yaklaşık üç gün sürer. CUT&RUN, yüksek sinyal ve düşük arka plan nedeniyle, düşük hücreli ve tek hücreli uygulama için optimize edilmiştir ve tek bir günde tamamlanabilir.

Bu tekniğin hemen hemen her biyolojik örneğe uygulanabileceğini ve değerli hasta örnekleri gibi nadir ve düşük bolluktaki örneklerde faktör lokalizasyonunu belirlemek için özellikle güçlü olabileceğini öngörüyoruz. Herhangi bir tek hücreli deney yapmadan önce, antikoru ve tekniği çok sayıda değerli olmayan hücre üzerinde test edin. Bu deneyin ana sınırlaması, sağlam bir antikora bağımlılıktır.

Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan deneyimli bir araştırma uzmanı olan Santana Lardo. Tek hücreleri ayırdıktan ve çekirdekleri boncuklara bağladıktan sonra, 96 delikli plakayı 96 delikli manyetik bir rafa yerleştirin ve boncukların en az beş dakika boyunca bağlanmasına izin verin. Ardından, süpernatanı çıkarın ve atın.

Çekirdeğe bağlı boncuklara 100 mikrolitre bloke edici tampon ekleyin, nazik pipetleme ile karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. Plakayı 96 delikli manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatantın en az beş dakika boyunca temizlenmesine izin verin. Ardından, boncukları rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın ve atın.

Plakayı manyetik raftan çıkarın ve boncukları reaksiyon başına 100 mikrolitre yıkama tamponunda nazik pipetleme ile yeniden askıya alın. Plakayı 96 delikli manyetik rafa geri yerleştirin, süpernatantın temizlenmesine izin verin ve ardından süpernatanı çıkarın ve atın. Boncukları, reaksiyon başına 25 mikrolitre yıkama tamponunda nazik pipetleme ile yeniden askıya alın.

Reaksiyon başına 25 mikrolitre yıkama tamponu alarak birincil bir antikor ana karışımı yapın ve ardından reaksiyon başına 0.5 mikrolitre antikor ekleyin. 25,5 mikrolitre antikor yıkama tamponu karışımı ekleyin, ardından ilgilenilen proteini hedefleyen bir antikor ile muamele edilen her numuneye nazik pipetleme yapın. Oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.

Ardından, numuneleri tekrar 96 delikli manyetik rafa yerleştirin. Süpernatant temizlendikten sonra, boncukları rahatsız etmeden çıkarın ve atın. Plakayı manyetik raftan çıkardıktan sonra, boncukları 100 mikrolitre yıkama tamponu ile yıkayın ve pipetle indirerek tekrar askıya alın.

Plakayı 96 delikli bir manyetik rafa geri yerleştirdikten ve daha önce gösterildiği gibi süpernatantı attıktan sonra, her numuneyi 25 mikrolitre yıkama tamponunda yeniden askıya alın. Reaksiyon başına 25 mikrolitre yıkama tamponu ve optimize edilmiş miktarda protein A MNaz ekleyerek bir protein A MNaz ana karışımı yapın. Kontrol numuneleri de dahil olmak üzere her numuneye 25 mikrolitre protein A MNase ana karışımı ekleyin.

Numuneleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Plakayı 96 delikli manyetik rafa yerleştirin. Süpernatantın en az beş dakika boyunca temizlemesine izin verin ve ardından boncukları rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın ve atın.

Plakayı manyetik raftan çıkardıktan sonra, boncukları 100 mikrolitre yıkama tamponu ile yıkayın ve nazik pipetleme ile yeniden askıya alın. Plakayı 96 delikli manyetik bir rafa yerleştirin ve daha önce gösterildiği gibi süpernatantı atın. Ardından, numuneleri manyetik raftan çıkarın ve boncukları 50 mikrolitre yıkama tamponunda nazik pipetleme ile yeniden askıya alın.

Numuneleri beş dakika boyunca buzlu su karışımında sıfır santigrat dereceye dengeleyin ve ardından numuneleri buzlu su banyosundan çıkarın. Çok kanallı pipet kullanarak bir mikrolitre 100 milimolar kalsiyum klorür ekleyin. Büyük hacimli çok kanallı pipet kullanarak nazik pipetleme ile üç ila beş kez iyice karıştırın ve ardından numuneleri sıfır santigrat dereceye geri döndürün.

