Gelişmekte Olan (Kurbağa) Embriyoda Hücre-Soy Kılavuzlu Kütle Spektrometrisi Proteomikleri
21 Nisan 2022
Burada, omurgalı Xenopus laevis embriyosunda bilinen doku kaderlerine sahip hücre soylarının kütle spektrometrisine dayalı proteomik karakterizasyonu açıklanmaktadır.
Bu soy rehberliğindeki yaklaşım, omurgalı embriyo içindeki uzamsal ve zamansal çözünürlükle önemli gelişimsel olayların proteomik analizini sağlar ve tüm embriyo ölçümleriyle erişilemeyecek bilgileri verir. Bu yaklaşım, gelişim sırasında farklılaştıkça farklı embriyonik hücrelerden proteinleri, metabolitleri ve transkriptleri incelemek için kolayca genişletilebilir. Bu yöntem, erken gelişim sırasında doku indüksiyonu ve hücre kaderi taahhüdü mekanizmaları da dahil olmak üzere normal ve hastalık gelişimini kontrol eden moleküler mekanizmalar hakkındaki anlayışımızı geliştirebilir.
Her embriyoyu bir kuyuya yönlendirmek için bir saç halkası kullanın ve hedeflenen ilgili hücrenin mikroiğneye doğru açıda olması için yavaşça konumlandırın. İlgilenilen soyun öncü hücresini tanımlamak için xenopus laevis doku kader haritalarını izleyin. Embriyoyu çevreleyen vitelin zarını nazikçe çıkarmak için iki keskinleştirilmiş forseps kullanın.
Forseps kullanarak manuel diseksiyon ile tek hücreleri embriyodan izole edin. Soy izleyici çözeltisini içeren enjeksiyon iğnesini ayarlayarak başlayın. Mikroenjeksiyon iğnesini, çok eksenli bir mikro manipülatör tarafından kontrol edilen bir mikro pipet tutucuya monte edin.
Mikro pipet tutucuyu bir mikro enjektöre bağlayın ve negatif basınç uygulayarak iğneyi soy izleyici ile doldurun. İğneyi kalibre edin ve mineral yağda ölçülen soy izleyici çözeltisinin yaklaşık bir nanolitresini vermek için iğne ucunun boyutunu ve enjeksiyon süresini ayarlayın. Enjekte edilen damlacık boyutunun doğru olduğundan emin olun ve gerekirse enjektör ayarlarını yapın.
Mikroenjeksiyon kil kabını %3'lük bir fCAL çözeltisi ile doldurun ve bir transfer pipeti kullanarak yaklaşık 10 embriyoyu kil kabına aktarın. İlgili hücrelere yaklaşık bir nanolitre floresan dekstran veya 200 pikogram GFP mRNA enjekte edin. Bir stereo mikroskop kullanarak, hücre etiketlemenin başarısını onaylayın.
Yalnızca amaçlanan hücrenin enjekte edildiğinden emin olun. Kurumsal politikalara uyarak yaralı veya yanlış etiketlenmiş hücreler içeren embriyoları atın. Enjekte edilen embriyoları 0.5x Steinberg çözeltisi içeren bir petri kabına aktarın.
İstenilen gelişim aşamasına ulaşana kadar onları 14 ila 25 santigrat derece arasında kültürleyin. Üç ila beş embriyoyu, mikro diseksiyonlar için 0.2x Steinberg çözeltisi içeren bir agar kabına aktarın. Etiketli klonu embriyodan diseke etmek için forseps kullanın.
Disseke edilmiş dokuyu 0,5 ila 10 mikrolitrelik bir pipetle toplayın ve bir mikro santrifüj dosyasına koyun. Bir pipet kullanarak, HRMS analizine müdahale edilmesini önlemek için numunedeki tuzları sınırlamak üzere toplanan dokuyu çevreleyen ortamı aspire edin. Numune şişesini kuru buz veya sıvı azot üzerine yerleştirerek izole edilmiş hücreleri derhal dondurun.
Kütle spektrometresi analizine kadar numuneleri eksi 80 santigrat derecede saklayın. CE ile tek hücreli numune işleme için, numuneyi yaklaşık 15 dakika boyunca 60 santigrat dereceye ısıtarak proteinleri denatüre edin. Daha sonra numuneyi beş dakika boyunca oda sıcaklığına dengeleyin ve sindirim için numunelere tripsin ekleyin.
NanoLC ile analiz için, 50 mikrolitre lizis tamponunda beş adede kadar disseke dokuyu lize edin. Numuneyi yukarı ve aşağı pipetleyerek işlemi kolaylaştırın. Disseke edilmiş dokuları işlemek için, lizatı 10 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.
