Name: Memeli Hücrelerinden Ubikitinlenmiş p53 Proteinlerinin Saflaştırılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Öğrenin, memeli hücrelerinden ubikitinlenmiş p53 proteinlerinin saflaştırılması yöntemini. Bu protokol, protein fonksiyon düzenlemesinde ubikitinasyonun rolünü incelemek için güvenilir bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (81972624) D.L.'ye verilen bir hibe ile desteklenmiştir.

NOT: H1299 hücreleri, Çin Bilimler Akademisi Kök Hücre Bankası tarafından nazikçe sağlanmıştır ve mikoplazma kontaminasyonu için negatif olduğu kanıtlanmıştır.
1. Hücre kültürü
<ol><li>İlk kültür için, insan akciğer adenokarsinom hücre hattının 1 x 106 hücresini, H1299'u% 10 fetal sığır serumu (FBS),% 10 glutamin katkı maddesi,% 1 sodyum piruvat ve antibiyotikler (100 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin) ile desteklenmiş 10-12 mL RPMI 1640 orta ile 10 cm'lik bir Petri kabına yerleştirin. Hücreleri% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de tutun. Hücreleri% 80 -% 90 akıcılığa ne zaman ulaştıklarına bağlı olarak her 2-3 günde bir bölün.</li>
	<li>Transfeksiyondan bir gün önce, transfeksiyon sırasında% 70-90'lık bir birleşme elde etmek için üç Petri kabı için6-9 x 10 6 hücre ve 10-12 mL ortam içeren tek bir 10 cm Petri kabında 2-3 x 106 hücre hazırlayın. NOT: HEK293T hücreleri, yüksek transfeksiyon verimliliği ve protein ekspresyon seviyesi nedeniyle ubikitinlenmiş proteinleri saflaştırmak için de kullanılabilir.</li>
</ol>2. Plazmid transfeksiyonu
<ol><li>Üç adet 15 mL'lik santrifüj tüpüne 1,5 mL azaltılmış serum ortamı ekleyin.</li>
	<li>Aşağıdaki gibi seyreltmeler yapmak için her tüpe transfeksiyona hazır plazmid DNA'sı ekleyin. Tüp 1: 1 μg Flag-p53 plazmid, 12 μg boş vektör; Tüp 2: 1 μg Flag-p53 plazmid, 3 μg His-HA-Ub (HH-Ub) plazmidi ve 9 μg boş vektör; Tüp 3: 1 μg Flag-p53 plazmid, 3 μg HH-Ub plazmid ve 9 μg Mdm2 plazmid. Transfeksiyon verimliliğini izlemek için her tüpe toplam 0,2 μg yeşil floresan protein (GFP) plazmidi ekleyin. NOT: Hücrelerde etkili hedef protein ekspresyonunu elde etmek için gereken en uygun plazmid miktarlarını belirlemek için bir pilot deney yapılmalıdır.</li>
	<li>Lipozomları seyreltmek için başka bir santrifüj tüpünde 4.5 mL azaltılmış serum ortamına 78 μL lipozom transfeksiyon reaktifi ekleyin. Tüpü hafifçe vurarak iyice karıştırın ve oda sıcaklığında (RT) 5 dakika bekletin.</li>
	<li>Seyreltilmiş DNA çözeltisinin 1.5 mL'sini içeren adım 2.2'den itibaren her tüpe 1.5 mL seyreltilmiş lipozom çözeltisi ekleyin. İyice karıştırın ve plazmidleri RT'de en az 20 dakika boyunca lipozomlarla çapraz bağlayın. Plazmid DNA'sı kullanın: her transfeksiyon için 1: 2 (μg: μL) lipozom oranı.</li>
	<li>Orijinal ortamı Petri kaplarından atın ve her bir kaba 9 mL azaltılmış serum ortamı ekleyin. Her bir kaba 3 mL lipozom-DNA karışımı ekleyin ve plakayı 3x ileri geri hafifçe sallayarak çözeltiyi karıştırın ve daha sonra karışımın plakada eşit dağılımı için 3x sola ve sağa doğru karıştırın.</li>
	<li>Hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde% 5 CO 2 ile 37 ° C'dekültürleyin. Ortamı 4-6 saat sonra değiştirin ve hücreleri 24-36 saat boyunca kültürlemeye devam edin.</li>
</ol>3. Hücre toplama
