Name: Murin İnce Bağırsak Epitel Organoidlerinin Doğuştan Lenfoid Hücrelerle Ko-Kültürü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-23T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Öğrenin, fare ince bağırsak organoidleri ve doğuştan lenfoid hücrelerle ko-kültür yöntemini kullanarak bağırsak epitel-hücre etkileşimlerini incelemeyi. Bu teknik, gastrointestinal hastalıkların mekanizmalarını anlamak için sağlam bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

E.R., Wellcome Trust'tan doktora bursunu kabul eder (215027 / Z / 18 / Z). G.M.J., Wellcome Trust'tan (203757 / Z / 16 / A) doktora bursunu kabul eder. D.C., NIHR GSTT BRC'den doktora öğrencisi olduğunu kabul eder. J.F.N., Marie Skłodowska-Curie Bursu, Kral Ödülü bursu, RCUK/UKRI Rutherford Fonu bursu (MR/R024812/1) ve Wellcome Trust'tan Bilim Tohum Ödülü (204394/Z/16/Z) kabul eder. Guy's Hospital'da bulunan BRC akış sitometrisi çekirdek ekibine de teşekkür ederiz. Rorc(γt)-GfpTG C57BL/6 muhabir fareleri, G. Eberl'in (Institut Pasteur, Paris, Fransa) cömert bir hediyesiydi. CD45.1 C57BL/6 fareler T. Lawrence (King's College London, Londra) ve P. Barral (King's College London, Londra) tarafından nazikçe verildi.

