Name: Primer Fare Retinal Pigmentli Epitel Hücrelerinin İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: Öğrenin, fare gözlerinden retinal pigmentli epitel hücrelerini izole etme yöntemini. Bu protokol, fotoreseptör fonksiyonu ve yaşla ilişkili maküler dejenerasyon gibi retinal hastalıkları araştırmak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ulusal Göz Enstitüsü (NEI), Ulusal Göz Enstitüsü (NEI) fonu R01 EY029751-04 tarafından desteklenmiştir.

Hayvanlar, Oakland Üniversitesi IACUC hayvan protokolü numarası 21063 yönergelerine ve Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı için ARVO Beyanı'nın kılavuzlarına göre kullanılmıştır.
1. Çözelti hazırlama
<ol><li>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı / Besin Karışımı F-12'yi (DMEM / F12) % 25 Fetal Sığır Serumu (FBS),% 1.5 penisilin / streptomisin ve% 0.02 gentamisin ile destekleyerek RPE hücre kültürü ortamının tamamını hazırlayın.</li>
	<li>741 μL Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisini (HBSS) 127 μL Kollajenaz stok çözeltisi ve 132 μL Hyaluronidaz stok çözeltisi ile destekleyerek Enzim A'yı hazırlayın. Bu, dört gözü tedavi edebilen 1 mL'lik son bir hacim yapar.<ol><li>Kollajenaz stok çözeltisini, 41 mL HBSS'de (19.5 ünite / mL) Clostridium histolyticum'dan 1 mg Kollajenaz çözerek hazırlayın.</li>
		<li>Hyaluronidaz stok çözeltisini, sığır testislerinden 1 mg Hyaluronidaz'ı 18.4 mL HBSS'de (38 ünite / mL) çözerek hazırlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Üç parça HBSS'ye iki parça% 0.25 Tripsin-EDTA ekleyerek B Enzimini hazırlayın. Toplam hacmin disseke edilen göz sayısına bağlı olduğunu unutmayın; Dört gözü tedavi etmek için 1 mL B Enzimi kullanılabilir.</li>
</ol>2. Enükleasyon
<ol><li>IACUC standartları21'e göre karbondioksit (CO2) inhalasyonunu kullanarak fareyi etik olarak ötenazi yapın.<ol><li>Kısaca, farelere en az sıkıntı vererek, 2 ila 3 dakika içinde bilinç kaybı sağlamak için CO 2 ile dakikada oda hacminin% 30-70'i doldurma oranıyla% 100 CO 2'yi tanıtmak için hayvanları CO 2 odasına yerleştirin.</li>
		<li>Ölümü onaylayın (solunum eksikliği ve soluk göz rengi), ardından fareyi kafesten sterilize edilmiş cerrahi ekipmanlarla donatılmış temiz bir sterilize cerrahi alana (alkolle temizlenmiş) taşıyın.</li>
	</ol></li>
	<li>Fareyi steril bir alt panelin üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Proptozu indüklemek için orbital bölgeye 5/45 tarzı cımbız basarak gözleri enüklee edin, ardından cımbızları gözün arkasına hareket ettirin. Optik sinir bozulmadan gözleri orbital boşluktan yavaşça çekerek gözleri çıkarın.</li>
	<li>Forseps kullanarak, gözleri 1mL% 5 Povidon-İyot içeren 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne batırın. Gözleri oda sıcaklığında 2-3 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Gözleri povidon-iyot çözeltisinden çıkarın ve bir Petri kabına yerleştirin. Steril bir transfer pipeti kullanarak, povidon-iyotun turuncu rengi gidene kadar gözleri HBSS ile yıkayın. Bu yaklaşık iki veya üç yıkama gerektirir.</li>
	<li>Gözleri yeni bir 60 mm'lik Petri kabına yerleştirin ve adım 1.1'de hazırlanan soğuk (2-8 °C) komple RPE hücre kültürü ortamına batırın.</li>
</ol>3. Diseksiyon
<ol><li>Cerrahi mikroskop altında, bağ dokusunu ve ekstraoküler kasları çıkarmak için M5S tarzı cımbız ve Vannas makası kullanın. NOT: Diseksiyon tamamen steril bir ortamda bir doku başlığı altında yapılır. Bununla birlikte, video amaçları için, diseksiyon mikroskobu, daha yüksek kalitede bir gösterim / film elde etmek için kaputun dışına yerleştirildi. Göz altına küçük bir parça tüy bırakmayan kağıt mendil yerleştirmek, diseksiyon sırasında stabiliteyi artırır. Gözler daha sonra soğuk RPE hücre kültürü ortamında geçici olarak (1 saatten fazla olmamak üzere) tutulabilir. Bununla birlikte, gözleri temizledikten hemen sonra doğrudan bir sonraki adıma geçmek tercih edilir.</li>
