Name: Memeli Hücre Lisatlarında E3 Ubikitin-ligaz ile Substrat Ubikitilasyonunun Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Öğrenin, memeli hücrelerinde E3 ubikitin-ligaz ile substrat ubikitilasyonunu değerlendirme yöntemini. HEK293T hücre hatları, immünopresipitasyon ve Western blot kullanılarak kanser ve nörolojik bozukluklarda tedavi stratejileri geliştirilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

F.R.T, FAPESP hibe numarası 2020/15771-6 ve CNPq Universal 405836/2018-0 tarafından desteklenmektedir. P.M.S.P ve V.S, CAPES tarafından desteklenmektedir. C.R.S.T.B.C, 2019/23466-1 sayılı FAPESP burs numarası ile desteklenmiştir. Sandra R. C. Maruyama'ya (FAPESP 2016/20258-0) maddi destek için teşekkür ederiz.

NOT: Memeli hücrelerinde ubikitilasyon tahlil protokolüne genel bir bakış Şekil 1'de gösterilmiştir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63561/63561fig01.jpg"> Şekil 1. Ubiquitilasyon testi prosedürüne genel bakış. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63561/63561fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
1. Hücre kültürü
<ol><li>HEK293T hücre hattını 100 mm TC ile muamele edilmiş bir kültür kabında büyüme ortamında% 80-90 oranında birleşime (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) yüksek glikozu,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve penisilin (100 ünite), streptomisin (100 μg) ve L-glutamin (0.292 mg / mL) ile desteklenmiştir) ile güçlendirin. Kültürü nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de% 5 CO2'de inkübe edin.</li>
	<li>Hücreleri geçmek için, serolojik bir pipet kullanarak medyayı kültür kabından aspire edin. Hücreleri bir kez 1 mL sterilize edilmiş 1x fosfat tamponlu salin (PBS 1x) ile yıkayın.</li>
	<li>1 mL tripsin / EDTA (etilendiamintetraasetik asit) çözeltisi ekleyerek hücreleri ayırın. Çanağı 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. 2 mL büyüme ortamında serolojik bir pipet kullanarak hücreleri yeniden askıya alın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu taze ve temiz bir 15 mL tüpe aktarın ve oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı dikkatlice dökerek çıkarın. Homojen bir hücre süspansiyonu elde etmek için hücre peletini yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre peletini 3 mL büyüme ortamında nazikçe yeniden askıya alın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunun 1 mL'sini, 9 mL büyüme ortamı içeren 100 mm TC ile işlenmiş bir kültür kabına aktarın. NOT: Hücreler iyi durumdaysa, birleşmenin% 80 -% 90 olduğu HEK293T'nin her kültür kabı, geçişten 2 gün sonra% 80 birleşimli üç kültür kabı üretebilir.</li>
</ol>2. Hücre transfeksiyonu
<ol><li><li><ol><li> </li><li> </li></ol></li><li></li><li></li></ol><ol><li></li><li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li><li></li><li><li></li><li></li><li> </li><li> </li></ol>