<ol><li>Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mend+your+fences%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Mend your fences.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).</li>
<li>Peterson, L. W., Artis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+cells%3A+regulators+of+barrier+function+and+immune+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis.</a> Nature Reviews Immunology. 14, 141-153 (2014).</li>
<li>Diefenbach, A., Gnafakis, S., Shomrat, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+lymphoid+cell-epithelial+cell+modules+sustain+intestinal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Innate lymphoid cell-epithelial cell modules sustain intestinal homeostasis.</a> Immunity. 52 (3), 452-463 (2020).</li>
<li>Ebbo, M., Crinier, A., Vély, F., Vivier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+lymphoid+cells%3A+major+players+in+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Innate lymphoid cells: major players in inflammatory diseases.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (11), 665-678 (2017).</li>
<li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+lymphoid+cells%3A+10+years+on%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Innate lymphoid cells: 10 years on.</a> Cell. 174 (5), 1054-1066 (2018).</li>
<li>Klose, C. S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+type+1+ILCs+from+a+common+progenitor+to+all+helper-like+innate+lymphoid+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of type 1 ILCs from a common progenitor to all helper-like innate lymphoid cell lineages.</a> Cell. 157 (2), 340-356 (2014).</li>
<li>Bernink, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-12+and+-23+control+plasticity+of+CD127%2B+group+1+and+group+3+innate+lymphoid+cells+in+the+intestinal+lamina+propria%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Interleukin-12 and -23 control plasticity of CD127+ group 1 and group 3 innate lymphoid cells in the intestinal lamina propria.</a> Immunity. 43 (1), 146-160 (2015).</li>
<li>Jowett, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ILC1+drive+intestinal+epithelial+and+matrix+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">ILC1 drive intestinal epithelial and matrix remodelling.</a> Nature Materials. 20 (2), 250-259 (2020).</li>
<li>Wong, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+ROR%CE%B1+is+critical+for+nuocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transcription factor RORα is critical for nuocyte development.</a> Nature Immunology. 13, 229-236 (2012).</li>
<li>Neill, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuocytes+represent+a+new+innate+effector+leukocyte+that+mediates+type-2+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nuocytes represent a new innate effector leukocyte that mediates type-2 immunity.</a> Nature. 464, 1367-1370 (2010).</li>
<li>Mjösberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+GATA3+is+essential+for+the+function+of+human+type+2+innate+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The transcription factor GATA3 is essential for the function of human type 2 innate lymphoid cells.</a> Immunity. 37 (4), 649-659 (2012).</li>
<li>Hoyler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+GATA-3+controls+cell+fate+and+maintenance+of+type+2+innate+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells.</a> Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-25-responsive%2C+lineage-negative+KLRG1hi+cells+are+multipotential+%27inflammatory%27+type+2+innate+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1hi cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells.</a> Nature Immunology. 16, 161-169 (2014).</li>
<li>von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuft-cell-derived+IL-25+regulates+an+intestinal+ILC2-epithelial+response+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit.</a> Nature. 529, 221-225 (2016).</li>
<li>Gerbe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+tuft+cells+initiate+type+2+mucosal+immunity+to+helminth+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites.</a> Nature. 529, 226-230 (2016).</li>
<li>Eberl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+function+for+the+nuclear+receptor+RORgamma%28t%29+in+the+generation+of+fetal+lymphoid+tissue+inducer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">An essential function for the nuclear receptor RORgamma(t) in the generation of fetal lymphoid tissue inducer cells.</a> Nature Immunology. 5, 64-73 (2004).</li>
<li>Spits, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+lymphoid+cells--a+proposal+for+uniform+nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Innate lymphoid cells--a proposal for uniform nomenclature.</a> Nature Reviews Immunology. 13, 145-149 (2013).</li>
<li>Mebius, R. E., Rennert, P., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+lymph+nodes+collect+CD4%2BCD3-+LTbeta%2B+cells+that+can+differentiate+to+APC%2C+NK+cells%2C+and+follicular+cells+but+not+T+or+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Developing lymph nodes collect CD4+CD3- LTbeta+ cells that can differentiate to APC, NK cells, and follicular cells but not T or B cells.</a> Immunity. 7 (4), 493-504 (1997).</li>