	<li>Gözleri, her dört göz için 1 mL Enzim A çözeltisi içeren 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Ardından, gözleri 40 dakika boyunca 37 ° C'de bir inkübatörde inkübe edin.</li>
	<li>Gözleri inkübatörden ve mikrosantrifüj tüpünden çıkarın. Daha sonra, bunları her dört göz için 1 mL Enzim B çözeltisi içeren yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüpü bir inkübatörde 50 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>Gözleri, 10 mL tam RPE hücre büyüme ortamı içeren yeni bir 60 mm süspansiyon kültürü kabına yerleştirin. Daha sonra gözleri 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>Çanağı cerrahi mikroskop altına yerleştirin ve diseksiyona başlayın.</li>
	<li>Gözün ön kısmını (kornea, iris ve lens) vizör adaptörünün arka kısmından (posterior retina) çıkarın.<ol><li>Gözü M5S tarzı forseps ile kavrayın ve ora serrata bölümünde (retinanın açık mavinin bittiği en ön kısmı) #11 bıçakla veya bir şırınganın iğnesiyle bir kesi yapın.</li>
		<li>Kesinin iç kısmını bir çift forseps ile kavrayın ve korneayı başka bir çift forseps ile kavrayın. Korneayı retinadan yavaşça çekmeye veya yırtmaya başlayın. RPE'nin çoğunlukla sağlam kalmasını ve daha temiz bir yırtılma ile sonuçlanmasını sağlamak için korneayı çıkarırken küçük artışlarla yırttığınızdan ve yırtığı aşağı doğru hareket ettirdiğinizden emin olun. NOT: Kornea tamamen ayrıldıktan sonra, iris ve lens görülebilir.</li>
		<li>Hem korneayı hem de irisi ayırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Gözün arka yarısının hafifçe sıkıştırılmasıyla lensi vizör adaptöründen ayırın.</li>
	<li>Nöral retinayı RPE katmanından çıkarmak için, vizör adaptörünün dış tabakasını bir çift cımbızla kavrayın ve ikinci bir cımbız çiftinin kolunu hem RPE hem de nöral katmanlar arasında konumlandırın. Oradan, nöral retinayı RPE katmanından yavaşça çekin veya kepçeyle alın. Nöral retinayı atın. NOT: Videoda, nöral retina ve lens birlikte çıkarılmıştır. Ancak, yeni başlayanlar için, her birini ayrı ayrı kaldırmak daha kolay olacaktır. Geriye kalan RPE, koroid ve skleradır.</li>
	<li>Korneayı, irisi, lensi ve nöral retinayı atın. Kalan vizör adaptörünü tabakta döküntü içermeyen yeni bir alana taşıyın.</li>
	<li>RPE'yi koroid ve skleradan ayırmak için, RPE hücrelerinin ayrılmasını sağlamak için vizör adaptörünün içini 5/45 tarzı cımbızla hafifçe kazıyın. RPE hücreleri, RPE hücresi büyüme ortamının tamamında askıya alındığında bulutlu görünür.</li>
	<li>3,2 mL'lik steril transfer pipeti kullanarak hücreleri aspire edin ve eksiksiz RPE hücre büyüme ortamı içeren yeni bir 15 mL santrifüj tüpüne aktarın.</li>
</ol>4. Santrifüjleme
<ol><li>Birincil RPE hücrelerini içeren 15 mL santrifüj tüpünü bir santrifüjün içine yerleştirin ve hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın.</li>
	<li>Süpernatantı aspire edin ve peleti 10 mL tam RPE büyüme ortamı ile yeniden askıya alın. Tam RPE büyüme ortamı, RPE büyümesi için Müller hücreleri veya koroidal endotel hücreleri gibi diğer kirletici hücrelerden daha spesifiktir. Müller hücreleri yüksek glukoz mediasına ihtiyaç duyarken, koroidal endotel hücreleri spesifik büyüme faktörleri gerektirir. Medyayı değiştirerek ve kültürü pasifleştirerek, sadece RPE hücreleri büyümeye devam edecektir.</li>
</ol>5. Hücre kültürü
<ol><li>Yeniden askıya alınmış birincil RPE hücrelerini steril bir 100 mm Petri kabına yerleştirin ve bir inkübatöre aktarın ( Şekil 1E-N'de belirtildiği gibi hücreleri spesifik RPE / Müller hücre belirteçleriyle boyayarak saflığı doğruladıktan sonra). Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin. NOT: Kullanılan işaretleyiciler Malzeme Tablosunda belirtilmiştir. Bu adım, kültür kurulduktan sonra gerçekleştirilir.</li>