<ol><li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).</li>
<li>Callis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitination+machinery+of+the+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+Arabidopsis+Book%22%5BJournal%5D)">The ubiquitination machinery of the ubiquitin system.</a> The Arabidopsis Book. 12, 0174(2014).</li>
<li>Koegl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+ubiquitination+factor%2C+E4%2C+is+involved+in+multiubiquitin+chain+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly.</a> Cell. 96 (5), 635-644 (1999).</li>
<li>French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+functions+of+branched+ubiquitin+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Discovery%22%5BJournal%5D)">Emerging functions of branched ubiquitin chains.</a> Cell Discovery. 7 (1), 6(2021).</li>
<li>Komander, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+discrimination+of+structurally+equivalent+Lys+63-linked+and+linear+polyubiquitin+chains%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Molecular discrimination of structurally equivalent Lys 63-linked and linear polyubiquitin chains.</a> EMBO Reports. 10 (5), 466-473 (2009).</li>
<li>Clague, M. J., Urbé, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin%3A+Same+molecule%2C+different+degradation+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways.</a> Cell. 143 (5), 682-685 (2010).</li>
<li>Davies, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vps9p+CUE+domain+ubiquitin+binding+is+required+for+efficient+endocytic+protein+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Vps9p CUE domain ubiquitin binding is required for efficient endocytic protein traffic.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19826-19833 (2003).</li>
<li>Raasi, S., Wolf, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+receptors+and+ERAD%3A+A+network+of+pathways+to+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin receptors and ERAD: A network of pathways to the proteasome.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 18 (6), 780-791 (2007).</li>
<li>Pan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+Ubr1-mediated+N-degron+polyubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural insights into Ubr1-mediated N-degron polyubiquitination.</a> Nature. 600 (7888), 334-338 (2021).</li>
<li>Raducu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF+%28Fbxl17%29+ubiquitylation+of+Sufu+regulates+Hedgehog+signaling+and+medulloblastoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">SCF (Fbxl17) ubiquitylation of Sufu regulates Hedgehog signaling and medulloblastoma development.</a> The EMBO Journal. 35 (13), 1400-1416 (2016).</li>
<li>Spagnol, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+E3+ubiquitin+ligase+SCF%28Fbxo7%29+mediates+proteasomal+degradation+of+UXT+isoform+2+%28UXT-V2%29+to+inhibit+the+NF-%CE%BAB+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">The E3 ubiquitin ligase SCF(Fbxo7) mediates proteasomal degradation of UXT isoform 2 (UXT-V2) to inhibit the NF-κB signaling pathway.</a> Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1865 (1), 129754(2021).</li>
<li>Teixeira, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gsk3%CE%B2+and+Tomm20+are+substrates+of+the+SCFFbxo7%2FPARK15+ubiquitin+ligase+associated+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Gsk3β and Tomm20 are substrates of the SCFFbxo7/PARK15 ubiquitin ligase associated with Parkinson's disease.</a> Biochemical Journal. 473 (20), 3563-3580 (2016).</li>
<li>Tan, M. K. M., Lim, H. J., Bennett, E. J., Shi, Y., Harper, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+SCF+adaptor+capture+proteomics+reveals+a+role+for+SCFFBXL17+in+NRF2+activation+via+BACH1+repressor+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Parallel SCF adaptor capture proteomics reveals a role for SCFFBXL17 in NRF2 activation via BACH1 repressor turnover.</a> Molecular Cell. 52 (1), 9-24 (2013).</li>
<li>van Wijk, S. J., Fulda, S., Dikic, I., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+ubiquitination+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Visualizing ubiquitination in mammalian cells.</a> EMBO Reports. 20 (2), 1-18 (2019).</li>
<li>Kisselev, A. F., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+inhibitors%3A+From+research+tools+to+drug+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteasome inhibitors: From research tools to drug candidates.</a> Chemistry and Biology. 8 (8), 739-758 (2001).</li>
<li>Bradford, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 228, 726-734 (1970).</li>
<li>Schröer, A., Schneider, S., Ropers, H. -H., Nothwang, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+UXT%2C+a+novel+gene+in+human+Xp11%2C+which+is+widely+and+abundantly+expressed+in+tumor+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of UXT, a novel gene in human Xp11, which is widely and abundantly expressed in tumor tissue.</a> Genomics. 56 (3), 340-343 (1999).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UXT-V1+facilitates+the+formation+of+MAVS+antiviral+signalosome+on+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">UXT-V1 facilitates the formation of MAVS antiviral signalosome on mitochondria.</a> The Journal of Immunology. 188 (1), 358-366 (2012).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UXT-V1+protects+cells+against+TNF-induced+apoptosis+through+modulating+complex+II+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">UXT-V1 protects cells against TNF-induced apoptosis through modulating complex II formation.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (8), 1389-1397 (2011).</li>
<li>Sun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UXT+is+a+novel+and+essential+co-factor+in+the+NF-%CE%BAB+transcriptional+enhanceosome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">UXT is a novel and essential co-factor in the NF-κB transcriptional enhanceosome.</a> The Journal of Cell Biology. 178 (2), 231-244 (2007).</li>
<li>Huang, X., Dixit, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugging+the+undruggables%3A+Exploring+the+ubiquitin+system+for+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Drugging the undruggables: Exploring the ubiquitin system for drug development.</a> Cell Research. 26 (4), 484-498 (2016).</li>
<li>Rajkumar, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+myeloma%3A+2020+update+on+diagnosis%2C+risk-stratification+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Multiple myeloma: 2020 update on diagnosis, risk-stratification and management.</a> American Journal of Hematology. 95 (5), 548-567 (2020).</li>
<li>Hideshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proteasome+inhibitor+PS-341+inhibits+growth%2C+induces+apoptosis%2C+and+overcomes+drug+resistance+in+human+multiple+myeloma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The proteasome inhibitor PS-341 inhibits growth, induces apoptosis, and overcomes drug resistance in human multiple myeloma cells.</a> Cancer Research. 61 (7), 3071-3076 (2001).</li>
<li>Tietsche, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+proteasome+inhibitors+in+the+treatment+of+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology%2C+Transfusion+and+Cell+Therapy%22%5BJournal%5D)">New proteasome inhibitors in the treatment of multiple myeloma.</a> Hematology, Transfusion and Cell Therapy. 41 (1), 76-83 (2018).</li>
<li>Vassilev, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+activation+of+the+p53+pathway+by+small-molecule+antagonists+of+MDM2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2.</a> Science. 303 (5659), 844-848 (2004).</li>
<li>Kuiken, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+F-box+only+protein+7+as+a+negative+regulator+of+NF-kappaB+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification of F-box only protein 7 as a negative regulator of NF-kappaB signalling.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (9), 2140-2149 (2012).</li>
<li>Yuan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bafilomycin+A1+targets+both+autophagy+and+apoptosis+pathways+in+pediatric+B-cell+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).</li>
<li>Iconomou, M., Saunders, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+approaches+to+identify+E3+ligase+Substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Systematic approaches to identify E3 ligase Substrates.</a> Biochemical Journal. 473 (22), 4083-4101 (2016).</li>
<li>Zhang, Z. R., Bonifacino, J. S., Hegde, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deubiquitinases+sharpen+substrate+discrimination+during+membrane+protein+degradation+from+the+ER%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Deubiquitinases sharpen substrate discrimination during membrane protein degradation from the ER.</a> Cell. 154 (3), 609-622 (2013).</li>
<li>Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+age+of+crosstalk%3A+Phosphorylation%2C+ubiquitination%2C+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The age of crosstalk: Phosphorylation, ubiquitination, and beyond.</a> Molecular Cell. 28 (5), 730-738 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Ubikitilasyon, birkaç proteinin seviyelerini düzenleyen ve birçok sinyal yolunda ve biyolojik süreçte önemli bir rol oynayan ve sağlıklı bir hücre içi ortam sağlayan önemli bir post-translasyonel modifikasyondur. Ubikitin-proteazom sistemi (UPS), tümör baskılayıcılarını stabilize etme veya onkojenik ürünlerin bozulmasını indükleme imkanı sağlayan son farmasötik araştırmaların ana odaklarından biridir22. Örneğin, multipl miyelomda (MM) monoklonal immünoglobulin sekresyonundan sorumlu plazma hücre n...

