Name: Membranla İlişkili Makromolekül Dinamiğini Karakterize Etmek için Kütleye Duyarlı Partikül İzleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 30 s
Description: Keşfedin iSCAT tabanlı kütle duyarlı parçacık izleme yöntemiyle lipid membranlarındaki makromoleküllerin dinamiklerini etiketsiz gözlemleyin. Bu protokol biyofizik ve nörobilim araştırmalarında oligomerik durumları belirlemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Philipp Kukura, Gavin Young ve Refeyn yazılım ekibinin desteğini içtenlikle takdir ediyor ve görüntü analiz kodunun bazı bölümlerini paylaşarak yardımlarını kabul ediyoruz. Ticari Refeyn kütle fotometresine erişim sağladığı için Cryo-EM MPIB Çekirdek Tesisi'ne teşekkür ederiz. F.S., Jürgen Plitzko ve Wolfgang Baumeister tarafından verilen destek ve finansmanı minnetle kabul eder. T.H. ve PS, Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı) - Proje Kimliği 201269156 - SFB 1032 (A09) aracılığıyla finansman aldı. N.H., DFG iade hibesi HU 2462/3-1 tarafından desteklenmiştir. Not: Alman Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (BMBF) ve Max Planck Derneği'nin ortak finansman girişimi aracılığıyla MaxSynBio araştırma ağı aracılığıyla desteği kabul ediyor.

<ol><li>Robertson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid+bilayer+membrane+and+its+protein+constituents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">The lipid bilayer membrane and its protein constituents.</a> Journal of General Physiology. 150 (11), 1472-1483 (2018).</li>
<li>Grecco, H. E., Schmick, M., Bastiaens, P. I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+from+the+Living+Plasma+Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Signaling from the Living Plasma Membrane.</a> Cell. 144 (6), 897-909 (2011).</li>
<li>Cho, W., Stahelin, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-protein+interactions+in+cell+signaling+and+membrane+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 34, 119-151 (2005).</li>
<li>Whited, A. M., Johs, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interactions+of+peripheral+membrane+proteins+with+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Physics+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">The interactions of peripheral membrane proteins with biological membranes.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 192, 51-59 (2015).</li>
<li>Gonzalez, L., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+membrane+trafficking%3A+Structural+insights+from+a+Rab%2Feffector+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of membrane trafficking: Structural insights from a Rab/effector complex.</a> Cell. 96 (6), 755-758 (1999).</li>
<li>Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mystery+of+membrane+organization%3A+composition%2C+regulation+and+roles+of+lipid+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).</li>
<li>Bagheri, Y., Ali, A. A., You, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+methods+for+detecting+cell+membrane+transient+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Current methods for detecting cell membrane transient interactions.</a> Frontiers in Chemistry. 8, 603259(2020).</li>
<li>Miller, H., Zhou, Z., Shepherd, J., Wollman, A. J. M., Leake, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+techniques+in+biophysics%3A+A+review+of+the+progress+in+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Reports+on+Progress+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Single-molecule techniques in biophysics: A review of the progress in methods and applications.</a> Reports on Progress in Physics. 81 (2), 024601(2018).</li>
<li>Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+progress+in+single+particle+tracking%3A+From+methods+to+biophysical+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Reports+on+Progress+in+Physics%22%5BJournal%5D)">A review of progress in single particle tracking: From methods to biophysical insights.</a> Reports on Progress in Physics. 78 (12), 124601(2015).</li>
<li>Gelles, J., Schnapp, B. J., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+kinesin-driven+movements+with+nanometre-scale+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tracking kinesin-driven movements with nanometre-scale precision.</a> Nature. 331 (6155), 450-453 (1988).</li>
<li>Funatsu, T., Harada, Y., Tokunaga, M., Saito, K., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+single+fluorescent+molecules+and+individual+ATP+turnovers+by+single+myosin+molecules+in+aqueous+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Imaging of single fluorescent molecules and individual ATP turnovers by single myosin molecules in aqueous solution.</a> Nature. 374 (6522), 555-559 (1995).</li>
<li>Schmidt, T., Schütz, G. J., Baumgartner, W., Gruber, H. J., Schindler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+single+molecule+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Imaging of single molecule diffusion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (7), 2926-2929 (1996).</li>
<li>Taylor, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+scattering+microscopy+reveals+microsecond+nanoscopic+protein+motion+on+a+live+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Interferometric scattering microscopy reveals microsecond nanoscopic protein motion on a live cell membrane.</a> Nature Photonics. 13 (7), 480-487 (2019).</li>
<li>Kukura, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+nanoscopic+tracking+of+the+position+and+orientation+of+a+single+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-speed nanoscopic tracking of the position and orientation of a single virus.</a> Nature Methods. 6 (12), 923-927 (2009).</li>
<li>Jacobsen, V., Stoller, P., Brunner, C., Vogel, V., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+optical+detection+and+tracking+of+very+small+gold+nanoparticles+at+a+water-glass+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Interferometric optical detection and tracking of very small gold nanoparticles at a water-glass interface.</a> Optics Express. 14 (1), 405(2006).</li>
<li>Ueno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+dark-field+microscopy+with+nanometer+spatial+precision+and+microsecond+temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Simple dark-field microscopy with nanometer spatial precision and microsecond temporal resolution.</a> Biophysical Journal. 98 (9), 2014-2023 (2010).</li>
<li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Herold, C., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Min+protein+patterns+emerge+from+rapid+rebinding+and+membrane+interaction+of+MinE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Min protein patterns emerge from rapid rebinding and membrane interaction of MinE.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 18 (5), 577-583 (2011).</li>
<li>Bezeljak, U., Loya, H., Kaczmarek, B., Saunders, T. E., Loose, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+activation+and+bistability+in+a+Rab+GTPase+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stochastic activation and bistability in a Rab GTPase regulatory network.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (12), 6504-6549 (2020).</li>
<li>Ha, T., Tinnefeld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photophysics+of+fluorescent+probes+for+single-molecule+biophysics+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 63 (1), 595-617 (2012).</li>
<li>Garcia-Parajo, M. F., Segers-Nolten, G. M. J., Veerman, J. A., Greve, J., Van Hulst, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+light-driven+dynamics+of+the+fluorescence+emission+in+single+green+fluorescent+protein+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Real-time light-driven dynamics of the fluorescence emission in single green fluorescent protein molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (13), 7237-7242 (2000).</li>
<li>Young, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mass+imaging+of+single+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative mass imaging of single biological macromolecules.</a> Science. 360 (6387), 423-427 (2018).</li>
<li>Piliarik, M., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+optical+sensing+of+single+unlabelled+proteins+and+super-resolution+imaging+of+their+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Direct optical sensing of single unlabelled proteins and super-resolution imaging of their binding sites.</a> Nature Communications. 5, 4495(2014).</li>
<li>Cole, D., Young, G., Weigel, A., Sebesta, A., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+single-molecule+imaging+with+numerical-aperture-shaped+interferometric+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Photonics%22%5BJournal%5D)">Label-free single-molecule imaging with numerical-aperture-shaped interferometric scattering microscopy.</a> ACS Photonics. 4 (2), 211-216 (2017).</li>
<li>Heermann, T., Steiert, F., Ramm, B., Hundt, N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-sensitive+particle+tracking+to+elucidate+the+membrane-associated+MinDE+reaction+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Mass-sensitive particle tracking to elucidate the membrane-associated MinDE reaction cycle.</a> Nature Methods. 18 (10), 1239-1246 (2021).</li>
<li>Foley, E. D. B., Kushwah, M. S., Young, G., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+photometry+enables+label-free+tracking+and+mass+measurement+of+single+proteins+on+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Mass photometry enables label-free tracking and mass measurement of single proteins on lipid bilayers.</a> Nature Methods. 18 (10), 1247-1252 (2021).</li>
<li>Voss, O. H., Lee, H. N., Tian, L., Krzewski, K., Coligan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+preparation+for+the+analysis+of+lipid-receptor+interaction+and+efferocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Liposome preparation for the analysis of lipid-receptor interaction and efferocytosis.</a> Current Protocols in Immunology. 120, 1-21 (2018).</li>
<li>Pincet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRAP+to+characterize+molecular+diffusion+and+interaction+in+various+membrane+environments%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">FRAP to characterize molecular diffusion and interaction in various membrane environments.</a> PLoS ONE. 11 (7), 0158457(2016).</li>
<li>Howarth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monovalent+streptavidin+with+a+single+femtomolar+biotin+binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A monovalent streptavidin with a single femtomolar biotin binding site.</a> Nature Methods. 3 (4), 267-273 (2006).</li>
<li>Allan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((soft-matter%2Ftrackpy%3A+Trackpy+v.0.5.0%5BTitle%5D)+AND+%22Zenodo%22%5BJournal%5D)">soft-matter/trackpy: Trackpy v.0.5.0.</a> Zenodo. , (2021).</li>
<li>Weimann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+comparison+of+single-dye+tracking+analysis+tools+using+Monte+Carlo+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A quantitative comparison of single-dye tracking analysis tools using Monte Carlo simulations.</a> PLoS ONE. 8 (5), 64287(2013).</li>
<li>Michalet, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mean+square+displacement+analysis+of+single-particle+trajectories+with+localization+error%3A+Brownian+motion+in+an+isotropic+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+E+-+Statistical%2C+Nonlinear%2C+and+Soft+Matter+Physics%22%5BJournal%5D)">Mean square displacement analysis of single-particle trajectories with localization error: Brownian motion in an isotropic medium.</a> Physical Review E - Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 82 (4), 041914(2010).</li>
<li>Sygusch, J., Beaudry, D., Allaire, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+rabbit+skeletal+muscle+aldolase+at+2.7-A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of rabbit skeletal muscle aldolase at 2.7-A resolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (22), 7846-7850 (1987).</li>
<li>Heath, G. R., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+AFM+height+spectroscopy+reveals+%C2%B5s-dynamics+of+unlabeled+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-speed AFM height spectroscopy reveals µs-dynamics of unlabeled biomolecules.</a> Nature Communications. 9 (1), 4983(2018).</li>
<li>Day, C. A., Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+the+confined+diffusion+of+cholera+toxin+B-subunit+in+intact+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying the confined diffusion of cholera toxin B-subunit in intact cell membranes.</a> PLOS ONE. 7 (4), 34923(2012).</li>
</ol>