	<li>Hücreleri büyümek için yaklaşık 5 gün boyunca inkübe edin. Bu süre zarfında, medyayı değiştirmeyin, hücreleri rahatsız etmeyin veya hücre kültürü plakasını hareket ettirmeyin (bu protokolde kritik bir adımdır; izolasyondan sonra, hücreler inkübe edilmeli ve 5 gün boyunca rahatsız edilmemelidir). NOT: Hücre sayısı, izolasyon için kullanılan göz sayısına bağlıdır. İzole edilen daha fazla sayıda göz, daha fazla sayıda hücre verecektir. İki gözden RPE izolasyonu ~ 440.000-880.000 hücre veya 8.8 milyon hücreyi tutabilen 100 mm Petri kabının% 5-10'unu verecektir.</li>
</ol>6. Pasaj
<ol><li>Ortamı aspire edin ve 2 mL PBS ile yıkayın. Sonra PBS'yi aspire edin.</li>
	<li>4 mL% 0.25 Tripsin-EDTA (1x) veya kabın tabanını örtecek kadar ekleyin. Oda sıcaklığında 5-10 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>8 mL önceden ısıtılmış RPE ortamı veya adım 6.2'de ne kadar tripsin kullanıldığının hacminin iki katı ekleyin. Daha sonra hücreleri toplayın ve 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 7 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj. Süpernatantı aspire edin ve peleti 10 mL'lik tam RPE hücre kültürü ortamında yeniden askıya alın. Tüm süspansiyonu steril bir 100 mm Petri kabına yerleştirin. NOT: Hücreler dört veya beş kez18'e kadar geçirilebilir. Bununla birlikte, en tutarlı deney sonuçları iki veya üç pasajdan sonra bulunur. İki ila dört pasajdan sonra, hücreler şekillerini ( Şekil 1B'de gösterildiği gibi) daha uzun olacak şekilde değiştirdiler, plakanın ortasında birikti, büyümeyi durdurdu ve ayrıldı.</li>
	<li>RPE spesifikliğini boyamak ve doğrulamak için daha önceyayınlanan 8,14,15,16 yöntemlerine göre immünofloresan protokollerini kullanın.</li>
</ol>7. İmmünofloresan
NOT: İmmünofloresan, RPE spesifikliğini boyamak ve doğrulamak için daha önceyayınlanan 8,14,15,16,17,18 yöntemlerine göre gerçekleştirilmiştir. Primer RPE hücrelerinin boyanması tipik olarak P1 ve P2 pasajlarında yapıldı. Burada, immünofloresan protokolüne kısa bir genel bakış sunulmaktadır.
<ol><li>Hücreleri bir hücre kültürü odası kaydırağındaki tohumlayın (8 delikli oda slaydı için kuyu başına 30.000 hücre).</li>
	<li>Tam RPE hücre kültürü ortamındaki hücreleri 37 °C'de ve 24-48 saat boyunca% 5 CO 2'de kültürleyin.</li>
	<li>Hücreler% 80 -% 90 birleştiğinde, ortamı aspire edin ve oda kızağını 1x PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Slaytı 10-15 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin.</li>
	<li>% 4'lük paraformaldehiti aspire edin ve daha sonra bloke edici çözelti ile bloke edin (bkz.</li>
	<li>Bloke edici çözeltiyi aspire edin ve birincil antikoru RPE65'i ekleyin ve 37 ° C'de üç saat boyunca inkübe edin (blokaj tamponunda 1:200-1:250 arasında değişen bir antikor konsantrasyonuyla, 150-200 μL / slayt hacminde). Ardından, PBS / TX-100 ile üç kez yıkayın (her yıkamada 5-10 dakika).</li>
	<li>Birincil antikoru aspire edin ve ikincil antikoru ekleyin (bloke edici tamponda 1: 1.000 antikor konsantrasyonu ile, 150-200 μL / slayt hacminde). 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Sekonder antikoru aspire edin. PBS/Trtion X-100 ile üç kez yıkayın (her yıkamada 5-10 dakika).</li>
	<li>Çekirdekleri etiketlemek için bir damla DAPI montaj ortamı ekleyin ve kızağın üzerine bir kapak parçası yerleştirin. Kapak kapağının altında kabarcık olmadığından emin olun.</li>
	<li>Ardından, yüksek çözünürlüklü mikroskop (HRM) kamera ve görüntü işleme yazılımı eşliğinde floresan mikroskopla görüntüler çekin (bkz.</li>
</ol>