Post-translasyonel modifikasyonlar (PTM'ler), hücre homeostazı için gerekli olan protein regülasyonu ile ilgili önemli bir mekanizmadır. Protein ubikitilasyonu, ökaryotik organizmalarda çeşitli hücresel sonuçlarla sonuçlanan farklı sinyallerin bir çeşitliliğini yaratan dinamik ve karmaşık bir modifikasyondur. Ubikitilasyon, 76 amino asit içeren bir ubikitin proteininin substrata bağlanmasından oluşan, üç farklı reaksiyondan oluşan enzimatik bir kaskadda meydana gelen geri dönüşümlü bir süreçtir1. İlk adım, ubikitin C-terminus ile E1 enziminin aktif bölgesinde bulunan sistein kalıntısı arasında yüksek enerjili bir tiyoestere bağlı ubikitin oluşturmak için bir ATP hidrolizine bağlı ubikitin aktivasyonu ile karakterizedir. Daha sonra, ubikitin, ubikitin ile tiyoester benzeri bir kompleks oluşturan E2 enzimine aktarılır. Daha sonra, ubikitin, substrat 2,3'ü tanıyan ve etkileşime giren E2 veya daha sık olarak, E3 enzimi tarafından kovalent olarak substratabağlanır. Bazen, multiubikitin zincir düzeneğini teşvik etmek için E4 enzimleri (Ubikitin zinciri uzama faktörleri)gereklidir 3.
Ubikitin yedi lizin kalıntısına sahiptir (K6, K11, K27, K29, K33, K48 ve K63), birkaç efektör protein tarafından tanınacak farklı üç boyutlu yapılar üretmek için farklı bağlantılar üreten poliubikitin zincirlerinin oluşumuna izin verir 4,5. Bu nedenle, substratta tanıtılan poliubikitin zincirinin türü,hücre kaderine 6,7,8 karar vermek için gereklidir. Dahası, substrat, N-degrons adı verilen N-terminal kalıntıları yoluyla da ubikitine edilebilir. Spesifik E3 ubikitin-ligazları, N-degron tanımadan sorumludur ve yakındaki lizin kalıntısı9'un poliubikitilasyonuna izin verir.
Günümüzde, karakterize edilen 40'tan fazla farklı SCF'ye özgü substrat vardır. Bunlar arasında, hücre farklılaşması ve gelişiminin yanı sıra hücre sağkalımı ve ölümü de dahil olmak üzere çeşitli biyolojik yolakların anahtar düzenleyicileribulunabilir 10,11,12,13. Bu nedenle, her bir E3 ubikitin-ligazın spesifik substratlarının tanımlanması, çeşitli biyolojik olayların kapsamlı bir haritasını tasarlamak için gereklidir. Gerçek substratların tanımlanması biyokimyasal olarak zor olsa da, biyokimya tabanlı yöntemlerin kullanımı, zincir özgüllüğünü ve mono- ve poliubikitilasyon arasındaki ayrımı değerlendirmek için çok uygundur14. Bu çalışma, E3 ubikitin-ligaz kompleksi SCF (Fbxo7) ile substrat UXT-V2'yi (Her yerde eksprese edilen prefoldin benzeri şaperon izoform 2) aşırı eksprese eden memeli hücre hattı HEK293T kullanılarak ubikitilasyon testi için tam bir protokolü açıklamaktadır. UXT-V2, NF-κB sinyallemesi için önemli bir ko-faktördür ve bu protein hücrelerde parçalandıktan sonra, TNF-α indüklenen NF-κB aktivasyonunu inhibe eder11. Bu nedenle, poliubikitillenmiş UXT-V2'yi tespit etmek için, proteazom inhibitörü MG132, proteazom kompleksi15'in 26S alt biriminin proteolitik aktivitesini bloke etme yeteneğine sahip olduğu için kullanılır. Ayrıca, hücre ekstresi, substratı saflaştırmak için küçük ölçekli bir IP'ye gönderilir ve seçilen antikorlar kullanılarak WB tarafından daha sonra tespit edilmek üzere agaroz reçinesine hareketsiz hale getirilmiş spesifik bir antikor kullanılır. Bu protokol, hücresel ortamda substrat ubikitilasyonunu doğrulamak için çok yararlıdır ve ayrıca farklı memeli hücreleri ve diğer E3 ubikitin-ligaz kompleksleri için uyarlanabilir. Bununla birlikte, in vitro ubikitilasyon testi ile test edilen substratın doğrulanması da gereklidir, çünkü her iki protokol de gerçek substratların tanımlanması konusunda birbirini tamamlar.