Sigma'nın Özü-N-Amp Doku PCR Kit kullanarak Fare Doku hızlı Genotiplendirme

Merhaba, benim adım Linda; California Üniversitesi Irvine'de Dr. Edwin Niki'nin laboratuvarında çalışıyorum. Bugün size, transgenik farelerin genotiplerini hızla belirlemek için Sigma'nın CypherGreen doku ekstraksiyonu PCR kitini nasıl kullandığımı göstereceğim. Genellikle bu kiti, akut olarak disosiye hücre kültürleri hazırlarken farelerimizin genotipini hızlıca öğrenmem gereken durumlarda, embriyonik farelerin genotiplerini belirlemek için kullanıyorum.

Ancak bugünün amaçları doğrultusunda, bu kiti nasıl kullandığımı gösterebileceğimiz yetişkin fare kuyruklarımız mevcuttur. Bu protokol; hızlı bir doku sindirimi ve DNA ekstraksiyonu ve ardından hızlı bir nötralizasyon adımını içerir. Ekstrakt DNA'yı, PCR amplikonlarını izleyebileceğimiz bir gerçek zamanlı PCR'da kullanıyoruz.

Hazırsanız, başlayalım. Başlamadan önce, ısıtma bloğunun 95 °C'ye ayarlandığından, Sybr Green'in çözüldüğünden ve ihtiyaç duyulana kadar buz üzerinde tutulduğundan ve diğer reaktiflerin oda sıcaklığında çözülmekte olduğundan emin olmak istiyoruz. Buz kovamda, genotipleme için kullanacağımız ve hedef genimiz için özel olarak tasarlanan ve qPCR için valide edilen iki primerim bulunuyor.

Ayrıca ilgilenilen gene yönelik pozitif kontrolüm, negatif kontrolüm ve yetişkin bir fareden önceden topladığım bir doku örneğim var. Doku örneğinizi toplarken son derece titiz davranmanız çok önemlidir. Embriyonik fare kuyruklarını topladığımızda, her doku toplama işleminden önce ve işlem sırasında forsepslerimizi her zaman %70 etanol ile durularız.

Kuyruk örneklerini her zaman önce TBS ile duruluyoruz; ardından her kuyruk için doku hazırlama ve DNA ekstraksiyonu için bir master mix hazırlamanız gerekir; 100 µL ekstraksiyon solüsyonu ve 25 µL doku hazırlama solüsyonuna ihtiyacınız olacak. Yeni bir eppendorf tüpüne 100 µL ekstraksiyon solüsyonu ve 25 µL doku hazırlama solüsyonu ölçmek için P 200 pipetim ve filtre uçlarım kullanacağım. Master mix solüsyonunuzu pipetleme yaparak yukarı-aşağı karıştırmanız gerekecektir.

Ardından, ilgi alanınızdaki örneğe 125 µL master mix eklemeniz gerekecek; eğer bu yetişkin bir fare kuyruğu ise, kesik ucun master mix çözeltisine tamamen daldığından emin olun. Parmağınızla vortex yapabilir ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edebilirsiniz. 10 dakikalık inkübasyon sırasında, kit içerisinde yer alan cider green master mix, milli Q veya PCR sınıfı su ve ileri ve geri primerlerimizden oluşan favori yeşil master mix'imi hazırlayacağım. Hepsi bu kadar.

10 dakikalık inkübasyon süresi dolduğuna göre, reaksiyonu 95 derecede üç dakika boyunca ısıtıp aktive etmemiz gerekiyor. Üç dakikalık inaktivasyon süresi doldu ve şimdi kit içerisinde sağlanan nötralizasyon solüsyonunu ekleyeceğiz; reaksiyon başına 100 µL ekleyerek vortex ile karıştıracağız. Nötralizasyon tamponunu ekledikten sonra, DNA örneklerinizi kullanmaya hazır olana kadar 4 °C'de saklayabilirsiniz.

Genotipimizi hemen elde etmek istiyoruz. Bu nedenle doğrudan qPCR aşamasına geçiyoruz; kuyruklarım nötralize edildi ve hazır. Cyber green PCR master mix'im hazır ve PCR tüplerim soğutucu blok üzerinde düzenlenmiş durumda.

Şimdi yapacağım tek şey, her kuyucuğa 16 µL master mix eklemek ve ardından her birine 4 µL nötralize edilmiş ekstrakt veya 4 µL pozitif ya da negatif kontrol eklemektir. Kısacası, her bir kuyucuğa 16 µL master mix ekliyorum. Daha sonra, toplam 20 µL reaksiyon hacmi elde etmek için kuyucuktaki 16 µL master mix'e 4 µL nötralize edilmiş ekstrakt ekleyeceğim.

