Name: Hedefler Altında Ultra Düşük Giriş Bölünmesi ve Nükleaz Kullanarak Salınım Kullanılarak Kromatin Üzerinde Tek Hücreli Faktör Lokalizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Öğrenin, CUT&RUN yöntemiyle kromatin üzerinde tek hücreli protein lokalizasyonunu nasıl belirleyeceğinizi. Bu teknik, düşük hücre girişi gerektirir ve nadir biyolojik örneklerde faktör haritalaması için idealdir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Hainer Lab üyelerine bu makalenin önceki bir versiyonunu okudukları ve yorumladıkları için teşekkür ederiz. Bu proje, Pittsburgh Üniversitesi Sağlık Bilimleri Sıralama Çekirdeği'nde bulunan NextSeq500'ü, Pittsburgh Çocuk Hastanesi'ndeki UPMC Çocuk Hastanesi'nde, direktörü William MacDonald'a özel teşekkürlerle sıralamak için kullandı. Bu araştırma kısmen Pittsburgh Üniversitesi Araştırma Hesaplama Merkezi tarafından sağlanan bilgisayar kaynakları aracılığıyla desteklenmiştir. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Hibe Numarası R35GM133732 (S.J.H.'ye) tarafından desteklenmiştir.

Etik beyanı: Tüm çalışmalar Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal Biyogüvenlik Araştırma Koruma Ofisi tarafından onaylanmıştır.
1. Manyetik boncuklar hazırlayın
NOT: Hücre sıralamadan önce gerçekleştirin ve kullanana kadar buz üzerinde tutun.
<ol><li>Pipet 30 μL ConA-konjuge paramanyetik mikrosferler boncuk bulamaç karışımı taze 1,5 mL mikrofuge tüpe reaksiyon başına ve karıştırmak için hafifçe pipetleme yaparak 850 μL Bağlayıcı Tampon ekleyin. NOT: KonA konjuge paramanyetik mikrosferler, lipit membranının bağlanmasına izin veren lektin kaplı manyetik boncuklardır.</li>
	<li>Tüpü manyetik bir rafa yerleştirin ve boncukların 1-2 dakika boyunca mıknatıslanmasına izin verin. Süpernatant temizlendikten sonra, boncukları rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın ve atın.</li>
	<li>Tüpü manyetik raftan çıkarın ve 1 mL Bağlayıcı Arabelleğe geri sarılarak boncukları yıkayın.</li>
	<li>1.2 ve 1.3 numaralı adımları yineleyin.</li>
	<li>Boncukları 2 dakika boyunca manyetize edin ve atmak için süpernatantı çıkarın.</li>
	<li>Tüpü manyetik raftan çıkarın ve boncukları reaksiyon başına 30 μL Bağlayıcı Tamponda yeniden askıya alın.</li>
	<li>Yıkanmış boncuk karışımını hücreler sıralanana kadar buz üzerinde tutun.</li>
</ol>2. Hasat hücreleri
NOT: Bu adım yapıştırılmış hücreler için yazılmıştır ve murin E14 embriyonik kök hücreleri için optimize edilmiştir. Hücrelerin kültürlenmesi ve toplanması hücre tipine bağlıdır.
<ol><li>Hücreleri 37 °C inkübatörden çıkarın ve kaliteyi sağlamak için mikroskop altında inceleyin.</li>
	<li>Ortamı hücre plakasından aspire edin ve 5 mL 1x PBS ile durulayın.</li>
	<li>PBS'yi plakadan aspire edin ve hücreleri toplayın (hücre tipine göre farklılık gösterecek geleneksel hücre toplama yöntemlerini kullanarak). Gerekirse, kültür kabına karşı serolojik bir pipetle hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek, tek hücreli süspansiyon elde edin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 200 x g'de aşağı doğru döndürün.</li>
	<li>Hücre peletini atmak ve yıkamak için medyayı 5 mL PBS +% 1 FBS ile aspire edin.</li>
	<li>Hücreleri 5 dakika boyunca 200 x g'de döndürün, süpernatanı atın ve hücre peletini 5 mL PBS +% 1 FBS'de yeniden askıya alın.</li>
	<li>Hücreleri sayın ve 1 mL'lik 1 x 106 hücreyi taze bir 1,5 mL mikrofüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>5 μL 7-Amino-Aktinomisin D (7-AAD) ekleyin, karıştırmak için tüpü iyice ters çevirin ve ardından canlı tek hücreleri 96 delikli bir plakanın ayrı deliklerine ayırmak için numuneyi hücre sıralayıcısına uygulayın. NOT: 7-AAD boya canlı hücrelerden dışlanır ve bu nedenle canlı hücre sıralamada kullanılabilir.</li>
</ol>3. Hücre sıralama ve lizis
<ol><li>Hücre sıralamadan önce her bir kuyucukta 100 μL Nükleer Ekstraksiyon (NE) Tamponu bulunan hücre ayıklayıcı uyumlu 96 delikli bir plaka hazırlayın.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarını izleyerek hücreleri 96 delikli plakalara ayırın.</li>
	<li>Hücrelerin kuyucuklar içindeki tamponda olduğundan emin olmak için plakayı (30 s için 600 x g) hızla döndürün. NOT: Kullanılan hücrelerin kuyucukların dibine güvenilir bir şekilde getirilip getirilmediğini bir ön deneyde test etmeye değer.</li>
	<li>Örnekleri 15 dakika boyunca buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Numuneleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 600 x g'de döndürün ve süpernatantı çıkarmak için dikkatlice pipet çekin (5 μL'yi geride bırakarak).</li>
	<li>Her numuneyi 55 μL NE tamponunda yeniden askıya alın ve her reaksiyona önceden yıkanmış ConA konjuge paramanyetik mikrosferlerin 30 μL'sini (adım 1.7'den; Bağlanma Tamponunda) ekleyin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.</li>
</ol>4. MNase ile erken sindirimi önlemek için numuneleri önceden bloke edin
<ol><li>Plakayı 96 delikli manyetik bir rafa yerleştirin, boncukların en az 5 dakika boyunca bağlanmasına izin verin ve ardından süpernatanı çıkarın ve atın.</li>
	<li>Çekirdeğe bağlı boncuklara 100 μL Bloke Edici Tampon ekleyin ve nazik pipetleme ile karıştırın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
</ol>5. Primer antikor ilavesi
<ol><li>Plakayı 96 delikli manyetik bir rafa yerleştirin, süpernatantın en az 5 dakika boyunca temizlemesine izin verin ve ardından boncukları rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın ve atın.</li>
	<li>Plakayı manyetik raftan çıkarın ve boncukları nazik pipetleme ile reaksiyon başına 100 μL Yıkama Tamponunda yeniden askıya alın.</li>
	<li>Plakayı 96 delikli manyetik rafa geri yerleştirin, süpernatantın temizlenmesine izin verin ve ardından süpernatanı çıkarın ve atın.</li>
	<li>Boncukları, nazik pipetleme ile reaksiyon başına 25 μL Yıkama Tamponunda yeniden askıya alın.</li>
	<li>Birincil antikor ana karışımı yapın: reaksiyon başına 25 μL Yıkama Tamponu + 0.5 μL antikor.</li>
	<li>Çekirdeğe bağlı boncukları nazikçe vortekslerken, ilgilenilen proteini hedefleyen bir antikor ile muamele edilen her numuneye birincil antikor ana karışımının 25 μL'sini ekleyin (tipik olarak 1:100 son seyreltme). Kontrol yapıyorsanız, antikor içermeyen 25 μL Yıkama Tamponu ekleyin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.</li>