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL mikrotüp</td><td>Axygen</td><td>PMI110-06A</td><td></td></tr><tr><td>100 mm TC ile muamele edilmiş kültür kabı</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tüp</td><td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu plaka</td><td>Cralplast</td><td>655111</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz-anti-HA boncukları</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6779</td><td></td></tr><tr><td>Anti Fare antikoru</td><td>Seracare</td><td>5220-0341</td><td>Keçi anti-Fare IgG</td></tr><tr><td>Anti Tavşan antikoru</td><td>Seracare</td><td>5220-0337</td><td>Keçi anti-Tavşan IgG</td></tr><tr><td>Anti-Aktin antikoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3853</td><td>Kullanılan seyreltme: 1:2000</td></tr><tr><td>Anti-Fbxo7 antikoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB1407251</td><td>Kullanılan seyreltme: 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-HA antikoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3663</td><td>Kullanılan seyreltme: 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-Myc antikor</td><td>Hücre Sinyali</td><td>2272</td><td>Kullanılan seyreltme: 1:1000</td></tr><tr><td>Bradford reaktifi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916-500ML</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-100G</td><td>Sığır Serumu Albümin</td></tr><tr><td>Hücre inkübatörü</td><td>Nuaire</td><td>NU-4850</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td>500 x g 5 dakika</td></tr><tr><td>ChemiDoc</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dijital pH metre</td><td>Kasvi</td><td>K39-2014B</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta Corning</td><td></td><td>10-017-CRV</td><td>Yüksek glikozlu</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Gibco</td><td>F4135</td><td>Filtrat önceki kullanım</td></tr><tr><td>HA peptid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2149</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR Yaşam Bilimleri</td><td>0365-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kline döndürücü</td><td>Küresel Ticaret Teknolojisi</td><td>GT-2OIBD</td><td></td></tr><tr><td>MG-132</td><td>Boston Biochem</td><td>I-130</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5418R</td><td></td></tr><tr><td>Na3VO 4 (Ortovanadato)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitroselüloz lekeleme membranı</td><td>GE Sağlık</td><td></td><td></td>10600016</tr><tr><td>NP40 (IGEPAL CA-630)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Optik mikroskop</td><td>OPTIKA mikroskopları</td><td>SN510768</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3</td><td>Invitrogen</td><td>V79020</td><td>Memeli ekspresyonu için</td></tr><tr><td>pcDNA3-2xFlag-Fbxo7</td><td>&nbsp; Dr. Marcelo Dam&aacute tarafından bağışlanmıştır; </td><td></td> rio <td>Tag 2xFlag (N-terminali). Restriksiyon enzimleri: EcoRI ve XhoI</td></tr><tr><td>pcDNA3-2xFlag-Fbxo7-&Delta; F kutusu</td><td>&nbsp; Dr. Marcelo Dam&aacute tarafından bağışlanmıştır; </td><td></td> rio <td>Tag 2xFlag (N-terminali). Restriksiyon enzimleri: EcoRI ve XhoI. &Delta; 335-367</td></tr><tr><td>pcDNA3-UXTV2-HA</td><td>&nbsp; Dr. Marcelo Dam&aacute tarafından bağışlanmıştır; </td><td></td> rio <td>Tag HA (C-terminali). Restriksiyon enzimleri: EcoRI ve XhoI</td></tr><tr><td>pCMV-6xHis-Myc-Ubiquitin</td><td>&nbsp; Dr. Marcelo Dam&aacute tarafından bağışlanmıştır; </td><td></td> rio <td>Tag 6x-His-Myc (N-terminali). Restriksiyon enzimleri: EcoRI ve KpnI</td></tr><tr><td>Pen Strep Glutamin 100x</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin 10x</td><td>AccuGENE</td><td>51226</td><td>1x PBS elde etmek için 10x PBS'yi ultra saf suya seyreltin</td></tr><tr><td>Polietilamin (PEI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>VWR Life Science</td><td>0860-50G</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü kokteyli SIGMAFAST</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>Sallanan Çalkalayıcı</td><td>Kasvi</td><td>19010005</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE sistemi</td><td>BioRad</td><td>165-8004</td><td></td></tr><tr><td>Çözelti Homojenizatör</td><td>Phoenix Luferco</td><td>AP-22</td><td></td></tr><tr><td>Trizma tabanı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tripsinüs (Triple Ekspres)</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>Western Blotting Luminol Reaktifi</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>SC-2048</td><td></td></tr></tbody></table>