<li>Lindemans, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-22+promotes+intestinal-stem-cell-mediated+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interleukin-22 promotes intestinal-stem-cell-mediated epithelial regeneration.</a> Nature. 528 (7583), 560-564 (2015).</li>
<li>Meininger, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+features+of+innate+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific features of innate lymphoid cells.</a> Trends in Immunology. 41 (10), 902-917 (2020).</li>
<li>Dutton, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+innate+lymphoid+cell+populations+at+different+sites+in+mice+with+defective+T+cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Wellcome+Open+Research%22%5BJournal%5D)">Characterisation of innate lymphoid cell populations at different sites in mice with defective T cell immunity.</a> Wellcome Open Research. 2, 117(2018).</li>
<li>Bal, S. M., Golebski, K., Spits, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+innate+lymphoid+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Plasticity of innate lymphoid cell subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 20, 552-565 (2020).</li>
<li>Bernink, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+type+1+innate+lymphoid+cells+accumulate+in+inflamed+mucosal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human type 1 innate lymphoid cells accumulate in inflamed mucosal tissues.</a> Nature Immunology. 14, 221-229 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Ootani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+in+vitro+intestinal+epithelial+culture+within+a+Wnt-dependent+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche.</a> Nature Medicine. 15 (6), 701-706 (2009).</li>
<li>Gjorevski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+matrices+for+intestinal+stem+cell+and+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture.</a> Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+mouse+small+intestinal+epithelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 945, Clifton, N.J. 319-328 (2012).</li>
<li>Date, S., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-gut+organoids%3A+reconstitution+of+the+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mini-gut organoids: reconstitution of the stem cell niche.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 269-289 (2015).</li>
<li>Bartfeld, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+infectious+diseases+and+host-microbe+interactions+in+gastrointestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Modeling infectious diseases and host-microbe interactions in gastrointestinal organoids.</a> Developmental Biology. 420 (2), 262-270 (2016).</li>
<li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3D+organoid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li>
<li>Tallapragada, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflation-collapse+dynamics+drive+patterning+and+morphogenesis+in+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Inflation-collapse dynamics drive patterning and morphogenesis in intestinal organoids.</a> Cell Stem Cell. 28 (9), 1516-1532 (2021).</li>
<li>Qiu, Z., Sheridan, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+lymphocytes+from+the+mouse+small+intestinal+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolating lymphocytes from the mouse small intestinal immune system.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e57281(2018).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell%3A+mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).</li>
<li>O'Rourke, K. P., Ackerman, S., Dow, L. E., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+maintenance+of+mouse+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and maintenance of mouse intestinal stem cells.</a> Bio-protocol. 6 (4), 1733(2016).</li>
<li>Serra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+and+symmetry+breaking+in+intestinal+organoid+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development.</a> Nature. 569 (7754), 66-72 (2019).</li>
<li>Lukonin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+landscape+of+intestinal+organoid+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration.</a> Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).</li>
<li>Cardoso, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+regulation+of+type+2+innate+lymphoid+cells+via+neuromedin+U%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuronal regulation of type 2 innate lymphoid cells via neuromedin U.</a> Nature. 549 (7671), 277-281 (2017).</li>
<li>Gury-BenAri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spectrum+and+regulatory+landscape+of+intestinal+innate+lymphoid+cells+are+shaped+by+the+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The spectrum and regulatory landscape of intestinal innate lymphoid cells are shaped by the microbiome.</a> Cell. 166 (5), 1231-1246 (2016).</li>
<li>Seehus, C., Kaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+murine+innate+lymphoid+cells+from+common+lymphoid+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of murine innate lymphoid cells from common lymphoid progenitor cells.</a> Bio-protocol. 6 (6), 1770(2016).</li>
</ol>