	<li>Numuneleri 96 delikli manyetik bir rafa yerleştirin, süpernatantın en az 5 dakika boyunca temizlemesine izin verin ve ardından boncukları rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın ve atın.</li>
	<li>Plakayı manyetik raftan çıkarın ve boncukları pipetleme ile yeniden yayınlayarak 100 μL Yıkama Tamponu ile yıkayın.</li>
</ol>6. pA-MNase veya pA/G-MNase ilavesi
NOT: Protein A, tavşanlar gibi belirli türlerden IgG molekülleri için yüksek bir afiniteye sahiptir, ancak fareler veya sıçanlar gibi diğer türlerden IgG'ler için uygun değildir. Alternatif olarak, Protein A / G-MNaz kullanılabilir. Bu melez, tavşan, fare ve sıçan IgG'lerini bağlar ve fare veya sıçan birincil antikorları kullanıldığında ikincil antikorlara ihtiyaç duyulmasını önler.
<ol><li>Plakayı 96 delikli manyetik bir rafa geri yerleştirin, süpernatantın en az 5 dakika boyunca temizlemesine izin verin ve ardından boncukları rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın ve atın.</li>
	<li>Plakayı manyetik raftan çıkarın ve her numuneyi 25 μL Yıkama Tamponunda yeniden askıya alın.</li>
	<li>Bir pA-MNase ana karışımı yapın (25 μL Yıkama Tamponu + reaksiyon başına optimize edilmiş pA-MNaz miktarı).</li>
	<li>Hafifçe girdap yaparken, kontrol numuneleri de dahil olmak üzere her numuneye 25 μL pA-MNase ana karışımı ekleyin. NOT: pA-MNaz konsantrasyonu, ev yapımı ise hazırlığa göre değişir ve her bağımsız saflaştırmada kullanımdan önce test edilmelidir. pA/G-MNaz için 20x stoğun 2,5 μL'si kullanılmalıdır.</li>
	<li>Numuneleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Plakayı 96 delikli manyetik bir rafa yerleştirin, süpernatantın en az 5 dakika boyunca temizlemesine izin verin ve ardından boncukları rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın ve atın.</li>
	<li>Plakayı manyetik raftan çıkarın ve boncukları 100 μL Yıkama Tamponu ile yıkayın, nazik pipetleme ile yeniden askıya alın.</li>
</ol>7. Yönlendirilmiş DNA sindirimi
<ol><li>Plakayı 96 delikli bir manyetik rafa yerleştirin, süpernatantın en az 5 dakika boyunca temizlemesine izin verin ve ardından süpernatanı çıkarın ve atın.</li>
	<li>Numuneleri manyetik raftan çıkarın ve boncukları nazik pipetleme ile 50 μL Yıkama Tamponunda yeniden askıya alın.</li>
	<li>Numuneleri 5 dakika boyunca bir buz/su karışımında 0 °C'ye dengeleyin.</li>
	<li>Numuneleri 0 °C buz/su banyosundan çıkarın ve çok kanallı pipet kullanarak 1 μL 100 mM CaCl2 ekleyin. Daha büyük hacimli çok kanallı pipet kullanarak nazik pipetleme ile iyice karıştırın (3-5 kez) ve ardından numuneleri 0 °C'ye geri döndürün. NOT: Burada iyice karıştırmak çok önemlidir. CaCl2 , ilgilenilen proteini çevreleyen DNA'nın MNaz sindirimini aktive etmek için eklenir.</li>
	<li>Plaka buz / su banyosuna geri döner dönmez 10 dakikalık bir zamanlayıcı başlatın.</li>
	<li>CaCl 2 eklendiği sıraya göre her bir kuyucuğa 50 μL 2XRSTOP+ Buffer pipetleyerek reaksiyonu durdurun. NOT: Aşırı sindirimi önlemek için 10 dakikalık sindirim bitmeden önce 2XRSTOP+ Buffer yapın.</li>
</ol>8. Numune fraksiyonasyonu
<ol><li>Numuneleri 37 °C'de 20 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Plakayı 4 ° C'de 5 dakika boyunca 16.000 x g'de döndürün.</li>
	<li>Plakayı 96 delikli manyetik bir rafa yerleştirin, süpernatantın en az 5 dakika boyunca temizlemesine izin verin ve süpernatantları taze bir 96 delikli plakaya aktarın. Boncukları atın.</li>
</ol>9. DNA ekstraksiyonu
<ol><li>Her numuneye 1 μL %10 Sodyum Dodesil Sülfat (SDS) ve 0.83 μL 20 mg/mL Proteinaz K ekleyin. DİKKAT: SDS tozu solunduğunda zararlıdır. Kullanıcılar iyi havalandırılan alanlarda gözlük, eldiven ve N95 sınıfı solunum cihazı takarak dikkatli bir şekilde kullanmalıdır.</li>
	<li>Numuneleri nazik pipetleme ile karıştırın.</li>
	<li>Numuneleri 70 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Plakayı oda sıcaklığına geri döndürün ve 46,6 μL 5 M NaCl ve 90 μL %50 PEG 4000 ekleyin. Nazik pipetleme ile karıştırın.</li>
	<li>Her numuneye 33 μL polistiren-manyetit boncuk ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın. NOT: Polistiren-manyetit boncukları oda sıcaklığına (~ 30 dakika) getirdiğinizden ve kullanmadan önce iyice karıştırdığınızdan emin olun.</li>
	<li>Plakayı manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatantın ~ 5 dakika boyunca temizlemesine izin verin ve ardından boncukları rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice atın.</li>
	<li>Boncukları rahatsız etmeden 150 μL %80 etanol ile 2x durulayın. DİKKAT: Etanol oldukça yanıcıdır ve cilt, göz ve akciğer tahrişine neden olur. Bu adımı uygun laboratuvar kıyafetleriyle ve havalandırmalı bir başlıkta gerçekleştirin.</li>
	<li>Plakayı 30 s için 1000 x g'de kısaca döndürün. Plakayı 96 delikli manyetik rafa geri yerleştirin ve boncukları rahatsız etmeden kalan tüm EtOH'leri çıkarın.</li>
	<li>Numuneleri ~ 2-5 dakika boyunca hava ile kurulayın. NOT: Boncukları 5 dakikadan daha uzun süre kurutmayın. EtOH'yi çıkarma konusunda gayretliyse, 2-3 dakika kurutma yeterlidir.</li>
	<li>Boncukları 37,5 μL 10 mM Tris-HCl (pH 8) ile yeniden askıya alın ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Plakayı manyetik bir rafa yerleştirin ve boncukların 5 dakika boyunca bağlanmasına izin verin.</li>
	<li>Süpernatantın 36,5 μL'sini taze bir termosikler uyumlu 96 delikli plakaya aktarın. Boncukları atın. NOT: Deney, numuneler -20 °C'de depolanarak burada durdurulabilir veya kütüphane oluşturma işlemine devam edebilir (10-15. adımlar).</li>
</ol>10. Son onarım, fosforilasyon, adenilasyon
NOT: Reaktifler, Malzeme Tablosunda belirtildiği gibi tedarik edilir. Aşağıdaki protokol, NEBNext Ultra DNA II kiti gibi ticari kitlere benzer bir yöntem izler.
<ol><li>5 U/μL T4 DNA polimeraz 1:20'yi 1x T4 DNA ligaz tamponunda seyreltin.</li>
	<li>Bir son onarım/3'A ana karışım hazırlayın: 2 μL 10x T4 DNA ligaz tamponu, 2,5 μL 10 mM dNTP, 1,25 μL 10 mM ATP, 3,13 μL %40 PEG 4000, 0,63 μL 10 U/μL T4 PNK, 0,5 μL seyreltilmiş T4 DNA polimeraz, 0,5 μL 5U/μL Taq DNA polimeraz, reaksiyon başına toplam hacmi 13,5 μL. NOT: Pipetlemeden önce oda sıcaklığına %40 PEG 4000 getirdiğinizden emin olun.</li>
	<li>36,5 μL DNA'ya 13,5 μL son onarım/3'A ana karışım ekleyin.</li>
	<li>Reaksiyonu hızlı girdap ve ardından hızlı bir spin (10 s için 500 x g) ile karıştırın.</li>