memeli hücre lisatlarında e3 ubikitin-ligaz ile substrat ubikitilasyonunun değerlendirilmesi

Evaluation of Substrate Ubiquitylation by E3 Ubiquitin-ligase in Mammalian Cell Lysates

Ubikitilasyon, ökaryotik hücrelerde meydana gelen ve hücre sağkalımı, proliferasyonu ve farklılaşması dahil olmak üzere çeşitli biyolojik yolakların düzenlenmesi için kritik olan translasyonel bir modifikasyondur. E1 (Ubikitin aktivasyon enzimi), E2 (Ubikitin-konjuge enzim) ve E3'ten (Ubikitin-ligaz enzimi) oluşan en az üç farklı enzimin kaskad reaksiyonu yoluyla ubikitinin substrata kovalent bir şekilde bağlanmasından oluşan geri dönüşümlü bir işlemdir. E3 kompleksi substrat tanıma ve ubikitilasyonda önemli bir rol oynar. Burada, seçilen substratı, bir E3 ubikitin ligazını ve etiketli bir ubikitini kodlayan bir plazmidin geçici ko-transfeksiyonunu kullanarak memeli hücrelerinde substrat ubikitilasyonunu değerlendirmek için bir protokol tanımlanmıştır. Lizisten önce, transfekte hücreler, substrat proteazomal bozulmasını önlemek için proteazom inhibitörü MG132 (karbobenzoksi-lö-lö-lösinal) ile muamele edilir. Ayrıca, hücre ekstresi, ubikitin etiketi için spesifik antikorlar kullanılarak batı lekelenmesi (WB) ile daha sonra tespit edilmek üzere poliubikitillenmiş substratı saflaştırmak için küçük ölçekli immünopresipitasyona (IP) gönderilir. Bu nedenle, memeli hücrelerinde ubikitilasyon testi için tutarlı ve karmaşık olmayan bir protokol, bilim adamlarına spesifik substratların ve E3 ubikitin ligazlarının ubikitilasyonunu ele almada yardımcı olmak için tanımlanmıştır.

UXT (her yerde ifade edilen transkript), kalp, beyin, iskelet kası, plasenta, pankreas, böbrek ve karaciğer gibi fare ve insan dokularında her yerde eksprese edilen protein katlama komplekslerini oluşturan prefoldin benzeri bir proteindir18. UXT-V1 ve UXT-V2 olarak adlandırılan iki ekleme izoformu, farklı fonksiyonlar ve hücre altı konumlar gerçekleştirerek tanımlanmıştır. UXT-V1 ağırlıklı olarak sitoplazmada ve mitokondri içinde lokalize olur ve TNF-α indüklenen apoptoz ve antiviral sinyalozom ol...

Memeli hücrelerinde belirli bir substratın ubikitilasyon testi ve bir E3 ubikitin-ligazının ubikitilasyon testi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. HEK293T hücre hatları protein aşırı ekspresyonu için kullanıldı, poliubikitillenmiş substrat immünopresipitasyon ile hücre lizatlarından arındırıldı ve SDS-PAGE'de çözüldü. Bu post-translasyonel modifikasyonu görselleştirmek için immünoblotlama kullanıldı.

Memeli Hücre Lisatlarında E3 Ubikitin-ligaz ile Substrat Ubikitilasyonunun Değerlendirilmesi

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, ...

