Name: Sigmanın Özü-N-Amp Doku PCR Kit kullanarak Fare Doku hızlı Genotiplendirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-01-22T18:40:00.000+00:00
Duration: 12 min 39 s
Description: Öğrenin, Sigma SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR kiti kullanarak fare kuyruk örneklerinde hızlı genotipleme yöntemini. Bu protokol yaklaşık bir buçuk saatte tam genotipleme sağlar ve transgenik fare çalışmalarında güvenilir sonuçlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Lütfen <a href="http://www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular-biology/dna-and-rna-purification/sybr-green-extractnamp-tissue.html?cm_mmc=JoVE-_-video-_-extract-_-video">burada</a> protokol görüntülemek için <a href="http://www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular-biology/dna-and-rna-purification/sybr-green-extractnamp-tissue.html?cm_mmc=JoVE-_-video-_-extract-_-video">tıklayın</a> .

Yazarların beyan edeceği herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

<table><tbody><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=XNATG%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346">SYBR Green Extract-N-Amp Doku PCR Kiti&lt;/a&gt;</td><td>Reaktif Kiti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=XNATG%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346">XNATG&lt;/a&gt;</td><td>İçerik: Ekstraksiyon Solüsyonu, Nötralizasyon Solüsyonu B, Doku Hazırlama Solüsyonu, Extract-N-Amp SYBR Green PCR ReadyMix</td></tr></tbody></table>

sigma&#39;nın Özü-n-amp doku pcr kit kullanarak fare doku hızlı genotiplendirme

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Genomik DNA&#39;nın elektroforetik bir jel üzerinde PCR ve algılama yoluyla algılama, bir doku örneği genotip kararlı olduğu bir standart yoludur. Hazır PCR-DNA dokuların Konvansiyonel hazırlık genellikle doku örneği bağlı olarak, gün birkaç saat sürebilir. Böylece örnek genotip deney birçok farklı türleri için bir seçenek değildir, birkaç gün süreyle ertelendi olabilir. Burada doku sindirim ve PCR okuma, bir ve Sigma&#39;nın SYBR Green Özü-N-Amp Doku PCR Kit kullanarak bir buçuk saat dahil olmak üzere, bir fare kuyruğu örnek tam genotipleme göstermektedir. İlk olarak, DNA doku örneği onbeş dakikalık çıkarma göstermektedir. Sonra, biz amplifiye olarak tanımlanması için olumlu bir örnek verir örnek PCR, gerçek zamanlı okuma göstermektedir. Birlikte çıkarma ve gerçek zamanlı okuma, hızlı, güvenilir PCR yöntemi ile dokuların çeşitli farklı türde genotip bir istemi tanımlanması için izin verir.

Doku sindirim ve PCR okuma da dahil olmak üzere bir fare kuyruğu örnek tam genotipleme, bir ve bir buçuk saat Sigma&#39;nın SYBR Green Özü-N-Amp Doku PCR kiti kullanılarak yapılır.

Sigma&#39;nın Özü-N-Amp Doku PCR Kit kullanarak Fare Doku hızlı Genotiplendirme

PCR amplifikasyonu yoluyla DNA'nın genomik tespiti ve elektroforetik jel üzerinde saptanması, bir doku örneğinin genotipinin ... belirlenmesinin standart bir yoludur.