	<li>>20 °C sıcaklıklar için ısıtılmış kapaklı önceden soğutulmuş bir termosikler'de aşağıdaki reaksiyon koşullarını kullanarak inkübe edin. Reaksiyon koşullarını kullanın: 15 dakika için 12 °C, 15 dakika için 37 °C, 20 dakika için 72 °C, 4 °C'de tutun.</li>
</ol>11. Adaptör ligasyonu
NOT: Aşağıdaki reaksiyonu ayarlarken numuneleri buz üzerinde tutun. Pipetlemeden önce ligaz tamponunun oda sıcaklığına gelmesine izin verin. Adaptörü (bkz. Malzeme Tablosu) 10 mM NaCl (pH 7,5) içeren 10 mM Tris-HCl'lik bir çözelti içinde seyreltin. Düşük verim nedeniyle, CUT & RUN ile zenginleştirilmiş DNA'yı önceden ölçmeyin. Bunun yerine, 0,6 μM'lik son çalışma adaptörü konsantrasyonunu kullanarak adaptörün 25 kat seyreltilmesini sağlayın.
<ol><li>Bir ligasyon ana karışımı yapın: 55 μL ligaz tamponu (2x), 5 μL T4 DNA ligaz ve 5 μL seyreltilmiş Adaptör, reaksiyon başına toplam 65 μL hacim.</li>
	<li>Ana ligasyon karışımının 65 μL'sini, adım 10.5'ten itibaren 50 μL DNA'ya ekleyin.</li>
	<li>Hızlı vorteksleme ile karıştırın, ardından hızlı eğirme (10 s için 500 x g).</li>
	<li>15 dakika boyunca bir termosiklerde (ısıtılmış kapak olmadan) 20 ° C'de inkübe edin. NOT: Hemen aşağıdaki adıma geçin.</li>
</ol>12. KULLANICI sindirimi
<ol><li>Her numuneye, girdaba ve spine 3 μL USER enzimi ekleyin (10 s için 500 x g).</li>
	<li>Termal bisikletçide 15 dakika boyunca 37 °C'de inkübe edin (ısıtmalı kapak 50 °C'ye ayarlanmıştır).</li>
</ol>13. Ligasyon reaksiyonunu takiben polistiren-manyetit boncuk temizliği
NOT: Polistiren-manyetit boncukların oda sıcaklığında (~30 dakika) dengelenmesine izin verin. Kullanmadan önce boncuk çözeltisini homojenize etmek için vorteks. Aşağıdaki adımları oda sıcaklığında gerçekleştirin.
<ol><li>Adaptör bağlı DNA içeren her bir kuyucuğa 39 μL (0.33x) polistiren-manyetit boncuk çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>Pipetleme ile iyice karıştırın ve ardından DNA'nın boncuklara bağlanmasına izin vermek için numuneleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Numuneleri 96 delikli manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatant temizlenene kadar 5 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Plakayı manyetik rafta tutun ve boncukları rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın.</li>
	<li>Boncukları rahatsız etmeden 200 μL% 80 EtOH ile durulayın.</li>
	<li>Çözümün temizlenmesini sağlamak için 96 delikli manyetik rafta 30 s boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Boncukları rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın ve atın.</li>
	<li>Toplam iki yıkama için 13,5-13,7 arasındaki adımları yineleyin.</li>
	<li>Plakayı 10 s boyunca 500 x g'de kısaca döndürün, plakayı 96 delikli bir manyetik rafa geri yerleştirin ve boncukları rahatsız etmeden artık EtOH'yi çıkarın.</li>
	<li>Plakayı manyetik rafta tutun ve numuneleri 2 dakika boyunca hava ile kurulayın. NOT: Boncukları fazla kurutmayın.</li>
	<li>Plakayı manyetik raftan çıkarın ve boncukları 10 mM Tris-HCl'nin (pH 8) 28,5 μL'sinde yeniden askıya alın. DİKKAT: Hidroklorik asit çok aşındırıcıdır. Kullanıcılar gözlük, eldiven ve laboratuvar önlüğü giyen kimyasal bir duman başlığında dikkatli bir şekilde kullanmalıdır.</li>
	<li>Boncukları pipetleyerek, kabarcık üretmemeye dikkat ederek iyice askıya alın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Plakayı 96 delikli manyetik bir rafa yerleştirin ve çözeltinin 5 dakika boyunca temizlenmesine izin verin.</li>
	<li>27.5 μL süpernatantı yeni bir PCR plakasına aktarın ve boncukları atın.</li>
</ol>14. Kütüphane zenginleştirme
NOT: Astarlar, adaptörle aynı çözelti ile seyreltilir. Bu kütüphane yapısı için, 0,6 μM'lik son bir çalışma astarı konsantrasyonu kullanın.
<ol><li>Her numuneye 5 μL seyreltilmiş indeksli astar ekleyin (bkz. NOT: Her numunenin sıralamadan sonra tanımlanması için farklı bir indekse ihtiyacı vardır.</li>
	<li>Bir PCR ana karışımı hazırlayın: 10 μL 5x yüksek doğrulukta PCR tamponu, 1,5 μL 10 mM dNTP, 5 μL seyreltilmiş Universal astar, 1 μL 1 U sıcak başlatma yüksek doğrulukta polimeraz, numune başına toplam ana karışım hacmi 17,5 μL.</li>
	<li>32.5 μL saflaştırılmış adaptör bağlı DNA'ya 17.5 μL pf PCR karışımı ekleyin (bu hacme 5 μL indekslenmiş primer dahil edilmiştir).</li>
	<li>Pipetleme ile çözeltiyi karıştırın.</li>
	<li>Maksimum rampa hızı 3 °C / s olan aşağıdaki reaksiyon koşullarını kullanarak bir termosikkerde inkübe edin: 45 s için 98 °C, 45 s için 98 °C, 10 s için 60 °C, ikinci ve üçüncü adımları 21 kez, 72 °C'yi 1 dakika boyunca tekrarlayın, 4 °C'de tutun. NOT: Numuneler kısa süreli depolama için 4 °C'de veya uzun süreli depolama için -20 °C'de tutulabilir.</li>
</ol>15. Polistiren-manyetit boncuk temizliği
<ol><li>Her numuneye 60 μL (1,2x) polistiren-manyetit boncuk ekleyin.</li>
	<li>Boncukları pipetleyerek, yeniden askıya alın ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Plakayı, çözelti temizlenene kadar 5 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin.</li>
	<li>Süpernatantı atın ve boncukları rahatsız etmeden 200 μL% 80 EtOH ile durulayın.</li>
	<li>Toplam iki adet %80 EtOH yıkama için yıkama adımını tekrarlayın.</li>
	<li>Plakayı 10 s boyunca 500 x g'de döndürün, plakayı 96 delikli bir manyetik rafa yerleştirin ve boncukların 5 dakika boyunca bağlanmasına izin verin.</li>
	<li>Boncukları rahatsız etmeden fazla EtOH'yi çıkarmak ve boncukların 2 dakika boyunca hava ile kurumasını sağlamak için pipet. NOT: Boncukları fazla kurutmayın.</li>
	<li>Boncukları 21 μL nükleaz içermeyen suda tekrar askıya alın ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Plakayı manyetik bir rafa yerleştirin ve çözeltinin 5 dakika boyunca temizlenmesine izin verin.</li>
	<li>Süpernatantın 20 μL'sini yeni bir plakaya aktarın. NOT: Deney, numune -20 °C'de saklanarak burada durdurulabilir.</li>
	<li>1x HS reaktifi kullanarak kütüphane konsantrasyonlarını bir florometre ile ölçün (bkz.</li>
	<li>Konsantrasyon izin veriyorsa, görselleştirmek için düşük moleküler ağırlıklı bir merdivenle% 1.5 agaroz jeli üzerinde 30 ng numune çalıştırın. Alternatif olarak, bir Parça Analizörü veya ilgili cihaz üzerinde görselleştirin.</li>
	<li>~ 50.000-100.000 benzersiz şekilde eşlenmiş okuma elde etmek için bir Illumina platformunda kütüphaneleri sıralayın.</li>
</ol>