<ol><li>24-36 saat sonra, hücreleri MG132 ile 4-6 saat boyunca 10 μM'lik son konsantrasyonda tedavi edin. NOT: MG132, 26S proteazom kompleksinin proteolitik aktivitesini etkili bir şekilde bloke eden bir peptid aldehittir. Lisin-48 (K48) bağlantılı poliubikitin zincirleri ile ubikitinlenen proteinlerin miktarları, hücreler MG132 veya diğer proteazom inhibitörleri ile tedavi edildikten sonra arttırılabilir.</li>
	<li>Ortamı atın, hücreleri 2 kat yıkayın (hücreleri temizlememeye dikkat ederek) buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve hücreleri serolojik pipetlerle aspire edin.</li>
	<li>Kaba 1 mL PBS ekleyin, temiz bir kazıyıcı ile kazıyarak hücreleri çıkarın ve hücre süspansiyonunu mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Hücre peletlerini toplamak için 5 dakika boyunca 700 x g'de santrifüj yapın.</li>
</ol>4. Ubikitinlenmiş proteinlerin denatüre olmayan koşullar altında saflaştırılması
<ol><li>Kullanmadan önce proteaz inhibitörü kokteyli ile taze olarak takviye edilmiş Bayrak lizis tamponu (50 mM Tris-HCl (pH 7.9), 137 mM NaCl, 10 mM NaF, 1 mM etilen diamin tetraasetik asit (EDTA),% 1 Triton X-100,% 0.2 sarkosil ve% 10 gliserol hazırlayın.</li>
	<li>Her tüpteki hücrelere 800 μL buz gibi soğuk Bayrak lizis tamponu ekleyin, hücreleri bir vorteks osilatör veya pipet tabancası kullanarak karıştırın ve ardından karışımı 30 dakika boyunca 4 ° C'de bir rotatörde inkübe edin.</li>
	<li>Karışımı ultrasonikasyonun 5-10 kısa darbesine maruz bırakın. 20 kHZ sonikasyon frekansında ve% 80 genlikte, 1 s süren her nabız ile buz üzerinde ultrasonikasyon gerçekleştirin. Karışımı bir rotatörde 4 °C'de dakikada 40 devirde (rpm) 30 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Ultrasonize edilmiş örnekleri 8,000 x g'de 20-30 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj edin. Süpernatantı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>Aliquot 80 μL (1/10) hücre ekstraktı ve 20 μL 5x sodyum dodesil sülfat (SDS) yükleme tamponu ile karıştırılır. Numuneleri 98 ° C'de 5 dakika kaynatın, 2 dakika buz üzerinde soğutun ve kullanana kadar -20 ° C'de saklayın. Bu örnekleri, protein ekspresyonunu izlemek için giriş grubu olarak kullanın.</li>
	<li>Kalan hücre ekstraktlarına 30 μL anti-Bayrak M2 antikor konjuge (Bayrak / M2) boncuk ekleyin ve en az 4 saat veya gece boyunca 4 ° C'de bir rotatör üzerinde inkübe edin.</li>
	<li>Boncukları toplamak için 1.500 x g'de 4 ° C'de 2 dakika boyunca santrifüj. Boncuklara 1 mL buz gibi soğuk Bayrak lizis tamponu ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın.</li>
	<li>Boncukları toplamak için 1.500 x g'de 4 ° C'de 2 dakika boyunca santrifüj. Adım 4.7'yi 4-6 kez tekrarlayın.</li>
	<li>Boncuklara 200 ng / μL'lik son konsantrasyonda 40 μL Bayrak peptitleri ekleyin ve bağlı proteinleri etkisiz hale getirmek için 2 saat boyunca 4 ° C'de bir rotatör üzerinde inkübe edin.</li>
	<li>4 °C'de 5 dakika boyunca 1.500 x g'de santrifüj. Süpernatantı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>10 μL 5x SDS yükleme tamponu ekleyin, karışımı 5 dakika boyunca 98 ° C'de kaynatın, 2 dakika boyunca buz üzerinde soğutun ve Batı lekelenmesi için -20 ° C'de saklayın. Alternatif olarak, diğer aşağı akış deneyleri için 4.10 adımındaki elüatı doğrudan -80 ° C'de saklayın. NOT: Saflaştırılmış ubikitinlenmiş proteinlerin miktarı, hücre sayısını ve transfekte edilen plazmid miktarlarını artırarak ölçeklendirilebilir. Bir epitop etiketleme stratejisi, doğal saflaştırma koşulları altında özellikle ubikitinlenmiş