Merhaba, benim adım Linda; California Üniversitesi Irvine'de Dr. Edwin Niki'nin laboratuvarında çalışıyorum. Bugün size, transgenik farelerin genotiplerini hızla belirlemek için Sigma'nın CypherGreen doku ekstraksiyonu PCR kitini nasıl kullandığımı göstereceğim. Genellikle bu kiti, akut olarak disosiye hücre kültürleri hazırlarken farelerimizin genotipini hızlıca öğrenmem gereken durumlarda, embriyonik farelerin genotiplerini belirlemek için kullanıyorum.Ancak bugünün amaçları doğrultusunda, bu kiti nasıl kullandığımı gösterebileceğimiz yetişkin fare kuyruklarımız mevcuttur. Bu protokol; hızlı bir doku sindirimi ve DNA ekstraksiyonu ve ardından hızlı bir nötralizasyon adımını içerir. Ekstrakt DNA'yı, PCR amplikonlarını izleyebileceğimiz bir gerçek zamanlı PCR'da kullanıyoruz.Hazırsanız, başlayalım. Başlamadan önce, ısıtma bloğunun 95 °C'ye ayarlandığından, Sybr Green'in çözüldüğünden ve ihtiyaç duyulana kadar buz üzerinde tutulduğundan ve diğer reaktiflerin oda sıcaklığında çözülmekte olduğundan emin olmak istiyoruz. Buz kovamda, genotipleme için kullanacağımız ve hedef genimiz için özel olarak tasarlanan ve qPCR için valide edilen iki primerim bulunuyor.Ayrıca ilgilenilen gene yönelik pozitif kontrolüm, negatif kontrolüm ve yetişkin bir fareden önceden topladığım bir doku örneğim var. Doku örneğinizi toplarken son derece titiz davranmanız çok önemlidir. Embriyonik fare kuyruklarını topladığımızda, her doku toplama işleminden önce ve işlem sırasında forsepslerimizi her zaman %70 etanol ile durularız.Kuyruk örneklerini her zaman önce TBS ile duruluyoruz; ardından her kuyruk için doku hazırlama ve DNA ekstraksiyonu için bir master mix hazırlamanız gerekir; 100 µL ekstraksiyon solüsyonu ve 25 µL doku hazırlama solüsyonuna ihtiyacınız olacak. Yeni bir eppendorf tüpüne 100 µL ekstraksiyon solüsyonu ve 25 µL doku hazırlama solüsyonu ölçmek için P 200 pipetim ve filtre uçlarım kullanacağım. Master mix solüsyonunuzu pipetleme yaparak yukarı-aşağı karıştırmanız gerekecektir.Ardından, ilgi alanınızdaki örneğe 125 µL master mix eklemeniz gerekecek; eğer bu yetişkin bir fare kuyruğu ise, kesik ucun master mix çözeltisine tamamen daldığından emin olun. Parmağınızla vortex yapabilir ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edebilirsiniz. 10 dakikalık inkübasyon sırasında, kit içerisinde yer alan cider green master mix, milli Q veya PCR sınıfı su ve ileri ve geri primerlerimizden oluşan favori yeşil master mix'imi hazırlayacağım. Hepsi bu kadar.10 dakikalık inkübasyon süresi dolduğuna göre, reaksiyonu 95 derecede üç dakika boyunca ısıtıp aktive etmemiz gerekiyor. Üç dakikalık inaktivasyon süresi doldu ve şimdi kit içerisinde sağlanan nötralizasyon solüsyonunu ekleyeceğiz; reaksiyon başına 100 µL ekleyerek vortex ile karıştıracağız. Nötralizasyon tamponunu ekledikten sonra, DNA örneklerinizi kullanmaya hazır olana kadar 4 °C'de saklayabilirsiniz.Genotipimizi hemen elde etmek istiyoruz. Bu nedenle doğrudan qPCR aşamasına geçiyoruz; kuyruklarım nötralize edildi ve hazır. Cyber green PCR master mix'im hazır ve PCR tüplerim soğutucu blok üzerinde düzenlenmiş durumda.Şimdi yapacağım tek şey, her kuyucuğa 16 µL master mix eklemek ve ardından her birine 4 µL nötralize edilmiş ekstrakt veya 4 µL pozitif ya da negatif kontrol eklemektir. Kısacası, her bir kuyucuğa 16 µL master mix ekliyorum. Daha sonra, toplam 20 µL reaksiyon hacmi elde etmek için kuyucuktaki 16 µL master mix'e 4 µL nötralize edilmiş ekstrakt ekleyeceğim.Pozitif ve negatif kontrol için de aynı işlemi yapacağım. 