<ol><li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+interactions+of+RNA+polymerase+II+with+genes+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster.</a> Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).</li>
<li>Solomon, M. J., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde-mediated+DNA-protein+crosslinking%3A+a+probe+for+in+vivo+chromatin+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (19), 6470-6474 (1985).</li>
<li>Irvine, R. A., Lin, I. G., Hsieh, C. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+has+a+local+effect+on+transcription+and+histone+acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA methylation has a local effect on transcription and histone acetylation.</a> Molecular and Cellular Biology. 22 (19), 6689-6696 (2002).</li>
<li>Albert, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+and+rotational+settings+of+H2A.Z+nucleosomes+across+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Translational and rotational settings of H2A.Z nucleosomes across the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 446 (7135), 572-576 (2007).</li>
<li>Blat, Y., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cohesins+bind+to+preferential+sites+along+yeast+chromosome+III%2C+with+differential+regulation+along+arms+versus+the+centric+region%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cohesins bind to preferential sites along yeast chromosome III, with differential regulation along arms versus the centric region.</a> Cell. 98 (2), 249-259 (1999).</li>
<li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+location+and+function+of+DNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide location and function of DNA binding proteins.</a> Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).</li>
<li>He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-nexus+enables+improved+detection+of+in+vivo+transcription+factor+binding+footprints%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints.</a> Nature Biotechnology. 33 (4), 395-401 (2015).</li>
<li>O'Neill, L. P., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoprecipitation+of+native+chromatin%3A+NChIP%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP.</a> Methods. 31 (1), 76-82 (2003).</li>
<li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIPmentation%3A+fast%2C+robust%2C+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li>
<li>Cao, Z., Chen, C., He, B., Tan, K., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+for+epigenomic+profiling+using+100+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device for epigenomic profiling using 100 cells.</a> Nature Methods. 12 (10), 959-962 (2015).</li>
<li>Shankaranarayanan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-tube+linear+DNA+amplification+%28LinDA%29+for+robust+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-tube linear DNA amplification (LinDA) for robust ChIP-seq.</a> Nature Methods. 8 (7), 565-567 (2011).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li>
<li>Grosselin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+single-cell+ChIP-seq+identifies+heterogeneity+of+chromatin+states+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer.</a> Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).</li>
<li>Adli, M., Bernstein, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+chromatin+profiling+from+limited+numbers+of+cells+using+nano-ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1656-1668 (2011).</li>
<li>Zwart, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+carrier-assisted+ChIP-seq+method+for+estrogen+receptor-chromatin+interactions+from+breast+cancer+core+needle+biopsy+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A carrier-assisted ChIP-seq method for estrogen receptor-chromatin interactions from breast cancer core needle biopsy samples.</a> BMC Genomics. 14, 232(2013).</li>
<li>Valensisi, C., Liao, J. L., Andrus, C., Battle, S. L., Hawkins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cChIP-seq%3A+a+robust+small-scale+method+for+investigation+of+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">cChIP-seq: a robust small-scale method for investigation of histone modifications.</a> BMC Genomics. 16, 1083(2015).</li>
<li>Brind'Amour, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultra-low-input+native+ChIP-seq+protocol+for+genome-wide+profiling+of+rare+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations.</a> Nature Communications. 6, 6033(2015).</li>
<li>Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. C. hI. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChlC+and+ChEC%3B+genomic+mapping+of+chromatin+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">ChlC and ChEC; genomic mapping of chromatin proteins.</a> Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li>
<li>Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChEC-seq+kinetics+discriminates+transcription+factor+binding+sites+by+DNA+sequence+and+shape+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo.</a> Nature Communications. 6, 8733(2015).</li>
<li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, 21856(2017).</li>
<li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+CUT%26RUN+chromatin+profiling+tools%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Improved CUT&RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, 46314(2019).</li>
<li>Hainer, S. J., Bošković, A., McCannell, K. N., Rando, O. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+pluripotency+factors+in+single+cells+and+early+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Profiling of pluripotency factors in single cells and early embryos.</a> Cell. 177 (5), 1319-1329 (2019).</li>
<li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUT%26Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930(2019).</li>
<li>Carter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+histone+modifications+in+low+cell+number+and+single+cells+using+antibody-guided+chromatin+tagmentation+%28ACT-seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq).</a> Nature Communications. 10 (1), 3747(2019).</li>
<li>Gopalan, S., Wang, Y., Harper, N. W., Garber, M., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+profiling+of+multiple+chromatin+proteins+in+the+same+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Simultaneous profiling of multiple chromatin proteins in the same cells.</a> Molecular Cell. 81 (22), 4736-4746 (2021).</li>
<li>Patty, B. J., Hainer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+chromatin+profiling+genome-wide+using+uliCUT%26RUN+in+single+cells+and+individual+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transcription factor chromatin profiling genome-wide using uliCUT&RUN in single cells and individual blastocysts.</a> Nature Protocols. 16 (5), 2633-2666 (2021).</li>
<li>Zheng, X. -Y., Gehring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-input+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+endosperm+using+CUT%26RUN%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Low-input chromatin profiling in Arabidopsis endosperm using CUT&RUN.</a> Plant Reproduction. 32 (1), 63-75 (2019).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin%2C+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li>
<li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+chromatin+accessibility+reveals+principles+of+regulatory+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation.</a> Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar bu projeyle ilgili hiçbir rakip çıkar beyan etmemektedir.

