Name: Embriyonik Yaralı Civciv Kornealarında İzsiz Doku Rejenerasyonunun İncelenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Keşfedin, embriyonik civciv korneasını yaralama ve izsiz iyileşme mekanizmalarını analiz etme yöntemini. Bu protokol, kornea rejenerasyonunu ve doku onarımını incelemek için değerli bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Illinois Wesleyan Üniversitesi aracılığıyla TS'ye verilen bir Sanatsal ve Bilimsel Gelişim hibesi ile desteklenmiş ve kısmen NIH-R01EY022158 (PL) tarafından finanse edilmiştir.

Bu protokolde kullanılan yumurta suşu Beyaz Leghorn idi ve tüm hayvan prosedürleri Illinois Wesleyan Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı.
1. Civciv yumurtalarının kuluçkalanması
<ol><li>Yumurtaları, gelişimi durdurmak için serildikten sonra 1 haftaya kadar ~ 10 ° C'de tutun. Civciv embriyosu gelişimini başlatmaya hazır olduğunuzda, kir ve kalıntıları temizlemek için tüm yumurta kabuğunu oda sıcaklığında suya doyurulmuş tüy bırakmayan mendillerle ( Malzeme Tablosuna bakınız) silin.</li>
	<li>Yumurta kabuğunun sterilize edildiğinden emin olun. Tüm yumurta yüzeyini% 70 etanol ile nemlendirilmiş tüy bırakmayan mendillerle silin. Yumurtayı kurutmak için etanolün hızla silin ve yumurta kabuğundan embriyoya etanol emilimini önleyin.</li>
	<li>Yumurtaları yatay olarak bir tepsiye yerleştirin. Embriyonun beklenen pozisyonunu belirtmek için yumurtanın üstünü işaretleyin. Yumurtaları yatay olarak, sallama fonksiyonu etkinleştirildiğinde, 38 °C nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin.</li>
</ol>2. Membran diseksiyonuna hazırlanmak için yumurtaların pencerelenmesi
<ol><li>Embriyonik gelişimin üçüncü gününde (E3) kuluçka makinesinden yumurtaları çıkarın. Yumurtaların üst kısmını% 70 etanol ile nemlendirilmiş tüy bırakmayan mendillerle sterilize edin. Etanolün yumurta kabuğu yüzeylerinden kurutulması. NOT: Pencereleme prosedürü sırasında gelişimin gecikmemesini sağlamak için, 6-12 yumurta çıkarıldı ve kalan yumurtalar inkübatörde bırakılırken prosedür bunlar üzerinde hızlı bir şekilde gerçekleştirildi.</li>
	<li>Bir yumurtayı güvenli bir yumurta tutucuya yatay olarak yerleştirin (bkz. Diseksiyon makasının keskin ucunu kullanarak, yumurta kabuğunun tepesinde, yumurtanın sivri ucuna yakın küçük bir delik oluşturun. NOT: Bu delik, yumurta sarısını ve embriyoyu iç yumurta kabuğu yüzeyinden uzağa bırakmak için gerekli olan albüminin çıkarılmasını kolaylaştıracaktır. Yumurta tutucular için, yumurtaların sevk edildiği kağıt-kağıt hamuru yumurta dolgu daireleri kullanılmıştır.</li>
	<li>Delikten (Adım 2.2.), 18 G eğimli hipodermik bir iğne yerleştirin. İğne yumurtanın alt iç yüzeyine itildiğinde ve iğnenin eğim tarafı yumurtanın sivri ucuna baktığında (örneğin, yumurta sarısının ve embriyonun yumurtanın ortasına yakın beklenen yerinden uzakta), tavuk yumurtasından 2-3 mL albümen çıkarın ve atın. NOT: Bu adım sırasında kişinin iğnesi embriyoyu veya ilişkili vaskülatürünü keserse, albümen ile kanın aspire edilmesine neden olur. Bu embriyo ölümü ile sonuçlanacaktır. Ayrıca, yumurta sarısı bu adımda albümen ile birlikte yanlışlıkla aspire edilirse, embriyo canlı olmayacaktır. Her iki durumda da, embriyo hemen başka amaçlar için kullanılamıyorsa, yumurta atılmalıdır.</li>
	<li>Deliği çevreleyen yumurta kabuğu yüzeyini% 70 etanol ile hafifçe nemlendirilmiş tüy bırakmayan mendillerle temizleyin ve kurulayın. Albümeni çıkarmak için yapılan deliği şeffaf bantla kapatın.</li>
	<li>Diseksiyon makasının keskin ucuyla, işaretleme bölgesinde yumurta kabuğunun tepesinde ikinci bir "pencere" deliği açın (Adım 1.3.). Makasların, embriyoya veya embriyonik vaskülatüre temas etmekten ve zarar vermekten kaçınmak için yumurta kabuğuna çok fazla uzanmadığından emin olun, bu da genellikle yumurtanın içinde ikinci deliğin bulunduğu yerin hemen altına yerleştirilir.</li>
	<li>Kavisli iris forseps kullanarak, "pencere" deliğini ~ 2-3 cm çapında olacak şekilde genişletin ve kabuğun altındaki gelişmekte olan embriyoya bir "pencere" görevi görür.<ol>
<li>Forsepslerin bir ucunu deliğe yerleştirin, yumurta kabuğuna paralel ve yakından yan yana koyun. Diğer forseps ucu yumurta kabuğunun dışına yerleştirildiğinde, iki forseps ucunu dikkatlice sıkıştırarak yumurta kabuğunun küçük parçalarını kırmalarını ve çıkarmalarını sağlar. Embriyoyu doğrudan kaplayan 2-3 cm'lik bir pencere kalana kadar yumurta kabuğu parçalarını kırmaya ve çıkarmaya devam edin. NOT: Embriyoların Adım 2.6'da yapılan deliğin hemen altına yatmadığı yumurtalar. Yaklaşan membran diseksiyonlarının tamamlanması zor olacağından kullanılmamalıdır. Yumurtaların yatay olarak sallanmasıyla bile, embriyonun zayıf konumlandırılması nedeniyle yumurtaların yaklaşık% 10'u kullanılamaz. Bu embriyolar başka amaçlar için kullanılabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Bakteriyel kontaminasyonu sınırlamak için, pencere deliğinden (örneğin yumurtaya) ~100-200 μL Ringer çözeltisi (8 g NaCl, 0.37 g KCl ve damıtılmış H2 0'ınL başına 0.23 g CaCl 2.2H 20) içeren Penisilin / Streptomisin antibiyotikleri (50 U / mL Penisilin ve 50 μg / mL Streptomisin, Bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	<li>Pencere deliğini şeffaf yapışkan bant kullanarak kapatın. Bandın bir köşesini deliğin uzun ekseni üzerinde hizalayarak ve bandı deliğin kenarından ~ 1-2 cm uzaktaki kabuğa bastırarak yumurta sızdırmazlığını gerçekleştirin.<ol>
<li>Bir tarafta asılı bir bant kapağı kalana kadar açıklığın etrafında sızdırmazlık sağlamaya devam edin. İki bant parçasını birbirine bastırın, deliğin üzerinde kubbeli bir şekil oluşturun ve yumurtayı kapatmayı bitirmek için asılı bant kapağını kabuğa bastırın. NOT: Yumurtaların E2 veya E3'te pencerelenmesi gerekir. Deneyimlere göre, E2'den önce pencereleme düşük embriyo canlılığı ile sonuçlanır. Dahası, E4 ile, embriyo ve ekstraembriyonik zarlar yumurta kabuğu10'a bağlanır ve E4'te veya daha sonra pencereleme girişimleri genellikle embriyo hasarı veya ekstraembriyonik kan damarlarının yırtılması ile sonuçlanır ve her iki olay da embriyo ölümünün sonucuna yol açar.</li>