16 µL qPCR master mix içeren tüplere dört µL ekliyorum. Hepsi eklendikten sonra, tüpleri optik olarak şeffaf sekizli kapak şeridi ile kapatabilirsiniz.Numunelerinizin üzerindeki kapakların optik olarak şeffaf olan kısmına dokunmamaya dikkat etmelisiniz. Bu nedenle, kapakların mühürlendiğinden emin olmak için onları aşağı doğru bastırmak amacıyla bir Kim wipe kullanıyorum. PCR ve DNA karışımımızı nazikçe vorteksladım, santrifüjle çökelttim ve artık onları QPCR cihazına yerleştirmeye hazırız.İlk olarak numunelerimizi Opticon PCR cihazına yükleyeceğiz ve yeni bir plaka düzeni oluşturacağım; burada birinci kuyucuk numunemiz, ikinci kuyucuk pozitif kontrolümüz ve üçüncü kuyucuk ise negatif kontrolümüz olacak. Toplam reaksiyon hacminin 20 µL olduğunu belirleyin. Ardından, hızlı genotipleme için tasarlanmış olan protokolü yükleyeceğim.Bu protokol, üç dakikalık bir denatürasyon adımının ardından; 15 saniyelik denatürasyon, 15 saniyelik primer bağlanması ve ardından 20 saniyelik primer uzamasından oluşan bir döngüyü içerir. Aslında primer uzama süresi yaklaşık 10 saniyeye kadar indirilebilir ve bu durumda toplam süre yalnızca 40 saniye olacaktır. Her döngü için, normal bir PCR'da olduğu gibi bu üç adım yaklaşık 40 kez tekrarlanır ve ardından işlemin sonunda bir erime eğrisi analiz edilir.Plakayı hazırladık ve protokolü yükledik. Şimdi tek yapmamız gereken qPCR işlemini başlatmak; işlem üç dakikalık denatürasyon aşamasıyla başlıyor. Kullandığım primerler, kuyruk örnekleri ve aradığım genler göz önüne alındığında, pozitif sonuçların anlamlı bir eşik döngü değerini aşarak yaklaşık 25. döngü civarında ortaya çıkmaya başlayacağını biliyorum.Şu anda, bu geçişin ne zaman gerçekleşeceği doku örneğinize, ne aradığınıza ve başlangıçta ne kadar DNA bulunduğuna büyük ölçüde bağlıdır. Pozitif kontrolümüzün zaten yükseldiğini görebiliyoruz ve örneğimizin de pozitif olduğu anlaşılıyor. Gördüğünüz gibi, pozitif kontrolümüzden kısa bir süre sonra yükselmeye başlıyor.Henüz 27 döngüde olduğumuz için beklememiz gerekecek, ancak umuyorum ki birkaç döngü daha sonra örneğimizin pozitif olduğundan emin olabilirim ve ardından deneyime devam edebilirim. Bu noktada, negatif kontrolün yeni yükselmeye başladığını görebilirsiniz; bunun nedeni fazla miktarda kuyruk almış olmamdır. Bu durum, bu fazla negatif kuyruktan önce yükselen herhangi bir sonucun pozitif olacağından emin olmanıza yardımcı olur.Bu noktada, negatif kontrolden önce gelen her şeyi pozitif olarak değerlendirir ve deneyime devam ederdim. PCR döngüleri tamamlandıktan sonra, cihaz bir erime eğrisi analizi gerçekleştirir. Bu, ürününüzün bileşimini ve saflığını belirlemenize yardımcı olacaktır.Böylece, pozitif ve negatif örnekleri doğru seçip seçmediğinizi anlayabilirsiniz. Örneğin, pozitif örnek, amplifiye edilmiş spesifik bir PCR ürününe karşılık gelen, belirgin ve keskin bir erime sıcaklığı pikine sahip olacaktır. Herhangi bir negatif örnek ise, PCR sırasında amplifiye olmuş spesifik olmayan DNA'ya karşılık gelen, spesifik olmayan ve geniş bir erime sıcaklığı pikine sahip olacaktır.Böylece Sigma'nın Cyber Green ekstraksiyon amplifikasyon kitini yetişkin fare kuyruklarını hızlıca genotiplemek için nasıl kullandığımızı göstermiş oldum. Ancak bu kit çeşitli hayvan dokuları, saç, tükürük ile birlikte kullanılabilir; ben bunu fare embriyonik kuyruklarını genotiplemek için kullanıyorum. Bu kiti, hızlı olduğu için tercih ediyoruz.Genotipimi bir saat içinde geri alabiliyorum, bu da oldukça kolay ve basit. İzlediğiniz için teşekkürler ve başarılar dilerim.