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Sunulan protokol, cam üzerinde adsorbe olan tek biyomoleküllerin kütlesini analiz eden bir teknik olan kütle fotometrisi21'i, etiketlenmemiş membranla etkileşime giren biyomoleküllerin kütlesini ve difüzyonunu aynı anda ölçebilen daha çok yönlü bir araca genişletmektedir. Bu analiz uzantısı, moleküllerin yanal hareketine uyarlanmış değiştirilmiş bir arka plan kaldırma stratejisinin uygulanmasıyla elde edilir24,25. Genel olarak, cam yüzey pürüzlülüğünün güçlü saçılması ana analiz engelini temsil ettiğinden ve her pikselin yerel arka planının doğru bir şekilde belirlenmesi, parçacık kütlesinin ve konumunun ölçülmesi için gerekli olduğundan, iSCAT tabanlı yaklaşımlar için arka planın kaldırılması son derece önemlidir. Partikül hareketine uyarlanmış görüntü analizinin yanı sıra, müteakip parçacık algılama, yörünge bağlantısı ve veri analizi, MP'nin kütleye duyarlı parçacık izlemesine (MSPT) yeni genişlemesini tamamlar.
Genel olarak, iyice temizlenmiş cam kapak slaytları ve temiz bir çalışma ortamı, MSPT deneylerinin başarılı bir şekilde gerçekleştirilmesi için kritik gereksinimlerdir. Makromolekül etiketlemesinin yokluğu nedeniyle, elde edilen sinyal doğal olarak seçici değildir. Bu nedenle, temiz numunelerin yanı sıra uygun numune işleme, gözlemlerin yanlış yorumlanmamasını sağlamak için çok önemlidir. Özellikle, düşük moleküler ağırlıklı moleküller incelendiğinde, arka plan katkılarını değerlendirmek için proteinsiz membranların kontrol ölçümleri onaylanmıştır (Ek Şekil 1). Bu nedenle, kontrol ölçümlerinin dahil edilmesinin yanı sıra, her akış odası için Şekil 2'de gösterilen hazırlık adımlarının izlenmesi önerilir. Birleştirildiğinde, bu güvenlik önlemleri, tespit edilen sinyalin, örneğin kontamine bir akış odası, tampon veya membrandan değil, ilgili biyomolekülden kaynaklanmasını sağlayacaktır.
Deneysel tasarıma ilişkin önlemlerin yanı sıra, MSPT görüntü işleme sırasında da dikkatli olunmalıdır. Video işleme sırasında, doğru sonuçları sağlamak için üç parametrenin değeri dikkatlice seçilmelidir: i) arka planın kaldırılması için medyan pencerenin uzunluğu, ii) parçacık algılama eşiği ve iii) bağlantı ataması sırasında maksimum arama yarıçapı. Daha büyük bir medyan pencere (i) genellikle dağınık parçacıkların üst üste bindirilmiş yarı-sabit arka plandan ayrılmasını kolaylaştırır. Bununla birlikte, çok büyük pencere boyutları için örnek kayması sonunda fark edilir hale gelir ve arka plan tahmininin doğruluğunu azaltır. Optimum ayarlar büyük ölçüde numune özelliklerine ve ölçüm koşullarına bağlıdır. Bununla birlikte, 1.001'lik bir değer sağlam bir başlangıç noktası olarak kullanılabilir. Eşik parametresi (ii), numunede beklenen en düşük moleküler kütleye bağlı olarak ayarlanmalıdır. Bu çalışmada kullanılan kütle fotometresi ile alınan ölçümler için 0.0005'in altında bir değer önerilmemektedir. Analiz sürelerini hızlandırmak için, yüksek moleküler ağırlığa sahip bir numune bekleniyorsa daha yüksek değerler seçilebilir. Yörünge bağlantısındaki arama yarıçapı (iii), parçacığın kaydırılan konumunun ardışık karelerde aranacağı piksel cinsinden maksimum radyal mesafeyi belirtir. Numunedeki en hızlı parçacığa uyarlanmalıdır ve tercih edilirse, hesaplama süresini azaltmak için uyarlanabilir bir arama aralığı ( trackpy belgelerine bakın) kullanılabilir. Özellikle bir projenin ilk aşamasında, elde edilen sonuçları doğrulamak için filmlerin değişen parametrelerle yeniden analiz edilmesi önerilir.
MSPT'nin tek moleküllü doğası ışığında, yüksek membran parçacık yoğunluklarında ölçüm yapmaktan kaçınılmalıdır, çünkü bunlar doğru kontrast ve kütle tayinine müdahale edebilir. Kare mikrometre başına bir parçacığın altındaki yoğunlukların MSPT ölçümleri için elverişli olduğu gösterilmiştir24. Ek bir husus, numunede beklenen difüzyon katsayılarıdır. Çok çeşitli difüzyon katsayılarına uygulanabilir olmasına rağmen, MSPT erişilebilir difüzyon katsayılarının daha düşük bir sınırına sahiptir. Medyan pencere periyodunun önemli bir bölümünde birkaç piksellik bir bölgeye yerel olarak hapsedilme, parçacığı statik arka planla birleştirir. Bu protokolde kullanılan görüntüleme koşulları için, 0.01 μm2/s'nin altındaki difüzyon katsayılarının ölçülmesi önerilmez. Bu difüzyon hızında, örneğin, medyan pencere yarım boyutu sırasında bir parçacığın ortalama kare yer değiştirmesi yaklaşık 4 pikseldir ve bu nedenle PSF'nin kapsamı ile benzer boyuttadır. Sonuç olarak, statik arka plan tahmininin, parçacığın kendisinden gelen sinyal katkılarını içermesi muhtemeldir, bu da sonunda gürültü seviyesine yaklaşana kadar parçacığın görünüşte azaltılmış bir kontrastı ile sonuçlanır. Bununla birlikte, 0.05 ila 10 μm2 / s arasında değişen makromolekül difüzyon katsayıları açıkça çözülebilir.
MSPT uygulamalarının aralığını daha da genişletmek için, geçici olarak bir parçacıkla işgal edilen piksellerin ortadan kaldırılması veya daha büyük medyan pencere boyutlarına olanak tanıyan örnek sürüklenme düzeltmesi yoluyla medyan tabanlı arka plan algoritmasının ilerlemesi öngörülebilir. Her iki yaklaşım da yüksek parçacık yoğunluklarında ve yavaş difüzyonda ölçümlerle ilgili sorunları hafifletecektir. Düşük kütle duyarlılığı açısından gelişmeler, 50 kDa'dan daha küçük biyomoleküllere erişim sağlayabilecek yeni nesil kütle fotometreleri ile ufuktadır. Bu nedenle, gelecekteki MSPT deneyleri, yastıklı çift katmanlar ve makromoleküler sistemler gibi daha geniş bir membran taklitleri yelpazesi için tek moleküllü dinamikleri ve membranla ilgili etkileşimleri inceleyebilecektir.