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Bu protokol, murin ince bağırsak organoidlerinin oluşturulması, bağırsak ayrışma protokolü sırasında lenfosit kaybını en aza indirgeyerek nadir ILC1'in izole edilmesi ve bu iki bölme arasında ko-kültürlerin oluşturulması yöntemlerini açıklamaktadır. Bu protokol için birçok adım vardır ve bazıları ILC1'lere özgü olsa da, bu yaklaşım diğer bağırsak bağışıklık hücresi tiplerine uygulanabilir ve ko-kültür kurulumları bireysel araştırma sorularına uyacak şekilde modüler olarak uyarlanabilir. Birkaç kritik adım (sapmaması öner...

Bağırsak epiteli ve bağırsakta yerleşik bağışıklık sistemi arasındaki iletişim, bağırsak homeostazının korunmasında merkezidir1. Bu etkileşimlerdeki bozulmalar, İnflamatuar Bağırsak Hastalığı (IBD) ve gastrointestinal kanserler dahil olmak üzere hem lokal hem de sistemik hastalıklarla ilişkilidir2. Homeostazın yakın zamanda tanımlanan kritik bir düzenleyicisinin dikkate değer bir örneği, bağırsak bağışıklık manzarasında kilit oyuncular olarak ortaya çıkan doğuştan gelen lenfoid hücrelerin (ILC'ler) çalışmasından kaynaklanmaktadır3. ILC'ler, bağırsak homeostazını düzenleyen ve inflamasyonu büyük ölçüde sitokin aracılı sinyalizasyon yoluyla düzenleyen heterojen doğuştan gelen bir immün hücre grubudur4.
Murin ILC'ler genel olarak transkripsiyon faktörü, reseptör ve sitokin ekspresyon profillerine göre alt tiplere ayrılır5. Sitotoksik Doğal Öldürücü (NK) hücreleri ve yardımcı benzeri tip-1 ILC'leri (ILC1'ler) içeren Tip-1 ILC'ler, sırasıyla T hücrelerinde (T-bet)6 ekspresyonlu transkripsiyon faktörü (eomezodermin) Eomes ve T-box proteininin ekspresyonu ile tanımlanır ve T yardımcı tip-1 (TH1) bağışıklığı ile ilişkili sitokinleri salgılar: interlökin (IL)-12'ye yanıt olarak interferon-γ (IFNγ) ve tümör nekroz faktörü (TNF), IL-15 ve IL-187. Homeostaz sırasında, dokuda yerleşik ILC1'ler, epitel proliferasyonunu ve matris yeniden modellemesini sağlamak için Transforme Edici Büyüme Faktörü β (TGF-β) salgılar8. Tip-2 ILC'ler (ILC2'ler) öncelikle helmint enfeksiyonuna T yardımcı tip-2 (TH2) ile ilişkili sitokinlerin salgılanması yoluyla yanıt verir: IL-4, IL-5 ve IL-13 ve retinoik asitle ilişkili yetim reseptör (ROR) α (ROR-α)9 ve GATA Bağlayıcı Protein 3 (GATA-3)10,11,12 ekspresyonu ile karakterizedir. . Farelerde, bağırsak "enflamatuar" ILC2'ler, epitel tutam-hücresi kaynaklı IL-25 14,15'e yanıt verdikleri Öldürücü hücre lektin benzeri reseptörün (alt aile G üyesi 1, KLRG)13 ekspresyonu ile karakterize edilir. Son olarak, lenfoid doku indükleyici hücreleri ve yardımcı benzeri tip-3 ILC'leri (ILC3'ler) içeren tip-3 ILC'ler, transkripsiyon faktörü ROR-γt16'ya bağımlıdır ve lokal IL-1β ve IL-23 sinyallerine yanıt olarak Granülosit Makrofaj Kolonisi Uyarıcı Faktörü (GM-CSF), IL-17 veya IL-22 salgılayan gruplara ayrılır17. Lenfoid doku indükleyici hücreler Peyer'in yamalarında kümelenir ve gelişim sırasında bu ikincil lenfoid organların gelişimi için çok önemlidir18, ILC3'ler ise erişkin murin ince bağırsak lamina propriasında en bol ILC alt tipidir. ILC3'lü en eski murin intestinal organoid ko-kültür sistemlerinden biri, sitokin IL-22'nin Sinyal Dönüştürücü ve Transkripsiyon Aktivatörü 3 (STAT-3) aracılı Lösin Bakımından Zengin Tekrar İçeren G Protein Eşleşmiş Reseptör 5 (Lgr5) + bağırsak kök hücre proliferasyonu19 üzerindeki etkisini ayırmak için kullanıldı. rejeneratif ILC-epitel etkileşiminin güçlü bir örneği. ILC'ler organlar arasında damga-heterojenlik sergiler 20,21 ve polarize edici sitokinlere yanıt olarak alt kümeler arasında plastisite sergiler22. Bu dokuya özgü izleri ve plastisite farklılıklarını yönlendiren ve IBD23 gibi kronik hastalıklarda hangi rolü oynadıkları, organoid ortak kültürleri kullanılarak ele alınabilecek heyecan verici konular olmaya devam etmektedir.
İntestinal organoidler, intestinal epitel24,25'i incelemek için başarılı ve güvenilir bir model olarak ortaya çıkmıştır. Bunlar, bağırsak epitelyal Lgr5 + kök hücrelerinin veya Wnt Ailesi Üyesi 3A'nın (Wnt3a) endojen bir kaynağı olarak Paneth hücrelerini içeren tüm izole kriptoların kültürlenmesiyle üretilir. Bu 3D yapılar, sentetik hidrojeller26'da veya bazal lamina propria'yı taklit eden biyomalzemelerde, örneğin Termal-çapraz bağlanan Bazal Hücre Dışı Matriks'te (TBEM) korunur ve ayrıca çevredeki nişi, özellikle Epitel Büyüme Faktörünü (EGF), Kemik Morfogenetik Protein (BMP) inhibitörü Noggin'i ve bir Lgr5-ligand ve Wnt-agonisti R-Spondin127'yi taklit eden büyüme faktörleri ile desteklenir. . Bu koşullar altında, organoidler epitelyal apiko-bazal polariteyi korur ve bağırsak epitelinin kript-villus yapısını, organoidin merkezindeki emici ve salgısal hücrelere terminal olarak farklılaşan tomurcuklanan kök hücre kriptleri ile özetler, daha sonra anoikis28 tarafından iç psödölümenin içine dökülür. Her ne kadar bağırsak organoidleri tek başına epitel gelişiminin indirgemeci modelleri ve izolasyondaki dinamikler olarak büyük ölçüde avantajlı olsa da29,30, bu davranışların bağışıklık bölmesi tarafından nasıl düzenlendiğini, etkilendiğini ve hatta bozulduğunu anlamak için muazzam bir gelecek potansiyeline sahiptir.
Aşağıdaki protokolde, murin ince bağırsak organoidleri ve lamina propria türevi ILC1'ler arasında, bu popülasyonun inflamasyonun bağırsak imzalarını beklenmedik bir şekilde nasıl azalttığını ve bunun yerine bu sistemde TGF-β yoluyla epitel proliferasyonunun artmasına katkıda bulunduğunu tanımlamak için kullanılan bir ko-kültür yöntemi tanımlanmıştır8.