Plaka buzlu su banyosuna geri döner dönmez 10 dakikalık bir zamanlayıcı başlatın. RSTOP+ ve tampon konsantrasyonunun iki katını içeren bir çözeltinin 50 mikrolitresini, kalsiyum klorür eklendiği sırada her bir kuyucuğa pipetleyerek reaksiyonu durdurun. Numuneleri 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca inkübe edin.

Plakayı dört santigrat derecede beş dakika boyunca 16.000 kez G'de döndürün. Plakayı 96 delikli manyetik rafa yerleştirin. Süpernatantın en az beş dakika boyunca temizlemesine izin verin.

Ardından, süpernatantları taze bir 96 kuyucuklu plakaya aktarın ve boncukları atın. DNA ekstraksiyonu için, her numuneye bir mikrolitre% 10 SDS ve mililitre proteinaz K başına 0.83 mikrolitre 20 miligram ekleyin ve örnekleri nazik pipetleme ile karıştırın. Numuneleri 70 santigrat derecede 10 dakika boyunca inkübe edin.

Plakayı oda sıcaklığına geri getirin. 46.6 mikrolitre beş molar sodyum klorür ve 90 mikrolitre% 50 PEG4000 ekleyin ve nazik pipetleme ile karıştırın. Her numuneye 33 mikrolitre polistiren manyetit boncuk ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın.

Plakayı manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatantın yaklaşık beş dakika boyunca temizlenmesine izin verin. Ardından, boncukları rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice atın. Boncukları rahatsız etmeden 150 mikrolitre% 80 etanol ile iki kez durulayın.

Plakayı 30 saniye boyunca 1000 kez G'de kısaca döndürün. Plakayı tekrar 96 delikli manyetik bir rafa yerleştirin ve boncukları rahatsız etmeden tüm artık etanolleri çıkarın. Numuneleri yaklaşık iki ila beş dakika boyunca hava ile kurutun.

Boncukları pH 8'in 37.5 mikrolitrelik 10 milimolar TRIS hidroklorüründe yeniden askıya alın ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Plakayı tekrar manyetik bir rafa yerleştirin ve boncukların beş dakika boyunca bağlanmasına izin verin. Süpernatantın 36,5 mikrolitresini taze bir termosiklet uyumlu 96 delikli plakaya aktarın ve boncukları atın.

Hücre kalitesi değerlendirmesi yapıldıktan sonra, hücre görünümü ve yüzdesi incelenerek düşük kaliteli embriyonik kök hücrelerin kullanılmaması gerektiği gösterilmiştir. Hoechst 33342 boyası kullanılarak tek hücreli sıralama yapıldı ve her bir kuyucukta sıfır veya bir hücre bulunduğundan emin olmak için test hücreleri sayıldı. Agarose jel analizi, düşük moleküler ağırlıklı bir merdiven ve bireysel tek hücreli uliCUT & RUN kütüphanelerini ortaya çıkardı.

Suboptimal ve optimal kütüphane analizleri düşük molekül ağırlıklı bir merdiven, verimsiz Mnaze sindirimi nedeniyle suboptimal kütüphane ve uygun sindirime sahip başarılı bir kütüphane göstermektedir. Parça analizörü dağılımı, beklenen tek hücreli boyutun 150 ila 500 baz çifti arasında değiştiğini göstermektedir. Bununla birlikte, büyük proteinlerde, DNA yaklaşık 270 baz çiftine sahip olacaktır.

Yüksek hücre sayısını veya negatif kontrolü gösteren tek lokuslu genom tarayıcısı ve tek hücreli CTCF uliCUT & RUN kullanılarak protein doluluğu, tek hücrenin büyük ölçüde yüksek hücreli uliCUT & RUN'a benzer şekilde güçlü zirveleri temsil ettiğini ortaya koymuştur. Tek hücreli CTCF veya negatif kontrolün ısı haritaları, hücrelerdeki yerleşik CTCF bağlanma bölgeleri üzerinde doğrudan net bir okuma zenginleştirme paterni ortaya koymuştur. Tek boyutlu ısı haritaları, çevre bölgelere ve antikor içermeyen kontrollere göre tek hücreli kütüphanelerde kurulu CTCF bağlanma bölgelerine göre daha yüksek bir okuma yoğunluğu gösterir ve yerleşik bağlanma bölgelerinde antikora özgü zenginleştirme gösterir.

Buzlu su banyosundaki boncuk bağlı çekirdeklerin dengelenmesi ve kalsiyum klorür ilavesi üzerine numunenin aşırı ısınmaması, kromatinin aşırı sindirimini önlemek için önemlidir.