<ol><li>Young, R. W., Droz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+renewal+of+protein+in+retinal+rods+and+cones%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The renewal of protein in retinal rods and cones.</a> The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).</li>
<li>Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium in health and disease.</a> Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).</li>
<li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li>
<li>Marlhens, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autosomal+recessive+retinal+dystrophy+associated+with+two+novel+mutations+in+the+RPE65+gene%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Autosomal recessive retinal dystrophy associated with two novel mutations in the RPE65 gene.</a> European Journal of Human Genetics. 6 (5), 527-531 (1998).</li>
<li>Morimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+RPE65+gene+in+patients+with+autosomal+recessive+retinitis+pigmentosa+or+leber+congenital+amaurosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mutations in the RPE65 gene in patients with autosomal recessive retinitis pigmentosa or leber congenital amaurosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (6), 3088-3093 (1998).</li>
<li>Weiter, J. J., Delori, F. C., Wing, G. L., Fitch, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+pigment+epithelial+lipofuscin+and+melanin+and+choroidal+melanin+in+human+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Retinal pigment epithelial lipofuscin and melanin and choroidal melanin in human eyes.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (2), 145-152 (1986).</li>
<li>Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+human+RPE%3A+morphometric+analysis+of+macular%2C+equatorial%2C+and+peripheral+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).</li>
<li>Ibrahim, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperhomocysteinemia+disrupts+retinal+pigment+epithelial+structure+and+function+with+features+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Hyperhomocysteinemia disrupts retinal pigment epithelial structure and function with features of age-related macular degeneration.</a> Oncotarget. 7 (8), 8532-8545 (2016).</li>
<li>Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration%3A+review+of+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration: review of pathogenesis.</a> European Journal of Ophthalmology. 8 (4), 199-206 (1998).</li>
<li>Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARPE-19%2C+a+human+retinal+pigment+epithelial+cell+line+with+differentiated+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties.</a> Experimental Eye Research. 62 (2), 155-170 (1996).</li>
<li>Flannery, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+animal+models+for+the+study+of+inherited+retinal+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Transgenic animal models for the study of inherited retinal dystrophies.</a> ILAR Journal. 40 (2), 51-58 (1999).</li>
<li>Gibbs, D., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigmented+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).</li>
<li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li>
<li>Samra, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implication+of+N-Methyl-d-Aspartate+receptor+in+homocysteine-induced+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Implication of N-Methyl-d-Aspartate receptor in homocysteine-induced age-related macular degeneration.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9356(2021).</li>
<li>van Marum, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+the+use+of+memantine+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychiatric+Disease+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Update on the use of memantine in Alzheimer's disease.</a> Neuropsychiatric Disease and Treatment. 5, 237-247 (2009).</li>
<li>Elsherbiny, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homocysteine+induces+inflammation+in+retina+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Homocysteine induces inflammation in retina and brain.</a> Biomolecules. 10 (3), 393(2020).</li>
<li>Tawfik, A., Elsherbiny, N. M., Zaidi, Y., Rajpurohit, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homocysteine+and+age-related+central+nervous+system+diseases%3A+role+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Homocysteine and age-related central nervous system diseases: role of inflammation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6259(2021).</li>
<li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler Jr, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e56997(2018).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+spontaneous+mouse+retinal+pigment+epithelial+cell+line+B6-RPE07%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Characterization of a spontaneous mouse retinal pigment epithelial cell line B6-RPE07.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3699-3706 (2008).</li>
<li>AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf">https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf</a> (2020).</li>
<li>Cai, X., Conley, S. M., Naash, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPE65%3A+role+in+the+visual+cycle%2C+human+retinal+disease%2C+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Genetics%22%5BJournal%5D)">RPE65: role in the visual cycle, human retinal disease, and gene therapy.</a> Ophthalmic Genetics. 30 (2), 57-62 (2009).</li>
<li>Pérez-Álvarez, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vimentin+isoform+expression+in+the+human+retina+characterized+with+the+monoclonal+antibody+3CB2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Vimentin isoform expression in the human retina characterized with the monoclonal antibody 3CB2.</a> Journal of Neuroscience Research. 86 (8), 1871-1883 (2008).</li>
<li>Tawfik, A., Samra, Y. A., Elsherbiny, N. M., Al-Shabrawey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implication+of+hyperhomocysteinemia+in+blood+retinal+barrier+%28BRB%29+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Implication of hyperhomocysteinemia in blood retinal barrier (BRB) dysfunction.</a> Biomolecules. 10 (8), 1119(2020).</li>
<li>Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, S. B., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B. S., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monomethylfumarate+induces+%CE%B3-globin+expression+and+fetal+hemoglobin+production+in+cultured+human+retinal+pigment+epithelial+%28RPE%29+and+erythroid+cells%2C+and+in+intact+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5382-5393 (2014).</li>
</ol>

Yazarların, bu makalenin içeriğiyle ilgili olduğunu beyan etmek için çıkar çatışması yoktur.

Geçerli protokol, fare gözlerinden RPE yalıtımı için raporlanmış, değiştirilmiş ve basitleştirilmiş ayrıntılı bir yordamdır. Protokol, fare gözlerinden izole edilen RPE hücrelerinin enükleasyonu, diseksiyonu, toplanması, tohumlanması, kültürü ve karakterizasyonunu içerir.
Başarılı RPE izolasyonu için farelerin yaşı, disseke edilen göz sayısı, doku kültürü tabağının veya kabının büyüklüğü ve tohumlama, depolama ve pasajdan sonra uyarılar gibi yerine getirilmesi gereken bazı sınırlamalar ve krit...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63543">Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells</a>. The Discussion and References sections were updated.
The third paragraph of the Discussion&#160;section was updated from:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of M&#252;ller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for M&#252;ller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn&#39;t require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
to:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of M&#252;ller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for M&#252;ller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn&#39;t require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
In the References section, a 24th reference was added:
<ol start="24">
	<li>Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces &#947;-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).</li>
</ol>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63543">Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells</a>. The Discussion and References sections were updated.

Erratum: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Retinal pigmentli epitel (RPE) hücreleri, koroid ve nöral retina arasında bulunur ve fotoreseptör (PR) hücrelerinin arkasında yatan basit bir küboidal hücre tabakası oluşturur1. RPE, PR hücreleri için sağlıklı bir ortamın korunmasında, esas olarak reaktif oksijen türlerinin (ROS) aşırı birikimini ve bunun sonucunda oksidatif hasarı azaltarak kritik bir rol oynar1. RPE hücreleri, retinoidlerin dönüşümü ve depolanması, dağınık ışığın emilimi, sıvı ve iyon taşınması ve dökülen PR dış segment membranının fagositozu 2,3 gibi birçok işlevi denetler. RPE'deki değişiklikler (morfoloji/fonksiyon) retinopatiye yol açan fonksiyonlarını bozabilir ve bu birçok oküler bozukluk tarafından paylaşılan ortak bir özelliktir4. Birçok oküler hastalık, retinitis pigmentosa, Leber konjenital amauroz ve albinizm 4,5,6 gibi bazı genetik hastalıkların yanı sıra diyabetik retinopati (DR) ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) gibi yaşa bağlı oküler bozukluklar da dahil olmak üzere RPE hücrelerinin morfolojisi ve fonksiyonundaki değişikliklerle ilişkilidir7,8 . İnsan hücreleri en çok arzu edilenlerdir, bu nedenle RPE monokatmanları oluşturmak için birincil insan RPE hücrelerindeki RPE bozukluklarını incelemek ideal olacaktır. Bununla birlikte, etik konular ve bu bozuklukların çoğunun morbiditeye yol açması nedeniyle insan donörlerinin sınırlı mevcudiyeti9, ancak mutlaka mortalite10 değil, böylece birincil insan RPE hücrelerinin izolasyonunu engellemektedir. Bu, insan olmayan hayvan donörlerinden RPE hücrelerinin kültürlenmesini tercih edilen bir alternatif haline getirir. Kemirgenler, özellikle fareler, farklı oküler hastalıkları incelemek için harika bir model olarak kabul edilir, çünkü transgenik teknoloji bu türlerde daha yaygın olarak kurulmuştur11. Kültürlenmiş primer RPE hücrelerinin kullanımı birçok avantaj sunsa da, birçok pasaj için büyüyen hücreleri korumak veya hücreleri depolamak ve yeniden kullanmak zor olmuştur. Bu protokolün ana sınırlaması farelerin yaşıdır; RPE izolasyonu için kullanılan fareler çok genç yaşta olmalıdır (18-21 günlüklük en uygunudur), çünkü yetişkin farelerden RPE hücrelerini kültürlemek zor olmuştur11,12,13. RPE hücreleri her yaşta fare gözlerinden izole edilebilir, ancak dört hücreye kadar pasaj sadece genç farelerde (18-21 günlük) başarılı olmuştur. RPE hücrelerinde N-metil-D-aspartat reseptörlerinin (NMDAR'lar) silinmesiyle hem C57BL6 fareleri hem de transgenik fareler kullanılarak fare retinalarından RPE izolasyonu, yüksek amino asit homosisteinin AMD14'ün gelişimi ve ilerlemesi üzerindeki etkisini incelemek için gerçekleştirildi. Ek olarak, izole primer RPE hücreleri, RPE hücrelerinde NMDAR'ların inhibisyonu ile AMD için terapötik bir hedef önerilmesine yardımcı oldu14. Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) tarafından onaylanan ve şu anda AMD14 için potansiyel bir terapötik hedef olabilecek memantin16 gibi Alzheimer hastalığına (AD) bağlı orta ila şiddetli karışıklığı (demans) tedavi etmek için kullanılan bazı NMDAR blokerleri vardır. Ayrıca, izole primer fare RPE hücreleri, enflamatuar belirteçlerin tespiti ve yüksek düzeyde homosistein16,17 sunan genetiği değiştirilmiş bir fare (CBS) kullanılarak AMD ve AD'nin homosistein kaynaklı özellikleri için altta yatan bir mekanizma olarak inflamasyonun önerilen indüksiyonu için kullanılmıştır.
Bu protokol, RPE hücrelerini hem vahşi tip C57BL / 6 farelerden hem de laboratuvarımızda geliştirilen transgenik farelerden, kolayca uygulanabilir ve güvenilir bir protokole ulaşmak için diğer yayınlanmış izolasyon protokollerinin 13,18,19'unun basitleştirilmiş bir uyarlaması olarak izole etmek için kullanılmıştır. Bu protokolde cinsiyet tercihi yoktur. Farelerin yaşları izolasyon süreci için kritik öneme sahipken, RPE izolasyonu için genç, yaşlı fareler (18-21 günlük) ve herhangi bir yaştaki (12 aya kadar) yaşlı fareler kullanılmıştır. Bununla birlikte, genç yaşlı farelerden izole edilen RPE hücrelerinin daha uzun yaşadığını ve dört pasajın gerçekleştirilebileceğini fark ettik. Yaşlı farelerden izole edilen RPE hücreleri bir veya iki kez geçirilebilir, daha sonra normal bir oranda büyümeyi durdurur ve şekillerini daha uzun olacak şekilde değiştirirler (fibroblast benzeri hücreler). Pigmentasyon kaybı ve doku kültürü plağına yapışmanın azalması ve ardından dekolmanı da gözlendi.