CUT&RUN, kromatin üzerindeki protein lokalizasyonunu belirlemek için etkili bir protokoldür. Diğer protokollere göre birçok avantajı vardır: 1) yüksek sinyal-gürültü oranı, 2) hızlı protokol ve 3) düşük sıralama okuma kapsamı gerekli ve böylece maliyet tasarrufuna yol açar. Protein A- veya Protein A/G-MNaz kullanımı, CUT&RUN'un mevcut herhangi bir antikor ile uygulanmasını sağlar; bu nedenle, birçok proteinin profilini hızlı ve kolay bir şekilde çıkarma potansiyeline sahiptir. Bununla birlikte, kromatin üzerindeki herhan...

Birçok nükleer protein, DNA şablonlu aktiviteleri teşvik etmek veya önlemek için kromatin ile etkileşime girerek işlev görür. Bu kromatin etkileşiminde bulunan proteinlerin işlevini belirlemek için, bu proteinlerin bağlandığı genomik yerleri tanımlamak önemlidir. 1985 yılında geliştirilmesinden bu yana, Kromatin İmmünopresipitasyonu (ChIP), bir proteinin kromatin 1,2'ye nerede bağlandığını belirlemek için altın standart olmuştur. Geleneksel ChIP tekniği aşağıdaki temel iş akışına sahiptir: hücreler toplanır ve çapraz bağlanır (genellikle formaldehit ile), kromatin kesilir (genellikle çapraz bağlama gerektiren sert sonikasyon yöntemleriyle), ilgilenilen protein, proteini (veya etiketli proteini) hedef alan bir antikor kullanılarak immünopreprepite edilir, ardından ikincil bir antikor (agaroz veya manyetik boncuklara bağlanmış), çapraz bağlama tersine çevrilir, DNA'yı saflaştırmak için protein ve RNA sindirilir ve bu ChIP ile zenginleştirilmiş DNA, analiz için şablon olarak kullanılır (radyoetiketli problar1,2, qPCR3, mikrodiziler 5,6 veya dizileme4 kullanılarak). Mikrodizilerin ortaya çıkması ve büyük ölçüde paralel derin dizilemeyle birlikte, ChIP-çip 5,6 ve ChIP-seq4 daha yakın zamanda geliştirilmiştir ve kromatin üzerindeki protein lokalizasyonunun genom çapında tanımlanmasına izin vermektedir. ChIP'yi çapraz bağlamak, ChIP-exo7 ve ChIP-nexus8 tarafından çözünürlükte büyük ilerlemelerle ortaya çıkmasından bu yana güçlü ve güvenilir bir teknik olmuştur. ChIP-seq'in geliştirilmesine paralel olarak, geleneksel çapraz bağlama ChIP tekniklerinde gerçekleştirilen sonikasyonun aksine, kromatini parçalamak için nükleaz sindirimini (genellikle mikrokokal nükleaz veya MNaz kullanarak) kullanan ChIP (N-ChIP) için doğal (çapraz bağlanmayan) protokoller kurulmuştur9. Bununla birlikte, hem çapraz bağlanma ChIP hem de N-ChIP teknolojilerinin en büyük dezavantajlarından biri, deneysel manipülasyonu takiben düşük DNA verimi nedeniyle yüksek hücre sayılarına duyulan gereksinim olmuştur. Bu nedenle, son yıllarda, ChIP teknolojilerini düşük hücre girişi için optimize etmeye yönelik birçok çaba sarf edilmiştir. Bu çabalar, uygulanabilirlikleri ve girdi gereksinimleri10,11,12,13,14,15,16,17,18 olarak değişen birçok güçlü ChIP tabanlı teknolojinin geliştirilmesine neden olmuştur. Bununla birlikte, tek hücreli ChIP-seq tabanlı teknolojiler, özellikle histon olmayan proteinler için eksiktir.
2004 yılında, Kromatin Endojen Bölünme (ChEC) ve Kromatin İmmün Kemebölünme (ChIC)19 olarak adlandırılan kromatin üzerindeki protein doluluğunu belirlemek için alternatif bir teknoloji geliştirilmiştir. Bu tek lokus teknikleri, ilgilenilen proteine bitişik DNA'nın doğrudan kesilmesi için MNaz'ın ilgilenilen proteine (ChEC) veya protein A'ya (ChIC) füzyonunu kullanır. Daha yakın yıllarda, hem ChEC hem de ChIC, kromatin (sırasıyla ChEC-seq ve CUT&RUN) üzerinde genom çapında protein profillemesi için optimize edilmiştir 20,21. ChEC-seq, faktör lokalizasyonunu belirlemek için güçlü bir teknik olsa da, her hedef için MNaz-füzyon proteinlerinin geliştirilmesini gerektirirken, ChIC ve genom çapındaki varyasyonu CUT&RUN, ilgilenilen proteine (ChIP'de olduğu gibi) ve Protein A'nın antikorun IgG sabit bölgesini tanıyabildiği rekombinant Protein A-MNaz'a yönelik bir antikora güvenir. Alternatif olarak, daha geniş bir yelpazedeki antikor sabit bölgelerini tanıyabilen bir füzyon Protein A / Protein G-MNaz (pA / G-MNaz) geliştirilmiştir22. CUT&RUN, kromatin genomu genelinde protein lokalizasyonunu belirlemek için hızla ChIP-seq'e popüler bir alternatif haline gelmiştir.
Düşük ve tek hücreli girişlerin kullanılmasını sağlayan bir CUT&RUN varyasyonu olan ultra düşük girişli CUT&RUN (ULICUT&RUN), 201923 yılında açıklanmıştır. Burada, manuel 96 delikli formatta tek hücreli bir uygulamanın metodolojisi açıklanmaktadır. uliCUT&RUN'un geliştirilmesinden bu yana, histon profillemesi için iki alternatifin, CUT&Tag ve iACT-seq'in geliştirildiğini ve histon proteinlerinin sağlam ve oldukça paralel profillenmesini sağladığını belirtmek önemlidir24,25. Ayrıca, scCUT&Tag, tek bir hücrede (multiCUT&Tag) birden fazla faktörün profilini çıkarmak ve histon olmayan proteinlere uygulama için optimize edilmiştir26. Birlikte, CUT&RUN, uliCUT&RUN'un bir hücre ayıklayıcıya ve standart ekipmana erişimi olan herhangi bir moleküler biyoloji laboratuvarında gerçekleştirilebildiği düşük girişli ChIP-seq'e çekici bir alternatif sunar.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL şeffaf mikrofüj tüpleri</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>90410</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL tüp manyetik raf</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL tüp uyumlu soğuk santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5404000537</td><td></td></tr><tr><td>10 cm steril doku kültürü plakaları</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150464</td><td></td></tr><tr><td>10X T4 DNA Ligaz tamponu</td><td>Yeni İngiltere Biolabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konik tüpler</td><td>VWR</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>1X TE tamponu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12090015</td><td></td></tr><tr><td>200 & mikro; L PCR tüpleri</td><td>Eppendorf</td><td>951010022</td><td></td></tr><tr><td>2X hızlı ligaz tamponu</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200</td><td>Ligaz Tamponu</td></tr><tr><td>5X KAPA HiFi tamponu</td><td>Roche</td><td>7958889001</td><td>5X yüksek kaliteli PCR tamponu</td></tr><tr><td>7-Amino-Aktinomisin D (7-AAD)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BDB559925</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu manyetik raf</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12027 veya 12331D</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu plaka</td><td>VWR</td><td>82006-636</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP boncukları</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>polistiren-manyetit boncuklar; AMPure XP boncuk lotları arasındaki potansiyel değişkenlik nedeniyle, AMPure boncuk çözeltinizin kalibre edilmesi önerilir. Üreticiye bakın' s talimatları</td></tr>: <tr><td>İlgilenilen proteine karşı antikor</td><td>değişir</td><td></td><td></td></tr>: <tr><td>ATP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0441</td><td></td></tr><tr><td>BioMag Plus, Concanavalin A boncuk</td><td>Polysciences,</td><td>86057-10</td>, <td>ConA-konjuge paramanyetik mikroküreler,</td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Kalsiyum Klorür (CaCl2),</td> <td>Fisher Scientific</td><td>AAJ62905AP</td><td></td></tr><tr><td>Hücre sıralayıcı</td><td>BD FACSAria II hücre sıralayıcı</td><td></td><td>Eğitim gerektirir</td></tr><tr><td>Hücre kültürü için hücreye özgü ortam</td><td>Değişir</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C298-500</td><td>Kloroform cildi tahriş eder ve yutulduğunda zararlıdır; eldiven, laboratuvar önlüğü ve gözlük kullanarak kimyasal bir davlumbaz takın</td></tr><tr><td>64 bit işlemcili bilgisayar ve süper bilgi işlem kümesine</td><td></td><td></td> erişim<td>Elde edilen sıralama veri kümelerinin hesaplamalı analizleri için</td></tr><tr><td>DNA döndürme sütunları</td><td>Epoch Yaşam Bilimleri</td><td>1920-250</td><td></td></tr><tr><td>dNTP seti</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446S</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Elektroforez ekipmanı</td><td>değişir</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>22032601</td><td>%100 hacim/hacim etanol son derece yanıcıdır; eldiven, laboratuvar önlüğü kullanarak kimyasal bir davlumbazda tutun, ve gözlük</td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit&nbsp; (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2482100</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Glikojen</td><td>VWR</td><td>97063-256</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Heterolog S. cerevisiae DNA spike-in</td><td>ev yapımı</td><td></td><td>Çapraz bağlı, MNaz ile sindirilmiş ve agaroz jel ekstrakte edilmiş genomik DNA'dan hazırlanır, protein / RNA'dan saflaştırılır ve 10 ng / mL'ye seyreltilir. Maya genomik DNA'sını öneriyoruz, ancak gerekirse diğer organizmalar da kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Hidroklorik Asit&nbsp; (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td>Hidroklorik Asit çok aşındırıcıdır; eldiven, laboratuvar önlüğü ve gözlük kullanarak kimyasal bir davlumbaz içinde tutun</td></tr><tr><td>Buz Kovası</td><td>değişir</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Illumina Sıralama platformu (örneğin, NextSeq500)</td> Sıcaklık ve atmosfer kontrollü <td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnkübatörü</td><td>ThermoFisher Bilimsel</td><td>51030284</td><td></td></tr><tr><td>5X KAPA HiFi tamponlu KAPA HotStart HiFi DNA Polimeraz</td><td>Roche</td><td>7958889001</td><td>Hotstart Yüksek Kaliteli Polimeraz</td></tr><tr><td>Laminer akış davlumbazı</td><td>Fırın Şirketi</td><td>SG404</td><td></td></tr><tr><td>Manganez Klorür (MnCl2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>244589</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet seti</td><td>Rainin</td><td>30386597</td><td></td></tr><tr><td>Minifuge</td><td>Benchmark Scientific</td><td>C1012</td><td></td></tr><tr><td>NEB Adaptörü</td><td>New England Biolabs</td><td>E6612AVIAL</td><td>Adaptörü</td></tr><tr><td>NEB Evrensel astar</td><td>New England Biolabs</td><td>E6611AVIAL</td><td>Üniversal Astar</td></tr><tr><td>NEBNext Illumina kiti için Multipleks Oligolar</td><td>New England Biolabs</td><td>E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L</td><td>İndeksli Primerler</td></tr><tr><td>Negatif kontrol antikoru</td><td>Antikorlar-Çevrimiçi</td><td>ABIN101961</td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz içermeyen su</td><td>New England Biolabs</td><td>B1500S</td><td></td></tr><tr><td>PCR termodöngüleyici</td><td>Eppendorf</td><td>2231000666</td><td></td></tr><tr><td>Faz kilit tüpleri</td><td>Qiagen</td><td>129046</td><td></td></tr><tr><td>Fenol/Kloroform/İzoamil Alkol (PCI)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15593049</td><td>Fenol yutulduğunda veya ciltle temas ettiğinde zararlıdır; eldiven, laboratuvar önlüğü ve gözlük</td></tr> <tr><td>kullanarak kimyasal bir davlumbaz takınFosfat tamponlu tuzlu su (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10814010</td><td></td></tr><tr><td>Pipet yardımı</td><td>Drummond Scientific</td><td># 4-000-100</td><td></td></tr><tr><td>Polietilen glikol (PEG) 4000</td><td>VWR</td><td>A16151</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Klorür (KCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Hidroksit (KOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250-1</td><td>DİKKAT: KOH, çözelti içinde katı ve aşındırıcı olarak gözü/cildi tahriş edicidir. Eldiven, laboratuvar önlüğü ve gözlük kullanarak kimyasal çeker ocakta tutun</td></tr><tr><td>Proteaz İnhibitörleri</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>ProteinA/G-MNase</td><td>Epicypher</td><td>15-1016</td><td>pA/G-MNaz</td></tr><tr><td>ProteinA-MNase, pK19pA-MN</td><td>Addgene</td><td>86973'ten</td><td></td>saflaştırılmış</tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 1X dsDNA HS Test Kiti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33230</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Test tüpleri</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Florometre</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33238</td><td></td></tr><tr><td>2X Hızlı Ligaz tamponlu Hızlı Ligaz</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>New England Biolabs</td><td>T3010</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Asetat&nbsp; (NaOAc)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür (NaCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5150-1L</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat (SDS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td>SDS solunduğunda zehirlidir; Sodyum Hidroksit (NaOH) ile çalışırken eldiven, göz koruması ve N95 sınıfı solunum cihazı kullanarak iyi havalandırılan alanlarda dikkatli</td></tr> <tr><td></td><td>kullanınFisher Scientific</td><td>S318-1</td><td>NaOH, çözelti içinde katı ve aşındırıcı olarak gözü/cildi tahriş edicidir. Eldiven, laboratuvar önlüğü ve gözlük kullanarak kimyasal bir çeker ocakta tutun</td></tr><tr><td>Spermidin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>Standart Ters Işık Mikroskobu</td><td>Leica</td><td>11526213</td><td></td></tr><tr><td>Standart laboratuvar agaroz jel malzemeleri</td><td>Değişir</td> Serolojik pipetler ve pipet uçları gibi standart laboratuvar malzemeleri Değişir <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaz</td><td>Yeni İngiltere Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Polimeraz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203S</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>Masaüstü girdap</td><td>Fisher Scientific</td><td>2215414</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA Polimeraz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0273S</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>5384000020</td><td>Alternatif olarak, bir su banyosu kullanabilir</td></tr><tr><td>Tris tabanı</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td>Triton X-100 tehlikelidir;</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25052</td><td></td></tr><tr><td>Tüp döndürücü</td><td>VWR</td><td>10136084</td><td></td></tr> KULLANICI enzimini kullanırken laboratuvar önlüğü, eldiven ve gözlük kullanın <tr><td></td><td>New England Biolabs</td><td>M5505S</td><td></td></tr></tbody></table>

