Anofellerde Plasmodium falciparum Enfeksiyonunun Tespiti için Standart Membran Besleme Testi

Standart membran besleme testi (SMFA), potansiyel sıtma önleyici bileşiklerin değerlendirilmesi ve tanımlanması için altın standart olarak kabul edilir. Bu yapay besleme sistemi, bu tür bileşiklerin Plasmodium falciparum parazitinin yoğunluğu ve prevalansı üzerindeki etkilerini daha fazla değerlendirmek için sivrisinekleri enfekte etmek için kullanılır.

Protokol, tedavinin Afrika sıtma vektörlerinin sıtma duyarlılığı üzerindeki etkisini tespit etmemizi sağlar. Örneğin, insandan sivrisineğe bulaşmayı engellemeyi amaçlayan bileşikler. Bu teknik, araştırmacıların toksisite GATE'leri mevcut olmadan önce bile, laboratuvar koşullarında çok sayıda bileşiği değerlendirmelerini sağlar.

Midgut diseksiyonları ilk başta zor olabilir, ancak sadece biraz pratik gerektirir. Ayrıca, ookistleri tanımlayabilmek her zaman kolay değildir. İlk olarak, bir ağız aspiratörü kullanarak, 25 adet beslenmemiş dişi Anopheles gambiae sivrisineklerini 350 mililitrelik bir besleme kabına yerleştirin.

Kontrol ve tedavi grupları arasında ayrım yapmak için bardakları açıkça etiketleyin. Dahil edilen teknik kopyaların sayısına göre tedavi başına bardak sayısını seçin. Cam besleyici sistemini bir su banyosuna bağlayın ve sıcaklığı 37 santigrat derecede tutun.

Daha sonra, bağırsağını veya sentetik zarı musluk suyunda durulayarak ve her besleyici için takılı olan parçalara ayırarak hazırlayın. Her besleyicinin alt kısmını örtün ve membranı elastik bir bantla sabitleyin. Besleme kaplarını enfeksiyon kapları olarak kullanmak için, önce zarı bardakların ağlarının üstünde tutun.

Daha sonra enfeksiyon kaplarını besleyicilerin altına yerleştirin. Şimdi, kontrol kaplarının besleyicilerine bir mililitre gametosit ile enfekte olmuş kan ve tedavi kaplarının besleyicilerine bir test bileşiği ile gametosit ile enfekte olmuş kan ekleyin. Sonra sivrisinekleri yaklaşık 40 dakika beslemeye bırakın.

Beslendikten sonra, besleyicileri bardaklardan çıkarın, besleyicileri durulayın ve fazla kanı hipoklorit ile tedavi edin. Ardından, tüm sivrisinekleri bir ila iki dakika boyunca buzun üzerine vurun ve şişmiş ve kırmızı karınları arayarak kan yemeği alan sivrisinekleri seçin. Her enfeksiyon kabına alternatif günlerde verilen şekerli suyu% 10'luk bir şekerli su pedi ile değiştirin ve enfeksiyon bardaklarını sekiz ila 10 gün boyunca bir biyogüvenlik odasında inkübe edin.

Beslenmeden sekiz ila 10 gün sonra, enfekte sivrisinekleri buzun üzerine yerleştirerek yıkın. Daha sonra, bunları% 70 etanol içeren etiketli tüplere aktarın ve her tedavi grubunda kontrolü ayrı tüplerde tutun. Kontrol ve test gruplarını ayrı tutarak, sivrisinekleri filtre kağıdı ile kaplı etiketli Petri kaplarına aktarın.

Uygun şekilde işaretlenmiş bir cam slayta bir damla PBS ekleyin ve filtre kağıdından damlaya bir sivrisinek aktarın. Sivrisinek göğüs kafesini diseksiyon iğnesi ile sabitleyin. Ardından, yedinci karın segmentini forsepslerle çekerek midgutu çıkarın ve yeni bir mikroskop slaytında% 0.1'lik bir merkürokrom damlacığına aktarın.

Bağırsağı sekiz ila 10 dakika lekelenmeye bırakın. Ardından lekeli bağırsağa bir kapak kayması yerleştirin ve 20 ila 40 kat büyütmede parlak alan aydınlatması altında görüntüleyin. Kontrol ve her tedavi grubu için midgut başına ookist sayısını kaydedin.

Bu çalışmada, MMV1581558 bileşiğinin, dişi Anopheles gambiae sivrisineklerinin orta bağırsaklarındaki Plasmodium falciparum ookistlerinin sayısını kontrole kıyasla anlamlı derecede kısıtladığı bulunmuştur. Kontrol grubunda, midguttaki ookistlerin ortalama prevalansı% 89 idi ve midgut başına ortalama 9.5 ookist yoğunluğa sahipti. Ancak MMV1581558 ile tedavi edilen grupta, ortalama ookist prevalansı% 36 idi ve midgut başına ortalama yoğunluk sadece 1.5 ookist idi.

Böylece, MMV1581558 tedavisi, her üç biyolojik replikasyonda da% 58 iletim bloke edici aktivite% 88 ve% 82 iletim azaltıcı aktivite ile sonuçlandı. Sivrisineklerin sağlıklı bir gametosit kültürüyle beslenmesini sağlamak çok önemlidir. Bunlar olgunlaşmamış gametositler ise veya beşinci aşama gametositler değilse, sivrisineklerde enfeksiyon kapma olasılığı sınırlıdır veya imkansızdır.

Tahlil görsel bir morfolojik tanımlama yöntemi kullanır, ancak moleküler niceleme testleri kullanılabilir. Bununla birlikte, bu daha maliyetlidir ve kaynak kısıtlı laboratuvarlarda kullanımlarını sınırlayabilir. Bu tekniği yapabilme yeteneğine sahip olmak, sivrisineklerdeki hemen hemen her şey arasındaki sıtma prevalansının ve yoğunluğunun değişimini değerlendirmek için yeni yollar açar.

Örneğin, türlerin vektörel kapasitesinin karşılaştırılması.