<table><tbody><tr><td><güçlü >Reaktifler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare CD45 (BV510)</td><td>BioLegend</td><td>103137</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare NK1.1 (PE)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-5941-83</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Takviyesi (50X), serum içermeyen</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>CD127 Monoklonal Antikor (APC)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-1271-82</td><td></td></tr><tr><td>CD19 Monoklonal Antikor (eFluor 450)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-0193-82</td><td></td></tr><tr><td>CD3e Monoklonal Antikor (eFluor 450)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-0051-82</td><td></td></tr><tr><td>CD5 Monoklonal Antikor (eFluor 450)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-0031-82</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris</td><td>4423/10</td><td></td></tr><tr><td>COLLAGEN D, 500MG</td><td>Merck</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T Hücreleri</td><td>Hücre hattı, şartlandırılmış RSpondin1 süpernatantını hasat etmek için kullanıldı, hücre hattı ve Malzeme Transfer Anlaşması, Lelands Stanford Junior Üniversitesi Mütevelli Heyeti (Calvin Kuo, MD, PhD, Stanford Üniversitesi) tarafından sağlandı.</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>DISPASE II (NÖTR PROTEAZ, DERECE II)</td><td>Merck</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco'nun Modifiye Eagle Orta Besin Karışımı F-12 (Gelişmiş DMEM/F12)</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DNASE I, DERECE II</td><td>Merck</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (1X)</td><td>Gibco</td><td>21969-035</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamin Tetraasetat Asit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP2482-100</td><td></td></tr><tr><td>FC blok</td><td>2B Scientific</td><td>BE0307</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu, nitelikli, inaktive</td> edilmiş <td>Gibco</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100X)</td><td>Gibco</td><td>3050-038</td><td></td></tr><tr><td>Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (10X)</td><td>Gibco</td><td>14065056</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (1X)</td><td>Gibco</td><td>12549069</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293T- mNoggin-Fc Hücreler</td><td>Hücre hattı, Hubrecth Enstitüsü, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, Hollanda ile Malzeme Transfer Anlaşması yoluyla elde edilen hücre hattı olan koşullu Noggin süpernatantını hasat etmek için kullanıldı ve Farin, Van Es ve Clevers Gastroenterology (2012) tarafından yapılan yayına dayanmaktadır.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES Tampon Çözeltisi (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>KLRG1 Monoklonal Antikor (PerCP eFluor-710)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-5893-82</td><td></td></tr><tr><td>Canlı/Ölü Sabitlenebilir Mavi Ölü Hücre Leke Kiti, UV uyarımı için</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L23105</td><td></td></tr><tr><td>Ly-6G/Ly-6C Monoklonal Antikor (eFluor 450)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Büyüme Faktörü Azaltılmış Bazal Membran Matrisi, Fenol Kırmızısı İçermeyen, LDEV İçermeyen</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Takviyesi (100X)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-asetilsistein (500mM)</td><td>Merck</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>NKp46 Monoklonal Antikor (PE Siyanin7)</td><td>Thermo Fisher</td><td>25-3351-82</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1 X) 7.2 pH</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>12549079</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td>Gibco</td><td>70013032</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Cytiva</td><td>17089101</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan EGF, Hayvansız Protein</td><td>R& D Sistemleri</td><td>AFL236</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan IL-15 GMP Proteini, CF R</td><td>& D Systems</td><td>247-GMP</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan IL-2 (taşıyıcısız)</td><td>BioLegend</td><td>589106</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Fare IL-7 (taşıyıcısız)</td><td>R& D Systems</td><td>407-ML-005 / CF</td><td></td></tr><tr><td>UltraComp eBeads</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>01-2222-42</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dihidroklorür (ROCK inhibitörü)</td><td>Bio-techne</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Plastikler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL tüp</td><td>Falcon</td><td>10788561</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL tüp</td><td>Eppendorf</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>10 mL pippette</td><td>StarLab</td><td>E4860-0010</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tüp</td><td>Falcon</td><td>11507411</td><td></td></tr><tr><td>25 mL pippette</td><td>StarLab</td><td>E4860-0025</td><td></td></tr><tr><td>p10 pippette uçları</td><td>StarLab</td><td>S1121-3810-C</td><td></td></tr><tr><td>p1000 pippette uçları</td><td>StarLab</td><td>I1026-7810</td><td></td></tr><tr><td>p200 pippette uçları</td><td>StarLab</td><td>E1011-0921</td><td></td></tr><tr><td>Standart doku kültürü ile tedavi edilmiş 24 oyuklu plaka</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Ekipman</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>CO2 ve sıcaklık kontrollü inkübatör</td><td>Eppendorf</td><td>Galaxy 170 R/S</td><td></td></tr><tr><td>Akış Destekli Hücresel Sıralayıcı</td><td>BD ekipmanı</td><td>FACS Aria II</td><td></td></tr><tr><td>Isıtmalı çalkalayıcı</td><td>Stuart Ekipmanları</td><td>SI500</td><td></td></tr><tr><td>Buz kutusu</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Ters çevrilmiş ışık mikroskobu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EVOS XL Çekirdek Görüntüleme Sistemi (AMEX1000)</td><td></td></tr> <tr><td>p10 pippette</td><td>Eppendorf</td><td>3124000016</td><td></td></tr><tr><td>p1000 pippette</td><td>Eppendorf</td><td>3124000063</td><td></td></tr><tr><td>p200 pippette</td><td>Eppendorf</td><td>3124000032</td><td></td></tr><tr><td>Pippette tabancası</td><td>Eppendorf</td><td>4430000018</td><td></td></tr><tr><td>Islak buz</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