	</ol></li>
	<li>Daha fazla gelişme için "pencereli" yumurtaları inkübatöre iade edin. Yumurtaları yatay tuttuğunuzdan ve inkübatörün sallanma işlevini kapattığınızdan emin olun.</li>
	<li>2.2.-2.9 numaralı adımları yineleyin. her yumurta için.</li>
</ol>3. Ekstraembriyonik membranların mikrodiseksiyonları
<ol><li>Bir E5.5 pencereli yumurtayı inkübatörden çıkarın. Bandı sterilize edilmiş diseksiyon makası ile pencereden keserek embriyoyu ortaya çıkarın.</li>
	<li>Embriyoyu ve ekstraembriyonik zarlarını pencereden gözlemlemek için diseksiyon mikroskobu kullanın. Gerekirse, pencereyi genişletmek için makas veya kavisli iris forseps kullanın, böylece embriyo pencerenin altına iyi yerleştirilmiştir ve embriyonik vaskülatüre zarar vermemeye özen gösterin.<ol>
<li>Embriyoyu nemlendirmek ve yumurtayı sterilize etmek için iki damla Penisilin / Streptomisin antibiyotik içeren Ringer çözeltisi ekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Embriyonun uygun gelişim aşamasında olduğundan emin olmak için diseksiyon mikroskobu kullanın (Hamburger Hamilton evre 27, ~ E5.5)11,12 ve amniyotoryonik membranın (ACM) ve koryoalantoik membranın (CAM) konumlarını bulun. NOT: Bu aşamada, embriyo, embriyonun bağırsak bölgesinden uzanan ve CAM11,12'yi oluşturmak için üst üste binen koryon ile kaynaşan ve kısmen yüksek vaskülarize allantoz ile kaynaşmış amniyotik membran ve üstteki koryonik membrandan oluşan ACM ile çevrilidir. ACM ağır vaskülarize değildir, bu da kan damarlarına zarar vermeden ve embriyoya zarar vermeden embriyoyu açığa çıkarmak için bu zarların disseke edilmesini sağlar.</li>
	<li>Bu aşamada ekstraembriyonik membran diseksiyonları yapın (E5.5). NOT: E5.5, ekstraembriyonik membran diseksiyonlarını gerçekleştirmek için ideal zamandır. TAT oluşumundan önce membranların daha erken diseke edilmesi (örneğin, E4'te) daha sonraki aşamalarda embriyo erişilebilirliğini azaltır11. Dahası, E5.5'te, embriyo sadece kısmen yüksek vaskülarize CAM tarafından kaplanır, ancak önümüzdeki 1-2 gün boyunca, TAT embriyo11,12'ye daha fazla erişimi hızla sarar, engeller. Bu nedenle, E6 veya daha sonra membran diseksiyonu, kan damarlarının yırtılma riski arttıkça zordur.<ol>
<li>ACM'yi nazikçe kavramak ve embriyodan uzaklaştırmak için bir çift sterilize edilmiş ince forseps kullanın. Daha sonra, ACM'de ön ayağın hemen üstünde, ön ayağın üzerindeki zardan başın üzerindeki zara kadar uzanan bir delik açmak için sterilize edilmiş mikro diseksiyon makası kullanın. NOT: Bu adım, koryon ve amniyon membranlarını gevşetir, böylece sonraki adımlarda forseps ile tutulmalarını ve daha fazla diseksiyon yapmalarını kolaylaştırır. Membranların yumurta kabuğu penceresinden nasıl diseke edildiğine dair yararlı bir şema için Şekil 1'e bakın.</li>
	</ol></li>
	<li>Amniyonu, ACM ve CAM arasındaki iki bitişik pozisyonda nazikçe tutmak için iki çift ince, steril forseps kullanın (örneğin, ön ayağın üzerinde yapılan kesim ile CAM'ın en yakın kenarı arasındaki bir alan).<ol>
<li>Her ikisi de amniyotik zarı sıkıca kavrayan her bir forseps çiftini birbirinden uzaklaştırın, bir çift dorsal olarak embriyoya ve diğeri ventralal olarak hareket eder. NOT: Bu hareket, amniyonun daha da yırtılmasına hizmet ederken, aynı zamanda ACM'yi (embriyoya göre dorsal yönde bir çift forseps tarafından çekilir) ve TAT (diğer forseps çifti tarafından embriyoya göre ventral yönde çekilir) ayırır.</li>
		<li>TAT artık embriyoyu örtmediğinde ve embriyonik bağırsaktan CAM'a yayılan allantoik arter ve venin kolayca görülebildiğinden membranların ayrıldığından emin olun.</li>
	</ol></li>
	<li>Embriyoyu kaplayan kalan amniyon zarını diseke etmek ve çıkarmak için sterilize edilmiş ince forseps kullanın. En yaygın olarak, kalan amniyonun embriyonun kaudal yarısını kısmen kapsayacağı gözlenir.<ol>
<li>Sterilize forseps kullanarak, embriyonun orta kraniyal bölgesinin yakınındaki amniyonu kavrayın ve amniyonu, embriyoya göre daha önce yer değiştirmiş CAM'a doğru kaudal bir yönde dikkatlice çekin. Embriyo şimdi tamamen açığa çıkacak ve TAT'ın daha da büyümesi esas olarak gelişmekte olan embriyodan uzakta gerçekleşecektir. NOT: Membran diseksiyonunu takiben maruz kalan embriyonun nasıl görüneceğine dair yararlı bir şema için Şekil 1'e bakınız. Ayrıca, Adım 3.3.-3.6'nın yararlı şematik diyagramları için daha önce yayımlanmış bir rapor11'e bakın.</li>
	</ol></li>
	<li>Embriyoyu nemlendirmek ve yumurtayı sterilize etmek için birkaç damla Penisilin / Streptomisin antibiyotik içeren Ringer çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>Adım 2.8'de açıklandığı gibi şeffaf bant kullanarak pencere deliğini yeniden kapatın. Daha fazla gelişme için yumurtayı inkübatöre geri verin, yumurtayı yatay tutun ve inkübatörün sallanma işlevini devre dışı bırakın.</li>
	<li>3.1.-3.8 arasındaki adımları yineleyin. her yumurta için. NOT: Yukarıda tarif edilen E5.5'teki ekstraembriyonik membran diseksiyonları, embriyoya E7 yoluyla erişim sağlayacaktır, bu da yaralamanın 8,9 yapılabileceği zamandır. E8 ile, TAT dokusunun devam eden büyümesi embriyonun kraniyal bölgesini örtmeye başlar, böylece korneaya daha fazla erişimi engeller. Daha yaşlı E8-E9 kornealarında yaralama yapmak istenirse, büyüyen TAT ventrallisini embriyoya göre yeniden konumlandırmak mümkündür (Adım 3.10.). E7'de yara almak istenirse, Adım 3.10. gerçekleştirmek gerekli değildir ve kişi Adım 4, kornea yaralanmasına devam edebilir.</li>