hedefler altında ultra düşük giriş bölünmesi ve nükleaz kullanarak salınım kullanılarak kromatin Üzerinde tek hücreli faktör lokalizasyonu

Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease

Bir proteinin kromatin üzerindeki bağlanma yerlerinin belirlenmesi, işlevini ve potansiyel düzenleyici hedeflerini anlamak için gereklidir. Kromatin İmmünopresipitasyonu (ChIP), 30 yılı aşkın bir süredir protein lokalizasyonunu belirlemek için altın standart olmuştur ve ilgilenilen proteini sonikleştirilmiş veya enzimatik olarak sindirilmiş kromatinden çıkarmak için bir antikor kullanımı ile tanımlanmıştır. Daha yakın zamanlarda, antikor bağlama teknikleri, artan duyarlılıkları nedeniyle kromatin üzerindeki protein lokalizasyonunu değerlendirmek için popüler hale gelmiştir. Nükleaz Altında Hedefler Altında Bölünme ve Salınım (CUT&RUN), Kromatin İmmünoklevajının (ChIC) genom çapında türevidir ve ilgilenilen bir proteini hedefleyen antikorun IgG sabit bölgesini tanımlamak için mikrokokal nükleaza (pA-MNase) bağlı rekombinant Protein A'yı kullanır, bu nedenle ilgilenilen proteini çevreleyen DNA'nın bölgeye özgü bölünmesini sağlar. CUT&RUN, histon modifikasyonlarını, transkripsiyon faktörlerini ve nükleozom yeniden şekillendirme faktörleri gibi diğer kromatin bağlayıcı proteinleri profillemek için kullanılabilir. Daha da önemlisi, CUT&RUN, ökromatik veya heterokromatik ilişkili proteinlerin ve histon modifikasyonlarının lokalizasyonunu değerlendirmek için kullanılabilir. Bu nedenlerden dolayı, CUT&RUN çok çeşitli proteinlerin bağlanma profillerini belirlemek için güçlü bir yöntemdir. Son zamanlarda, CUT&RUN, düşük hücre popülasyonlarında ve tek hücrelerde transkripsiyon faktörü profillemesi için optimize edilmiştir ve optimize edilmiş protokol ultra düşük girişli CUT&RUN (uliCUT&RUN) olarak adlandırılmıştır. Burada, uliCUT & RUN kullanılarak manuel 96 kuyucuklu bir biçimde tek hücreli faktör profili oluşturma için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır.

Burada, 96 kuyucuklu manuel bir format uliCUT &amp; RUN kullanılarak kromatin üzerinde tek hücreli protein profillemesi için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Sonuçlar, profillenen proteine (protein bolluğu ve antikor kalitesi nedeniyle), hücre tipine ve diğer katkıda bulunan faktörlere bağlı olarak değişmekle birlikte, bu teknik için beklenen sonuçlar burada tartışılmaktadır. Hücre kalitesi (hücre görünümü ve canlı hücrelerin yüzdesi) ve tek hücreli sıralama, NE tamponuna canlı hücre ayıklamasından önce veya bu sıra...

CUT&RUN ve varyantları, kromatin üzerindeki protein doluluğunu belirlemek için kullanılabilir. Bu protokol, tek hücreli uliCUT&RUN kullanarak kromatin üzerindeki protein lokalizasyonunun nasıl belirleneceğini açıklar.