Bu protokol, belirli bir substratın bir E3 ligaz tarafından ubikitilasyonunu değerlendirmeyi sağlar. Ligaz-substrat etkileşiminin karakterizasyonunun, hücrelerdeki işlevlerini anlamak için çok önemli olduğunu biliyoruz. Bu teknik pahalı reaktifler veya sofistike ekipman gerektirmez.Plazmidlere ve ilgilenilen genleri kodlamaya, hücre lizatları ile bir immünopresipitasyon testi geliştirmeye ve substrat ubikitilasyonunu tespit etmek için bir Batı lekesine ihtiyaç duyar. Kanser ve nörolojik bozukluklar gibi çeşitli insan hastalıkları, E3 ligazın düzensizliği ile ilişkilidir. Bu nedenle, substrat ubikitilasyonunun spesifik E3 ligaz ile tanımlanması, bu hastalıkların tedavisinde veya teşhisinde yardımcı olabilir.Prosedürün gösterilmesi Valentine Spagnol tarafından yapılacaktır. Başlamak için, HEK293T hücre hattını% 10 fetal sığır serumu ve 100 birim penisilin, 100 mikrogram streptomisin ve mililitre L-glutamin başına 0.292 miligram ile desteklenmiş Dulbecco'nun modifiye Eagles ortamında 80 ila% 90 oranında birleştirin. Daha sonra, bu kültürü% 5 karbondioksit içinde nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin.Serolojik bir pipet kullanarak ortamı kültür kabından aspire ederek hücreleri geçirin ve bir mililitre sterilize edilmiş 1X PBS ile bir kez yıkayın. Daha sonra, bir mililitre tripsin etilendiamintetraasetik asit çözeltisi ekleyerek hücreleri ayırın ve 37 santigrat derecede beş dakikalık inkübasyondan sonra, bu hücreleri serolojik bir pipet kullanarak iki mililitre büyüme ortamında yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu taze ve temiz 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 kez G'de santrifüj yapın.Daha sonra, süpernatantı yavaşça çıkarın ve homojen bir hücre süspansiyonu elde etmek için yukarı ve aşağı pipetle çekerek hücre peletini üç mililitre büyüme ortamında yeniden askıya alın. Daha sonra, bu hücre süspansiyonunun bir mililitresini, dokuz mililitre büyüme ortamı içeren 100 milimetrelik TC ile işlenmiş bir kültür kabına aktarın. Transfeksiyondan önce, hücrelerin kontaminasyondan arındırılmış olup olmadığını ve geçici transfeksiyonlar için yeterli bir birleşimde olup olmadığını onaylayın.Her transfeksiyon numunesi için, DNA-polietilenimin komplekslerini, her plazmidin üç mikrogramını 100 mikrolitre Opti-MEM 1 indirgenmiş serum ortamında takviye edilmeden seyrelterek ve çözeltiyi yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe karıştırarak hazırlayın. Daha sonra, DNA-polietilendimini oda sıcaklığında çözün ve bir mikrogram DNA başına üç mikrolitre DNA-polietilenimin oranını takiben çözeltiye ekleyin. Çözeltiyi yukarı ve aşağı pipetleyerek homojenize edin.Daha sonra, DNA-polietilenimin komplekslerinin oluşumuna izin vermek için oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. DNA-polietilenimin komplekslerinin toplam hacmini hücre kültürünü içeren her kaba ekleyin ve tabağı ileri geri sallayarak hafifçe karıştırın. Daha sonra, bu hücreleri nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin.Kuluçkadan sonra ve hücre lizisinden altı saat önce, transfekte edilmiş hücreleri 10-mikromolar proteazom inhibitörü MG132 ile tedavi edin ve nemlendirilmiş hücre kültürü inkübatöründe hücreleri inkübe edin. Daha sonra, serolojik bir pipet kullanarak her kültür kabındaki ortamı aspire edin ve hücreleri bir mililitre 1X PBS ile bir kez yıkayın. Daha sonra, bir mililitre tripsin ekleyerek hücreleri ayırın ve kabı beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Hücreleri bir mililitre büyüme ortamında yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonunu taze ve temiz iki mililitrelik bir mikrotüpe aktarın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 kez G'de santrifüj yapın. Santrifüjleme bittikten sonra, süpernatantı dikkatlice dökerek çıkarın ve proteaz ve fosfataz inhibitörleri kokteyli ile desteklenmiş 200 mikrolitre buz gibi soğuk MP40 lizis tamponunda hücre peletini nazikçe yeniden askıya alın. Daha sonra bu çözeltiyi temiz bir 1.5 mililitrelik mikrotüpe aktarın.Bu hücre lizatını buz üzerinde 30 dakika