<table><tbody><tr><td>Beher: 100mL</td><td>KIMAX</td><td>14000</td><td></td></tr><tr><td>Clostridium histolyticum'dan kollajenaz&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7657-25MG</td><td>Çalışma enzimi için,</td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Dereceli Transfer Pipetleri: 3.2 mL Steril</td><td></td><td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12</td> <td>&nbsp; gibco&nbsp;</td><td>11330</td><td>RPE hücrelerini büyütmek için ortam&nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>gibco</td><td>26140079</td><td>Komple RPE hücre kültürü ortamı için</td></tr><tr><td>Gentamisin Reaktif Çözeltisi</td><td>gibco</td><td>15750-060</td><td>Komple RPE hücre kültürü ortamı için</td></tr><tr><td>Hanks' Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) Thermo</td> <td>Scientific</td><td>88284</td><td>Çalışan enzimler için (A& B)&nbsp;</td></tr><tr><td>Heracell VISO 160i CO2 İnkübatör</td><td>Thermo Scientific</td><td>50144906</td><td></td></tr><tr><td>sığır testislerinden Hyaluronidaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506-500MG</td><td>A çalışma enzimi için</td></tr><tr><td>Kimberly-Clark Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luer-Lok Şırınga, ekli iğne ile 21 G x 1 1/2 inç, steril, tek kullanımlık, 3 mL</td><td>BD</td><td>309577</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Santrifüj Tüpü: 2 mL</td><td>Grainger</td><td>11L819</td><td></td></tr><tr><td>Fare monoklonal anti-RPE65 antikoru&nbsp;</td><td>Abcam, Cambridge, MA, ABD</td><td>ab78036</td><td>IF boyama için&nbsp;</td></tr><tr><td>Kalem Strep</td><td>gibco</td><td>15140-122</td><td>Komple RPE hücre kültürü ortamı için</td></tr><tr><td>Pozitif Etkili Cımbız, Stil 5/45</td><td>Dumont</td><td>72703-DZ</td><td></td></tr><tr><td>Makas İris Standart Düz 11,5cm</td><td>GARANA INDUSTRIES</td><td>2595</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall St8 Santrifüj</td><td>ThermoScientific</td><td>75007200</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 305 Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi Bıçak, # 11, Paslanmaz Çelik</td><td>Bard-Parker</td><td>371211</td><td></td></tr><tr><td>Süspansiyon Kültür Kabı 60mm x 15mm Stil</td><td>Corning</td><td>430589</td><td></td></tr><tr><td>Doku Kültürü Tabağı: 100x20mm stil</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Kasırga Tüpleri: 15 mL</td><td>Midsci</td><td>C15B</td><td></td></tr><tr><td>Kasırga Tüpleri: 50mL</td><td>Midsci</td><td>C50R</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin EDTA (1x)% 0.25 </td><td>gibco</td><td>2186962</td><td>Enzim B</td></tr><tr><td>Cımbız çalışmak için 5MS, 8.2cm, Düz, 0.09x0.05mm Uçlar</td><td>Dumont</td><td>501764</td><td></td></tr><tr><td>Cımbız Pozitif Eylem Stili 5, Biyolojik, Dumostar, Cilalı Kaplama, 110 mm OAL</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri Dumont</td><td>50-241-57</td><td></td></tr><tr><td>Alt Pedler, Orta : 23" X 36"</td> <td>McKesson</td><td>4033</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Yaylı Makas - 2.5mm Son Teknoloji</td>: <td>FST</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioImager Z2</td>, <td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr>, <tr><td>Zeiss Zen Blue 2.6</td>, <td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

primer fare retinal pigmentli epitel hücrelerinin İzolasyonu

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Retinal pigmentli epitel (RPE) tabakası, fotoreseptörlerin hemen arkasında yer alır ve fotoreseptörlerin işlevini sürdürmede birkaç kritik rol oynayan karmaşık bir metabolik sistemi barındırır. Bu nedenle, RPE yapısı ve işlevi normal görüşü sürdürmek için gereklidir. Bu yazıda primer fare RPE hücre izolasyonu için belirlenmiş bir protokol sunulmaktadır. RPE izolasyonu, oküler bozuklukların farklı fare modellerinde RPE patolojisinin altında yatan moleküler mekanizmaları araştırmak için harika bir araçtır. Ayrıca, RPE izolasyonu, vahşi tip ve genetiği değiştirilmiş farelerden izole edilen birincil fare RPE hücrelerinin karşılaştırılmasında ve görme bozuklukları için tedavinin gelişimini hızlandırabilecek ilaçların test edilmesinde yardımcı olabilir. Makale adım adım RPE izolasyon protokolü sunmaktadır; enükleasyondan tohumlamaya kadar tüm prosedür yaklaşık 4 saat sürer. İzole hücrelerin bozulmadan büyümesine izin vermek için tohumlamadan sonra 5-7 gün boyunca ortam değiştirilmemelidir. Bu süreci, immünofloresan yoluyla hücrelerdeki morfoloji, pigmentasyon ve spesifik belirteçlerin karakterizasyonu izler. Hücreler en fazla üç veya dört kez geçirilebilir.

İzole RPE hücrelerinin özgüllüğünün, saflığının ve bariyer fonksiyonunun/oluşumunun doğrulanması İzole edilen hücreler, canlılıklarını, morfolojilerini ve pigmentasyonlarını doğrulamak için bir ışık mikroskobu altında incelendi. Hücrelerdeki değişiklikleri göstermek için P0 ve P1'den görüntüler (Şekil 1A,B) ve P0 ve P4'ten görüntüler (Şekil 1C,D) yakalandı; Pasajlar dördüncü pasaja ilerledikçe şekil, boyut ve pigmentasyon (siy...

Bu yazıda retinal pigmente epitel (RPE) hücrelerinin fare gözlerinden kademeli olarak izole edilmesi için basitleştirilmiş bir protokol anlatılmaktadır. Protokol, fare gözlerinin enükleasyonunu ve diseksiyonunu, ardından RPE hücrelerinin izolasyonunu, tohumlanmasını ve kültürlenmesini içerir.