Hedefler Altında Ultra Düşük Giriş Bölünmesi ve Nükleaz Kullanarak Salınım Kullanılarak Kromatin Üzerinde Tek Hücreli Faktör Lokalizasyonu

Determining the binding locations of a protein on chromatin is essential for understanding its function and potential regulatory targets. Chromatin ...

CUT&RUN, kromatin üzerinde protein lokalizasyonunu belirlemek için güçlü bir tekniktir ve burada bu tekniğin tek hücreli bir versiyonunu manuel 96 kuyucuklu bir biçimde açıklıyoruz. ChIP-seq gibi çoğu protein lokalizasyon tekniği, yüksek hücre girişi gerektirir ve tamamlanması yaklaşık üç gün sürer. CUT&RUN, yüksek sinyal ve düşük arka plan nedeniyle, düşük hücreli ve tek hücreli uygulama için optimize edilmiştir ve tek bir günde tamamlanabilir.Bu tekniğin hemen hemen her biyolojik örneğe uygulanabileceğini ve değerli hasta örnekleri gibi nadir ve düşük bolluktaki örneklerde faktör lokalizasyonunu belirlemek için özellikle güçlü olabileceğini öngörüyoruz. Herhangi bir tek hücreli deney yapmadan önce, antikoru ve tekniği çok sayıda değerli olmayan hücre üzerinde test edin. Bu deneyin ana sınırlaması, sağlam bir antikora bağımlılıktır.Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan deneyimli bir araştırma uzmanı olan Santana Lardo. Tek hücreleri ayırdıktan ve çekirdekleri boncuklara bağladıktan sonra, 96 delikli plakayı 96 delikli manyetik bir rafa yerleştirin ve boncukların en az beş dakika boyunca bağlanmasına izin verin. Ardından, süpernatanı çıkarın ve atın.Çekirdeğe bağlı boncuklara 100 mikrolitre bloke edici tampon ekleyin, nazik pipetleme ile karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. Plakayı 96 delikli manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatantın en az beş dakika boyunca temizlenmesine izin verin. Ardından, boncukları rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın ve atın.Plakayı manyetik raftan çıkarın ve boncukları reaksiyon başına 100 mikrolitre yıkama tamponunda nazik pipetleme ile yeniden askıya alın. Plakayı 96 delikli manyetik rafa geri yerleştirin, süpernatantın temizlenmesine izin verin ve ardından süpernatanı çıkarın ve atın. Boncukları, reaksiyon başına 25 mikrolitre yıkama tamponunda nazik pipetleme ile yeniden askıya alın.Reaksiyon başına 25 mikrolitre yıkama tamponu alarak birincil bir antikor ana karışımı yapın ve ardından reaksiyon başına 0.5 mikrolitre antikor ekleyin. 25,5 mikrolitre antikor yıkama tamponu karışımı ekleyin, ardından ilgilenilen proteini hedefleyen bir antikor ile muamele edilen her numuneye nazik pipetleme yapın. Oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.Ardından, numuneleri tekrar 96 delikli manyetik rafa yerleştirin. Süpernatant temizlendikten sonra, boncukları rahatsız etmeden çıkarın ve atın. Plakayı manyetik raftan çıkardıktan sonra, boncukları 100 mikrolitre yıkama tamponu ile yıkayın ve pipetle indirerek tekrar askıya alın.Plakayı 96 delikli bir manyetik rafa geri yerleştirdikten ve daha önce gösterildiği gibi süpernatantı attıktan sonra, her numuneyi 25 mikrolitre yıkama tamponunda yeniden askıya alın. Reaksiyon başına 25 mikrolitre yıkama tamponu ve optimize edilmiş miktarda protein A MNaz ekleyerek bir protein A MNaz ana karışımı yapın. Kontrol numuneleri de dahil olmak üzere her numuneye 25 mikrolitre protein A MNase ana karışımı ekleyin.Numuneleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Plakayı 96 delikli manyetik rafa yerleştirin. Süpernatantın en az beş dakika boyunca temizlemesine izin verin ve ardından boncukları rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın ve atın.Plakayı manyetik raftan çıkardıktan sonra, boncukları 100 mikrolitre yıkama tamponu ile yıkayın ve nazik pipetleme ile yeniden askıya alın. Plakayı 96 delikli manyetik bir rafa yerleştirin ve daha önce gösterildiği gibi süpernatantı atın. Ardından, numuneleri manyetik raftan çıkarın ve boncukları 50 mikrolitre yıkama tamponunda nazik pipetleme ile yeniden askıya alın.Numuneleri beş dakika boyunca buzlu su karışımında sıfır santigrat dereceye dengeleyin ve ardından numuneleri buzlu su banyosundan çıkarın. Çok kanallı pipet kullanarak bir mikrolitre 100 milimolar kalsiyum klorür ekleyin. Büyük hacimli çok kanallı pipet kullanarak nazik pipetleme ile üç ila beş kez iyice karıştırın ve ardından numuneleri sıfır santigrat dereceye geri döndürün.Plaka buzlu su banyosuna geri döner dönmez 10 dakikalık bir zamanlayıcı başlatın. RSTOP+ ve tampon konsantrasyonunun iki katını içeren bir çözeltinin 50 mikrolitresini, kalsiyum klorür eklendiği sırada her bir kuyucuğa pipetleyerek reaksiyonu durdurun. Numuneleri 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca inkübe edin.Plakayı dört santigrat derecede beş dakika boyunca 16.000 kez G'de döndürün. Plakayı 96 delikli manyetik rafa yerleştirin. Süpernatantın en az beş dakika boyunca temizlemesine izin verin.Ardından, süpernatantları taze bir 96 kuyucuklu plakaya aktarın ve boncukları atın. DNA ekstraksiyonu için, her numuneye bir mikrolitre% 10 SDS ve mililitre proteinaz K başına 0.83 mikrolitre 20 miligram ekleyin ve örnekleri nazik pipetleme ile karıştırın. Numuneleri 70 santigrat derecede 10 dakika boyunca inkübe edin.Plakayı oda sıcaklığına geri getirin. 46.6 mikrolitre beş molar sodyum klorür ve 90 mikrolitre% 50 PEG4000 ekleyin ve nazik pipetleme ile karıştırın. Her numuneye 33 mikrolitre polistiren manyetit boncuk ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın.Plakayı manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatantın yaklaşık beş dakika boyunca temizlenmesine izin verin. Ardından, boncukları rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice atın. Boncukları rahatsız etmeden 150 mikrolitre% 80 etanol ile iki kez durulayın.Plakayı 30 saniye boyunca 1000 kez G'de kısaca döndürün. Plakayı tekrar 96 delikli manyetik bir rafa yerleştirin ve boncukları rahatsız etmeden tüm artık etanolleri çıkarın. Numuneleri yaklaşık iki ila beş dakika boyunca hava ile kurutun.Boncukları pH 8'in 37.5 mikrolitrelik 10 milimolar TRIS hidroklorüründe yeniden askıya alın ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Plakayı tekrar manyetik bir rafa yerleştirin ve boncukların beş dakika boyunca bağlanmasına izin verin. Süpernatantın 36,5 mikrolitresini taze bir termosiklet uyumlu 96 delikli plakaya aktarın ve boncukları atın.Hücre kalitesi değerlendirmesi yapıldıktan sonra, hücre görünümü ve yüzdesi incelenerek düşük kaliteli embriyonik kök hücrelerin kullanılmaması gerektiği gösterilmiştir. Hoechst 33342 boyası kullanılarak tek hücreli sıralama yapıldı ve her bir kuyucukta sıfır veya bir hücre bulunduğundan emin olmak için test hücreleri sayıldı. Agarose jel analizi, düşük moleküler ağırlıklı bir merdiven ve bireysel tek hücreli uliCUT & RUN kütüphanelerini ortaya çıkardı.Suboptimal ve optimal kütüphane analizleri düşük molekül ağırlıklı bir merdiven, verimsiz Mnaze sindirimi nedeniyle suboptimal kütüphane ve uygun sindirime sahip başarılı bir kütüphane göstermektedir. Parça analizörü dağılımı, beklenen tek hücreli boyutun 150 ila 500 baz çifti arasında değiştiğini göstermektedir. Bununla birlikte, büyük proteinlerde, DNA yaklaşık 270 baz çiftine sahip olacaktır.Yüksek hücre sayısını veya negatif kontrolü gösteren tek lokuslu genom tarayıcısı ve tek hücreli CTCF uliCUT & RUN kullanılarak protein doluluğu, tek hücrenin büyük ölçüde yüksek hücreli uliCUT & RUN'a benzer şekilde güçlü zirveleri temsil ettiğini ortaya koymuştur. Tek hücreli CTCF veya negatif kontrolün ısı haritaları, hücrelerdeki yerleşik CTCF bağlanma bölgeleri üzerinde doğrudan net bir okuma zenginleştirme paterni ortaya koymuştur. Tek boyutlu ısı haritaları, çevre bölgelere ve antikor içermeyen kontrollere göre tek hücreli kütüphanelerde kurulu CTCF bağlanma bölgelerine göre daha yüksek bir okuma yoğunluğu gösterir ve yerleşik bağlanma bölgelerinde antikora özgü zenginleştirme gösterir.Buzlu su banyosundaki boncuk bağlı çekirdeklerin dengelenmesi ve kalsiyum klorür ilavesi üzerine numunenin aşırı ısınmaması, kromatinin aşırı sindirimini önlemek için önemlidir.