Daha sonra hücre kalıntılarını ve yumurta sarısı trombositlerini 4.500 RCF'de merkezleştirme yoluyla dört santigrat derecede peletleyin. Süpernatantı temiz bir mikro santrifüj şişesine aktarın ve lizatta% 1'lik SDS'lik nihai bir konsantrasyon elde etmek için% 10 SDS ekleyin. Dokular için, yaklaşık 25 milimolar'lık nihai bir konsantrasyon elde etmek için lizata 0.5 molar ditiyotreitol ekleyin.
Daha sonra, proteinlerdeki disülfit bağlarını kimyasal olarak azaltmak için lizatı 60 santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edin. Lizatta yaklaşık 75 milimolar'ın nihai konsantrasyonunu elde etmek için 0.5 molar iyodoasetamid ekleyin ve karışımı karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. Alkilasyon reaksiyonundan kalan reaktanları söndürmek için başlangıç hacmiyle aynı 0.5 molar ditiyotreitol ekleyin.
Metin protokolünde açıklandığı gibi gece boyunca asetondaki proteinleri çökeltin ve 0.5 molar amonyum bikarbonatta yeniden oluşturun. Numune sindirimi için tripsin ekleyin ve şişeleri 37 santigrat derecede inkübe edin. Peptitleri CE kullanarak ayırmak için, numune çözücüsünün bir ila iki mikrolitresinde sindirilen proteini yeniden oluşturun.
Karışık numuneyi ve merkezcilleştirmeyi 10.000 RCF'de dört santigrat derecede iki dakika boyunca pelet hücresi kalıntılarına vorteks. CE kılcal damarını BGE ile yıkayarak CE-ESI cihazını başlatın. Numune şişesine bir mikrolitre numune yerleştirin ve numunenin bir ila 10 nanolitresini hidrodinamik enjeksiyonla CE ayırma kılcal damarına enjekte edin.
CE ayırma kılcal damarının giriş ucunu BGE'ye aktarın. CE ayırma voltajını toprak topraklamasından kademeli olarak artırarak elektroforetik ayırmaya başlayın. 10 mikro amperin altında bir akımla 20 ila 28 kilovoltluk potansiyeller, analiz için istikrarlı ve tekrarlanabilir enstrümantal performans sağlar.
Nano LC kullanarak ayırmak için, peptid numunesini mobil faz A'da yeniden askıya alın.Numunenin konsantrasyonu ve enjeksiyon hacmi, mevcut LC sistemine ve kolonuna bağlıdır. Numuneyi bir LC şişesine aktarın. C18 analitik sütununa yaklaşık 200 nanogram ila iki mikrogram peptit örneği yükleyin ve peptitleri, metin makalesinde açıklandığı gibi gradyan elüsyonunu kullanarak dakikada 300 nanolitrelik bir akış hızında ayırın.
Bir kamera kullanarak, elektro sprey yayıcıdan sıvı akışını kontrol edin ve kurulumu olası sızıntılara karşı görsel olarak inceleyin. Kütle spektrometresi olaylarını elde edin ve peptitleri metin makalesinde açıklandığı gibi sıralayın. CE-ESI-HRMS kullanılarak farklı embriyolardan diseke edilen D11 hücreleri arasında gen translasyonel farklılıklar tespit edildi.
Soy etiketli disseke hücre klonları LC-HRMS ile analiz edildi. Proteinlerin yol analizi, Spemann'ın organizatöründe nöroektoderm ile birlikte düzenlenmiş protein translasyonunu ve enerji metabolizmasını gösterdi. Nöroektoderm prodeumu, hücredeki protein yükünün nükleer taşınması ile ilişkili proteinlerle zenginleştirildi ve muhtemelen sinyallemeyi takiben aşağı akış olaylarını gösterdi.
Moleküler fonksiyonların zenginleştirme analizi, translasyon başlatma, RNA bağlanma ve proteazom kompleksinin bağlanmasında yukarı regülasyonu gösterdi ve Spemann'ın organizatörünü geliştiren dinamik protein döngüsü için bir rol düşündürdü. Tekrarlanabilirliği ve sonuç yorumlamasını iyileştirmek için bu protokol için sadece basmakalıp embriyoları seçin. Diseke edilmiş doku bir şişeye aktarılmalı ve tampon tuzlarından kaynaklanan kontaminasyonu en aza indirmek için mümkün olduğunca az ortam tamponu içeren derhal dondurulmalıdır.