Primer Fare Retinal Pigmentli Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Bu protokol, birincil fare retinal pigmentli epitel hücrelerini başarılı bir şekilde izole etmenin kolay ve etkili bir yolunu özetleyecektir. Retina pigmentli epitel hücreleri, fotoreseptör hücrelerin korunmasında ve retinanın normal fonksiyonunun sağlanmasında çok önemli bir rol oynar. Laboratuvarımız primer fare pigmentli epitel hücrelerini, dış kan-retina bariyerini ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu gibi ilgili hastalıkları incelemek için önemli bir araç olarak izole etmektedir.Fare gözlerini çıkarmak için, fareyi kurumunuzun onaylı yöntemlerine göre etik olarak ötenazi yapın, ardından fareyi steril bir alt tabana yerleştirin ve proptozu indüklemek için orbital bölgeye 5/45 tarzı bir cımbız basarak gözü çekirdeklendirin, ardından cımbızı gözün arkasına doğru hareket ettirin ve optik sinirin hala sağlam olmasını sağlamak için gözü çıkarmak için yavaşça çekin. Forseps kullanırken, gözleri% 5 povidon iyot içeren 2 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne batırın. Gözleri oda sıcaklığında 2 ila 3 dakika kuluçkaya yatırın.Gözleri povidon iyottan çıkarın ve bir Petri kabına yerleştirin. Steril bir transfer pipeti kullanırken, povidon iyotun turuncu rengi gidene kadar gözleri Hanks'Balanced Saline Solution ile yıkayın. Bu yaklaşık 2 ila 3 yıkama gerektirir.Gözleri yeni bir Petri kabına yerleştirin ve soğuk tam RPE hücre büyüme ortamına batırın. Oradan, diseksiyon mikroskobu altında diseksiyona başlayabilirsiniz. Mikroskop altında, ekstraoküler kaslardaki bağ dokusunu çekmek veya kesmek için cımbız ve / veya Vannas makası kullanın.Gözler daha sonra soğuk RPE hücre kültürü ortamında bir saat tutulabilir. Ancak göz küresini temizledikten sonra doğrudan bir sonraki adıma geçmek tercih edilir. Gözleri, A enzimi çözeltisini içeren 2 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın, ardından gözleri 40 dakika boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatörün içinde inkübe edin.Gözleri A enzimi çözeltisinden çıkarın ve B enzimi çözeltisini içeren yeni bir 2 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin, ardından bir inkübatörün içine yerleştirin ve 50 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Gözleri B enziminden çıkarın ve 60 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin ve batırın ve RPE hücresi büyüme ortamını tamamlayın, ardından gözleri 30 dakika boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin. Çanağı diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin ve diseksiyona başlayın.Ora seratta bölümünde bir kesi yapmak için M5S forseps ve bir şırınga iğnesi kullanın. Şimdi iki forseps ile, bir forseps ile insizyonun iç kısmını kavrayın ve korneayı diğer forseple kavrayın. Korneayı çekerek retinadan yavaşça yırtmaya başlayın.Küçük artışlarla yırttığınızdan ve korneayı çıkarırken yırtığı aşağı doğru hareket ettirdiğinizden emin olun. Bu, RPE'nin çoğunlukla bozulmadan kalmasını ve daha temiz bir gözyaşı elde etmenizi sağlayacaktır. Kornea tamamen ayrıldıktan sonra, iris ve lensi görebilmelisiniz.İzolasyonun saflığını korumak için hem irisi hem de lensi forseps ile çıkarın. Nöral retinayı RPE katmanından çıkarmak için, vizör adaptörünün dış tabakasını bir cımbızla kavrayın ve ikinci bir cımbızın bir kolunu hem RPE hem de nöral katmanlar arasında konumlandırın. Oradan, nöral retinayı RPE katmanından yavaşça çekin veya kepçeyle uzaklaştırın, ardından nöral retinayı atın.RPE katmanını tabakta döküntü içermeyen farklı bir yere taşıyın. RPE'yi koroid ve skleradan ayırmak için, RPE hücrelerinin ayrılmasını sağlamak için vizör adaptörünün içini 5/45 tarzı bir cımbızla hafifçe kazıyın. RPE hücreleri askıya alındığında bulutlu görünür ve RPE hücresi büyüme ortamını tamamlar.3,2 mililitrelik steril transfer pipeti kullanarak hücreleri aspire edin ve eksiksiz RPE hücre büyüme ortamı içeren 15 mililitrelik yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücreler oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300g'da santrifüj edilebilir. Daha sonra süpernatantı aspire edebilir ve peleti ısıtılmış RPE hücre büyüme ortamında yeniden askıya alabilirsiniz.Hücreleri 100 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin ve 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübe edin. Bu görüntüler, RPE hücrelerinin pigmentasyonu ile belirgin olan pasaj 0 ve pasaj 1'de başarılı bir izolasyon göstermektedir. 4. pasajda, hücreler daha az karakteristik hale gelir ve daha az pigment sergiler, iğ benzeri bir görünüm gösterir veya daha geniş bir yüzey alanı ile daha sağlam hale gelir.RPE hücrelerini RPE'ye özgü bir belirteç, RPE65 ve bir sitoiskelet proteini F-aktin ile doğruladık. Ayrıca, Muller hücresine özgü bir belirteç olan vimentin ile boyayarak Muller hücreleri ile potansiyel kontaminasyonu kontrol ettik. Bu protokol, mevcut protokollerin basitleştirilmiş bir uyarlamasıdır.Protokol, çoğu araştırma laboratuvarında bulunan ve birincil fare RPE hücrelerinin etkili bir şekilde izole edilmesine yardımcı olacak malzemeleri ve ilgili ekipmanları kullanır.

