Name: Fizyolojik Koşullar Altında Hücre Altı Membran Yeniden Şekillenmesini Araştırmak için Fare Derisinde Nötrofil Migrasyonunun Görüntülenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Keşfedin fare derisinde nötrofil migrasyonunun intravital subselüler mikroskopi ile görüntülenmesini. Bu yöntem, fizyolojik koşullarda hücre membranı dinamiklerini ve bağışıklık yanıtlarını incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Kanser Enstitüsü, Kanser Araştırma Merkezi'nin intramural araştırma programı tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell migration.</a> Comprehensive Physiology. 2 (4), 2369-2392 (2012).</li>
<li>Oudin, M. J., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+chemical+gradients+in+the+tumor+microenvironment+regulate+tumor+cell+invasion%2C+migration%2C+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Symposia+on+Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">Physical and chemical gradients in the tumor microenvironment regulate tumor cell invasion, migration, and metastasis.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 81, 189-205 (2016).</li>
<li>Devreotes, P., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+networks+that+regulate+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Signaling networks that regulate cell migration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), 005959(2015).</li>
<li>Alexandrova, A. Y., Chikina, A. S., Svitkina, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cytoskeleton+in+mesenchymal-to-amoeboid+transition+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin cytoskeleton in mesenchymal-to-amoeboid transition of cancer cells.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 356, 197-256 (2020).</li>
<li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Bioarchitecture%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy.</a> Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).</li>
<li>Wagner, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWagner%2C+R+%22Explanatory+panels+on+physiology+and+development+history+1839%22">Explanatory panels on physiology and development history 1839</a>. , Leopold Voss. Leipzig, Germany. (1839).</li>
<li>Yaniv, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+lymphatic+development+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Live imaging of lymphatic development in the zebrafish.</a> Nature Medicine. 12 (6), 711-716 (2006).</li>
<li>Vinegoni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoscopic+fluorescence+tomography+for+in-vivo+imaging+of+developing+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mesoscopic fluorescence tomography for in-vivo imaging of developing Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. (30), e1510(2009).</li>
<li>Sack, F. -U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+of+pulmonary+microcirculation+after+single+lung+transplantation+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy of pulmonary microcirculation after single lung transplantation in pigs.</a> Transplantation Proceedings. 38 (3), 737-740 (2006).</li>
<li>Rehberg, M., Krombach, F., Pohl, U., Dietzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+3D+visualization+of+cellular+and+tissue+structures+in+intact+muscle+with+second+and+third+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Label-free 3D visualization of cellular and tissue structures in intact muscle with second and third harmonic generation microscopy.</a> PloS One. 6 (11), 28237(2011).</li>
<li>Weigelin, B., Bakker, G. -J., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+third+harmonic+generation+microscopy+of+collective+melanoma+cell+invasion%3A+Principles+of+interface+guidance+and+microvesicle+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Intravital%22%5BJournal%5D)">Intravital third harmonic generation microscopy of collective melanoma cell invasion: Principles of interface guidance and microvesicle dynamics.</a> Intravital. 1, 32-43 (2012).</li>
<li>Poole, J. J. A., Mostaço-Guidolin, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+microscopy+and+the+extracellular+matrix+structure%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Optical microscopy and the extracellular matrix structure: A review.</a> Cells. 10 (7), 1760(2021).</li>
<li>Weigelin, B., Bakker, G. -J., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Third+harmonic+generation+microscopy+of+cells+and+tissue+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Third harmonic generation microscopy of cells and tissue organization.</a> Journal of Cell Science. 129 (2), 245-255 (2016).</li>
<li>Ebrahim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+polyhedral+actomyosin+lattices+remodel+micron-scale+curved+membranes+during+exocytosis+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic polyhedral actomyosin lattices remodel micron-scale curved membranes during exocytosis in live mice.</a> Nature Cell Biology. 21 (8), 933-939 (2019).</li>
<li>Shitara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc42+negatively+regulates+endocytosis+during+apical+membrane+maintenance+in+live+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Cdc42 negatively regulates endocytosis during apical membrane maintenance in live animals.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (3), 324-332 (2019).</li>
<li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+the+actomyosin+complex+in+regulated+exocytosis+revealed+by+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13552-13557 (2011).</li>
<li>Subramanian, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+LTB4-BLT1+axis+regulates+actomyosin+and+%CE%B22-integrin+dynamics+during+neutrophil+extravasation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The LTB4-BLT1 axis regulates actomyosin and β2-integrin dynamics during neutrophil extravasation.</a> The Journal of Cell Biology. 219 (10), 201910215(2020).</li>
<li>Yan, S. L. S., Hwang, I. -Y., Kamenyeva, O., Kehrl, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+F-Actin+filament+organization+during+lymphocyte+transendothelial+and+interstitial+migration+revealed+by+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">In vivo F-Actin filament organization during lymphocyte transendothelial and interstitial migration revealed by intravital microscopy.</a> iScience. 16, 283-297 (2019).</li>
<li>Porat-Shliom, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tissue-wide+synchronization+of+mitochondrial+metabolic+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">In vivo tissue-wide synchronization of mitochondrial metabolic oscillations.</a> Cell Reports. 9 (2), 514-521 (2014).</li>
<li>Takihara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+axonal+transport+of+mitochondria+in+the+diseased+and+aged+mammalian+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10515-10520 (2015).</li>
<li>Calvo-Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+mitochondrial+calcium+levels+associated+with+neuronal+death+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Increased mitochondrial calcium levels associated with neuronal death in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Nature Communications. 11, 2146(2020).</li>
<li>Lämmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+swarms+require+LTB4+and+integrins+at+sites+of+cell+death+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo.</a> Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).</li>
<li>Li, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+imaging+of+immune+responses+in+the+mouse+ear+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton imaging of immune responses in the mouse ear skin.</a> Nature Protocols. 7 (2), 221-234 (2012).</li>
<li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+purification+and+labeling+of+mouse+bone+marrow+neutrophils+for+functional+studies+and+adoptive+transfer+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3AJoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (77), e50586(2013).</li>
<li>Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Ly6C%2FLy6G-based+strategy+to+analyze+the+mouse+splenic+myeloid+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).</li>
<li>Lakschevitz, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+neutrophil+surface+marker+changes+in+health+and+inflammation+using+high-throughput+screening+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of neutrophil surface marker changes in health and inflammation using high-throughput screening flow cytometry.</a> Experimental Cell Research. 342 (2), 200-209 (2016).</li>
<li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Isolation+Protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3AJoVE%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Isolation Protocol.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (17), e745(2008).</li>
<li>MATLAB - Bio-Formats 6.1.0 documentation. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://docs.openmicroscopy.org/bio-formats/6.1.0/users/matlab/index.html">https://docs.openmicroscopy.org/bio-formats/6.1.0/users/matlab/index.html</a> (2022).</li>
<li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Threshold+selection+method+from+gray-level+histograms%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Systems%2C+Man%2C+and+Cybernetics%22%5BJournal%5D)">A Threshold selection method from gray-level histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9, 62-66 (1979).</li>
<li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+digital+video+microscopy+for+colloidal+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Methods of digital video microscopy for colloidal studies.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179, 298-310 (1996).</li>
<li>Xu, C., Prince, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snakes%2C+shapes%2C+and+gradient+vector+flow%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%3A+A+Publication+of+the+IEEE+Signal+Processing+Society%22%5BJournal%5D)">Snakes, shapes, and gradient vector flow.</a> IEEE Transactions on Image Processing: A Publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (3), 359-369 (1998).</li>
<li>Driscoll, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image+analysis+of+nuclear+shape%3A+what+can+we+learn+from+a+prematurely+aged+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">Automated image analysis of nuclear shape: what can we learn from a prematurely aged cell.</a> Aging. 4 (2), 119-132 (2012).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li>
<li>Tauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+risks+of+multiphoton+microscopy+in+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Advantages and risks of multiphoton microscopy in physiology.</a> Experimental Physiology. 87 (6), 709-714 (2002).</li>
<li>Débarre, D., Olivier, N., Supatto, W., Beaurepaire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitigating+phototoxicity+during+multiphoton+microscopy+of+live+Drosophila+embryos+in+the+1.0-1.2+%C2%B5m+wavelength+range%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Mitigating phototoxicity during multiphoton microscopy of live Drosophila embryos in the 1.0-1.2 µm wavelength range.</a> PloS One. 9 (8), 104250(2014).</li>
<li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy%3A+a+practical+guide+on+imaging+intracellular+structures+in+live+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Bioarchitecture%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy: a practical guide on imaging intracellular structures in live animals.</a> Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).</li>
<li>Ng, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+neutrophil+response+to+sterile+tissue+injury+in+mouse+dermis+reveals+a+three-phase+cascade+of+events%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 131 (10), 2058-2068 (2011).</li>
<li>Wu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanoregulin+regulates+a+shedding+mechanism+that+drives+melanosome+transfer+from+melanocytes+to+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Melanoregulin regulates a shedding mechanism that drives melanosome transfer from melanocytes to keratinocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 2101-2109 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar rekabet eden hiçbir mali çıkar beyan etmemektedir.

Hücre göçü ve zarın yeniden şekillenmesi alanındaki onlarca yıllık ilerlemelere rağmen, çok az sayıda çalışma canlı hayvanlarda hücre altı özellikleri görselleştirmek için IVM'yi kullanmıştır. Bu protokolde açıklanan prosedürler, canlı hayvanlarda nötrofil göçü ve daha spesifik olarak bu işlem sırasında plazma zarının yeniden şekillenmesi hakkında yeni bilgiler edinmek için güçlü bir araç sağlar. Bu yaklaşım, doku mikro çevresinin doğal karmaşıklığını göz önünde bulundurarak fizyolojik koşullar altında nötrofil göçünü araştırmayı mümkün kılar. Gerçekten de, MPM kullanımı, seçilen floresan belirteçleri ifade eden fare suşlarının, eksojen doku etiketlemesinin, endojen floresansın uyarılmasının ve SHG veya THG12,13 yoluyla üretilen sinyallerin bir kombinasyonunu kullanarak konakçı doku içindeki çoklu özelliklerin görselleştirilmesini sağlar.
Bu prosedürde dikkate alınması gereken olası bir konu fotohasardır. MPM, fotobleaching ve fototoksisite açısından genellikle konfokal mikroskopiden daha güvenli olsa da, canlı dokuları görüntülerken dikkatli olunmalıdır34. Fototoksisite, küçük parlak beneklerden daha büyük hasarlı doku alanlarına kadar değişen görüntüleme artefaktları oluşturarak veya çeşitli hücre içi yolları inhibe ederek/uyararak sonuçları büyük ölçüde engelleyebilir. Fototoksisiteyi önlemek için, lazer gücü minimumda tutulmalı ve fizyolojik koşulların korunduğunu doğrulamak için uygun kontroller tasarlanmalıdır (örneğin, kan akışının ölçülmesi, oksidatif stres probları)35,36. Ayrıca, cildi içeren bu özel prosedürde, koyu tüylü hayvanlarda bulunan melanin fototoksisiteye daha duyarlı olduğu için albino suşları şiddetle tavsiye edilir 36,37,38.
Prosedürün ana sınırlamaları arasında kullanılan mikroskop sistemi ve nötrofillerin doğası yer almaktadır. MPM kullanımı, diğer ışık mikroskobu teknikleriyle (örneğin, konfokal, eğirme diski) karşılaştırıldığında doku görüntüleme derinliğini önemli ölçüde artırsa da, kulaktaki hücre altı dinamikleri görselleştirme yeteneği dokunun en dış katmanlarıyla (80-100 μm) sınırlıdır. Bunun nedeni, kalın ECM katmanı tarafından üretilen yoğun ışık saçılımının daha derin katmanlardaki göçü araştırmayı zorlaştırmasıdır. Diğer bir sınırlama, nötrofillerin çok kısa ömürlü olması ve gen düzenleme tekniklerini gerçekleştirmek için yeterince uzun süre kültürde tutulamamasıdır. Bu, belirli genlerden yoksun nötrofiller üretmek veya seçilmiş mutasyonları barındırmak için mühendislik fareleri tarafından aşılabilir, bu da elbette araştırma maliyetlerini ve süresini artırır.
Burada açıklanan prosedürler, zar dinamiklerini araştırmak için tasarlanmış olmasına rağmen, sadece nötrofillerde değil, aynı zamanda diğer bağışıklık hücresi tiplerinde ve göçmen hücrelerde de herhangi bir hücre biyolojik sorusunu ele almak için uyarlanabilir. Hücresel davranışlar (örneğin, göç fenotipi, hücre hızı ve yönlülük22) hakkında düşük büyütmeli IVM yoluyla toplanan bilgiler, organellerin yeniden konumlandırılması, protein salgılanması, endositoz, nükleer dinamikler, kalsiyum dinamikleri, hücre iskeleti organizasyonu ve netoz hakkında ISMic aracılığıyla elde edilen mekanik bilgilerle tamamlanabilir ve ilişkilendirilebilir. Farmakolojik ve/veya genetik manipülasyonların kullanılması, ilgi sürecinde spesifik moleküler yolların rolünü vurgulayabilir ve bu da bunu benzersiz ve çok güçlü bir yaklaşım haline getirir.

Yönlendirilmiş hücre göçü, gelişim, bağışıklık tepkisi, doku onarımı ve tümörün başlaması, ilerlemesi ve yayılması dahil olmak üzere farklı fizyolojik ve patolojik süreçler sırasında meydana gelen kritik bir olaydır 1,2. Bu işlem, plazma zarındaki akraba reseptörleri tarafından algılanan ve daha sonra karmaşık hücre içi sinyallere dönüştürülen spesifik hücre dışı kemotaktik sinyallere dayanır. Bu yollar, sırayla, hücre iskeletinin lokal aktivasyonu, zar kaçakçılığı ve yeniden şekillenmesi ve hücre polarizasyonu dahil olmak üzere bir dizi yanıt yoluyla hücre göçünü aktive eder3. İki farklı hücre göçü türü iyi karakterize edilmiştir: mezenkimal ve amip4. Mezenkimal göç nispeten yavaştır (<1 μm/dak), hücreler ve hücre dışı matris (ECM) arasında güçlü yapışmaya dayanır ve metaloproteazların neden olduğu matris bozunmasına bağlıdır. Buna karşılık, enflamatuar ipuçlarına hızla yanıt veren bağışıklık hücrelerinin bir özelliği olan ameboid göçü daha hızlıdır (>10 μm/dak) ve ECM'de gezinmek için zayıf yapışmalar kullanır. Modaliteden bağımsız olarak, hücre göçü, plazma zarının sürekli olarak yeniden şekillenmesini gerektirir, bu da hücrelerin ön kenarında çıkıntılı yapıların oluşmasına neden olur ve bu, arkadaki zarın geri çekilmesi ile sıkı bir şekilde koordine edilir1.
Bu hücre altı süreçlerin altında yatan moleküler mekanizmaları çözmek için, göç eden hücrelerdeki zarların dinamiklerini uygun bir zamansal ve mekansal çözünürlükte görselleştirmek esastır. Ayrıca, zarın yeniden şekillenmesi, göç eden hücreleri çevreleyen doku mikro ortamının özelliklerinden güçlü bir şekilde etkilendiğinden, bu süreci doğrudan doğal dokuda, canlı hayvanlarda görüntülemek çok önemlidir. Bu, intravital mikroskopi (IVM) kullanılarak gerçekleştirilir5. İlk IVM görüntüleme, ~ 200 yıl önce, lökosit ekstravazasyonunun basit bir trans-aydınlatma mikroskobu6 kullanılarak görselleştirildiği ve daha sonra IVM'nin esas olarak Zebra Balığı ve Drosophila 7,8 gibi yarı saydam model organizmalar üzerinde kullanıldığı zaman gerçekleştirildi. Son yirmi yılda, IVM farelerde, sıçanlarda ve domuzlar gibi daha büyük memelilerde hücresel süreçleri araştırmak için başarıyla kullanılmıştır 5,9. Bu, 1) konfokal ve çoklu foton (MP) mikroskobundaki önemli gelişmeler ve 2) floresan etiketli proteinleri ve raportörleri ifade etmek için çeşitli hayvan modellerinin hızlı mühendisliğine izin veren CRISPR-Cas9 gibi gen düzenleme teknolojisinin artması nedeniyle mümkün olmuştur. Ayrıca, tümör başlangıcı, hücre göçü ve bağışıklık tepkisi gibi süreçler sırasında tek tek hücrelerin ve mikro çevrelerinin görselleştirilmesi, damar sistemini etiketlemek için boyaların sistemik olarak eklenmesi gibi diğer dışsal etiketleme biçimleriylemümkün olmuştur 10,11 ve İkinci Harmonik Nesil (SHG)10 yoluyla kollajen gibi endojen moleküllerin uyarılması, 12 ve Üçüncü Harmonik Nesil (THG) yoluyla sinir lifleri11,13. Son olarak, kalp atışı ve solunuma bağlı hareket artefaktlarını en aza indirmek için tekniklerde bir gelişme, araştırmacıların canlı hayvanlarda gözlemlenenlere benzer bir çözünürlük düzeyinde birkaç hücre altı olayı doğrudan görüntülemesine ve araştırmasına olanak tanıyan intravital hücre altı mikroskopinin (ISMic) geliştirilmesine yol açmıştır in vitro 14,15,16,17 . ISMic örnekleri arasında ekzositoz 14,15,16,17 ve endositoz15 sırasında hücre iskeleti dinamiklerinin araştırılması, hücre göçü17,18 sırasında hücre iskeleti dinamik yeniden şekillenmesi, mitokondriyal lokalizasyon ve metabolizma 19,20 ve beyinde kalsiyum sinyalizasyonu21 yer alır.
Bu protokol, ISMic kullanan canlı bir farenin kulak derisinde nötrofil göçü sırasında hücre altı çözünürlükte hücre zarının yeniden şekillenmesini araştırmak için farklı adımları ve prosedürleri detaylandırır. Bu yaklaşım, daha önce açıklananprotokoller 22,23'e dayanmaktadır ve daha yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlük elde etmek için uyarlanmıştır.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL tüpler</td><td>USA Scientific</td><td>4036-3204</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tüpler</td><td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>1 mL şırınga</td><td>Covidien</td><td>8881501400</td><td></td></tr><tr><td>27 G iğne</td><td>Kendall</td><td>827112</td><td></td></tr><tr><td>27 G kanatlı infüzyon seti</td><td>Terumo</td><td>SV*27EL 30x</td><td></td></tr><tr><td>objektif</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO30XS</td><td>1.05 NA, silikon yağına daldırma</td></tr><tr><td>40x objektif</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO40XS</td><td>1.23 NA, silikon yağına daldırma</td></tr><tr><td>60 mm tabaklar</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>6 mL şırınga</td><td>Kendall</td><td>8881516937</td><td></td></tr><tr><td>Asepromazin (10 mg / mL)</td> <td>Vet one</td><td>13985-587-50</td><td></td></tr><tr><td>ACK lizis tamponu</td><td>Kalite Biyolojik</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>Denge</td><td>VE</td><td>EK-1200A</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Hücre süzgeci 40 & m</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS431750</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td>N/A</td><td>Görüntü görselleştirme/analiz yazılımı</td></tr><tr><td>Fluoview Yazılımı</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td>Edinme yazılımı</td></tr><tr><td>FVB fare suşu</td><td>Jackson</td><td>N/A</td><td>FVB arka plan</td></tr><tr><td>Gaz Anestezi sistemi</td><td>Patterson veteriner</td><td>07-8915712</td><td>Link 7 modeli</td></tr><tr><td>Yeşil Hücre izleyici</td><td>Thermo</td><td>C2925</td><td>1 mM konsantrasyona ulaşmak için hücre kültürü sınıfı DMSO'da çözündürüldü (1000x)</td></tr><tr><td>Epilasyon kremi</td><td>Nair</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (w/o Ca2+, Mg2+)</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M pH 7.3</td><td>Kalite Biyolojik</td><td>118-089-721</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1991</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11191-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>N/A</td><td>Görüntü görselleştirme/analiz yazılımı</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Vet one</td><td>13985-528-40</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin (100 mg/mL)</td><td>Vet one</td><td>13985-584-10</td><td></td></tr><tr><td>LyzM-cre x mT/mG</td><td>laboratuvarda üretildi</td><td>N/A</td><td>C57BL/6J arka plan</td></tr><tr><td>Manuel mikromanipülatör</td><td>WPI</td><td>M3301R</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MatWorks</td><td>N/A</td><td>Analiz yazılımı</td></tr><tr><td>laboratuvarda üretilen</td><td>mtomato fare suşu</td><td>N/A</td><td>mT/mG, FVB arka plan</td></tr><tr><td>Multifoton</td><td>lazer Spectra Physics</td><td>Insight DS+</td><td></td></tr><tr><td>Multiphoton Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>MPE-RS</td><td></td></tr><tr><td>Nanofil 10 & mikro; L şırınga</td><td>WPI</td><td>NANOFIL</td><td></td></tr><tr><td>Nanofil 33 G iğne</td><td>WPI</td><td>NF33BV-2</td><td></td></tr><tr><td>Objektif ısıtıcı</td><td>Bioptechs</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Objektif ısıtıcı kontrolörü</td><td>Bioptechs</td><td>150803</td><td></td></tr><tr><td>Oftalmik merhem</td><td>Majör</td><td>NDC 0904-6488-38</td><td></td></tr><tr><td>Oksijen konsantratörü</td><td>Caire</td><td>VisionAire 5</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Ca2+, Mg2+ olmadan)</td> <td>Kalite Biyolojik</td><td>114-058-131</td><td></td></tr><tr><td>Tuzlu</td><td>Kalite Biyolojik</td><td>114-055-101</td><td></td></tr><tr><td>Sahne ısıtıcısı</td><td>Okolab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sahne ısıtıcı kontrolörü</td><td>Okolab</td><td>H401-T</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi bant</td><td>3M</td><td>1538-1</td><td>Hipoalerjenik</td></tr><tr><td>Şırınga sürücüsü</td><td>Harvard Aparatı</td><td>PHD Ultra</td><td></td></tr><tr><td>Isıtma Pedleri</td><td>Parkland Scientific</td><td>A2789B</td><td></td></tr><tr><td>Isıtma Pompası</td><td>Parkland Scientific</td><td>TP-700</td><td></td></tr><tr><td>Ksilazin (100 mg / mL)</td> <td>Veteriner bir</td><td>13985-704-10</td><td></td></tr></tbody></table>

fizyolojik koşullar altında hücre altı membran yeniden Şekillenmesini araştırmak için fare derisinde nötrofil migrasyonunun görüntülenmesi

Imaging Neutrophil Migration in the Mouse Skin to Investigate Subcellular Membrane Remodeling Under Physiological Conditions

Dokularda bağışıklık hücresi alımı ve işlevi üzerine yapılan çalışmalar, son yirmi yılda çok aktif bir alan olmuştur. Nötrofiller, iltihaplanma bölgesine ulaşan ve enfeksiyon veya doku hasarı sırasında doğuştan gelen bağışıklık tepkisine katılan ilk bağışıklık hücreleri arasındadır. Şimdiye kadar, nötrofil göçü, tek tip stimülasyona veya agaroz veya mikro-akışkan kanallar altında sınırlı göçe dayalı çeşitli in vitro deneysel sistemler kullanılarak başarılı bir şekilde görselleştirilmiştir. Bununla birlikte, bu modeller, nötrofillerin in vivo olarak karşılaştığı karmaşık mikro ortamı özetlememektedir. İntravital hücre altı mikroskobu (ISMic) gibi çoklu foton mikroskobu (MPM) tabanlı tekniklerin geliştirilmesi, fizyolojik koşullar altında hücre altı çözünürlüklerde nötrofil dinamiklerini görselleştirmek ve araştırmak için benzersiz bir araç sunar. Özellikle, canlı anestezi uygulanmış bir farenin kulağı, erişilebilirlik kolaylığı ve cerrahi maruziyet eksikliği nedeniyle nötrofil interstisyel göçünü gerçek zamanlı olarak takip etmek için deneysel bir avantaj sağlar. ISMic, hem hücresel hem de daha da önemlisi hücre altı süreçleri zaman içinde 3D (4D) olarak izlemek için gerekli optik çözünürlüğü, hızı ve alım derinliğini sağlar. Ayrıca, interstisyel mikroçevrenin (yani, kan damarları, yerleşik hücreler, hücre dışı matris) çok modlu görüntülemesi, seçilmiş floresan belirteçleri eksprese eden transgenik farelerin, floresan problar aracılığıyla eksojen etiketlemenin, doku içsel floresansının ve ikinci/üçüncü harmonik üretilen sinyallerin bir kombinasyonu kullanılarak kolayca gerçekleştirilebilir. Bu protokol, 1) fare kulağına evlat edinen transfer için nötrofillerin hazırlanmasını, 2) optimal hücre altı görüntüleme için farklı ayarları, 3) fizyolojik bir yanıtı korurken hareket artefaktlarını en aza indirme stratejilerini, 4) ISMic kullanılarak nötrofillerde gözlemlenen zar yeniden şekillenme örneklerini ve 5) in vivo göç eden nötrofillerde zar yeniden şekillenmesinin kantitatif analizi için bir iş akışını açıklar.

Burada, sırasıyla hücresel ve hücre altı çözünürlük sağlayan klasik IVM ve ISMic'i göstermek için iki farklı sonuç seti sunulmuştur. İlk örnekte, nötrofiller vahşi tip (WT) bir fareden saflaştırıldı, sitoplazmayı boyamak için Cell Tracker Green ile etiketlendi ve plazma zarını hedefleyen bir floresan proteini eksprese eden transgenik bir fareye enjekte edildi (mTomato faresi, mT / mG33 olarak da bilinir, Şekil 1 ve Film 1 ve Film 2). Bu alıcı fare, IVM tabanlı yaklaşımla (adım 6.8.1) kan damarları, yerleşik hücreler ve saç folikülleri gibi kulak dokusundaki yapısal özelliklerin görselleştirilmesini sağladı (Şekil 1C ve Film 1). SHG (uyarma dalga boyunun yarısında tespit edilen) yoluyla ortaya çıkan kollajen lifleri, nötrofillerin enjekte edildiği dermiste karmaşık bir ağda düzenlendi. Saç foliküllerinin (HF) kenarı boyunca, bir epitel hücresi tabakası (yani keratinositler) gözlendi. Bazen, deride lokal bir çöküntü ile sonuçlanan kalıntı kıllardan elde edilen artefaktlar görselleştirildi (H). Lazer kaynaklı yaralanmalar, tüm kanallarda tespit edilen güçlü oto-floresansları ve kollajen düzenlemesindeki değişiklikler sayesinde kolayca görüntülenebildi (Şekil 1D). Derinin 3B mimarisinin ve enjekte edilen nötrofillerin lokalizasyonunun daha eksiksiz bir görünümü, derinin dış katmanlardan iç katmanlara kadar bir Z yığınını ve bir 3B hacim oluşturmayı tasvir eden Film 1'de takdir edilebilir. Hızlandırılmış görüntüleme, nötrofillerin kulak derisini örneklediğini ve ECM ve konak doku ile etkileşime girdiğini gösterdi (Film 2). Bu çözünürlükte görüntüleme ve her 30 saniyede bir Z yığını elde etmek, hücre izlemenin gerçekleştirilmesine ve hareketlilik parametrelerinin (yani hız ve yönlülük) ölçülmesine izin verir, ancak bu çözünürlükte membran yeniden şekillenmesinin kesin ve ayrıntılı bir analizi zordur.
İkinci örnekte, membranın yeniden şekillenmesi, LyzM-cre mT / mG farelerinden saflaştırılan ve WT hayvanlarına enjekte edilen mGFP eksprese eden nötrofiller kullanılarak ISMic yaklaşımı (adım 6.8.2) yoluyla değerlendirildi (Şekil 2A, deneysel akış şeması). ISMic protokolü kullanılarak (Şekil 2B'deki Film 3 ve hareketsiz görüntüler) ve lazer yaralanması üzerine, göç sırasında plazma zarının dinamik yeniden şekillenmesi gözlenir ve ön kenarda zar çıkıntılarının oluşumu ve hücrelerin arkasının geri çekilmesi açıkça görüntülenir (Şekil 2 ve Film 3). Film 3'te vurgulanan zaman atlamalı sekanslar, ECM ile etkileşimlerin karmaşıklığını ortaya çıkarır. Gerçekten de, nötrofiller ya lifler boyunca ya da aralarındaki boşluklarda hareket eden interstisyel boşluktan göç etti. Son olarak, eğrilikteki değişiklikler ve hücrelerin önündeki ve arkasındaki alan değişiklikleri gibi nicel yönler her bir zaman noktası için niceliksel olarak ölçüldü. Örnek olarak Şekil 2B'de açıklanan hücre kullanılarak, plazma zarının yerel dinamikleri, hücre yüzeyinin altında yatan 100 sınır noktasının tanımlanmasına dayanan bir algoritma boru hattı (bkz. adım 7) kullanılarak analiz edildi (Şekil 3A). Lokal eğrilikteki (Şekil 3B) ve plazma zarı çıkıntılarının altını çizdiği alandaki (Şekil 3C) değişiklikler her bir sınır noktası için hesaplanmış ve her bir zaman dilimi için kimografi olarak rapor edilmiştir (Şekil 3D,E). Hücrelerin hem önü hem de arkası, hücrelerin yan tarafına göre daha yüksek eğriliği korur (Şekil 3D); negatif alan değişiklikleri (geri çekilmeler, mavi bölgeler), hücrelerin arkasında, pozitif alan değişikliklerinin daha belirgin olduğu ön kenara göre daha belirgindir (çıkıntılar, kırmızı bölgeler) (Şekil 3E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63581/63581fig01.jpg"> Şekil 1: Fare kulağı derisindeki nötrofillerin IVM'si. (A) Mikroskop sahnesinde kulak kurulumunun şematik çizimi. (B) Deneysel akış şeması. (C) Farklı çıkıntılara sahip, floresan etiketli nötrofiller enjekte edilmiş bir mTomato faresinin kulak derisinin temsili görüntüsü. Saç folikülü (HF), Kan Damarı (BV), Epidermis (E), Dermis (D), Bazal Hücre Tabakası (BCL) ve Saç artefaktı (cilt yüzeyinde kalan kıl nedeniyle, H). (D) Steril lazer yaralanmasından sonra fare derisinin temsili görüntüsü: mavi kanal (sağda), yeşil ve kırmızı kanallar (ortada), birleştirilmiş görüntü (solda). Görüntünün sol tarafında, hem yeşil hem de kırmızı kanallarda güçlü bir otofloresan emisyonunun yanı sıra kollajen-I liflerinde bir delik oluşumuyla gözlemlenen ECM'nin bozulması nedeniyle yaralanma görülebilir. C ve D'de Yeşil: nötrofiller; Kırmızı: fare konak dokusu; Camgöbeği: Kollajen-I SHG. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/63581fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63581/63581fig02.jpg"> Şekil 2: Bir WT fare kulağında göç eden mGFP nötrofilinin hızlandırılmış çekimi. (A) Deneysel akış şeması. (B) Film 3'ten temsili hareketsiz görüntüler. (C) Membran 3D organizasyonunu görselleştirmek için aynı hücrenin hacim oluşturması. Yüksek zar dinamiği alanı bir okla gösterilir (geri çekme için kırmızı ve çıkıntı için mavi). (D) İşlenen hücre hacminin yakın çekim ve eğik görselleştirmesi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/63581fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63581/63581fig03.jpg"> Şekil 3: ISMic kullanılarak toplanan membran dinamiğinin nicelleştirilmesi için analiz hattı. (A) Şekil 2B'de açıklanan mGFP nötrofil için iki ardışık çerçeve arasında hücre konturu belirleme ve sınır noktalarının yeniden bölünmesi (100 sınır noktası). (B) Renkli sınırlar, her sınır noktası için belirlenen yerel zar eğriliğini temsil eder. (C) Yerel alan, iki ardışık çerçeve arasındaki değişiklikler (geçerli: mavi ve sonraki: kırmızı). Yeşil alanlar, yerel membran hareketinin izleme sonuçlarını temsil eder. Sarı oklar, zar yer değiştirmesinin genel yönünü gösterir. (D) Hücrenin zaman içindeki sınır eğriliği kimografisi. Dikey eksen, 1 ve 100'ün göç yönüne göre hücrenin arkasını temsil ettiği sınır noktaları indekslerini temsil eder. (E) Zaman içinde hücrenin zar çıkıntısını (kırmızı) ve zar geri çekilmesini (mavi) yansıtan lokal alan değişikliği kimografisi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/63581fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Film 1: IVM kullanılarak bir mTomato fare kulağında görselleştirilen yeşil etiketli nötrofiller. Kırmızı: mTomato konakçı fare dokusu. Camgöbeği: Kollajen-I SHG; Yeşil: nötrofil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/Movie1_Jove_final.mp4" target="_blank">Bu filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Film 2: Bir mTomato fare kulak derisinde göç eden nötrofillerin IVM'si. Videolar, 5 kare/sn kare hızıyla ͂27 dakika boyunca elde edilen bir görüntü yığınının maksimum yoğunluktaki projeksiyonlarıdır. Kırmızı: mTomato konakçı fare dokusu. Camgöbeği: Kollajen-I SHG; Yeşil: nötrofil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/Movie2_Jove_final.mp4" target="_blank">Bu filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Film 3: Bir WT fare kulağında nötrofil göçü sırasında zar yeniden şekillenmesinin ISMic'i. Videolar, 10 kare/sn kare hızıyla ͂8 dakika boyunca elde edilen bir görüntü yığınının maksimum yoğunluktaki projeksiyonlarıdır. Kırmızı: mTomato konakçı fare dokusu. Camgöbeği: Kollajen-I SHG; Yeşil: mGFP nötrofil; Açık yeşil: işlenmiş nötrofil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/Movie3_Jove_final.mp4" target="_blank">Bu filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Nötrofil göçü, kemoatraktana ve hücre dışı mikro çevre ile etkileşimlerine yanıt olarak plazma zarının hızlı ve sürekli olarak yeniden şekillenmesine dayanır. Burada açıklanan, anestezi uygulanmış farelerin kulağına enjekte edilen nötrofillerde zar yeniden şekillenmesinin dinamiğini araştırmak için İntravital Hücre Altı Mikroskobuna dayalı bir prosedürdür.

Fizyolojik Koşullar Altında Hücre Altı Membran Yeniden Şekillenmesini Araştırmak için Fare Derisinde Nötrofil Migrasyonunun Görüntülenmesi

The study of immune cell recruitment and function in tissues has been a very active field over the last two decades. Neutrophils are among the first ...

Bu yöntem, intravital hücre altı mikroskopi kullanılarak canlı hayvanda nötrofil göçü sırasında zarın yeniden şekillenmesini incelemek için bir tekniği açıklar. Bu protokol, fiziksel koşullar altında hayvan göçü sırasında membran dinamiklerini incelemek ve doku mikro çevresini dahil etmek için benzersiz bir yaklaşım sağlar. Bu teknik, farklı hücre tiplerinde ve göçmen hücrelerde zarın yeniden şekillenmesi ve hücre iskeleti dinamik organının yeniden konumlandırılması ve zar kaçakçılığını ele almak için uyarlanabilir.Başlamak için, yeşil floresan boyayı, 1.5 mililitre BSA kaplı tüpte vahşi tip fareden saflaştırılmış nötrofil süspansiyonuna ekleyin. Bir tüp döndürücüde hafif çalkalama altında oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. HBSS kullanarak üç yıkama yapın, ardından oda sıcaklığında beş dakika boyunca 400 kez G'de santrifüjleyin ve peleti bir mililitre Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi içinde yeniden süspanse edin.Bu süspansiyonu, enjeksiyon prosedürüne kadar hafif çalkalama altında bir tüp döndürücüde BSA kaplı tüpe yerleştirin. Enjeksiyondan önce, 20 mikrolitre başına 2 milyon ila 5 milyon hücre yoğunluğuna ulaşmak için hücre peletini tuzlu su çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. Anestezi uygulanmış hayvanı, vücut ısısını korumak için 37 santigrat dereceye sahip bir ısıtma pedine aktarın.Pençe çekme refleksini test ettikten sonra, görüntü kalitesini optimize etmek için ince bir düzeltici kullanarak kulaktaki tüyleri alın. Hayvanı yan yatırın, kulağın kenarını tutun ve cerrahi bandı kullanarak ısıtma pedi boyunca düzleştirin, ardından 33 gauge iğne ile donatılmış bir şırıngayı nötrofil süspansiyonu ile doldurun ve bir mikromanipülatöre monte edin. İğneyi yavaşça kulağa doğru hareket ettirin ve cildi yavaşça delin.İğne cildin içine girdikten sonra, pistonu yavaşça itin ve iki ila üç mikrolitre hücre süspansiyonu verin. Enjeksiyonu kulağın iki ila üç farklı bölgesi için dikkatlice tekrarladıktan sonra, cerrahi bandı dikkatlice çıkarın ve hayvanın gözetim altında bilincini geri kazanmasına izin verin. Doku ve hücrelerin enjeksiyon prosedüründen sonra iyileşmesine izin vermek için görüntülemeden önce hayvanın bir saat dinlenmesine izin verin.Anestezi uygulanmış hayvanı mikroskop sahnesine yerleştirmeden önce mikroskobun açık olduğundan ve tabla ile lenslerin 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtıldığından emin olun. Sahnedeki deliği bir cam lamel ile kapatın. Anestezi uygulanmış hayvanı dikkatlice sahneye taşıyın.Görüntüleme bir saatten fazla planlanıyorsa, oftalmik merhem uygulayın ve kanatlı infüzyon bazlı perfüzyon sistemini sabitleyin. Lamelin ortasına bir damla salin damlatın ve nötrofil enjekte edilen kulağı üzerine yerleştirin. Hava ceplerini çıkarmak için lamel ortası boyunca steril bir pamuklu çubuk kullanarak kulağı nazikçe düzleştirin.Kulağın yan tarafına hayvanın kafasına daha yakın olan tahta bir çubuğu hafifçe bastırarak ve bantla kilitleyerek kulağı sabitleyin. Ardından mikroskop merceğini kullanarak bir ilgi alanı bulun ve çoklu foton toplama moduna geçin. Yeşil floresan boya, mTomato ve kollajen-I'in aynı anda elde edilmesini sağlamak için lazer uyarma dalga boyunu 900 ila 930 nanometreye ayarlayın.Ardından, yayılan ışığı toplamak için dedektörlere uygun ayna setini ve filtre kombinasyonlarını ayarlayın. Donanım yapılandırmasına en uygun ayarı belirleyin. Göç eden hücreler 30 saniye ila bir dakikalık aralıklarla izlenebilse bile, hücre altı olayları en az on saniyeden daha kısa aralıklarla daha yüksek bir hızda görüntüleyin.Klasik intravital mikroskopi yaklaşımında, hücre göçünü izlemek ve konakçı fare dokusunu araştırmak için 512 x 512 piksel görüntü boyutuna sahip bir 30X lens ve bir Galvo tarayıcı kullanın ve her 30 saniyede bir 30 mikrometre derinliğinde bir hacmin görüntülenmesine izin vermek için iki mikrometrelik bir adım boyutuna sahip motorlu aşamayı kullanarak Z ekseni yer değiştirmesini ayarlayın. İntravital hücre altı mikroskopi yaklaşımında, son derece dinamik membran yeniden şekillenmesini daha yüksek bir büyütme ve çözünürlükte görüntülemek için ortalama üç kez 40X lens ve bir rezonans tarayıcı kullanın. Ayrıca, her dört ila beş saniyede bir 20 mikrometre derinliğinde hacim görüntülemeye izin vererek, bir mikrometre adım boyutuna sahip bir piezo kullanarak Z ekseni yer değiştirmesini ayarlayın.Yüksek güçlü bir uyarma lazerini 10 saniye boyunca 20 x 20 mikrometrelik dar bir alana odaklayarak nötrofil göçünü tetiklemek için steril bir lazer yaralanmasına neden olun. Lazerin neden olduğu yaralanmayı, tüm kanallarda görünen güçlü otofloresan sinyalleri ve bunun sonucunda ortaya çıkan kollajen düzenlemesindeki değişiklikle tanımlayın. Daha fazla analiz için deneyin sonunda verileri kaydedin.Alıcı fare, intravital mikroskopi tabanlı bir yaklaşımla kulak dokusundaki kan damarları, yerleşik hücreler ve saç folikülleri gibi yapısal özelliklerin görselleştirilmesini sağladı. Lazere bağlı yaralanmalar, tüm kanallarda tespit edilen güçlü otofloresansları ve kollajen düzenindeki değişiklikler nedeniyle kolayca görüntülendi. Derinin üç boyutlu mimarisinin ve enjekte edilen nötrofillerin lokalizasyonunun tam bir görünümü, üç boyutlu bir hacim oluşturmada cildin dış katmanlarından iç katmanlarına doğru bir Z yığınını tasvir eder.Hızlandırılmış görüntüleme, kulak derisini örnekleyen ve hücre içi matriks ve konak doku ile etkileşime giren nötrofilleri gösterdi. İntravital hücre altı mikroskopi kullanılarak, göç sırasında plazma zarının dinamik olarak yeniden şekillenmesi, ön kenarda zar çıkıntılarının oluşumu ve hücrelerin arkasının geri çekilmesi açıkça görselleştirilir. Hızlandırılmış diziler, hücre içi matris ile etkileşimlerin karmaşıklığını ortaya koymaktadır.Plazma zarının yerel dinamikleri, hücre yüzeyinin altında yatan 100 sınır noktasının tanımlanmasına dayanan bir algoritma hattı kullanılarak analiz edildi. Yerel eğrilik ve plazma zarı çıkıntılarının altını çizdiği alandaki değişiklikler her bir sınır noktası için hesaplandı ve her zaman dilimi için kimografi olarak raporlandı. Hücrelerin hem önü hem de arkası, hücrelerin yan tarafına göre daha yüksek eğriliği korur.Negatif alan değişiklikleri, hücrelerin arkasında, pozitif alan değişikliklerinin daha belirgin olduğu ön kenara göre daha belirgindir. Görüntülemeyi takiben, ilgilenilen hedefi daha fazla değerlendirmek ve mekanizmaları aydınlatmak için doku toplanabilir, sabitlenebilir ve boyama için işlenebilir. Zar dinamiklerini görüntülemek için tasarlanan bu prosedür, farklı hücre tiplerinde ve kendi ortamlarında göç eden hücrelerde daha geniş hücre biyolojisi sorusunu ele alacak şekilde uyarlanabilir.

imaging-neutrophil-migration-mouse-skin-to-investigate-subcellular

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada, fare Kapkaççı lökosit homing çalışmada non-invaziv bir iki foton (2P) mikroskopi yaklaşımı açıklar. Biz, bizim doku görüntüleme hazırlık teknik yönlerini tartışmak ve yürütme ve veri toplama için kurulmuş ilk tipik bir deney yoluyla okuyucu yürümek.

Lökosit Homing Göç ve non-invaziv Görüntüleme In vivo</em

Biz aydınlık intravital mikroskopi, in vivo olarak nötrofil kemoatraktan kaynak yanıt nötrofil göçünü sırasında dinamik nötrofil-endotel hücre etkileşimleri ölçmek için bir protokol tanımlamaktadır. Nötrofil intraluminal tarama, fare Cremaster'ın kas dokusu transendoteliyal göç ve kemotaksis zaman lapsed video ImageJ ile fotoğraf ve takip ile görüntülendi.

Takip Nötrofil Lumen Crawling, intravital video Mikroskopi Doku transendoteliyal Göç ve Kemotaksis

Bu video, GFP eksprese eden nötrofillere sahip bağışıklığı baskılanmış, transgenik bir farede bir enfeksiyon bölgesindeki nötrofil alım dinamiklerini incelemek için in vivo görüntülemeyi göstermektedir. Bir enfeksiyona neden olmak için ışıldayan bakterilerin enjekte edilmesini içerir. Bu, izlenmesi görüntüleme ile yapılan enfeksiyon bölgesine nötrofil alımına yol açar.

Bir Murin Modelinde Enfeksiyon Bölgesinde Nötrofil Alım Dinamiklerinin ve Bakteri Yükünün İzlenmesi

Lökositler paraselüler veya transselüler yolu kullanarak endotel tek tabaka çapraz. Biz endojen junctional dağıtım VE-kaderin ve PECAM-1 lökosit transendotelyal göç sırasında fizyolojik akış altında iki âlemden yolları arasında ayrım için takip basit bir deney geliştirildi.

Nötrofil Hicret altında Fizyolojik Akış sırasında endotel hücre-hücre Eklemlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

Anestezi uygulanmış farelerde intravital konfokal mikroskopi kullanarak kararlı durum ve enflamatuar koşullar altında mezenterik venlerdeki nötrofillerin ve monositlerin davranışını izlemek için bir protokolü detaylandırıyoruz.

Real Time Anestetize Farelerde Intravital Mikroskopi Mezenterik Damarlardaki nötrofiller ve monositler Görüntüleme

enflamasyon bölgelerinde CD4 efektör T hücrelerinin geçiş motilite yöneten mekanizma nispeten bilinmemektedir. Biz görselleştirmek ve yerinde bu hücrelerin dinamik davranışının çalışması için izin iltihaplı kulak dermiş in vitro -astarlı CD4 T hücrelerinde işlemek için non-invaziv bir yaklaşım sunuyoruz.

Iltihaplı Dermisinde içinde görüntüleme CD4 + T hücre Geçiş Göç

Bu mevcut protokol, canlı hayvanlarda nötrofil hazırlamanın dinamik sürecinin izlenmesini sağlamak için floresan raportörler, in vivo etiketleme ve intravital görüntüleme teknikleri kullanır.

IL-1β Promoter odaklı DsRed Muhabir Fare kullanma Nötrofil Hazırlama intravital Görüntüleme

Burada, fare cremaster kasının post-kılcal venüzlerinde intravital mikroskopinin nasıl yapılacağını gösteriyoruz. Yaygın olarak farklı inflamasyon ve sepsis modellerine, özellikle kemokinler ve sitokinler tarafından indüklenenlere uygulanan, abartılı kas lökosit infiltrasyonu içeren muscolopatilerin çalışmasında önemini vurguluyoruz.

İntravital Mikroskopi Ile Değerlendirilen Farelerde Cremaster Kasın Lökosit İnfiltrasyonu

Burada nötrofil göçünü ve infiltrasyonu hem in vivo hem de in vitro olarak değerlendirmek için üç yöntem sayılmaktadır. Bu yöntemler nötrofil göç hedefleyen umut verici terapötik keşfetmek için kullanılabilir.

Farelerde Nötrofillerin Göçü ve İnfiltrasyonunun Saptanması

Burada, zebra balığı nötrofillerde kemoattractant reseptör dinamiklerinin canlı görüntüleme ve kantitatif analizini gerçekleştirmek için protokolleri açıklıyoruz.

Yara Yanıtları Sırasında Zebra Balığı Nötrofillerdeki Kemokin Reseptörlerinin Canlı Görüntülenmesi

Eklemlerin in vivo görüntülemesi, iltihaplı eklemler içindeki lökositlerin göç davranışını ve moleküler dinamiklerini ortaya çıkarmak için değerli bir tekniktir. Burada, tip II kollajen kaynaklı artritin (CIA) fare modeli kullanılarak eklemlerin in vivo görüntülemesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

In Vivo'da Görüntüleme, eklemlerdeki lökositlerin göç davranışını ortaya çıkarıyor

Keşfedin fare derisinde nötrofil migrasyonunun intravital subselüler mikroskopi ile görüntülenmesini. Bu yöntem, fizyolojik koşullarda hücre membranı dinamiklerini ve bağışıklık yanıtlarını incelemek için kullanılır.

Fizyolojik Koşullar Altında Hücre Altı Membran Yeniden Şekillenmesini Araştırmak için Fare Derisinde Nötrofil Migrasyonunun Görüntülenmesi (Video) | JoVE Journal

Fizyolojik Koşullar Altında Hücre Altı Membran Yeniden Şekillenmesini Araştırmak için Fare Derisinde Nötrofil Migrasyonunun Görüntülenmesi

Daha fazla video keşfet