boyunca inkübe edin ve inkübasyondan sonra, hücre lizatlarını dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 16.900 kez G'de santrifüj edin. Bu arada, agaroz anti-HA boncuklarını buz gibi soğuk MP40 lizis tamponu ile dengeleyin. Her numune için 15 mikrolitre agaroz anti-HA boncuk kullanın.Boncukları 200 mikrolitre MP40 lizis tamponu ile yıkayarak 3.000 kez G'de bir mikro santrifüj tüpünde dört santigrat derecede bir dakika boyunca darbelendirin. Daha sonra, süpernatantı bir pipetle dikkatlice aspire edin ve atın ve bu işlemi üç kez tekrarlayın. Daha sonra, boncukları kullanana kadar buz üzerinde dengede tutun.Hücre lizatlarını santrifüjledikten sonra, süpernatantı geri kazanın ve immünopresipitasyona maruz kalan her numunenin eşit miktarda protein sunmasını sağlamak için Bradford yöntemini kullanarak toplam lizattaki protein içeriğini ölçün. Gerekli hücre lizat hacmini dört saat boyunca dengelenmiş agaroz anti-HA boncukları ile inkübe edin, dönen bir inkübatörde dört santigrat derecede hafifçe döndürün, bu da UXT-V2-HA'nın agaroz anti-HA boncuklarına bağlanmasını sağlar. Agaroz anti-HA boncuklarını, dört santigrat derecede bir dakika boyunca 3.000 kez G'de bir mikrosantrifüj tüpünde atımlayarak toplayın.Süper natantı dikkatlice aspire edin ve atın. Boncukları üç kez buz gibi soğuk MP40 hücre lizis tamponu ve iki kez buz gibi soğuk FLAG HA tamponu ile yıkayın. Son yıkamadan sonra, bir pipet kullanarak tüm süpernatantı dikkatlice çıkarın ve poli-ubikitile proteini, FLAG HA tamponu üzerinde seyreltilmiş mililitre başına 300 mikrogram HA peptidi ile etkisiz hale getirin.Agaroz anti-HA boncuklarını, sallanan bir çalkalayıcı platformunda dört santigrat derecede bir saat boyunca HA peptidi ile inkübe edin. Daha sonra, boncukları dört santigrat derecede iki dakika boyunca 3.000 kez G'de döndürün ve poli-ubikitinlenmiş proteinleri içeren süpernatantı dikkatlice çıkarın. Gerekirse, eluent'i eksi 20 santigrat derecede taze ve temiz bir mikrotüp içinde saklayın.Elüentleri ve hücre lizatlarını% 10 sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi ve immünoblotlama ile çözün. Islak transfer Western lekeleme işlemini gerçekleştirmek için, jeli filtre kağıdı, jel membran filtre kağıdından oluşan bir transfer sandviçinin içine yerleştirin, pedlerle yastıklayın ve bir destek ızgarası ile birlikte bastırın. Ardından, bu sistemi paslanmaz çelik veya platin tel elektrotlar arasına transfer tamponu ile dolu bir tanka dikey olarak yerleştirin.Aktarım, ıslak bir transfer tamponunda 150 voltta 90 dakika boyunca gerçekleşir. Son olarak, anti-myc antikoru kullanarak immünoblot membranını araştırın. Hücrelerde F-box protein 7'nin aracılık ettiği UXT-V2-HA'nın spesifik poli-ubikitilasyonu, substrata konjuge edilen myc-ub'u tespit eden bir anti-myc antikoru ile anti-HA immünopresipitasyonundan elde edilen elüentin araştırılmasından sonra gözlenmiştir.Poli-ubikitillenmiş substrat için anti-myc'nin özgüllüğü, bir ve iki şeritte görselleştirildi; burada hücreler UXT-V2-HA plazmidinin yokluğunda F-box protein 7 ve myc-ub ile birlikte transfekte edildiğinde poli-ubikitillenmiş proteinlerin bir yayması tespit edilmedi. Ek olarak, myc-ub plazmidi olmadan F-box protein 7 ve UXT-V2-HA kombinasyonunda protein poli-ubikitinasyonuna karşılık gelen hiçbir yayma görselleştirilmedi. Aktif SCF'yi bir araya getiremeyen boş vektörlü vahşi tip bir F-kutusu proteini 7 veya F-kutusu proteini 7 mutantı UXT-V2-HA ve myc-ub ile kombinasyon halinde transekte edildiğinde, sadece vahşi tip F-box protein 7 için poli-ubikitillenmiş UXT-V2'nin güçlü bir yayma sinyali gözlendi, bu da UXT-V2'nin SCF F-box protein 7 kompleksi ve kontrollere kıyasla hücreler tarafından poli-ubikitillendiğini düşündürdü.Hücre lizatlarının dengeli boncuklarla inkübasyonu ve immünoçökeltilmiş proteinlerin elüsyonu da dahil olmak üzere mono-çökeltme adımları, bu protokolün amacına ulaşmak için esastır. Bu işlemden sonra, E3 ligaz tarafından substrat ubikitilasyonunun özgüllüğünü doğrulamak için in vitro ubikitilasyon testi yapılmalıdır.