Bu yaklaşım, tanımlanmış hücrelerdeki protein dinamiklerini ve canlı embriyolardaki hücre soylarını incelememizi sağlamıştır. Gelişmekte olan dokulardaki önemli proteinlerin mekansal zamansal üretimi hakkında elde ettiğimiz yeni bilgiler, biyolojik işlevlerini değerlendirmek için hedefli deneyler tasarlamamızı sağlamıştır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, omurgalı Xenopus laevis embriyosundaki hücre soylarının kütle spektrometriye dayalı proteomik karakterizasyonunu sunar. Soy yönlendirmeli yaklaşım, gelişimsel olayların mekansal ve zamansal çözünürlük ile detaylı analizini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Proteomik
- Gelişimsel Biyoloji
- Xenopus laevis Embriyoloji
Arka Plan
- Hücre soyunu ve doku kaderini anlamak, gelişimsel biyolojide kritik öneme sahiptir.
- Proteomik analiz, gelişimin altında yatan moleküler mekanizmaları ortaya çıkarabilir.
- Geleneksel tüm embriyo ölçümleri önemli detayları gözden kaçırabilir.
- Xenopus laevis, omurgalı gelişimini incelemek için bir model organizma olarak hizmet eder.
Çalışmanın Amacı
- Embriyonik gelişim sırasında hücre soylarının proteomik analizini sağlamak.
- Doku indüksiyonu ve hücre kader taahhüdü hakkında bilgiler sağlamak.
- Normal ve hastalık gelişimi mekanizmalarının anlaşılmasına katkıda bulunmak.
Kullanılan Yöntemler
- Proteomik karakterizasyon için kütle spektrometrisi.
- Hedefli analiz için soy yönlendirmeli yaklaşım.
- Hassas hücre hedeflemesi için mikronejde pozisyonlandırması.
- Prekürsör hücreleri tanımlamak için doku kader haritalarının kullanımı.
Ana Sonuçlar
- Belirli hücre soylarının başarılı proteomik profillemesi.
- Gelişimsel süreçlerde yer alan anahtar proteinlerin tanımlanması.
- Protein analizinde mekansal ve zamansal çözünürlüğün gösterilmesi.
- Embriyonik hücrelerde farklılaşma çalışmaları için bir çerçeve sağlanması.
Sonuçlar
- Yöntem, gelişimsel biyoloji anlayışını ilerletir.
- Çeşitli moleküler mekanizmaları incelemek için yeni yollar açar.
- Hastalık gelişimini anlamadaki potansiyel uygulamalar.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Cell-lineage guided mass spectrometry proteomics in Xenopus embryos enables high-resolution mapping of protein dynamics during vertebrate development. This approach provides actionable insights into spatial and temporal protein expression, supporting mechanistic de-risking and target validation in early discovery. The method's adaptability and quantitative outputs position it as a reusable capability for translational research and portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of developmental pathways and cell fate decisions at the protein level.
- Supports biological de-risking by clarifying lineage-specific molecular mechanisms.
- Facilitates predictive confidence in target selection through quantitative proteomic data.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, lineage-specific biological samples for downstream screening workflows.
- Delivers reproducible and quantitative proteomic outputs for assay standardization.
- Enables scalable sample processing compatible with high-resolution mass spectrometry platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns proteomic findings with disease-relevant developmental processes for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by linking molecular events to tissue outcomes.
- Provides mechanistic insights that inform preclinical model selection and biomarker discovery.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates from early discovery through preclinical research by enabling precise hypothesis testing and pathway clarification in vertebrate development models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven analysis of cell fate and tissue induction mechanisms.
- Screening: Provides reproducible, quantitative proteomic data for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Delivers high-resolution measurements of protein abundance and pathway activity across developmental stages.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical validation by mapping protein dynamics in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable workflow for diverse tissues and organisms in R&D pipelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and proteomic analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing quantitative, lineage-specific data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryology, proteomics, and mass spectrometry instrumentation.
- Demands access to high-resolution mass spectrometry and sample preparation infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of lineage tracing and sample handling protocols.
- Adaptable to various tissues and organisms with validated fate maps and labeling strategies.
- Sample contamination and selection of stereotypical embryos are critical for reproducibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:52
Identification and Isolation of Single Cells
1:27
Labeling Cells of Interest
2:42
Isolation of Labeled Clones
3:47
Proteomic Analysis
5:39
Separation by Capillary Electrophoresis
6:37
Separation by Liquid Chromatography
7:12
Ionization and Detection of Peptides
7:30
Results: Characterization of Protein Expression in Single Cells and Cell Lineages of Xenopus laevis Embryos
8:25
Conclusion