rapid-genotyping-mouse-tissue-using-sigma-s-extract-n-amp-tissue-pcr

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz fare embriyonik doku doku-spesifik gen ekspresyonu başlangıcı sırasında veya sonrasında doku spesifik genlerin faktör etkileşimleri belirlemek için yöntem bir kromatin immunoprecipitation (ChIP) göstermektedir. Bu protokol, normal embriyonik gelişim sırasında ortaya çıkan doku-spesifik gen aktivasyon çalışması için yaygın olarak uygulanabilir olmalıdır.

Erken evre Fare Embriyolar kullanarak Doku özel Genler Kromatin Immunoprecipitation Testi

Tek hücreli ifade profil, tek tek hücrelerin ayrıntılı gen ekspresyon analizi sağlar. Biz kardiyomiyositlerde izolasyonu için yöntemler tanımlamak ve belirli hedeflere bütün transcriptome mikroarray veya qPCR için lizatları hazırlanıyor.

Yetişkin Fare kardiyomiyositlerde Tek Hücre transkripsiyonel Profilleme

Burada sunulan Direkt PCR yaklaşım doğrudan arıtılmadan bitki ve hayvan dokusu küçük miktarlarda PCR kolaylaştırır.

Önce DNA Saflaştırma olmadan Bitki ve Hayvan Örnekleri genotiplendirmesi

Biz etiketleme ve yenidoğan farelerin genotiplenmesi ve onlardan birincil nöronal kültürlerin üreten prosedürleri açıklar. genotyping, hızlı, verimli ve güvenilir, ve otomatik nükleik asit ekstraksiyon için izin verir. Bu neonatally öldürücü fareler ve genotipleme önce tamamlanmasını gerektirmektedir kültürleri için özellikle yararlıdır.

Hayvanlar Rapid Genotipleme Beyin Nöronlar İlköğretim Kültürler kurulması izledi

Bu iletişim kuralı kritik adımlar ve yama-kelepçe sonra tek hücre multiplex Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirmek için gereken önlemleri açıklar. Bu teknik ifade profil genler tarafından yama-kelepçe kayıtları ile karakterize bir tek hücreden önceden belirlenmiş bir dizi analiz etmek için basit ve etkili bir yöntemdir.

Tek hücre Multiplex Ters transkripsiyon polimeraz zincir tepkimesi sonra yama-kelepçe

Burada, testis 'teki RBP adaylarının büyük RNA hedeflerini belirlemek için bir eCLIP Protokolü sunuyoruz.

Gelişmiş Crosslinking Immünoprecipitation (eCLIP) fare testis protein bağlı RNA verimli tanımlaması için yöntem

Burada fare embriyonik dokularında gen ekspresyonunu profillemek için çok katlı tek hücreli mRNA dizileme yöntemi ni sunduk. Damlacık tabanlı tek hücreli mRNA dizileme (scRNA-Seq) yöntem çoklama stratejileri ile birlikte aynı anda birden fazla örnekten tek hücre profili olabilir, hangi önemli ölçüde reaktif maliyetlerini azaltır ve deneysel toplu etkileri en aza indirir.

Fare Embriyonik Hücrelerinin Çok katlı Tek Hücreli mRNA Sıralama Analizi

Burada, tek hücreli embriyoların kriyopreservation için değiştirilmiş bir yöntem yanı sıra genetik olarak değiştirilmiş farelerin verimli nesil için dondurulmuş çözülmüş embriyolar ve elektroporasyon kullanarak çiftler bir protokol sıyoruz.

Genetiği Değiştirilmiş Farelerin Yüksek Verimli Üretimi için Dondurulmuş Çözülmüş Embriyoların Kullanımı

Mevcut protokol, Gja1'de tam uzunlukta Connexin43 jenerasyonunu koruyan, ancak daha küçük GJA1-20k dahili olarak çevrilmiş izoformun translasyonunu önleyen tek bir M213L mutasyonunu tanımlamaktadır.

Tam Boy Proteinin İfadesini Korurken mRNA'dan Bir İç Translasyonel Başlangıç Bölgesinin Çıkarılması

Oviductal Nükleik Asitler Yoluyla Geliştirilmiş Genom Düzenleme  (I-GONAD) yönteminin etkinliği, donör dişilerden zigot toplanmasını ve yalancı hamile kadınlara aktarılmasını gerektiren geleneksel mikroenjeksiyon ile karşılaştırılabilir. Bu protokol, CRISPR/Cas9 ile indüklenen mutasyonları kromozom 6'daki ROSA26 lokusuna sokarak etkinliğini gösterir.

Nakavt Fare Üretimi için Oviduktal Nükleik Asitler Teslimatına Dayalı In Vivo Elektroporasyon Tekniği ile Geliştirilmiş Genom Düzenleme

Öğrenin, Sigma SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR kiti kullanarak fare kuyruk örneklerinde hızlı genotipleme yöntemini. Bu protokol yaklaşık bir buçuk saatte tam genotipleme sağlar ve transgenik fare çalışmalarında güvenilir sonuçlar sunar.

Sigma'nın Özü-N-Amp Doku PCR Kit kullanarak Fare Doku hızlı Genotiplendirme

Daha fazla video keşfet