	<li>Ekstraembriyonik membranları daha önce E5.5'te diseke edilmiş olan inkübatörden bir E7 yumurtasını çıkarın (Adım 3.1.-3.8.). CAM ile kaynaşmış mevcut amniyon membran dokularını sterilize forseps ile kavrayın ve amniyon zarını embriyoya göre ventral yönde embriyonun kafatası bölgesinden yavaşça çekin. NOT: Embriyodan uzaklaşan amniyonik membran CAM ile kaynaştırıldığından, büyüyen ve yüksek oranda vaskülarize olmuş TAT amniyon kavrayan forsepsleri takip edecek ve kraniyal bölgeden uzaklaşacaktır. Embriyo yaralanma için istenen yaşa gelene kadar TAT'ı embriyodan sürekli olarak uzaklaştırmak için bu adımı günlük olarak tekrarlayın.</li>
</ol>4. Kornea yaralanması
<ol><li>İstenilen embriyonik yaşta, E7-E9'da yaralama için inkübatörden bir yumurta alın. Bandı sterilize edilmiş diseksiyon makası ile pencereden keserek embriyoyu ortaya çıkarın. Embriyoyu nemlendirmek ve yumurtayı sterilize etmek için birkaç damla Penisilin / Streptomisin antibiyotik içeren Ringer çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>Koroid fissüre paralel ve onunla aynı doğrultuda olan sağ gözün korneasının derecesini kapsayan bir kesi yapmak için mikro diseksiyon bıçağı kullanın (embriyonun yumurtada nasıl yattığına bağlı olarak, sol göze erişilemez, ancak yaralanmamış bir kontrol görevi görebilir) (Şekil 1). İlk kesim kornea epitelini geçecektir.<ol>
<li>Korneayı ilk kesi ile aynı noktada 2 kat daha fazla bağlamak için mikro diseksiyon bıçağını kullanın (örneğin; toplam üç kesik, kesilmiş 2 ve kesilmiş 3, korneada kesilmiş 1)11 ile aynı pozisyonda meydana gelir. İkinci yırtılma bazal membrandan geçecek ve üçüncüsü anterior stromaya nüfuz edecektir. NOT: Embriyo disseke edilmiş CAM'ın altına yerleşmişse, kafayı CAM'ın altından dikkatlice hareket ettirmek için sterilize edilmiş kavisli iris forseps kullanılabilir. Kavisli iris forsepslerini başın altına yerleştirin ve başın sol tarafıyla temas ettirin. Tüm kafayı kapalı kavisli iris forsepslerinin üzerine yerleştirin ve kafayı yavaşça CAM'ın etrafına ve üstüne kaldırın. Canlılığa yardımcı olmak için, CAM'ın düzgün büyümesini teşvik etmek için ameliyattan sonra embriyoyu TAT'ın altına geri çekmek için kavisli iris forseps ile benzer bir teknik kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Embriyoyu nemlendirmek ve yumurtayı sterilize etmek için Penisilin / Streptomisin antibiyotikleri içeren 3-4 damla Ringer çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>Pencere deliğini şeffaf bantla tekrar kapatın ve yumurtayı yatay bırakarak inkübatöre geri dönün. Embriyonun gelişmesine ve kornea yarasının istenen bir süre boyunca iyileşmesine izin verin (örneğin, 0.5-11 gün) ve daha sonra embriyoyu dekapitasyon yoluyla insancıl bir şekilde ötenazi yapın.</li>
	<li>Ringer'ın salin çözeltisinin Petri kabında yüzen ötenazi embriyosundan gözü toplamak için kavisli iris forseps kullanın, gözü göz ve yüz dokusunun buluştuğu arka tarafında hafifçe kavrayarak ve tüm gözü dikkatlice kaldırarak yüz dokusundan kurtarın.<ol>
<li>Tüm gözün arkasında küçük bir delik (3-5 cm) dürtmek için ince forseps kullanın ve tüm gözü hafif ajitasyonla gece boyunca 4 ° C'de% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Wilson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Corneal wound healing.</a> Experimental Eye Research. 197, 108089(2020).</li>
<li>Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+corneal+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Progress in corneal wound healing.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).</li>
<li>Whitcher, J. P., Srinivasan, M., Upadhyay, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+blindness%3A+a+global+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Corneal blindness: a global perspective.</a> Bulletin of the World Health Organization. 79 (3), 214-221 (2001).</li>
<li>Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+cornea+as+a+model+of+wound+healing+and+neuronal+re-innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation.</a> Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2001).</li>
<li>Berdahl, J. P., Johnson, C. S., Proia, A. D., Grinstaff, M. W., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+sutures+and+dendritic+polymer+adhesives+for+corneal+laceration+repair+in+an+in+vivo+chicken+model%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Comparison of sutures and dendritic polymer adhesives for corneal laceration repair in an in vivo chicken model.</a> Archives of Ophthalmology. 127 (4), 442-447 (2009).</li>
<li>Fowler, W. C., Chang, D. H., Roberts, B. C., Zarovnaya, E. L., Proia, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+paradigm+for+corneal+wound+healing+research%3A+the+white+leghorn+chicken+%28Gallus+gallus+domesticus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">A new paradigm for corneal wound healing research: the white leghorn chicken (Gallus gallus domesticus).</a> Current Eye Research. 28 (4), 241-250 (2004).</li>
<li>Huh, M. I., Kim, Y. E., Park, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+TGF-%CE%B2+isoforms+and+signaling+intermediates+in+corneal+fibrotic+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The distribution of TGF-β isoforms and signaling intermediates in corneal fibrotic wound repair.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 108 (2), 476-488 (2009).</li>
<li>Spurlin, J. W., Lwigale, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wounded+embryonic+corneas+exhibit+nonfibrotic+regeneration+and+complete+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Wounded embryonic corneas exhibit nonfibrotic regeneration and complete innervation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6334-6344 (2013).</li>
<li>Koudouna, E., Spurlin, J., Babushkina, A., Quantock, A. J., Jester, J. V., Lwigale, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulation+of+normal+collagen+architecture+in+embryonic+wounded+corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Recapitulation of normal collagen architecture in embryonic wounded corneas.</a> Scientific Reports. 10 (1), 13815(2020).</li>