single-cell-factor-localization-on-chromatin-using-ultra-low-input

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Mikrokokal nükleaz (MNase) füzyon proteinleri ile genom çapında protein bağlama bölgelerinin haritalanması için bir kromatin immünopresipitasyon (ChIP) -orthogonal yöntem olan yüksek verimli sekanslama (ChEC-seq) ile birleşince, kromatin endojen bölünmeyi tarif ederiz.

ChEC-seq ile Protein-DNA Etkileşimlerinin Genom Boyunca Haritalandırılması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Bu iletişim kuralı ChIP-seq, 4sU seq, toplam RNA-seq ve hücre satırları ve Primer hücre için profil oluşturma ribozom Kombinatorik kullanımını açıklar. Transkripsiyon faktörü de novo transkripsiyon, RNA işlenmesi, ciro ve çeviri zamanla, bağlama ve olayların genel gidişatı harekete geçirmek ve/veya hızla değişen hücrelerde görüntüleme izleme değişiklikleri sağlar.

Gerçek zamanlı analiz bağlama, transkripsiyon, çeviri ve ciro hücresel etkinleştirme sırasında küresel olayları görüntülemek üzere transkripsiyon faktörü

Genlerin ve onların düzenleyici elemanlarının arasındaki fiziksel etkileşimleri tanımlaması zordur ama kromozom conformation yakalama yöntemleri tarafından kolaylaştırdı. Bu değişiklik 4C-seq protokolü için PCR önyargı yanında en aza indirgemek PCR şablonları aşırı amplifikasyon azaltır ve bir ek Restriksiyon enzimi Özet adım dahil ederek okur mappability en üst düzeye çıkarır.

Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq)

TEK molekül düzeyinde DNA'nın bölgeye özgü dekoltesini ölçmek için son derece paralel bir yöntem tanımlanmıştır. Bu protokol, kısıtlama enonuclease NdeI kullanarak tekniği göstermektedir. Yöntem kolayca siteye özgü DNA bölünmesi ile sonuçlanan herhangi bir süreci incelemek için değiştirilebilir.

Siteye Özgü DNA Bölünmesi için Paralel Yüksek İş Kinetik Test

Hedefler ve etiketleme altında bölünme (CUT&amp;Tag) etkili bir kromatin epigenomik profilleme stratejisidir. Bu protokol, tesislerdeki histon modifikasyonlarının profillenmesi için rafine bir CUT&amp;Tag stratejisi sunar.

Hedefler Altında Bölünme ve Etiketleme Kullanılarak Bitkilerde H3K4me3 Modifikasyonunun Profillenmesi

Hi-C 3.0, sinyal-gürültü oranını ve kromatin etkileşimi algılamasının çözünürlüğünü artırmak için formaldehit ve dissüksinimidil glutarat çapraz bağlayıcılarını DpnII ve DdeI kısıtlama enzimlerinin bir kokteyli ile birleştiren geliştirilmiş bir Hi-C protokolüdür.

Uzunluk Ölçekleri Arasında Kromozom Konformasyonunu Yakalama

Genom çapında kromozom konformasyon yakalama yöntemi Micro-C-XL kullanılarak üç boyutlu genom organizasyonunu nükleozom çözünürlüğü ile haritalamak için bir protokol burada sunulmaktadır.

Memeli 3D Genom Etkileşimlerinin Micro-C-XL ile Haritalanması

Burada sunulan, fare uzuv kas uydu hücrelerinin floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) izolasyonu için, hedeflerin altında bölünme ve nükleaz (CUT &amp;RUN) kullanılarak salım yoluyla kas liflerinde transkripsiyon regülasyonu çalışmasına uyarlanmış etkili bir protokoldür.

FACS ile İzole Edilmiş Fare Uydu Hücrelerinin CUT&amp;RUN Analizi için Etkili Bir Protokol

Gen ekspresyonu, gen promotörlerinin distal düzenleyici elementlerle etkileşimleri ile düzenlenir. Burada, düşük girişli Capture Hi-C'nin (liCHi-C) daha önce ölçülemeyen nadir hücre tiplerinde bu etkileşimlerin tanımlanmasına ne kadar izin verdiğini açıklıyoruz.

Kıt hücre popülasyonlarında promotör merkezli uzaysal-zamansal genom mimarisini incelemek için entegre bir iş akışı

Bu protokol, biyoinformatiğe yeni başlayanlara, kullanıcıların CUT &amp; RUN sıralama verilerinin ilk analizini ve doğrulamasını tamamlamalarını sağlayan giriş niteliğinde bir CUT &amp; RUN analiz hattı aracılığıyla rehberlik eder. Burada açıklanan analiz adımlarının tamamlanması, aşağı akış tepe açıklaması ile birlikte, kullanıcıların kromatin regülasyonu hakkında mekanik içgörüler elde etmesine olanak tanır.

CUT&#38;RUN Sıralama Verilerinin Giriş Analizi ve Doğrulanması

Nöroendokrin küçük hücreli akciğer kanseri hücre hatları için optimize edilmiş bir Hedefin Altında Bölünme ve Nükleaz Kullanılarak Bırakım ve ardından yeni nesil dizileme (CUT&amp;RUN-seq) protokolü tanımlanmıştır. SCLC patobiyolojisinde epigenetik ve transkripsiyonel deregülasyonları incelemek için çeşitli histon modifikasyonları ve transkripsiyon faktörü (örneğin E2F7) bağlanma noktalarının genom çapında haritalanmasını sağlar.

CUT&amp;RUN kullanılarak nöroendokrin küçük hücreli akciğer kanseri hücre hatlarında histon modifikasyonları ve transkripsiyon faktörü bağlanma noktalarının genom çapında haritalanması

Öğrenin, CUT&RUN yöntemiyle kromatin üzerinde tek hücreli protein lokalizasyonunu nasıl belirleyeceğinizi. Bu teknik, düşük hücre girişi gerektirir ve nadir biyolojik örneklerde faktör haritalaması için idealdir.

Hedefler Altında Ultra Düşük Giriş Bölünmesi ve Nükleaz Kullanarak Salınım Kullanılarak Kromatin Üzerinde Tek Hücreli Faktör Lokalizasyonu (Video) | JoVE Journal

Hedefler Altında Ultra Düşük Giriş Bölünmesi ve Nükleaz Kullanarak Salınım Kullanılarak Kromatin Üzerinde Tek Hücreli Faktör Lokalizasyonu

Daha fazla video keşfet