Bir zamanlar sadece çok çeşitli ortam fiziksel koşullarına karşı bir bariyer olarak algılanan biyolojik membranlar, günümüzde fonksiyonel varlıklar ve katalitik platformlar olarak kabul edilmektedir 1,2. Membranla ilişkili makromolekül reaksiyonlarına yanıt olarak sinyalleri lokalize etme, yükseltme ve yönlendirme yeteneklerine dayanarak, lipit arayüzleri, membran kaçakçılığı ve sinyal kaskadları 3,4,5 gibi çok çeşitli hücresel süreçler için çok önemli bir unsur oluşturur. Kararlı komplekslerin montajı için bir çekirdeklenme bölgesi olarak hizmet veren membran ataşmanı, genellikle makromoleküllerin membranla ilişkili ve sitozolik formları arasındaki dinamik bir dengeye dayanır ve bu nedenle geçici niteliktedir 6,7.
Biyolojideki büyük önemlerine rağmen, membranla ilişkili makromolekül reaksiyonlarının bileşimsel, mekansal ve zamansal heterojenliklerine gerçek zamanlı 7,8'de erişim sağlayabilecek yöntemler geliştirmek şimdiye kadar zor olmuştur. Altta yatan moleküler süreçleri çözmek için, iki deneysel yön belirleyicidir: yeterli zaman çözünürlüğü ve tek parçacık duyarlılığı. Bu nedenle, fotobeyazlatma sonrası floresan geri kazanımı (FRAP) gibi topluluk ortalama tekniklerinin yanı sıra çok daha hassas floresan korelasyon spektroskopisi (FCS) de zamansal bilgiden mekansal bilgiyi büyük ölçüde ayırdıkları için sınırlamaları vardır9. Bireysel molekül dinamiklerinin karakterizasyonuna yönelik önemli bir adım, bu nedenle, yüksek hassasiyetli mikroskopi ile kombinasyon halinde tek parçacık izlemenin (SPT) ortaya çıkması olmuştur. Özellikle, iki SPT yaklaşımının bu konuda etkili olduğu kanıtlanmıştır. İlk olarak, floroforların etiket olarak kullanılması ve buna karşılık gelen floresan algılama sistemleri, nanometre hassasiyetinin ve milisaniye zaman çözünürlüğü 10,11,12'nin yolunu açtı. İkincisi, altın nanopartikülleri kullanarak saçılma tabanlı algılama, hem lokalizasyon hassasiyetini hem de zaman çözünürlüğünü sırasıyla13,14,15,16 alt nanometre ve mikrosaniye aralığına geliştirdi. Her iki yaklaşımın birçok avantajına ve membranla ilişkili sistemlerin mekanik anlayışına ilişkin önemli katkılarına rağmen17,18, her iki teknik de şimdiye kadar sınırlı kalmıştır: doğal davranışlarını potansiyel olarak bozan ve membranla ilişkili parçacıkların moleküler bileşimine duyarsız olan ilgili moleküllerin etiketlenmesini gerektirirler 19,20.
Her iki sınırlama da yakın zamanda kütle fotometrisi (MP)21,22,23 olarak adlandırılan yeni bir interferometrik saçılma (iSCAT) tabanlı yaklaşımın tanıtılmasıyla aşılmıştır. Bu teknik, bir cam arayüze iniş yaparken biyomoleküllerin iSCAT kontrastına göre çözelti içi kütle dağılımlarının belirlenmesini sağlar. Bununla birlikte, lipit membranlara yayılan hareketli moleküllerin tespiti ve karakterizasyonu için, daha sofistike bir görüntü analizi yaklaşımının geliştirilmesi gerekiyordu. Bu arada bu başarılı bir şekilde uygulanmıştır ve bir lipit arayüzü24,25 üzerinde yayılan tek etiketsiz biyomoleküllerin moleküler kütlesini tespit etmeye, izlemeye ve belirlemeye izin verir. Dinamik kütle fotometrisi veya kütleye duyarlı parçacık izleme (MSPT) olarak adlandırılan bu teknik, şimdi izlenen varlıkların moleküler kütlesindeki değişiklikleri doğrudan kaydederek karmaşık makromolekül etkileşimlerinin değerlendirilmesini sağlar ve böylece membranla ilişkili moleküler dinamiklerin mekanik analizi için yeni olanaklar sunar.
Burada, örnek hazırlama, görüntüleme ve MSPT için gereken veri analizi işlem hattı için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Özellikle numune gereksinimleri ve ölçüm ve analiz sırasında oluşabilecek olası sorunlar tartışılmaktadır. Ayrıca, membranla etkileşime giren makromolekül sistemlerini analiz etmek için eşsiz potansiyel, çeşitli temsili sonuçlarla sergilenmektedir.

<table><tbody><tr><td>annexin V</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#SRP8026</td><td>örnek membran etkileşimli protein</td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Testi</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td><td>#5000006</td><td>Protein stok konsantrasyonlarını belirlemek için Bradford Test Kiti</td></tr><tr><td>biyotin etiketli sığır</td><td>albümini Sigma Aldrich</td><td>#A8549</td> MSPT kolera toksin alt birimi B <td>için standart protein olarak kullanılabilen örnek protein</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>#SAE0069</td><td>örnek membran etkileşimli protein</td></tr><tr><td>kaplama camları, #1.5, 24 x 24 mm</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG#</td><td>0102062</td><td></td></tr><tr><td>kapak camları, # 1.5, 24 x 60 mm</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td> <td># 0102242</td><td></td></tr><tr><td>dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DOPC)</td> <td>Avanti Polar Lipids</td> <td># 850375</td><td>lipid - desteklenen lipid çift tabaka oluşumu için gerekli ekstrüde küçük unilamellar veziküller şeklinde</td></tr><tr><td>dioleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-cap biotinil (18: 1 Biotinyl Cap PE</td><td>Avanti Polar Lipids</td> <td>#870273</td><td>lipid - desteklenen lipid çift tabaka oluşumu için gerekli ekstrüde küçük unilameller veziküller şeklinde</td></tr><tr><td>dioleoil-sn-glisero-3-fosfogliserol (DOPG)</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>#840475</td><td>lipid - desteklenen lipid çift tabaka oluşumu için gerekli ekstrüde küçük unilamellar veziküller şeklinde</td></tr><tr><td>dioleoil-sn-glisero-3-fosfo-L-serin (DOPS)</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>#840035</td><td>lipid - desteklenen lipid çift tabaka oluşumu için gerekli ekstrüde edilmiş küçük unilamellar veziküller şeklinde</td></tr><tr><td>cam numune odalarının montajı için gerekli</td>çift<td>taraflı bant</td><td>tesa</td><td>#57912-00000-02</td></tr><tr><td>Ekstruder</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>#610023</td><td>Monodispers vezikül dağılımlarını sağlamak için lipid ekstrüder</td></tr><tr><td>EZ-Link Maleimid-PEG2-Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#A39261</td><td>MSPT Fibronektin (Biyotinillenmiş) Cytoskeleton Inc. için standart proteinleri biyotinillemek için kullanılabilen maileimid ile kaynaşmış biyotin</td></tr><tr><td></td><td>.</td><td>MSPT Jel</td> Filtrasyonu HMW Kalibrasyon Kiti için <td>standart protein olarak kullanılabilen #FNR03-A örnek proteini</td></tr><tr><td></td><td>Cytiva</td><td>#28403842</td><td>standart proteinler, örneğin biyotinile edilebilen ve MSPT</td></tr><tr><td>GM1 Gangliosit (Beyin, Küçük-Sodyum Tuzu)</td><td></td> için moleküler ağırlık standartları olarak kullanılabilen aldolaz <td>#860065</td><td>lipid - desteklenen lipid çift tabaka oluşumu için gerekli ekstrüde küçük unilamellar veziküller şeklinde</td></tr><tr><td>Keçi anti-Tavşan IgG (H + L) İkincil Antikoru, Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, ABD)</td><td># 31820</td><td>Farklı protein durumlarının varlığını vurgulamak için örnek protein</td></tr><tr><td>İzopropanol, %99,5, spektroskopi için</td><td>Thermo Fisher Scientific</td> <td># 10003643</td><td></td></tr><tr><td>Düşük Otofloresan Daldırma Yağı</td><td>Olimpos K.K.</td><td>#IMMOIL-F30CC</td><td></td></tr><tr><td>pET21a-Streptavidin-Alive</td><td>Addgene</td> <td># 20860</td>, <td>iki değerlikli streptavidini birbiriyle kombinasyon halinde eksprese etmek ve saflaştırmak için gereklidir</td></tr>, <tr><td>pET21a-Streptavidin-Dead</td><td>Addgene</td> <td># 20859</td>, <td>iki değerlikli streptavidini birbiriyle kombinasyon halinde eksprese etmek ve saflaştırmak için gereklidir</td></tr><tr><td>Pierce Alkalin Fosfataz, biyotinile Thermo</td><td>Fisher Scientific</td> <td># 29339</td><td>MSPT Pierce Protein A için standart protein olarak kullanılabilen örnek protein</td></tr><tr><td>, MSPT Refeyn</td><td>Acquire Refeyn</td> Ltd. <td>için standart protein olarak kullanılabilen</td>Biotinile Thermo Fisher Scientific <td># 29989</td> örnek protein</tr><tr><td></td><td>.</td><td></td><td>Refeyn OneMP</td></tr><tr><td>Refeyn One</td><td>Refeyn Ltd.</td> için kontrol yazılımı<td>-</td><td>Kütle Fotometre</td></tr><tr><td>Steril Şırınga Filtreleri 0.45 ve Mikro; m selüloz asetat membran</td><td>VWR International</td> <td># 514-0063</td>, <td>ilgilenilen tampondan partikülleri filtrelemek için gerekli</td></tr><tr><td>tetravalent streptavidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#SNN1001</td><td>tetravalent streptavidin birkaç biyotin bağlanma bölgesinin varlığını sağlamak için</td></tr><tr><td>Whatman Nuclepore Hidrofilik Membran, 0.05 &; m Gözenek Boyutu, 25 mm Circle</td><td>Cytiva</td><td>#110603</td> MSPT Zepto model 2 plazma temizleyici Diener electronic GmbH- bağlamında <td>desteklenen lipid çift tabaka oluşumu için 50 nm'lik bir gözenek boyutu önerilir</td></tr><tr><td></td><td></td><td>.</td><td></td></tr></tbody></table>

membranla İlişkili makromolekül dinamiğini karakterize etmek için kütleye duyarlı partikül İzleme

Mass-Sensitive Particle Tracking to Characterize Membrane-Associated Macromolecule Dynamics

Çok sayıda esansiyel biyolojik reaksiyonun gerçekleştiği bir arayüz olan lipit membranlarında ve membranlarda makromoleküllerin kısa ömürlü veya geçici etkileşimleri, standart biyofiziksel yöntemlerle değerlendirilmesi doğal olarak zordur. Kütleye duyarlı parçacık izlemenin (MSPT) tanıtılması, bu tür işlemlerin kapsamlı bir nicel karakterizasyonuna yönelik önemli bir adımı oluşturmaktadır. Teknik olarak, bu, interferometrik saçılma mikroskobu (iSCAT) tabanlı kütle fotometrisinin (MP) ortaya çıkmasıyla mümkün olmuştur. Arka plan kaldırma stratejisi, membranla ilişkili parçacıkların iki boyutlu hareketini ortaya çıkarmak için optimize edildiğinde, bu teknik, biyolojik membranlar üzerindeki etiketlenmemiş makromoleküllerin hem difüzyonunun hem de moleküler kütlesinin gerçek zamanlı analizine izin verir. Burada, membranla ilişkili sistemlerin kütleye duyarlı parçacık takibini gerçekleştirmek ve analiz etmek için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. Ticari bir kütle fotometresinde yapılan ölçümler, milisaniye rejiminde zaman çözünürlüğüne ve MP sistemine bağlı olarak 50 kDa'ya kadar bir kütle algılama sınırına ulaşır. MSPT'nin genel olarak membran katalizörlü makromolekül dinamiklerinin derinlemesine analizi için potansiyelini göstermek için, doğal membran interaktör ek V gibi örnek protein sistemleri için elde edilen sonuçlar sunulmuştur.

Bu protokol, moleküler kütlenin ve lipit membranlarla etkileşime giren makromoleküllerin difüzyon davranışının eşzamanlı olarak araştırılmasını sağlayan iSCAT tabanlı bir görüntü işleme ve tek parçacık izleme yaklaşımını açıklar. Numune hazırlama, kütleden kontrasta dönüştürme, film edinme ve son işleme için adım adım talimatlar, olası tuzakları önlemek için talimatlarla birlikte sağlanır.

Membranla İlişkili Makromolekül Dinamiğini Karakterize Etmek için Kütleye Duyarlı Partikül İzleme

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take ...

Kütleye duyarlı parçacık takibi ile, lipit membranları üzerinde yayılan bireysel biyomolekülleri gözlemleyebilir ve dinamiklerini gerçek zamanlı olarak ölçebiliriz, hepsi tamamen etiketsizdir. Etiket gerekmediğinden, biyomoleküllerin dinamik davranışını bozma tehlikesi yoktur. Bu yöntemin bir diğer avantajı, membrana bağlı oligomerik durumları belirlememizi sağlayan kütle duyarlılığıdır.Çok yönlülüğü nedeniyle, bu yöntemi membranla ilişkili herhangi bir sisteme uygulayabiliriz. Özellikle, ligand kaynaklı reseptör komplekslerinin oluşumunu incelemek için kullanılabilir. PTFE tutucularda eşit sayıda mikroskop slaytı dağıtarak başlayın.PTFE tutucuları beherlere aktarın. Ultra saf su ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca sonikleştirin. Tutucuları temiz beherlere aktarmak ve ultra saf izopropanol eklemek için cımbız kullanın.15 dakika boyunca tekrar sonikleştirin, sonra tekrar izopropanolü ultra saf suyla değiştirin ve tutucuları içeren beheri 15 dakika boyunca sonikleştirin. Tutucuları beherlerden çıkarın ve tutucudaki mikroskop kızaklarını sabit bir azot gazı veya basınçlı hava akışı altında üfleyerek kurutun. Büyük mikroskop slaytlarını içeren kurutulmuş tutucuyu plazma temizleyiciye yerleştirin ve açın.Düz kartonu alüminyum folyo ile sarın. Temizlenen 24 milimetre ile 24 milimetre mikroskop kızaklarını alüminyum folyo üzerine birbirleri arasında yeterli mesafe ile yayın. Ardından, çift taraflı bant şeritlerini slaytların üst ve alt kenarlarına takın.Her mikroskop slaytını, alüminyum folyodan çıkarılabilecek şekilde bir neşterle tüketin. Her slaytta, slaytın üst ve alt kenarlarına tutturulmuş çift taraflı bant şeritleri bulunmalıdır. Ardından slaytı iki çift taraflı bant şeridiyle hidrofilize kızağa takın.Bu, daha küçük ve daha büyük mikroskop slaytları arasında bir akış yolu oluşturacaktır. Taze ekstrüde edilmiş küçük unilamellar vezikülleri veya SUV'ları, gerekli reaksiyon tamponunda mililitre başına 0,4 miligramlık bir son konsantrasyona kadar seyreltin. İsteğe bağlı olarak, vezikül rüptürünü teşvik etmek için, vezikül süspansiyonuna iki milimolar kalsiyum klorür ekleyin.Kütle fotometre aşamasına bir akış odası monte edin. Vezikül süspansiyonunun 25 mikrolitresini akış odasına yıkayın ve odayı iki dakika boyunca inkübe edin, ardından akış odasının her seferinde 200 mikrolitre reaksiyon tamponu ile tekrar tekrar yıkanmasıyla kaynaşmamış vezikülleri çıkarın. Lipid zarı kaynaşmamış veziküllerden arındırıldığında, numune odasına ilgilenilen proteinin 50 mikrolitresini ekleyin.Ardından, edinme yazılımında görüş alanının boyutu, pozlama süresi, kare hızı ve edinme süresi gibi görüntüleme koşullarını ayarlayın. Netlemeyi otomatik olarak ayarlayın. Gerekirse, görüş alanını homojen bir membrana sahip bir konuma taşımak için yanal kontrolü kullanın.Bir proje klasörü oluşturun ve filmi kaydetmeye başlayın. Kayıt tamamlandıktan sonra, edinme yazılımı tarafından istenen iletişim kutusunda bir dosya adı belirtin. Film, sonraki analizler için otomatik olarak proje klasörüne MP dosyası olarak kaydedilir.Kaydedilen videoları analiz etmek için Jupyter not defteri uygulamasını başlatın. Görüntülenen klasör listesinde, MSPT çözümlemesinin yapıldığı konuma gidin. ipy notebook dosyası saklanır ve dosyaya tıklayın.Jupyter not defterlerinde, kod hücrelerde düzenlenir ve adım adım yürütülebilir. Hücrenin yanındaki küçük Oynat düğmesine tıklayın veya bir hücre seçin ve hücreyi yürütmek için Shift Enter tuşuna basın. Analiz için gerekli tüm paketleri içe aktararak başlayın.Bir dosya istemi başlatmak için bir sonraki hücreyi çalıştırın. Analiz edilecek bir veya daha fazla MP video dosyası içeren bir klasör seçin ve Klasör Seç'e basın. Seçilen dosyaların listesi hücrenin altına yazdırılır.Piksel tabanlı arka plan tahmin algoritmasıyla ışığın baskın statik saçılımını kaldırmak için, parametre modu için sürekli medyan seçeneğini belirleyin ve kayan medyan penceresi için uygun bir uzunluk ayarlayın. İsteğe bağlı olarak, arka plan kaldırıldıktan sonra filmleri parçacık algılama ve yörünge bağlantısı için kullanmak üzere True save_processed_movies ayarlayarak kaydedin. CPU'da işlem yapmak için paralel Doğru ve GPU Yanlış ayarladığınızdan emin olun veya GPU'da işlem yapmak için tam tersini yapın.Parçacıklar ve ilgili konumları film boyunca tanımlanır ve lokalize edilir. Parçacık algılamanın hassasiyetini, görüntü ikilileştirme ile aday noktaları vurgulamak için kullanılan bir eşik parametresiyle ayarlayın. Film görselleştirme adı verilen ayrı bir not defterinde değişen eşik parametrelerinin nokta algılama duyarlılığı üzerindeki etkisini inceleyin.ipy defter. Filmi kare görüntüleyiciye yükledikten sonra, parçacık algılama eşiğini ayarlamak ve uygun bir ayar bulmak için eşik kaydırıcısını kullanın. Diğer not defterine geri döndüğümüzde, Python paket trackpy'sini kullanarak ardışık çerçevelerdeki parçacıkları yörüngelere bağlamak için üç parametre seçin.Beklenen maksimum difüzyon hızına göre parçacıkların maksimum yer değiştirmesini bir çerçeveden diğerine ayarlayın. Bir parçacığın kaybolabileceği ve yeniden ortaya çıkabileceği, ancak yine de aynı parçacık olarak kabul edilebileceği maksimum çerçeve sayısını seçin. Çok az noktaya sahip yörüngeler, difüzyon katsayılarının daha sağlam bir şekilde belirlenmesi için minimum_trajectory_length parametresi kullanılarak kaldırılabilir.Hücredeki tüm parametreleri çalıştırarak düzeltin. Seçilen tüm videoları seçilen parametrelerle analiz etmek için bir sonraki hücreyi çalıştırın. Her işleme adımı için ilerleme çubukları hücrenin altında görünür.Bu işlem, video uzunluğuna, parametre ayarlarına ve donanıma bağlı olarak biraz zaman alabilir. Bir sonraki adımda yazılım, hem atlama mesafesi dağılımına hem de ortalama kare yer değiştirme analizine dayanarak, önceki bölümde bulunan yörüngeler için difüzyon katsayılarını belirler. Film frame_rate ve pixel_size belirterek başlayın.Hücreyi yürüterek bunları düzeltin, ardından bir sonraki hücreyi çalıştırın ve trackpy tarafından oluşturulan tüm CSV dosyalarını içeren üst dizini seçin. Bulunan CSV dosyalarının listesi hücrenin altına yazdırılır. Bir sonraki hücrede, sonuçların depolandığı HDF5 kapsayıcısı için bir ad seçin ve yürütün.Son olarak, difüzyon analizini gerçekleştirmek için C.4 hücresini çalıştırın. C.5 hücresinde, kütle kalibrasyon hattı parametrelerinin kontrastını girin, bu da bilinen kütlenin örnekleri kullanılarak belirlenen eğim ve ofset anlamına gelir ve tüm parçacık kontrastlarını moleküler kütleye dönüştürmek için uygulayın. Membran üzerindeki görünür parçacık yoğunluğunu, algılanan parçacıklar açısından medyan yoğunluk değerini döndüren ve her kare sırasında yörüngeleri veri çerçevesinde ek sütunlar olarak sunan C.6 hücresini yürüterek değerlendirin.Kütle ve difüzyon katsayısının korelasyonuna ilişkin son grafiği oluşturmak için, bir dosya istemi yüklemek üzere D.1 hücresini yürütün ve MSPT sonuçlarını içeren HDF5 dosyasını belirtin, ardından D.2 hücresinde çizilecek tek bir videodaki veri kümesini seçin veya D.3 hücresini yürüterek birden çok videodaki verileri tek bir veri karesinde birleştirin. Bu örnekte, tüm videolar aynı örneklerin kopyaları olduğundan, veri kümesi havuza alınır. Son olarak, D.4 hücresini çalıştırarak 2B çekirdek yoğunluğunu çizin.Memnun kalırsanız, grafiği D.5 hücresindeki bir PDF dosyasına kaydetmek ve yürütmek için bir konum belirtin. Desteklenen bir lipit çift katmanının oluşumu sırasında, sağlam bir desteklenen lipit çift katmanlı bir cam kapak slaytının yüzey pürüzlülüğünün ve bir SLB üzerinde yeniden oluşturulan örnek proteinlerin temsili görüntüleri burada gösterilmiştir. Dört örneğin tümü, ölçümün kendisi sırasında erişilebilen yerel modda ve medyan tabanlı arka plan kaldırma işleminden sonra işlenmiş oranmetrik görüntüler olarak görüntülenir.Kontrastı moleküler kütleye çeviren bir kalibrasyon, bilinen kütlenin biyomoleküllerinin bir biyotin-streptavidin-biyotin kompleksi aracılığıyla bir SLB'ye bağlanmasıyla elde edilebilir. Örnek bir strateji olarak, sığır serum albümini, protein A, alkalen fosfataz ve fibronektinin biyotinile edilmiş varyantları, membrandaki biyotin içeren lipitlere bağlı olan streptavidin'e bağlanır. Bu örnek makromoleküllerin giderek daha belirgin hale gelen kontrastı, ilgili biyotinillenmiş standartların artan moleküler ağırlığını yansıtmaktadır.Kontrast histogramlarının her bir tepe noktasını standart proteinin oligomer durumunun karşılık gelen kütlesine atayarak, kontrast ve kütle arasında doğrusal bir ilişki ortaya çıkar ve daha sonra bilinmeyen makromolekül sistemlerinin analizi için kullanılabilir. Biyotinile aldolaz veya biyotin modifiye keçi anti-Tavşan IgG antikoru ile kompleks halinde bulunan tetravalan streptavidinin hem kütlesinin hem de difüzyon katsayısının 2D çekirdek yoğunluğu tahminleri burada gösterilmiştir. Temsili görüntüler, dört değerlikli streptavidin kompleksi için belirlenmiş oligomer kütlelerinin biyotin modifiye aldolaz veya IgG ve beklenen moleküler ağırlıklarla karşılaştırıldığını göstermektedir.MSPT ile biyomolekülleri doğrudan lipit membranları üzerinde izleyebilir, hangi kütleye sahip olduklarını, nasıl hareket ettiklerini ve nasıl etkileşime girdiklerini belirleyebiliriz. Bu tekniğin, membranlar üzerindeki ve membranlarla biyolojik süreçler hakkındaki anlayışımızı dönüştüreceğinden eminim.

mass-sensitive-particle-tracking-to-characterize-membrane-associated

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Çoklu Hedef İzleme canlı hücrelerinin plazma membranı içinde ayrı ayrı işaretli moleküllerin izlenmesi için geliştirilen ev yapımı bir algoritma. Verimli, tespit nano ölçekli membran dinamiğini incelemek için kullanıcı dostu, kapsamlı bir araç sağlamak, yüksek yoğunluklu zaman içinde moleküller tahmin ve izleme.

Çoklu Hedef İzleme (MTT) tarafından Plazma Membran Moleküler Difüzyon Haritalama

Bu protokol, canlı hücrelerin yüzeyindeki tek reseptörleri görselleştirmek ve izlemek ve böylece reseptör yanal hareketliliğini, reseptör komplekslerinin boyutunu analiz etmek ve ayrıca geçici reseptör-reseptör etkileşimlerini görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan mikroskobunun nasıl kullanılacağını açıklar. Bu protokol diğer zar proteinlerine genişletilebilir.

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Plazma zarı proteinlerinin ve lipitlerinin mekansal dağılımı ve zamansal dinamikleri biyolojide sıcak bir konudur. Burada bu sorun, kavramsal olarak tek parçacık izlemenin aynı fiziksel miktarlarını sağlayan bir uzaysal-zamansal görüntü dalgalanma analizi ile ele alınmaktadır, ancak küçük moleküler etiketler ve standart mikroskopi kurulumları kullanır.

Ticari Mikroskop Canlı Hücre Zarları Moleküler Difüzyon Kanunu Hızlı Floresans Görüntüleme Gönderen

Biz yüksek çözünürlüklü mikroskopi için mika desteklenen lipit katmanlarını hazırlamanın bir yöntem mevcut. Mica bir atomik ölçekte şeffaf ve düz, ancak nadiren nedeniyle zorluklar ele görüntülenmesinde kullanılan; bizim hazırlık mika tabakanın da birikimi ile sonuçlanır, ve iki katmanlı hazırlanmasında kullanılan malzemeyi azaltır.

Mika hazırlanması Yüksek Çözünürlüklü Optik Mikroskopi Görüntüleme için lipit tabakalarının Desteklenen

Sunulan protokol, gözenekleri kapsayan solvent içermeyen lipid çift katmanları kullanılarak tek taşıyıcı seviyesinde membran protein aracılı taşımanın analizini açıklar. Bu, yüksek derecede paralel veri toplama ve analizi ile birleştirilen toplu olarak üretilen nanopor dizi çiplerinin oluşturulmasıyla elde edilir ve gelecekte membran protein efektör taramalarının kurulmasını sağlar.

Membran Transport Tek Protein çözünürlükte Oldukça Paralel nanopore çip Sistemi Analiz Süreçleri

Burada, tek parçacık kantitatif değerlendirilmesi Difüzyon katsayıları, Floresans mikroskobu tarafından algılanan tek parçacıkların hareket ve küme boyutları türleri sağlar görüntü analizi izleme için bir iletişim kuralı mevcut.

Görüntü membran reseptörleri Floresans mikroskobu tarafından küme boyutunu ve Difüzyon analizi için protokol işleme

3D tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi, yaşayan bakteri hücrelerinde floresan olarak etiketlenmiş proteinlerin mekansal konumlarını ve hareket yörüngelerini araştırmak için kullanılır. Burada açıklanan deneysel ve veri analizi protokolü, sitosolik proteinlerin havuzhalinde ki tek moleküllü yörüngelere dayalı yaygın diffüzif davranışlarını belirler.

Tek Moleküllü İzleme Mikroskobu - Sitosolik Moleküllerin Diffüz Durumlarını Belirlemede Bir Araç

Burada, hücre zarındaki altın nanorodların (AuNR) dinamiklerini izlemek için geleneksel karanlık alan mikroskopisinin kullanımını gösteriyoruz. Tek AuNR'lerin konumu ve yönü ImageJ ve MATLAB kullanılarak algılanır ve AuNR'lerin difüzif durumları tek parçacık izleme analizi ile karakterize edilir.

Tek Nanopartikül Darkfield Mikroskopisi Kullanarak Hücre Zarında Altın Nanorodların Difüzyonel Dinamiklerini Görselleştirme

Görüntüleme kaynaklı ortalama kare yer değiştirme (iMSD) analizi, makropinozomlara yapısal ve dinamik özellikler açısından içsel zaman evrimleşen doğalarını vurgulamak için uygulanır. Makropinozomlar daha sonra zaman değişmez ortalama yapısal / dinamik özelliklere sahip hücre altı yapılar için bir referans olarak insülin salgı granülleri (ISG'ler) ile karşılaştırılır.

Spatiotemporal Dalgalanma Spektroskopisi ile Kaçakçılık Yapan Hücre Altı Nanoyapıların Yapısal ve Dinamik Özelliklerinin İncelenmesi

Burada, tek moleküllü toplam iç yansıma floresan (smTIRF) mikroskobu kullanılarak yapay kalabalık lipit membranları üzerindeki tek moleküllerin bağlanma, hareketlilik ve montajını gerçekleştirmek ve analiz etmek için bir protokol sunulmaktadır.

Tek Moleküllü Difüzyon ve Polimer Kalabalık Lipid Membranlara Montaj

Bu makale, katı destekli lipid çift katmanlarında tek protein izleme için örnekler nasıl oluşturulacağına dair ayrıntılı bir açıklama sunmaktadır. Ayrıca, tek molekül hassasiyeti ve hızlı kare hızına sahip basit bir floresan mikroskobu da açıklar. Son olarak, tek protein yörüngelerinin çıkarılması prosedürünü özetliyoruz.

Lipid çift katmanlarında tek proteinlerin floresan mikroskopisi kullanılarak takibi

Keşfedin iSCAT tabanlı kütle duyarlı parçacık izleme yöntemiyle lipid membranlarındaki makromoleküllerin dinamiklerini etiketsiz gözlemleyin. Bu protokol biyofizik ve nörobilim araştırmalarında oligomerik durumları belirlemenizi sağlar.

Membranla İlişkili Makromolekül Dinamiğini Karakterize Etmek için Kütleye Duyarlı Partikül İzleme

Daha fazla video keşfet