<li>Luo, J., Redies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+ovo+electroporation+for+gene+transfer+into+older+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos.</a> Developmental Dynamics. 233 (4), 1470-1477 (2005).</li>
<li>Spurlin, J., Lwigale, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+to+increase+accessibility+to+late-stage+chick+embryos+for+in+ovo+manipulations%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations.</a> Developmental Dynamics. 242 (2), 148-154 (2013).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li>
<li>Neath, P., Roche, S. M., Bee, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraocular+pressure+dependent+and+independent+growth+phases+of+the+embryonic+chick+eye+and+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Intraocular pressure dependent and independent growth phases of the embryonic chick eye and cornea.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (9), 2483-2491 (1991).</li>
<li>Matsuda, A., Yoshiki, A., Tagawa, Y., Matsuda, H., Kusakabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+wound+healing+in+tenascin+knockout+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Corneal wound healing in tenascin knockout mouse.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (6), 1071-1080 (1990).</li>
<li>Nishida, T., Nakagawa, S., Nishibayashi, C., Tanaka, H., Manabe, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+enhancement+of+corneal+epithelial+wound+healing+of+rabbits+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Fibronectin enhancement of corneal epithelial wound healing of rabbits in vivo.</a> Archives of Ophthalmology. 102 (3), 455-456 (1984).</li>
<li>Sumioka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+cornea+wound+healing+in+a+tenascin+C-deficient+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Investigation%22%5BJournal%5D)">Impaired cornea wound healing in a tenascin C-deficient mouse model.</a> Lab Investigation. 93 (2), 207-217 (2013).</li>
<li>Tervo, K., van Setten, G. B., Beuerman, R. W., Virtanen, I., Tarkkanen, A., Tervo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+tenascin+and+cellular+fibronectin+in+the+rabbit+cornea+after+anterior+keratectomy.+Immunohistochemical+study+of+wound+healing+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Expression of tenascin and cellular fibronectin in the rabbit cornea after anterior keratectomy. Immunohistochemical study of wound healing dynamics.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (11), 2912-2918 (1991).</li>
<li>Lwigale, P. Y., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens-derived+Semaphorin3A+regulates+sensory+innervation+of+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Lens-derived Semaphorin3A regulates sensory innervation of the cornea.</a> Developmental Biology. 306 (2), 750-759 (2007).</li>
<li>Kubilus, J. K., Linsenmayer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+corneal+innervation%3A+interactions+between+nerves+and+specialized+apical+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Developmental corneal innervation: interactions between nerves and specialized apical corneal epithelial cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 782-789 (2010).</li>
<li>Schwend, T., Deaton, R. J., Zhang, Y., Caterson, B., Conrad, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+sulfated+glycosaminoglycans+and+their+effects+on+trigeminal+nerve+growth+cone+behavior+in+vitro%3A+roles+for+ECM+in+cornea+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Corneal sulfated glycosaminoglycans and their effects on trigeminal nerve growth cone behavior in vitro: roles for ECM in cornea innervation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (13), 8118-8137 (2012).</li>
<li>Lee, M. K., Tuttle, J. B., Rebhun, L. I., Cleveland, D. W., Frankfurter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+and+posttranslational+modification+of+a+neuron-specific+beta-tubulin+isotype+during+chick+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">The expression and posttranslational modification of a neuron-specific beta-tubulin isotype during chick embryogenesis.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 17 (2), 118-132 (1990).</li>
<li>Chen, X., Nadiarynkh, O., Plotnikov, S., Campagnola, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+harmonic+generation+microscopy+for+quantitative+analysis+of+collagen+fibrillar+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Second harmonic generation microscopy for quantitative analysis of collagen fibrillar structure.</a> Nature Protocols. 7, 654-669 (2012).</li>
<li>Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+high-resolution+second-harmonic+generation+imaging+of+endogenous+structural+proteins+in+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues.</a> Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).</li>
<li>Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+ex-ovo+culturing+of+chick+embryos+to+advanced+stages+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52129(2015).</li>
<li>Waldvogel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bird%27s+eye+view%5BTitle%5D)+AND+%22American+Scientist%22%5BJournal%5D)">The bird's eye view.</a> American Scientist. 78, 342-353 (1990).</li>
<li>Martin, P., Parkhurst, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallels+between+tissue+repair+and+embryo+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis.</a> Development. 131 (13), 3021-3034 (2004).</li>
<li>Wilson, S. E., Mohan, R. R., Mohan, R. R., Ambrosio, R., Hong, J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corneal+wound+healing+response%3A+cytokine-mediated+interaction+of+the+epithelium%2C+stroma%2C+and+inflammatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The corneal wound healing response: cytokine-mediated interaction of the epithelium, stroma, and inflammatory cells.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 20 (5), 625-637 (2001).</li>
</ol>

Yazarların bu makalede sunulan bilgilerle ilgili olarak rakip finansal çıkarları yoktur.

Civciv, fetal, yarasız kornea yara onarımını incelemek için ideal bir model sistemdir. Memelilerin aksine, civciv, ovo 8 veya ex ovo stratejileri24 kullanılarak gelişim boyunca kolayca erişilebilir. Embriyonik civciv korneası, kemirgen kornealarından çok daha büyüktür, kafatası hacminin yaklaşık% 50'si göze25'e adanmıştır ve bu da onu yaralama gibi fiziksel manipülasyonlara oldukça uygun hale getirir. Dahası, tavuk yumurtası yıl boy...

Kornea, görme keskinliğine elverişli ışığı ileten ve kıran gözün şeffaf, en dıştaki dokusudur. Yetişkin korneada, kornea stromasına verilen hasar veya enfeksiyon, keratosit proliferasyonu, fibroz, sitokin kaynaklı apoptozise yol açan inflamasyon artışı, onarım miyofibroblastlarının oluşumu ve hücre dışı matriksin (ECM) genel olarak yeniden şekillenmesi ile karakterize hızlı ve sağlam bir yara iyileşme yanıtına yol açar1,2 . Yaralanmayı takiben, bu tür kornea dokusu onarımı, kornea saydamlığını azaltan ve ışığın geçişini engelleyen, böylece görüşü bozan ve en ciddi vakalarda kornea körlüğüne yol açan opak skar dokusu ile sonuçlanır3. Bu nedenle, yara iyileşmesinin karmaşıklığını ele almak ve yara kapanması ve doku yenilenmesinden sorumlu hücresel ve moleküler faktörleri tanımlamak için güvenilir hayvan modelleri geliştirmeye açık bir ihtiyaç vardır.
Bugüne kadar, kornea yarasının iyileşmesini inceleyen çoğu çalışmada doğum sonrası4 veya yetişkin hayvan modelleri 1,2,5,6,7 kullanılmıştır. Bu çalışmalar kornea yarası iyileşme yanıtının ve skar oluşumunun altında yatan mekanizmaların anlaşılmasında önemli bir ilerlemeye yol açmış olsa da, bu iyileşme modellerindeki hasarlı kornea dokuları tam olarak yenilenememekte, böylece kornea morfolojisinin ve yaralanma sonrası yapının tam olarak özetlenmesinden sorumlu moleküler faktörlerin ve hücresel mekanizmaların tanımlanmasındaki yararlılıklarını sınırlamaktadır. Buna karşılık, embriyonik civciv korneasında bıçakla oluşturulan fetal yaralar, yarasız bir şekilde tamamen iyileşmek için içsel bir kapasiteye sahiptir8. Spesifik olarak, embriyonik civciv korneası, hücre dışı matriks yapısının ve innervasyon paternlerinin tam özetlenmesiyle fibrotik olmayan rejenerasyon sergiler 8,9.
Mevcut protokol, ovo'daki embriyonik bir civcivin korneasının yaralanmasında rol oynayan bir dizi adımı tanımlamaktadır. İlk olarak, embriyoya erişimi kolaylaştırmak için yumurtalar erken embriyonik yaşlarda pencerelenir. İkincisi, korneanın üç hücresel tabakasının oluştuğu ve yaralanmanın istendiği zamana karşılık gelen, gelişimin sonraki aşamalarında göze erişimin korunmasını sağlamak için ekstraembriyonik membranlara bir dizi in ovo fiziksel manipülasyonu gerçekleştirilir. Üçüncü olarak, kornea epitelinden ve anterior stroma içine nüfuz eden lineer santral kornea insizyonları mikrocerrahi bıçak kullanılarak yapılır. Rejenerasyon süreci veya tamamen restore edilmiş kornealar, yaralama prosedürünü takiben çeşitli hücresel ve moleküler teknikler kullanılarak rejeneratif potansiyel açısından analiz edilebilir.

<table><tbody><tr><td>18 G hipodermik iğne</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-5D</td><td></td></tr><tr><td>30 derece açılı mikrodiseksiyon bıçağı</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>10056-12</td><td></td></tr><tr><td>4 & prime ;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td> <td>Moleküler Problar</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>5 mL şırınga</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-45</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor etiketli ikincil antikorlar</td><td>Moleküler Problar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür dihidrat (CaCl2-H 20)</td> <td>Sigma</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Tavuk yumurtası tepsileri</td><td>GQF</td><td>O246</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon Forseps, İnce Uç, Tırtıklı</td><td>VWR</td><td>82027-408</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon makası, keskin uç</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td></td></tr><tr><td>İris 1 x 2 Diş Dokusu Forseps, Tam Kavisli</td><td>VWR</td><td>100494-908</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Sigma</td><td>Z188956</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodiseksiyon Makası</td><td>VWR</td><td>470315-228</td><td></td></tr><tr><td>Fare anti-fibronektin (IgG1)</td><td>Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası</td><td>B3/D6</td><td></td></tr><tr><td>Fare anti-laminin (IgG1)</td><td>Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası</td><td>3H11</td><td></td></tr><tr><td>Fare antinöronuna özgü &beta;-tubulin (Tuj1, IgG2a)</td><td>Biolegend</td><td>801213</td><td></td></tr><tr><td>Fare anti-tenasin (IgG1)</td><td>Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası</td><td>M1-B4</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür (KCl)</td> <td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Sportsman 1502 yumurta kuluçka makinesi</td><td>GQF</td><td>1502</td><td></td></tr><tr><td>Elle yırtma ambalajı (1,88 inç genişlik)</td><td>Scotch</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

embriyonik yaralı civciv kornealarında İzsiz doku rejenerasyonunun İncelenmesi

Investigating Scarless Tissue Regeneration in Embryonic Wounded Chick Corneas

Civciv embriyonik kornea yaraları tamamen ve hızlı bir şekilde yenilenmek için dikkate değer bir kapasite gösterirken, yetişkin yaralı kornealar fibrotik skarlaşma nedeniyle şeffaflık kaybı yaşarlar. Yaralı embriyonik korneaların doku bütünlüğü, saptanabilir bir skar oluşumu olmadan içsel olarak restore edilir. Erişilebilirliği ve manipülasyon kolaylığı göz önüne alındığında, civciv embriyosu, yarasız kornea yara onarımını incelemek için ideal bir modeldir. Bu protokol, ovo'daki embriyonik bir civcivin korneasının yaralanmasında yer alan farklı adımları göstermektedir. İlk olarak, yumurtalar göze erişmek için erken embriyonik yaşlarda pencerelenir. İkincisi, korneanın üç hücresel tabakasının oluştuğu zamana karşılık gelen, gelişimin sonraki aşamalarında göze erişimin korunmasını sağlamak için ekstraembriyonik membranlara bir dizi in ovo fiziksel manipülasyonu gerçekleştirilir. Üçüncüsü, dış epitel tabakasına ve anterior stromaya nüfuz eden lineer kornea yaraları mikrocerrahi bıçak kullanılarak yapılır. Rejenerasyon süreci veya tamamen restore edilmiş kornealar, yaralama prosedürünü takiben çeşitli hücresel ve moleküler teknikler kullanılarak rejeneratif potansiyel açısından analiz edilebilir. Bu modeli kullanarak bugüne kadar yapılan çalışmalar, yaralı embriyonik korneaların keratosit farklılaşmasının aktivasyonunu gösterdiğini, ECM proteinlerinin doğal üç boyutlu makroyapılarına koordineli bir şekilde yeniden şekillendiğini ve kornea duyu sinirleri tarafından yeterince yeniden innerve edildiğini ortaya koymuştur. Gelecekte, endojen veya eksojen faktörlerin rejeneratif süreç üzerindeki potansiyel etkisi, doku aşılama, elektroporasyon, retroviral enfeksiyon veya boncuk implantasyonu gibi gelişimsel biyoloji teknikleri kullanılarak iyileşen kornealarda analiz edilebilir. Mevcut strateji, embriyonik civcivleri, skarsız kornea yara iyileşmesini koordine eden moleküler ve hücresel faktörleri aydınlatmak için çok önemli bir deneysel paradigma olarak tanımlamaktadır.

Gelişmekte olan embriyonun kraniyal bölgesini ortaya çıkarmak için E5.5'te ACM ve TAT'ın daha önce diseksiyonunu takiben, ovo'da E7 merkezi korneasını kapsayan bir dizi yırtılma yapıldı (Şekil 1). Kornea rejenerasyonunu incelemek için ideal bir yara, her biri korneanın aynı yerinde yapılan üç yırtılmayı takiben ortaya çıkar. İlk yırtılma kornea epitelini geçerken, ikinci ve üçüncü yırtıklar sırasıyla altta yatan bazal membrana ve anterior stromaya nüfuz eder. İdeal bir yara elde etm...

Mevcut protokol, ovo'daki embriyonik bir civcivin korneasının yaralanmasında yer alan farklı adımları göstermektedir. Rejenere veya tamamen restore edilmiş kornealar, yaralama prosedürünü takiben çeşitli hücresel ve moleküler teknikler kullanılarak rejeneratif potansiyel açısından analiz edilebilir.

Embriyonik Yaralı Civciv Kornealarında İzsiz Doku Rejenerasyonunun İncelenmesi

Chick embryonic corneal wounds display a remarkable capacity to fully and rapidly regenerate, whereas adult wounded corneas experience a loss of ...

Yetişkin kornea stromasındaki hasar, opak skar dokusu oluşumu nedeniyle kişinin görüşünü tehlikeye atan hızlı bir yara iyileşmesi tepkisine yol açar. Bu protokol, embriyonik civciv kornealarında, yetişkinlerin aksine, yara izi olmadan iyileşebilen yaralar oluşturur. Yaralı embriyonik korneanın, saptanabilir bir yara izi olmadan doğal kornea yapısının tam bir özetine maruz kalma içsel kapasitesi göz önüne alındığında, embriyonik civciv, yarasız kornea yarasının iyileşmesi için moleküler ve hücresel faktörleri aydınlatmak için önemli bir hayvan modeline hizmet eder.Bu tekniğin en zorlu yönü, hem en dış epiteli hem de daha derin kornea stromasını delen tutarlı bir yara oluşturmaktır. Öğrenilirken, yaralı korneaları bir kesitte görmek yararlı olabilir, böylece kornea stromasına yara penetrasyonunun derinliği değerlendirilebilir. Başlamak için, yumurtaları yatay olarak bir tepsiye yerleştirin ve embriyonun beklenen konumunu belirtmek için yumurtanın üstünde işaretleyin.Bu yumurtaları, sallanma fonksiyonu etkinleştirilerek 38 santigrat derece nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin. Embriyonik gelişimin üçüncü gününde yumurtayı inkübatörden çıkarın ve yatay olarak güvenli bir yumurta tutucuya yerleştirin. Diseksiyon makasının keskin ucunu kullanarak yumurta kabuğunun üst kısmında, yumurtanın sivri ucuna yakın küçük bir delik oluşturun.Delikten 18 gauge eğimli hipodermik iğne yerleştirin. İğne yumurtanın iç yüzeyinin dibine ve iğnenin eğim tarafı yumurtanın sivri ucuna bakacak şekilde itilirken, albüminin iki ila üç mililitresini tavuk yumurtasından çıkarın ve atın. Deliği çevreleyen yumurta kabuğu yüzeyini,% 70 etanol ile hafifçe nemlendirilmiş tüy bırakmayan mendillerle temizleyin ve kurulayın.Albümini çıkarmak için yapılan deliği şeffaf bantla kapatın. Diseksiyon masasının keskin ucuyla, yumurta kabuğunun üstünde ikinci bir pencere deliği açın. Makasların, ikinci deliğin hemen altına yerleştirilmiş embriyo veya embriyonik vaskülatürün temas etmesini ve zarar görmesini önlemek için yumurta kabuğuna çok fazla uzanmadığından emin olun.Kavisli forseps kullanarak, kabuğun altındaki gelişmekte olan embriyoyu ortaya çıkarmak ve bunlara erişmek için pencere deliğini yaklaşık iki ila üç santimetre çapında olacak şekilde genişletin. Şimdi, forsepslerin bir ucunu deliğe yerleştirin, yumurta kabuğuna paralel ve yakından yan yana koyun. Diğer forseps ucu yumurta kabuğunun dışına yerleştirildiğinde, iki forseps ucunu dikkatlice sıkıştırarak yumurta kabuğunun küçük parçalarını kırmalarını ve çıkarmalarını sağlar.Embriyoyu doğrudan kaplayan iki ila üç santimetrelik bir pencere kalana kadar yumurta kabuğu parçalarını kırmaya ve çıkarmaya devam edin. Bakteriyel kontaminasyonu sınırlamak için, pencere deliğinden mililitre penisilin başına 50 birim ve mililitre streptomisin başına 50 mikrogram içeren 100 ila 200 mikrolitre zil çözeltisi ekleyin. Pencere deliğini şeffaf yapışkan bant kullanarak kapatın.Bu yumurta sızdırmazlığını, bandın bir köşesini deliğin uzun eksenine hizalayarak ve bandı deliğin kenarından bir ila iki santimetre uzaktaki kabuğa bastırarak gerçekleştirin. Bir tarafta asılı bir bant kapağı kalana kadar açıklığın etrafında sızdırmazlık sağlamaya devam edin. İki bant parçasını birbirine bastırın, deliğin üzerinde kubbeli bir şekil oluşturun ve yumurtayı kapatmayı bitirmek için çıkıntılı bant kapağını kabuğa bastırın.Daha fazla gelişme için pencereli yumurtaları inkübatöre iade edin. Bu yumurtaları yatay tuttuğunuzdan emin olun ve inkübatörlerin sallanma işlevini kapatın. Embriyonun uygun gelişim aşamasında olduğundan emin olmak için diseksiyon mikroskobu kullanın ve amniyotoryonik membranın ve koryoalantoik membranın konumlarını bulun.Daha sonra, amniyotoryonik membranda, membrandan uzanan ön ayağın hemen üstünde, ön ayağın başın üzerindeki zara kadar uzanan bir delik açmak için sterilize edilmiş mikro diseksiyon makası kullanın. İki çift ince steril forseps kullanın ve amniyoniği amniyotiyonik membran ACM ile koryoallantoik membran arasındaki iki bitişik pozisyonda yavaşça tutun. Her ikisi de amniyotik zarı sıkıca kavrayan her bir forseps çiftini, bir çift dorsal olarak embriyoya ve diğer ventralal olarak hareket ederek birbirinden uzaklaştırın.Embriyoyu kaplayan kalan amniyon zarını diseke etmek ve çıkarmak için sterilize edilmiş ince forseps kullanın. Sterilize forseps kullanarak, embriyonun orta kraniyal bölgesinin yakınındaki amniyonu kavrayın ve amniyonu, embriyoya göre daha erken yer değiştirmiş koryoallantoik membrana doğru dikkatlice bir coddle yönünde çekin. Pencere deliğini el yazmasında açıklandığı gibi şeffaf bant kullanarak yeniden kapatın ve daha fazla gelişme için yumurtayı inkübatöre geri verin.Sağ gözün erişilebilir olmasını sağlamak için ekstra embriyonik membranların yeniden konumlandırılması gerekebilir. Embriyonun yumurtadaki konumu nedeniyle sağ göze yaralama için erişilebilir değilse, yaralanmamış bir kontrol görevi görebilir. Koroid dokuya paralel ve aynı hizada olan sağ gözün kornea derecesini kapsayan bir kesi yapmak için mikro diseksiyon bıçağı kullanın.Mikro diseksiyon bıçağını tekrar kullanın, korneayı ilk kesi ile aynı noktada, iki kat daha fazla olacak şekilde bağlayın, böylece iki ve üç kesim korneada aynı pozisyonda bir kesilen olarak meydana gelir. Canlılığa yardımcı olmak için, korioallantoik membranın düzgün büyümesini teşvik etmek için ameliyattan sonra embriyoyu koryoallantoik membranın altına geri çekmek için kavisli iris forsepslerini kullanın. Daha sonra, embriyoyu nemlendirmek ve yumurtayı sterilize etmek için antibiyotik içeren üç ila dört damla ringer çözeltisi ekleyin.Pencere deliğini şeffaf bantla tekrar kapatın ve yumurtayı yatay bırakarak inkübatöre geri dönün. Embriyonun gelişmesine ve kornea yarasının istenen bir süre iyileşmesine izin verin. Kuluçkadan sonra, embriyoyu ötenazi yapın ve gözü Ringer'ın tuzlu su çözeltisinin Petri kabında toplamak için kavisli iris forseps kullanın, gözü göz ve yüz dokusunun buluştuğu arka tarafındaki gözü hafifçe kavrayarak ve tüm gözü dikkatlice kaldırarak yüz dokusundan arındırın.Tüm gözün arkasında üç ila beş santimetrelik küçük bir delik açmak için ince forseps kullanın ve tüm gözü hafif ajitasyonla gece boyunca dört santigrat derecede% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin. İdeal bir yara elde etmek için, keskin bir mikro diseksiyon bıçağı kullanmak ve yırtılma sırasında doğru miktarda basınç uygulamak çok önemlidir. Çok az basınç uygulamak, anterior stromaya yeterince nüfuz etmeden kornea epitelini yırtan sığ bir yaraya neden olacaktır.Çok fazla basınç uygulanması, tüm stromaya nüfuz eden ve sulu mizahı dış ortama maruz bırakan tam ölçüde bir yara ile sonuçlanır. Uygun yırtıcı insizyonların yapılması, başlangıçta yaralamadan sonra sıfır ila üç gün içinde genişleyen ideal bir yara üretir. Bundan sonra, yeniden epitelizasyon ve yeni doku oluşumu, yarayı yara sonrası 11 gün boyunca yara izi bırakmadan kapatmak için meydana gelir.İyileşen yara içindeki hücre dışı matriks proteinleri, fibronektin ve tenassinin spatiotemporal lokalizasyonunun, kornea yeniden epitelizasyonuna karşılık gelen zaman noktalarında yükseldiği ve yara kapanması, epitel hücre göçü ve sağkalımına dahil olduklarını düşündürdüğü bulunmuştur. Tüm mount immünohistokimyası, yaralı merkezi korneayı doğrudan yan yana getiren sinirlerin, iyileşen kornea dokusundan geçici olarak inhibe edildiğini ortaya koymuştur. Daha önceki inhibisyona rağmen, kornea sinirleri sonunda tamamen iyileşmiş kornea dokusunu yaralamadan 11 gün sonra benzer yoğunluk seviyelerine ve benzer modellerde yaralı olmayan kontrollerin embriyonik 18. gününe kadar innerve eder.İkinci jenerasyon harmonik görüntüleme ile kanıtlandığı gibi, santral kornea yarasının değişen derinlikleri boyunca kollajen lif demetleri, yaralanmamış merkezi kornea dokusunun doğal makro yapısına uyan ortogonal olarak düzenlenmiş olarak görülür. Doku greftleme ve boncuk implantasyonu gibi klasik gelişimsel biyoloji yaklaşımlarının yanı sıra retroviral enfeksiyon ve DNA elektroporasyonu gibi gen manipülasyonu için günümüz yaklaşımlarıyla birleştirildiğinde, bu hayvan modeli, skarsız kornea yarasının iyileşmesini teşvik etmek için gerekli moleküler faktörleri ve hücresel mekanizmaları ortaya çıkarmayı vaat ediyor. Fetal skarsız yara iyileşmesini düzenleyen matriks proteinlerinde anahtar moleküler faktörlerin belirlenmesi, daha az yara izi ve normal doku mimarisinin daha iyi özetlenmesi ile daha restoratif bir iyileşme sürecini teşvik eden tedavilerin yolunu açacaktır.

investigating-scarless-tissue-regeneration-embryonic-wounded-chick

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz hücre davranışlarını incelemek için hangi electrospun zarlar içinde mikrocepler imalatı için bir teknik rapor. Özellikle, PLGA (poli (laktid-ko-glikolid)) microfeatures ile donatılmış kornea biyomalzeme cihazların üretimi için microstereolithography ve üretebilmektedir bir kombinasyonunu tarif eder.

Microstereolithography ve ELEKTROÜRETİM kombinasyonu Kornea Yenilenme Nişli ile donatılmış Membranlarını Üretiliyor

Burada açıklanan, epitel dokularının doğal mikro çevreleri içindeki yaralanma tepkisinin mekanizmalarını araştırmak için kullanılabilecek klinik olarak anlamlı bir ex vivo sahte katarakt cerrahisi modelinin oluşturulmasıdır.

Bir Klinik İlgili kurulması<em&gt; Ex Vivo</emYerli mikroçevresinin Epitelyal Yara Tamir incelenmesi için&gt; Mock Katarakt Cerrahisi Modeli

Bu makalede, R26R-Confetti fareleri kullanarak çok renkli bir soy izleme deneyi tasarlama ve gerçekleştirme ilkelerini açıklıyoruz. İlgilenilen diğer dokular için modifiye edilebilen kornea epitel hücrelerinin izlenmesi için özel bir protokol sunuyoruz.

Çok renkli Floresan Reporter Fare kullanma Kornea Hücre Lineage İzleme Bir Yöntem

Bu iletişim kuralı oküler yüzey için bir aşınma fare indirebilmek için ve yara iyileşme süreci bundan sonra izlenecek yöntemi açıklanır. Protokol kısmen göz yüzey epitel anaesthetized farelerde kaldırmak için oküler bir burr yararlanır.

Kornea epitel aşınma oküler Burr ile bir Model olarak kornea için yara iyileşme

Eski bir protokol vivo kornea organ kültür model çalışmaları şifa yara açıklanan için yararlı. Bu modeli sistem rejeneratif iyileşmesine katkıda bulunmak üzere ajanlar veya ilaç toksisitesi organize 3D çok hücreli ortamında etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir.

Ex vivo kornea Organ kültür modeli için yaranın çalışmaları

Burada, bir trefin ve künt bir golf kulübü spud kullanarak farede merkezi bir kornea epitelyal aşınma yarası oluşturmak için bir protokol açıklanmaktadır. Bu kornea yara iyileşmesi modeli yüksek oranda tekrarlanabilir ve şimdi hastalıklar bağlamında tehlikeye atılmış kornea yara iyileşmesini değerlendirmek için kullanılmaktadır.

Kornea Yara İyileşmesini İncelemek İçin Epitelyal Aşınma Modeli

Bu makalede, korneanın anatomisini ve histolojisini ve iyileşme süreçlerini incelemek için geliştirilen yeni bir hayvan modeli açıklanmaktadır. Bu yeni hayvan modeli, insan korneasına birçok benzerliği olan bir korneaya sahip olan Moğol gerbilini kullanıyor.

Yara İyileşmesinin Bir Hayvan Modeli Olarak Moğol Gerbilleri

Descemet's Stripping Only, Fuchs Endotelyal Kornea Distrofisinden kaynaklanan merkezi kornea guttası olan hastalarda, periferik hücrelerin endotel tabakasını yenilemesi için Descemet'in zarının sıyrıldığı deneysel bir prosedürdür. Bu yazıda, eFGF1 (NM141) tarafından uyarılan hızlandırılmış iyileşme ile distrofik insan kornealarında ex vivo'da DSO'yu simüle eden yeni metodoloji sunulmaktadır.

Descemet'in Sadece Mühendislik Fibroblast Büyüme Faktörü 1 Tarafından Uyarılan Hızlandırılmış İyileşme ile Sıyırılmasının İnsan Kornea Organ Kültürü Modeli

Burada, korneayı innerve eden duyu liflerine zarar vermek için üç farklı yöntem öneriyoruz. Bu yöntemler, farelerde akson rejenerasyonunun incelenmesini kolaylaştırır. Diğer hayvan modellerine uyarlanabilen bu üç yöntem, kornea innervasyon fizyolojisi ve rejenerasyonunun incelenmesi için idealdir.

Murin Korneasında Nörotrofik Keratit ve Sinir Rejenerasyonunu İndüklemek için Üç Strateji

Domuz korneasının ex vivo organ kültürü ve epitelyal yara iyileşmesi, kimyasalların oküler toksisitesini test etmek için ekonomik, etik, tekrarlanabilir ve kantitatif bir araç sağlar. Ayrıca, epitelizasyon ve doku onarımının düzenlenmesinin altında yatan mekanizmaların aydınlatılmasına ve diyabetik keratopati ve gecikmiş yara iyileşmesinin tedavisi için terapötiklerin değerlendirilmesine yardımcı olurlar.

Organ Kültürü Domuz Korneaları Kullanılarak Terapötik ve Kimyasal Toksisitenin Değerlendirilmesi ve Epitel Yara İyileşmesi

Tavşanlarda kornea stromal yara onarımı için yerinde mavi ışık-çapraz bağlanabilir jelatin–riboflavin hidrojelinin hazırlanması, zenginleştirilmesi ve uygulanması için tekrarlanabilir bir protokol sunulur; bu süreç cerrahi müdahale, kısmi tarsorrafi ve ameliyat sonrası bakım için prosedürel adımlar içerir.

Tavşanlarda Korneal yara onarımı için zenginleştirilmiş foto-çapraz bağlı jelatin–riboflavin hidrojellerin üretimi ve cerrahi uygulaması

Keşfedin, embriyonik civciv korneasını yaralama ve izsiz iyileşme mekanizmalarını analiz etme yöntemini. Bu protokol, kornea rejenerasyonunu ve doku onarımını incelemek için değerli bir model sunar.

Embriyonik Yaralı Civciv Kornealarında İzsiz Doku Rejenerasyonunun İncelenmesi

Daha fazla video keşfet