evaluation-substrate-ubiquitylation-e3-ubiquitin-ligase-mammalian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Ubikitinasyon üç enzimlerin kümesi tarafından yürütülen bir anahtar posttranslasyonel modifikasyonu. Bu değişiklik ilgili genler Mutasyonlar birçok farklı insan hastalıkları ile ilişkilidir. Burada, kültür hücrelerinde protein ubikuitinasyon tespit protokolleri...

Protein Ubikitinasyon Tespiti

Bu video, sıralı bir enzim kaskad kullanılarak substrat proteinlerinin SUMOylasyonu için in vitro yöntemi göstermektedir. Ayrıca, proteinin SUMOylated durumu, elektroforez ve immünoblotlama tekniği kullanılarak tanımlanır.

SUMOylation Assay: İmmünoblotlama ile Substrat Proteinlerinin SUMOylation Durumunu Tespit Etmek İçin İn Vitro Bir Teknik

Ubikuitin ligazlar, birkaç E3 SUMO ligazlar tespit edilmiştir. Bu değiştirilmiş vitro SUMOylation Protokolü roman SUMO E3 ligazlar bir vitro sulandırma tahlil tarafından tespit edebilmek.

Vitro SUMOylation SUMO E3 ligaz etkinlik eğitim için tahlil

Kompleks biyolojik örneklerden her yerde bulunan proteinlerden kaynaklanan diGly peptidlerin arıtılmı, saptanması ve tanımlanması için bir yöntem salıyoruz. Sunulan yöntem çoğaltılabilir, sağlam ve ubiquitinome analizinin derinliği düzeyine göre yayınlanmış yöntemleri geride bırakır.

Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması

Ubiquitination hücresel süreçlerde önemli roller oynar ve sıkıca deubiquitination tarafından koordine edilen bir post-translational modifikasyon olduğunu. Her iki reaksiyon kusurları insan patolojileri altında yatan. Biz arıtılmış bileşenleri kullanarak in vitro mayası ve deubiquitination reaksiyonu yürütmek için protokoller sunuyoruz.

Nükliosomal Histones in vitro Ubiquitination ve Deubiquitination bulguları

Bu protokol, bu tür çeviri sonrası modifikasyonların (PtM'ler) bir tedavi veya fenotip gibi belirli bir durumla ilişkili değişikliklerini belirlemek için ubiquitin (Ub) ve ubiquitin benzeri (Ubls) spesifik proteomların oluşturulmasını amaçlamaktadır.

Ubiquitin ve Ubiquitin benzeri Bağımlı Post-translational Modifikasyonlar ve Önemli Değişikliklerin Belirlenmesi Profilleme

Bu makalenin amacı, RING tipi E3 ubikitin ligaseskapsamlı biyokimyasal ve fonksiyonel çalışmalar için bir anahat sunmaktır. Ayrıntılı protokollere sahip bu çok aşamalı boru hattı, test edilen proteinin enzimatik aktivitesini doğrular ve aktivitenin işlevine nasıl bağdaştırılabildiğini gösterir.

Ring Tipi E3 Ubiquitin Ligases In Vitro ve Planta Fonksiyonel Karakterizasyonu

Bu yöntem, ubiquitin zincir topolojislerindeki küresel değişikliklerin değerlendirilmesini açıklar. Değerlendirme, kütle spektrometresi tabanlı hedefli proteomik yaklaşımın uygulanmasıyla gerçekleştirilir.

Paralel Reaksiyon İzleme ile Ubiquitin Zincir Analizi

Bu çalışma, E3 ubiquitin ligase katalitik aktivitesinin analizi için ayrıntılı in vitro ubiquitylation tahlil protokolleri sunmaktadır. Rekombinant proteinler Escherichia coli kültürü gibi prokaryotik sistemler kullanılarak ifade edildi.

In Vitro E3 Ubiquitin Ligase fonksiyonunun analizi

Ubiquitinasyon, hücre içi protein fonksiyonlarının kritik bir düzenleyicisidir. Burada, memeli hücrelerinde substrat protein ubiquitinasyon seviyelerini tespit etmek için iki hücre lizisi yöntemini tanımlıyor ve ubiquitinasyon seviyelerini analiz etme etkinliklerini karşılaştırıyoruz. HEK293T hücrede protein aşırı ekspresyonu, geçici transfeksiyonla indüklenmiş ve ubiquitinated proteinler western blot analiziyle tespit edilmiştir.

SMAD2/SMURF2 modeli kullanılarak memeli hücre lizatlarında ubiquitinasyon tespiti için karşılaştırmalı stratejiler

Bu protokol, Streptococcus pneumoniae'nin memeli hücre lizat veya saf ubiquitin enzim kompleksi kullanılarak ubiquitinasyon yöntemini tanımlar; ardından arıtılmış VCP/p97-UFD1-NPLOC4 protein kompleksiyle tedavi edilip, bakteriyolitik aktivitesini değerlendirir; böylece ubiquitin bağımlı bağışıklık efektörlerinin incelenmesi mümkün olur.

In vitro Bakteriyel Ubiquitinasyonun Yeniden Yapılandırılması ve VCP/p97 aracılı Eliminasyonun Yeniden Yapılması

Öğrenin, memeli hücrelerinde E3 ubikitin-ligaz ile substrat ubikitilasyonunu değerlendirme yöntemini. HEK293T hücre hatları, immünopresipitasyon ve Western blot kullanılarak kanser ve nörolojik bozukluklarda tedavi stratejileri geliştirilir.

Memeli Hücre Lisatlarında E3 Ubikitin-ligaz ile Substrat Ubikitilasyonunun Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet