Name: Lakrimal Bez Kök Hücreleri için Üç Boyutlu, Serumsuz Kültür Sistemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Keşfedin, lakrimal bez kök hücrelerini serumsuz üç boyutlu kültür sistemiyle nasıl izole edip çoğaltacağınızı. Bu yöntem, uzun süreli genişleme ve farklılaşma potansiyeli sunarak bez onarımı için değerli bir model oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (No. 31871413) ve iki Guangdong Bilim ve Teknoloji Programından (2017B020230002 ve 2016B030231001) bir hibe ile desteklenmiştir. Çalışma sırasında bize yardımcı olan araştırmacılara ve hayvan merkezinde çalışan personele hayvan bakımına verdikleri destek için gerçekten minnettarız.

<ol><li>Zoukhri, D., Macari, E., Kublin, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+injection+of+interleukin-1+induces+reversible+aqueous+tear+deficiency%2C+lacrimal+gland+inflammation%2C+and+acinar+and+ductal+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">A single injection of interleukin-1 induces reversible aqueous tear deficiency, lacrimal gland inflammation, and acinar and ductal cell proliferation.</a> Experimental Eye Research. 84 (5), 894-904 (2007).</li>
<li>Gromova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lacrimal+gland+repair+using+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lacrimal gland repair using progenitor cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2016).</li>
<li>Buzhor, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+therapy+approaches%3A+the+hope+for+incurable+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell-based therapy approaches: the hope for incurable diseases.</a> Regenerative Medicine. 9 (5), 649-672 (2014).</li>
<li>Tiwari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+human+lacrimal+gland+cultures+with+secretory+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function.</a> PLoS One. 7 (1), 29458(2012).</li>
<li>You, S., Kublin, C. L., Avidan, O., Miyasaki, D., Zoukhri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+propagation+of+mesenchymal+stem+cells+from+the+lacrimal+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and propagation of mesenchymal stem cells from the lacrimal gland.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2087-2094 (2011).</li>
<li>Ackermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+investigation+of+presumptive+murine+lacrimal+gland+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and investigation of presumptive murine lacrimal gland stem cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Lugli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-spondin+1+and+noggin+facilitate+expansion+of+resident+stem+cells+from+non-damaged+gallbladders%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">R-spondin 1 and noggin facilitate expansion of resident stem cells from non-damaged gallbladders.</a> EMBO Reports. 17 (5), 769-779 (2016).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1), 299-312 (2015).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1), 324-338 (2015).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%2B%28ve%29+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5+(ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li>
<li>Linnemann, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+regenerative+potential+in+primary+human+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells.</a> Development. 142 (18), 3239-3251 (2015).</li>
<li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li>
<li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nature Cell Biology. 16 (1), 951-961 (2014).</li>
<li>Maimets, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vitro+expansion+of+salivary+gland+stem+cells+driven+by+Wnt+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-term in vitro expansion of salivary gland stem cells driven by Wnt signals.</a> Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).</li>
<li>Xiao, S., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+long-term+serum-free+culture+for+lacrimal+gland+stem+cells+aiming+at+lacrimal+gland+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Establishment of long-term serum-free culture for lacrimal gland stem cells aiming at lacrimal gland repair.</a> Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 20(2020).</li>
<li>Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+progenitor+cells+in+uninjured%2C+adult+rat+lacrimal+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).</li>
<li>Mishima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+side+population+cells+restores+the+function+of+damaged+exocrine+glands+through+clusterin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Transplantation of side population cells restores the function of damaged exocrine glands through clusterin.</a> Stem Cells. 30 (9), 1925-1937 (2012).</li>
<li>Aluri, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+improves+tear+production+in+a+mouse+model+of+sj%C3%B6gren%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves tear production in a mouse model of sjögren's syndrome.</a> Stem Cells International. 2017, 1-10 (2017).</li>
<li>Dietrich, J., Schrader, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+lacrimal+gland+regeneration%3A+current+concepts+and+experimental+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Towards lacrimal gland regeneration: current concepts and experimental approaches.</a> Current Eye Research. 45 (3), 230-240 (2020).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+growing+organoids+from+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: growing organoids from stem cells.</a> Cell. 161 (7), 1700(2015).</li>
<li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+basement+membrane+matrix+with+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Matrigel: basement membrane matrix with biological activity.</a> Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).</li>
<li>Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+matrix+%28BME%29+has+multiple+uses+with+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Basement membrane matrix (BME) has multiple uses with stem cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 8 (1), 163-169 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar, rakip çıkarları olmadığını beyan ederler.

Lakrimal kök hücre kültürü ve LG yaralanma onarımı için lakrimal kök hücrelerin izolasyonu ve in vitro kültürü için iyi kurulmuş yöntemler vardır. Shatos ve ark.17 ve Ackermannve ark. Sıçan ve farelerin sırasıyla 2D kültür yöntemleriyle başarılı bir şekilde kültürlenmiş ve alt kültürlenmiş lakrimal kök hücreleri, ADD tedavisi için lakrimal kök hücrelerin naklini mümkün kılmaktadır. 2D olarak kültürlenmiş LG'lerin 18 kök hücreleri<su...

Lakrimal bez kök hücreleri (LGSC'ler) lakrimal bez (LG) hücre yenilenmesini sürdürür ve asinar ve duktal hücrelerin kaynağıdır. Bu nedenle, LGSC transplantasyonu ciddi inflamatuar hasarın ve sulu eksikliği olan kuru göz hastalığının (ADDED) tedavisinde alternatif bir yaklaşım olarak kabul edilir1,2,3. Tiwari ve ark. çeşitli büyüme faktörleri ile desteklenmiş kollajen I ve matris jeli kullanarak birincil LG hücrelerini ayırmış ve kültüre almış; ancak LG hücreleri sürekli kültürlenemedi4. İki boyutlu (2D) kültür kullanılarak, fare LG'sinden türetilmiş kök hücreler You ve ark.5 ve Ackermann ve ark. tarafından izole edilmiştir. 6, kök / progenitör hücre belirteci genlerini, Oct4, Sox2, Nanog ve nestini eksprese ettiği bulundu ve alt kültürlenebilir. Bununla birlikte, bu hücrelerin asinar veya duktal hücrelere farklılaşabileceğine dair net bir gösterge yoktur ve in vivo farklılaşma potansiyelini doğrulamak için bir transplantasyon deneyi yoktur.
Son zamanlarda, c-kit + dim / EpCAM + / Sca1 - / CD34 - / CD45- hücreleri, akış sitometrisi ile fare LG'lerinden izole edildi, Pax6 ve Runx1 gibi LG progenitör hücre belirteçlerini eksprese ettiği bulundu ve in vitro olarak kanallara ve acini'ye farklılaştı. ADDED'li farelerde, bu hücrelerle ortotopik enjeksiyon, hasarlı LG'leri onarabilir ve LG'lerinsalgı fonksiyonunu geri yükleyebilir 2. Bununla birlikte, bu yöntemle izole edilen kök hücrelerin sayısı azdı ve izole LGSC'leri genişletmek için uygun kültür koşulları yoktu. Özetle, yetişkin LGSC'leri etkin bir şekilde izole etmek ve kültürlemek için uygun bir kültür sisteminin kurulması ve ADD'lerin tedavisinde LGSC'lerin incelenmesi için istikrarlı ve sürekli genişleme sağlanmalıdır.
Kök hücrelerden veya pluripotent kök hücrelerden türetilen organoidler, histolojik olarak ilgili organlara benzeyen ve kendi yenilenmelerini sürdürebilen bir hücre grubudur. Fare bağırsağı organoidi 2009 yılında Sato ve ark. tarafından başarıyla kültürlendikten sonra, safra kesesi8, karaciğer9, pankreas 10, mide 11, meme12, akciğer13, prostat 14 ve tükürük bezi15 gibi Sato'nun kültür sistemine dayanarak, diğer organlardan gelen organoidler art arda kültürlendi. . Organoid kültürde hücre farklılaşmasından önce yetişkin kök hücrelerin yüksek oranda olması nedeniyle, üç boyutlu (3D) organoid kültür yöntemi, LG'nin yetişkin kök hücrelerinin izolasyonu ve kültürü için en uygun olarak kabul edilir.
Bu çalışmada 3D, serumsuz kültür yöntemi optimize edilerek yetişkin fare LGSC kültür sistemi kurulmuştur. Hem normal hem de ADDED farelerden kültürlenen LGSC'lerin istikrarlı bir kendini yenileme ve çoğalma kapasitesi gösterdiği kanıtlanmıştır. ADDED fare LG'lerine transplantasyondan sonra, LGSC'ler bozulmuş LG'leri kolonize etti ve gözyaşı üretimini geliştirdi. Ek olarak, kırmızı floresan LGSC'ler ROSA26mT / mG farelerden izole edildi ve kültürlendi. Bu çalışma, ADDED tedavisi için klinik uygulamada in vitro LGSC zenginleştirmesi ve LGSC otogreft için güvenilir bir referans sağlamaktadır.

<table><tbody><tr><td> Hayvan (Fare)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Bal B/C</td><td>Nanjing Üniversitesi</td><td></td><td></td>Model Hayvan Araştırma Merkezi</tr><tr><td>C57 BL/6J</td><td>Sun Yat-sen Üniversitesi</td><td></td><td></td>Laboratuvar Hayvanları Merkezi</tr><tr><td>NOD/ShiLtJ</td><td>Nanjing Üniversitesi</td><td></td><td></td>Model Hayvan Araştırma Merkezi</tr><tr><td>ROSA26mT/mG</td><td>Nanjing Üniversitesi</td><td></td><td></td> Model Hayvan Araştırma Merkezi</tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analitik denge</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Otomatik kurutucu</td><td>Termo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kan sayma odası</td><td>BLAU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hücre Sayacı</td><td>CountStar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 sabit sıcaklık inkübatörü</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECL Jel görüntüleme sistemi</td><td>GE sağlık hizmetleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Su banyosu için elektrikli banyo</td><td>Yiheng Teknolojisi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektroforez cihazı</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Floresan kantitatif PCR cihazı</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dondurulmuş doku dilimleyici</td><td>Lecia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yatay santrifüj</td><td>CENCE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ters floresan mikroskobu</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ters</td> mikroskop <td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lazer katmanlı tarama mikrografı</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sıvı nitrojen kabı</td><td>Termo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Düşük sıcaklık yüksek hız santrifüjü</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikropipetleyici</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrodalga fırın</td><td>Panasonic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop ultraviyole spektrofotometre</td><td>Termo</td><td>ölçüm RNA konsantrasyonu</td><td></td></tr><tr><td>Parafin dilimleme makinesi</td><td>Termo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR Amplifikatör</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH değeri test cihazı</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 & derece; C Buzdolabı</td><td>Haier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termostatik kültür osilatörü</td><td>ZHICHENG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Doku parafin gömme aleti</td><td>Termo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-80&deg; C Ultra düşük sıcaklıklı buzdolabı</td><td>Termo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-20&�; C Ultra düşük sıcaklıklı buzdolabı</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra saf su arıtma sistemi</td><td>ELGA</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>u>Reagent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hayvan Deneyi</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCG</td><td>Sigma</td><td>9002-61-3</td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Sigma</td><td>14158-65-7</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital Sodyum</td><td>Sigma</td><td>57-33-0</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Hücre Kültürü< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz I</td><td>Gibco</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>BD</td><td>354235</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>Sigma</td><td>D0697</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500895</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Gibco</td><td>04-001-1ACS</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050087</td><td></td></tr><tr><td>İnsan FGF10</td><td>PeproTech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (Matris jel)</td> <td>BD</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Murin Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Murin Wnt3A</td><td>PeproTech</td><td>315-20</td><td></td></tr><tr><td>Murine EGF</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>R-spondin 1</td><td>PeproTech</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin İnhibitörü (TI)</td><td>Sigma</td><td>T6522</td><td>Glisin max'den türetilmiştir; tripsin, kimotripsin ve plazminazı daha az ölçüde inhibe edebilir. Bir mg 1.0-3.0 mg tripsin inhibe edecektir.</td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; T4799</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>HE boyama ve İmmün boyama< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 eşek anti-Fare IgG Thermo</td><td></td><td>A-21202</td><td>Kullanılan seyreltme: IHC) 2 & mu; g/mL, (IF) 0.2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 eşek anti-Tavşan IgG Thermo</td><td></td><td>A-21206</td><td>Kullanılan seyreltme: (IHC) 2 &mu; g/mL, (IF) 2 & mu; g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 eşek anti-Fare IgG Thermo</td><td></td><td>A-10037</td><td>Kullanılan seyreltme: (IHC) 2 &mu; g/mL, (IF) 2 & mu; g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 eşek anti-Tavşan IgG Thermo</td><td></td><td>A-10042</td><td>Kullanılan seyreltme: (IHC) 2 & mu; g/mL, (IF) 4 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-AQP5 tavşan antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab104751</td><td>Kullanılan seyreltme: (IHC) 1 &mu; g/mL, (IF) 0.1 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-E-kaderin Sıçan antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab11512</td><td>Kullanılan seyreltme: (IF)&nbsp; 5 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-Keratin14 tavşan antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab181595</td><td>Kullanılan seyreltme: (IHC) 1 & mu; g/mL, (IF) 2 & mu; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-Ki67 tavşan antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>Kullanılan seyreltme: (IHC) 1 & mu; g/mL, (IF) 1 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-mCherry fare antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab125096</td><td>Kullanılan seyreltme: (IHC) 2 & mu; g/mL, (IF) 2 & mu; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-mCherry tavşan antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab167453</td><td>Kullanılan seyreltme: (IF)&nbsp; 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>C<alt>6</alt>H8O7</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501702-0500</td><td></td></tr><tr><td>Sitrik Asit</td><td>Sangon Biotech</td><td>201-069-1</td><td></td></tr><tr><td>DAB Kiti (20x)</td><td>CWBIO</td><td>CW0125</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Termo</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>BASO</td><td>68115</td><td></td></tr><tr><td>Floresan Montaj Orta</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501912-0500</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-Fare IgG antikoru (HRP)</td> <td>Abcam</td><td>ab6789</td><td>Kullanılan seyreltme: 2 & mu; g / mL</td></tr><tr><td>Keçi anti-Tavşan IgG antikoru (HRP)</td> <td>Abcam</td><td>ab6721</td><td>Kullanılan seyreltme: 2 & mu; g / mL</td></tr><tr><td>Hematoksilen</td><td>BASO</td><td>517-28-2</td><td></td></tr><tr><td>Histogel (Gömme hidrojel)</td> <td>Thermo</td><td>HG-400-012</td><td></td></tr>% <tr><td>30 H < alt > 2 < / alt > O < > 2 < / alt ></td> <td>Guangzhou Kimya</td><td>KD10</td><td></td></tr>% <tr><td>30 Hidrojen Peroksit Çözeltisi</td><td>Guangzhou Kimya</td><td>7722-84-1</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Guangzhou Kimya</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Na3C6H5O7.2H2O</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501293-0500</td><td></td></tr><tr><td>Nötr balsam</td><td>SHANGHAI YIYANG</td><td>YY-Nötr balsam</td><td></td></tr><tr><td>Aşılanmamış Keçi Serumu</td><td>BOSTER</td><td>AR0009</td><td></td></tr><tr><td>Parafin</td><td>Sangon Biyoteknoloji</td><td>A601891-0500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>DAMAO</td><td>200-001-8</td><td></td></tr><tr><td>Sakkaroz</td><td>Guangzhou Kimya</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum sitrat tribazik dihidrat</td><td>Sangon Biotech</td><td>200-675-3</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Guangzhou Kimya</td><td>IB11-AR-500G</td><td></td></tr><tr><td>Doku-Tek OTC Bileşik</td><td>SAKURA</td><td>SAKURA.4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>DINGGUO</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Ksilen</td><td>Guangzhou Kimya</td><td>128686-03-3</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>RT-PCR ve qRT-PCR< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Alkol</td><td>Guangzhou Kimya</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Guangzhou Kimya</td><td>865-49-6</td><td></td></tr><tr><td>Etidyum Bromür</td><td>Sangon Biotech</td><td>214-984-6</td><td></td></tr><tr><td>İzopropil Alkol</td><td>Guangzhou Kimya</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR Yeşil I Master Mix</td><td>Roche</td><td>488735200H</td><td></td></tr><tr><td>ReverTra Ace qPCR RT Master Mix</td><td>TOYOBO-Taq</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>DNA Polimeraz</td><td>TAKARA</td><td>R10T1</td><td></td></tr><tr><td>Goldview (nükleik asit leke)</td><td>BioSharp</td><td>BS357A</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Magen</td><td>R4801-02</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Vektör Yapısı ve Hücre Transfeksiyonu< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>OXID-Ampisilin</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sigma</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Kloramfenikol</td><td>Sigma</td><td>56-75-7</td><td></td></tr><tr><td>Endotoksin İçermeyen Plazmit Ekstraksiyon Kiti</td><td>Thermo</td><td>A36227</td><td></td></tr><tr><td>Kanamisin</td><td>Sigma</td><td>25389-94-0</td><td></td></tr><tr><td>Lipo3000 Plazmid Transfeksiyon Kiti</td><td>Termo</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>LR Reaksiyon Kiti</td><td>Termo</td><td>11791019</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid Ekstraksiyon Kiti</td><td>TIANGEN</td><td>DP103</td><td></td></tr><tr><td>Trans5 & alfa; Kimyasal Olarak Yetkin Hücre</td><td>TRANSGEN</td><td>CD201-01</td><td></td></tr><tr><td>Trytone</td><td>OXID-Maya</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Özü</td><td>OXID-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primerler ve Sıra</td><td>Company<</td><td></td><td></td></tr><tr><td>strong>Primer: AQP5 Sequence: F: CATGAACCCAGCCCGATCTT R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: &beta;-actin Sequence: F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Epcam Sequence: F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Krt5 Sequence: F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Krt14 Sequence: F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA R: GCCACCTCCTCGTGGTTC</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Krt19 Sequence: F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Ltf Sequence: F: CACATGCTGTCGTATCCCGA R: CGATGCCCTGATGGACGA</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: Nestin Sequence: F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer: P63 Sequence: F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC</td><td>Synbio Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vector</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pLX302 lentivirus yüksüz vektör</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pENRTY-mCherry</td><td>Xiaofeng Qin laboratuvarı, Sun Yat-sen Üniversitesi</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

lakrimal bez kök hücreleri için Üç boyutlu, serumsuz kültür sistemi

Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells

Lakrimal bez (LG) kök hücre bazlı tedavi, lakrimal bez hastalıkları için umut verici bir stratejidir. Bununla birlikte, yeterli sayıda LG kök hücresi (LGSC) elde etmek için güvenilir, serumsuz bir kültür yönteminin bulunmaması, daha fazla araştırma ve uygulama için bir engeldir. Yetişkin fare LGSC'leri için üç boyutlu (3D), serumsuz kültür yöntemi iyi kurulmuş ve burada gösterilmiştir. LGSC'ler sürekli olarak geçirilebilir ve asinar veya duktal benzeri hücrelere farklılaşmak için indüklenebilir.
LGSC birincil kültürü için, 6-8 haftalık farelerden gelen LG'ler dispaz, kollajenaz I ve tripsin-EDTA ile sindirildi. Toplam 1 × 10 4 tek hücre,20 μL matris jel-LGSCM matrisi ile önceden kaplanmış, 24 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğunda 80 μL matris jel-lakrimal bez kök hücre ortamı (LGSCM) matrisine tohumlandı. Karışım, 37 ° C'de 20 dakika boyunca inkübasyondan sonra katılaştı ve 600 μL LGSCM eklendi.
LGSC bakımı için, 7 gün boyunca kültürlenen LGSC'ler, dispase ve tripsin-EDTA ile tek hücrelere ayrıştırıldı. Tek hücreler LGSC primer kültüründe kullanılan yönteme göre implante edildi ve kültürlendi. LGSC'ler 40 defadan fazla geçiş yapabilir ve kök / progenitör hücre belirteçleri Krt14, Krt5, P63 ve nestini sürekli olarak eksprese edebilir. LGSCM'de kültürlenen LGSC'ler kendini yenileme kapasitesine sahiptir ve in vitro ve in vivo olarak asinar veya duktal benzeri hücrelere farklılaşabilir.

3D, serumsuz kültür sistemi kurmak Bu çalışmada, fare LGSC'leri için EGF, Wnt3A, FGF10 ve Y-27632 içeren LGSCM geliştirilmiş ve LGSC'ler 3D kültür yöntemi ile başarılı bir şekilde izole edilmiş ve kültürlenmiştir (Şekil 1A). C57BL / 6 farelerden, NOD / ShiLtJ farelerden, BALB / c farelerden ve ROSA26mT / mG farelerinden LGSC'lerin başarılı bir 3D, serumsuz kültür sistemi bu yöntemkullanılarak kurulmuştur 16. Bir erkek fare için, ayrışma ...

Yetişkin lakrimal bez (LG) kök hücreleri için üç boyutlu, serumsuz kültür yöntemi, LG organoid oluşumunun indüksiyonu ve asinar veya duktal benzeri hücrelere farklılaşması için iyi bir şekilde kurulmuştur.

Lakrimal Bez Kök Hücreleri için Üç Boyutlu, Serumsuz Kültür Sistemi

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture ...

Bu protokol, lakrimal bezin rejenerasyonu ve rekonstrüksiyonu için lakrimal bez kök hücrelerinin zenginleştirilmesi için avantajlı bir strateji sağlar. Lakrimal bez kök hücreleri uzun süreli genişleme kapasitesi ve farklılaşma potansiyeli gösterir. Bu tekniğin temel avantajı, lakrimal bez kök hücreleri için kültür ortamının serumsuz olmasıdır, bu da lakrimal bez onarımı için muazzam değeri gösterir Ötenazi altı ila sekiz haftalık bir BALB / c erkek fare elde ederek ve lakrimal bezi ve etrafındaki bağ dokusunu açığa çıkarmak için kulağın arkasındaki cildi keserek başlayın.Cımbız yardımıyla künt diseksiyon ile bağ dokusunu soyun ve lakrimal bezi çıkarın. Lakrimal bezleri 10 saniye boyunca dört mililitre% 75 etanol içeren altı santimetrelik bir kaba batırın ve hemen iki kez 10 milimolar PBS çözeltisi ile durulayın. Lakrimal bezleri yaklaşık bir milimetre küp küçük parçalar halinde kesin.Bunları steril bir 15 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın ve dokuları 37 santigrat derecede bir saat boyunca mililitre dispase başına 500 mikrolitre 25 ünite ve 500 mikrolitre% 0.1 kollajenaz I ile tedavi edin. Lakrimal bez fragmanlarını 37 santigrat derecede 10 dakika boyunca bir mililitre% 0.05 tri

three-dimensional-serum-free-culture-system-for-lacrimal-gland-stem

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Sağlam doku organoids kullanılarak primer hücre kültürü çok hücresel in vivo mikroortam taklit eden bir model sistemi sağlar. Biz enzimatik doku hasarı olmadan, morfoloji farklılaşmış karışık hücre kültürü soyları ve sergiler yaşatan bir serum serbest birincil meme epitel doku kültürü modeli geliştirmiştir. Meme organoids&gt; 6 ay için geçerli kalır.

Enzimatik olmayan, Mammospheres spontan Üretimi için Ön-invaziv Meme Lezyonların Serum serbest Doku Kültürü

Gözyaşı bezi (LG) vizyon ve göz sağlığını korumak için gerekli gözyaşının sulu bileşenlerini üreten bir dallanma organdır. Burada LG gelişiminde rol oynayan sinyal yolları deşifre üzere kemirgen LG diseksiyonu ve ex vivo kültür teknikleri açıklar.

Kemirgen Gözyaşı bezi kurgulama

Burada, insandan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (hiPSC) serum serbest embriyo gövdesi (SFEB) denilen üç boyutlu (3 boyutlu) bir sistem geliştirmek için bir protokol bildirdik. Bu 3 Boyutlu model, insan kortikal gelişimini modellemek için organotipik dilim kültürü gibi ve gelişmekte olan sinir devrelerinin fizyolojik sorgusu için kullanılabilir.

Fizyolojik Olarak İlgili Tahliller Kullanılarak 3-D Kök Hücre Kültürlerinin Sorgulanması İçin HiPSC Türevi Serum Serbest Embriyoid Cisim Geliştirilmesi

Bu iletişim kuralı kornea limbal epitel kök hücre xeno - ve besleyici boş hücre kültür koşullar altında insan pluripotent kök hücrelerden ayırt için basit iki adımlı bir yöntem sağlar. Burada sunulan hücre kültür yöntemleri klinik kalite hücre kornea hücre terapisi kullanmak için uygun maliyet-etkin, büyük ölçekli üretim sağlar.

Verimli ve ölçeklenebilir yönlendirilmiş farklılaşma klinik olarak uyumlu kornea Limbal epitel kök hücrelerden insan Pluripotent kök hücreler

Bu protokol, insan pluripotent kök hücrelerden tanımlanan kültür sistemi ve hücre kendi kendine montaj kullanarak hepatospheres üretmek için bir yaklaşım açıklanmaktadır. Bu protokol, hücre çizgilerinin bir dizi tekrarlanabilir, maliyet etkili ve Biyomedikal uygulama için istikrarlı insan hepatospheres üretimi sağlar.

Pluripotent kök hücrelerinden üç boyutlu ınsan Hepatokürlerin serum ücretsiz üretimi

Bu protokol, birincil fare ve insan dokusundan türetilen lakrimal bez organoidlerinin nasıl kurulacağını, sürdürüleceğini, genetik olarak değiştirileceğini, farklılaştırılacağını, fonksiyonel olarak karakterize edileceğini ve nakledileceğini açıklar.

Fare ve İnsan Lakrimal Bezi Organoidlerinin Kurulması, Bakımı, Farklılaşması, Genetik Manipülasyonu ve Transplantasyonu

Burada, adipoz kaynaklı kök hücre (ADSC) kültürü için üç boyutlu (3D) hücre kültürü çerçevesi olarak hidrojelin kullanımını gösteren ve 3D kültür ortamında ADSC'lerin proliferasyonunu arttırmak için fotobiyomodülasyonu (PBM) tanıtan bir protokol sunuyoruz.

Hidrojel İçinde Yağ Kaynaklı Kök Hücrelerin Fotobiyomodülasyon Ogmentasyonu ile Üç Boyutlu Hücre Kültürü

Bu protokol, yaşlı fare gözyaşı bezlerinin ayrıştırılmasında optimize edilmiş bir yöntem tanımlayarak tek hücreli RNA dizileme için canlı tek hücreler elde edilir. Ardışık enzimatik sindirim ve nazik kullanım, hücre bütünlüğünü korur ve hücre tipine özgü izolasyon ve yaşlanmaya bağlı değişikliklerin lakrimal bez popülasyonlarındaki transkriptomik analizi için uygun yüksek kaliteli süspansiyonlar sağlar.

Yaşlanmış gözyaşı ve tükürük bezlerinden miyoepitel hücreleri ve fibroblastların tek hücre ayrımı, RNA dizileme ve izolyasyonu protokolü

Biz, mikro-biyoreaktörler hücrelerin üç boyutlu ekimi için çip tabanlı platform açıklar. Bir çip 10 milyon kadar ev. steril, kapalı bir dolaşım döngü içinde sıvı akışı, oksijen basıncı vb ilişkin kesin olarak tanımlanmış koşullar altında yetiştirilen hücreler.

Perfüze Mikro-biyoreaktörler Chip tabanlı üç boyutlu Hücre Kültürü

İnsan trombosit lizat, büyüme faktörleri ve hücre kültüründe güçlü bir ek zengin bir kaynak. Bu protokol, zengin plazma, trombosit başlayarak, çeşitli donma-çözülme döngüsünden performans ve trombosit parçaları tüketen insan trombosit lizat büyük bir havuz hazırlama süreci sunar.

Hayvan Serum Ücretsiz İnsan Kök Hücre Kültürleri Verimli Ek olarak Pooled İnsan Trombosit Lizat (pHPL) hazırlanması

Keşfedin, lakrimal bez kök hücrelerini serumsuz üç boyutlu kültür sistemiyle nasıl izole edip çoğaltacağınızı. Bu yöntem, uzun süreli genişleme ve farklılaşma potansiyeli sunarak bez onarımı için değerli bir model oluşturur.

Lakrimal Bez Kök Hücreleri için Üç Boyutlu, Serumsuz Kültür Sistemi

Daha fazla video keşfet