isolation-of-primary-mouse-retinal-pigmented-epithelium-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, bir tavşan modelinden oküler pigment epitel hücreleri elde etmek için bir prosedür gösteriyoruz. Hücreler, retinal dejeneratif hastalıklar için terapötik stratejiler geliştirmede yardımcı olur.

IPE ve RPE Hücrelerinin İzole Edilmesi: Tavşan Gözünden Oküler Pigment Epitel Hücrelerinin Elde Edilmesi İçin Bir Teknik

Bu videoda, in vivo ve ex vivo çalışmalar için birincil kültürlerini elde etmek üzere domuz gözlerinden iris ve retina pigment epitel hücrelerini izole etmek için bir tekniği açıklıyoruz. Bu pigment hücreleri, oküler bozuklukları tedavi etmek için rejeneratif yaklaşımları incelemek için genetik olarak değiştirilebilir.

IPE ve RPE Hücrelerinin İzolasyonu: İzole Domuz Gözünden Pigmente Epitel Hücreleri Elde Etme Tekniği

Retina pigment epiteli (RPE) çok fonksiyonlu bir epitel göz olduğunu. Burada bir iletişim kuralı fare RPE türetilmiş birincil hücre kültürleri kurmak için mevcut.

Fare retina Pigment epiteli birincil hücre kültürleri

İlk olarak 20161'deFernandez-Godino ve arkadaşları tarafından bildirilen bu protokol, Transwell plakalarında bir hafta içinde işlevsel ve polarize bir RPE monolayer oluşturan fare RPE hücrelerini verimli bir şekilde izole etmek ve kültüre etmek için bir yöntem tanımlamaktadır. İşlem yaklaşık 3 saat sürer.

Birincil Fare Retina Pigment Epitel Hücrelerinin Verimli Diseksiyonu ve Kültürü

Retinal pigment epitel (RPE) hücrelerinin hücrelerini genç pigmentli kobayların gözlerinden izole etmek için basit ve etkili bir yöntem sunuyoruz. Bu prosedür, gen ekspresyon analizleri de dahil olmak üzere izole RPE üzerinde moleküler biyoloji çalışmalarının izlenmesine izin verir.

Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin Guinea Pig Gözlerinden İzolasyonu

Bu protokol, lokal kaynaklı domuz gözlerinden primer retinal pigment epitel (RPE) hücrelerinin elde edilmesi ve kültürlenmesi prosedürünü özetlemektedir. Bu hücreler, kök hücrelere yüksek kaliteli bir alternatif olarak hizmet eder ve in vitro retinal araştırmalar için uygundur.

İn Vitro Modelleme için Primer Domuz Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

Bu el yazması, fare gözlerinden retinal glial Müller hücrelerini izole etmek için ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır. Protokol, fare gözlerinin enükleasyonu ve diseksiyonu ile başlar, ardından Müller hücrelerinin izolasyonu, tohumlanması ve kültürlenmesi ile devam eder.

Primer Fare Retinal Glial Müller Hücrelerinin İzolasyonu

Retina pigment epiteli (RPE), koroid ve retina arasında çok önemli bir bariyer görevi görür ve fotoreseptörler gibi retina hücre tiplerinin sağlığını ve işlevini destekler. Burada, yetişkin murin RPE'yi izole etmek ve kültürlemek için basit ve etkili bir protokol açıklıyoruz.

Yetişkin Farelerden Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü için Basitleştirilmiş Bir Yöntem

Bu video, siliyer epitelden fare gözün retina kök hücreleri izole kültür ve klonal retina küreler oluşturacak şekilde büyümeye nasıl göstereceğiz. Izole edilmiş kök hücre küre kardinal özelliklere sahip: kendini yenileme ve multipotentiality.

Fare Göz Retina Kök Hücre İzolasyonu

Bu protokol, biz bir Percoll gradyanı kullanılarak trofoblast hücrelerinin izolasyonu takiben gebelik d10.5 üzerinde fare plasenta diseksiyonu tarif. Daha sonra bir Matrigel işgali tayininde izole hücrelerin kullanımını göstermektedir.

Birincil Fare trofoblast hücreleri ve trofoblast invazyonu Assay İzolasyonu

Öğrenin, fare gözlerinden retinal pigmentli epitel hücrelerini izole etme yöntemini. Bu protokol, fotoreseptör fonksiyonu ve yaşla ilişkili maküler dejenerasyon gibi retinal hastalıkları araştırmak için kullanılır.

Primer Fare Retinal Pigmentli Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

Daha fazla video keşfet