murin İnce bağırsak epitel organoidlerinin doğuştan lenfoid hücrelerle ko-kültürü

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

Organoidlerin bağışıklık hücreleri ile karmaşık ko-kültürleri, mukozal homeostazın hassas dengesini destekleyen çift yönlü etkileşimleri sorgulamak için çok yönlü bir araç sağlar. Bu 3D, çok hücreli sistemler, çok faktörlü hastalıkları ele almak ve dokuda yerleşik doğuştan gelen lenfoid hücreler (ILC'ler) gibi nadir hücre tiplerini incelerken ortaya çıkan teknik zorlukları çözmek için indirgemeci bir model sunar. Bu makalede, ince bağırsak organoidlerini ve ince bağırsak lamina propria'dan türetilmiş yardımcı benzeri tip-1 ILC'leri (ILC1'ler) birleştiren ve diğer ILC veya immün popülasyonlara kolayca genişletilebilen bir murin sistemi anlatılmaktadır. ILC'ler, homeostazı teşvik ettikleri ve hasar veya enfeksiyona hızla yanıt verdikleri mukozada özellikle zenginleştirilmiş dokuda yerleşik bir popülasyondur. ILC'lerle organoid ko-kültürleri, bağırsaktaki yeni epitelyal-immün sinyal modüllerine ışık tutmaya başlamış ve farklı ILC alt kümelerinin bağırsak epitel bariyeri bütünlüğünü ve rejenerasyonunu nasıl etkilediğini ortaya koymuştur. Bu protokol, mukozal homeostaz ve inflamasyon mekanizmaları hakkında yeni bilgiler sağlama potansiyeline sahip epitel ve bağışıklık hücreleri arasındaki karşılıklı etkileşimler hakkında daha fazla araştırma yapılmasını sağlayacaktır.