Pozitif ve negatif kontrol için de aynı işlemi yapacağım. 16 µL qPCR master mix içeren tüplere dört µL ekliyorum. Hepsi eklendikten sonra, tüpleri optik olarak şeffaf sekizli kapak şeridi ile kapatabilirsiniz.

Numunelerinizin üzerindeki kapakların optik olarak şeffaf olan kısmına dokunmamaya dikkat etmelisiniz. Bu nedenle, kapakların mühürlendiğinden emin olmak için onları aşağı doğru bastırmak amacıyla bir Kim wipe kullanıyorum. PCR ve DNA karışımımızı nazikçe vorteksladım, santrifüjle çökelttim ve artık onları QPCR cihazına yerleştirmeye hazırız.

İlk olarak numunelerimizi Opticon PCR cihazına yükleyeceğiz ve yeni bir plaka düzeni oluşturacağım; burada birinci kuyucuk numunemiz, ikinci kuyucuk pozitif kontrolümüz ve üçüncü kuyucuk ise negatif kontrolümüz olacak. Toplam reaksiyon hacminin 20 µL olduğunu belirleyin. Ardından, hızlı genotipleme için tasarlanmış olan protokolü yükleyeceğim.

Bu protokol, üç dakikalık bir denatürasyon adımının ardından; 15 saniyelik denatürasyon, 15 saniyelik primer bağlanması ve ardından 20 saniyelik primer uzamasından oluşan bir döngüyü içerir. Aslında primer uzama süresi yaklaşık 10 saniyeye kadar indirilebilir ve bu durumda toplam süre yalnızca 40 saniye olacaktır. Her döngü için, normal bir PCR'da olduğu gibi bu üç adım yaklaşık 40 kez tekrarlanır ve ardından işlemin sonunda bir erime eğrisi analiz edilir.

Plakayı hazırladık ve protokolü yükledik. Şimdi tek yapmamız gereken qPCR işlemini başlatmak; işlem üç dakikalık denatürasyon aşamasıyla başlıyor. Kullandığım primerler, kuyruk örnekleri ve aradığım genler göz önüne alındığında, pozitif sonuçların anlamlı bir eşik döngü değerini aşarak yaklaşık 25. döngü civarında ortaya çıkmaya başlayacağını biliyorum.

Şu anda, bu geçişin ne zaman gerçekleşeceği doku örneğinize, ne aradığınıza ve başlangıçta ne kadar DNA bulunduğuna büyük ölçüde bağlıdır. Pozitif kontrolümüzün zaten yükseldiğini görebiliyoruz ve örneğimizin de pozitif olduğu anlaşılıyor. Gördüğünüz gibi, pozitif kontrolümüzden kısa bir süre sonra yükselmeye başlıyor.

Henüz 27 döngüde olduğumuz için beklememiz gerekecek, ancak umuyorum ki birkaç döngü daha sonra örneğimizin pozitif olduğundan emin olabilirim ve ardından deneyime devam edebilirim. Bu noktada, negatif kontrolün yeni yükselmeye başladığını görebilirsiniz; bunun nedeni fazla miktarda kuyruk almış olmamdır. Bu durum, bu fazla negatif kuyruktan önce yükselen herhangi bir sonucun pozitif olacağından emin olmanıza yardımcı olur.

Bu noktada, negatif kontrolden önce gelen her şeyi pozitif olarak değerlendirir ve deneyime devam ederdim. PCR döngüleri tamamlandıktan sonra, cihaz bir erime eğrisi analizi gerçekleştirir. Bu, ürününüzün bileşimini ve saflığını belirlemenize yardımcı olacaktır.

Böylece, pozitif ve negatif örnekleri doğru seçip seçmediğinizi anlayabilirsiniz. Örneğin, pozitif örnek, amplifiye edilmiş spesifik bir PCR ürününe karşılık gelen, belirgin ve keskin bir erime sıcaklığı pikine sahip olacaktır. Herhangi bir negatif örnek ise, PCR sırasında amplifiye olmuş spesifik olmayan DNA'ya karşılık gelen, spesifik olmayan ve geniş bir erime sıcaklığı pikine sahip olacaktır.

Böylece Sigma'nın Cyber Green ekstraksiyon amplifikasyon kitini yetişkin fare kuyruklarını hızlıca genotiplemek için nasıl kullandığımızı göstermiş oldum. Ancak bu kit çeşitli hayvan dokuları, saç, tükürük ile birlikte kullanılabilir; ben bunu fare embriyonik kuyruklarını genotiplemek için kullanıyorum. Bu kiti, hızlı olduğu için tercih ediyoruz.

Genotipimi bir saat içinde geri alabiliyorum, bu da oldukça kolay ve basit. İzlediğiniz için teşekkürler ve başarılar dilerim.