Başarılı bir şekilde tamamlandığında, yeni izole edilmiş kriptler 2-4 gün içinde tomurcuklanan kript yapıları oluşturmalıdır (Şekil 1A). Sağlıklı ve sağlam organoid kültürler aktif olarak büyümelidir ve protokolde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi geçirilebilir ve genişletilebilir.
Bu protokol, ince bağırsak ILC1'in RORγtGFP murin transgenik raporlayıcı hattından izolasyonunu açıklar ve bu da canlı ILC1'in FACS tarafından izole edilmesini sağlar (<stron...

Bu protokol, murin ince bağırsak organoidlerinin oluşturulması, tip-1 doğuştan gelen lenfoid hücrelerin murin ince bağırsak lamina propriasından izole edilmesi ve bağırsak epitel hücreleri ile tip-1 doğuştan gelen lenfoid hücreler arasındaki çift yönlü etkileşimleri incelemek için her iki hücre tipi arasında 3 boyutlu (3D) ortak kültürlerin oluşturulması için ayrıntılı talimatlar sunmaktadır.

Murin İnce Bağırsak Epitel Organoidlerinin Doğuştan Lenfoid Hücrelerle Ko-Kültürü

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate ...

Bu protokol, bağırsak bağışıklık hücreleri ve epitel arasındaki etkileşimleri incelemek ve bu etkileşimlerin bağırsak homeostazı ve inflamasyonunda nasıl düzenlenebileceğini incelemek için önemli bir araç sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, epitel ve immün biyolojideki soruları ele almak için kullanılabilecek in vitro modelin azaltılmasıyla kolaylaştırılan mükemmel miktarda deneysel kontroldür. Bu sistem, CD44-pozitif epitel kriptlerinin genişlemesinde ILC1'in rolünü belirlemek için zaten kullanılmıştır ve inflamasyon aracılı gastrointestinal hastalıklar hakkındaki anlayışımızı daha da ilerletme potansiyeline sahiptir.Başlamak için, çözülmesi için buzun üzerine termal çapraz bağlanan bazal hücre dışı matrisi yerleştirin ve standart bir doku kültürü ile muamele edilmiş 24 delikli plakayı 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirerek önceden ısıtın. Daha sonra, organoidler içeren plakayı inkübatörden çıkarın ve ortamı geçilecek kuyudan atın. Daha sonra, kuyucuklara 500 mikrolitre buz gibi soğuk gelişmiş DMEM F12 ekleyin ve bir P-1000 ucu kullanarak, organoidleri tüm kuyucuklardan 15 mililitrelik bir tüpe toplayın.Kuyucukların dibini 250 ila 300 mikrolitre buz gibi soğuk gelişmi

co-culture-murine-small-intestine-epithelial-organoids-with-innate

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video protokolünde, primer intestinal epitel organoidlerinde lentiviral transdüksiyonun ve bu kültürlerin kantitatif RT-PCR, RNA-mikroarray ve immünohistokimya ile işlenmesi ve aşağı akış analizinin adım adım açıklamasını veriyoruz.

Lentiviral İletim ve Bağırsak Organoids Mansabında Analizi için Protokol

Kök hücre türevli kültürler, bulaşıcı hastalıkları modellemek için muazzam bir potansiyel barındırıyor. Burada, yetişkin kök hücrelerden türetilen fare ve insan mide organoidlerinin kültürü anlatılmaktadır. Organoidlere mide patojeni Helicobacter pylori mikroenjekte edilir.

Enfeksiyon Hastalıkları Modeli Olarak Organoids: Helicobacter Pylori ve İnsan Kültür ve kemirgen Mide Organoids ve Mikroenjeksiyon

Burada, hasat korumak ve patojen ilişkili moleküler modelleri (PAMPS) ve Listeria monocytogenes fare ince bağırsak organoids tedavisi için bir protokol da gen ifadesi ve protein için uygun normalizasyon ağırlıklı olarak, tarif edilmektedir.

<em&gt; Ex Vivo</emFare Bağırsak Organoids ve&gt; Kültür ve Desen Tanıma Reseptör Uyarım

Bu protokolde, murine primer epitel kolon monolayerlerinin doğrudan bağırsak mahzenlerinden nasıl üretılacağını açıklıyoruz. Geçirgen filtreler üzerinde birleştirici monolayerler, çizik yarası iyileşmesi ve biyokimyasal çalışmalar için birikme monolayerleri ve immünofluoresans analizi için seyrek ve birleştirici monolayerler üretmek için deneysel yaklaşımlar sunuyoruz.

Bağırsak Mezarlarından Murine Primer Kolon Epitel Monolayerlerinin Üretimi

Burada bağırsak apikal spesifik etkileşimlerin modellenmesine izin veren iki protokol sunuyoruz. Organoid türevli bağırsak monolayerleri ve Hava-Sıvı Arayüzü (ALI) kültürleri, hem aydınlık hem de bazolateral taraflardan erişilebilen iyi ayırt edilmiş epitellerin üretilmesini kolaylaştırırken, polarite ters bağırsak organoidleri apikal yanlarını ortaya çıkarır ve yüksek verim testlerine uygundur.

Bağırsak Organoid Modellerini Kullanarak Apikal Spesifik Etkileşimleri İncelemek için Kültür Yöntemleri

Bu protokol, bir klodin-7 nakavt modelinde kolonik kök hücrelerin aktivitesini ve işleyişini incelemek için bir murin kolonik organoid sisteminin kurulmasını açıklamaktadır.

Bağırsak Kök Hücre Fonksiyonunu Incelemek için Murin Kolonik Kriptlerinin Üç Boyutlu Kültürü Ex Vivo

Burada, kriyokorunmuş epitel kriptlerinden domuz bağırsak 3D organoidlerini kültürlemek için bir protokol açıklıyoruz. Ayrıca, epitel hücrelerinin apikal tarafına erişime izin veren 3D organoidlerden türetilen hücre monokatmanları oluşturmak için bir yöntem de açıklıyoruz.

Kriyokorunmuş Epitel Kriptlerinden Domuz Yavrusu Bağırsak 3D Organoidlerinin Kültürü ve Hücre Tek Katmanlarının Oluşturulması

Murin ince bağırsak kriptlerini ve kültür bağırsak 3D organoidlerini kriptlerden izole etmek için bir protokol tarif ediyoruz. Ek olarak, bir alt epitelyal hücresel nişin yokluğunda tek bir bağırsak kök hücresinden organoidler üretmek için bir yöntem tarif ediyoruz.

Murin Bağırsak Kriptlerinden Organoidlerin 3D Kültürlenmesi ve Organoid Araştırmaları için Tek Bir Kök Hücre

Çalışma, doku kök hücresinden türetilen bağırsak organoidleri kullanılarak bakteriyel enfeksiyonun in vitro incelenmesi için bir yöntem sunmaktadır. Protokol, organoidlerin iki boyutta nasıl kültürleneceğini ve farklılaştırılacağını, onları yapışkan-invaziv Escherichia coli ile enfekte edeceğini ve epitel bariyer sızıntısı, enfeksiyon görüntüleme ve epitel RNA yanıtı gibi önemli okumaları nasıl değerlendireceğini açıklar.

Konak-bakteri etkileşimlerini incelemek için invazin veya bazal zar ekstraktı üzerine iki boyutlu organoid kültürü

İki raporlayıcı stratejiye uygulanan konfokal görüntüleme ve takip boru hatlarını açıklıyoruz: bireysel hücre davranışını çözmek için mozaik organoidler ve insan ve fare bağırsak organoidlerinde hücre tipi geçişlerini izlemek için fate reporter organoidler.

İnsan ve fare bağırsak organoidlerinde klonal dinamikleri ve kader geçişlerini izlemek için canlı hücre görüntüleme ve tek hücreli takip

Öğrenin, fare ince bağırsak organoidleri ve doğuştan lenfoid hücrelerle ko-kültür yöntemini kullanarak bağırsak epitel-hücre etkileşimlerini incelemeyi. Bu teknik, gastrointestinal hastalıkların mekanizmalarını anlamak için sağlam bir model sunar.

Murin İnce Bağırsak Epitel Organoidlerinin Doğuştan Lenfoid Hücrelerle Ko-Kültürü

Daha fazla video keşfet