p53'e bağlanan hücresel kompleksleri saflaştırmak için uyarlanabilir. Flag-p53, mdm2 ve HA-ubiquitin'i birlikte eksprese ederek, ubikitinlenmiş p53 protein kompleksi, memeli hücrelerinden sıralı Flag ve HA antikoru konjuge agaroz tarafından immünopreçökeltilebilir. Her yerde bulunan p53 proteinlerinin bağlanma ortaklarını tutmak için, saflaştırma işlemi sırasında daha az sıkı BC100 lizis tamponu (20 mM Tris-HCl (pH 7.9), 100 mM NaCl,% 10 gliserol, 0.2 mM EDTA,% 0.2 Triton X-100 ve 1x proteaz inhibitörü) kullanılmalıdır. HA peptidinden elde edilen elüat, özellikle ubikitinlenmiş p53'e bağlanan tüm ortakları tanımlamak için kütle spektrometrisine tabi tutulur.</li>
</ol>5. Her yerde bulunan proteinlerin denatüre koşullar altında saflaştırılması
<ol><li>Adım 3.3'te elde edilen hücre peletlerine 1 mL buz gibi soğuk PBS ekleyin ve eşit şekilde karıştırın. Aliquot 100 μL (1/10 hacim) hücre süspansiyonu, giriş numunesi olarak bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirilir.</li>
	<li>Hücre peletlerini toplamak için 4 °C'de 5 dakika boyunca 700 x g'de santrifüj yapın. Giriş numunesine 80 μL Bayrak lizis tamponu ekleyin, hücreleri bir vorteks osilatör veya pipet tabancası kullanarak karıştırın ve hücreleri 1 saat boyunca buz üzerinde lize edin.</li>
	<li>4 °C'de 20-30 dakika boyunca 8.000 x g'de santrifüj. Aliquot 80 μL süpernatantın yeni bir mikrosantrifüj tüpüne dönüştürülmesi.</li>
	<li>Süper natanta 20 μL 5x SDS yükleme tamponu ekleyin, 5-10 dakika boyunca 98 ° C'de kaynatın, 2 dakika buz üzerinde soğutun ve kullanıma kadar -20 ° C'de saklayın.</li>
	<li>Hücre peletini toplamak için hücre süspansiyonunun kalan 900 μL'sini 700 x g'de 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin. Hücre peletlerine 1 mL ubikitin tamponu 1 (UB tamponu 1; 6 M guanidin-HCI, 0.1 M Na 2 HPO 4, 6.8 mM NaH 2 PO4, 10 mM Tris-HCI (pH 8.0) ve%0.2Triton X-100, taze olarak 10 mM β-merkaptoetanol ve 5 mM imidazol ile desteklenmiş) ekleyin ve hücreleri eşit olarak dağıtmak için yukarı ve aşağı pipetleyerek birkaç kez karıştırın. NOT: İmidazol konsantrasyonu, nikel yüklü reçine üzerindeki spesifik olmayan protein bağlanmasını azaltmak için 5 mM ila 20 mM arasında değişebilir. Ubikitin tamponu, hem ligazları hem de DUB'leri inaktive eden guanidin hidroklorür içerir. β-merkaptoetanol, çürük yumurtalara benzer güçlü, hoş olmayan bir kokuya sahip berrak, renksiz bir sıvıdır. Yüksek konsantrasyonlu bir çözelti mukoza zarında, üst solunum yollarında, cilde ve gözlerde ciddi hasara neden olur. Eldiven ve gözlük takın ve duman başlığında çalışın.</li>
	<li>Hücre, çözelti artık viskoz olmayana kadar ultrasonikasyonun 10-20 turuna lizatlar. 20 kHZ sonikasyon frekansında ve% 80 genlikte, 1 s süren her nabız ile buz üzerinde ultrasonikasyon gerçekleştirin. RT'de 20-30 dakika boyunca 8.000 x g'de santrifüj yapın ve süpernatantı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>Süpernatanta 30 μL nikel yüklü reçine ekleyin ve 4 saat boyunca 15 rpm'de ayarlanmış bir rotatörde veya RT'de bir gecede inkübe edin.</li>
	<li>1 mL UB tampon 1 ekleyin, RT'de 10 dakika boyunca bir çalkalayıcıda rotasyonla inkübe edin ve boncukları toplamak için RT'de 2 dakika boyunca 1.500 x g'de santrifüj yapın.</li>
	<li>Boncuklara 1 mL ubikitin tamponu 2 (UB tamponu 2; 8 M üre, 0.1 M Na 2 HPO 4, 6.8 mM NaH 2 PO4, 10 mM Tris-HCI (pH 8.0) ve% 0.2 Triton X-100) ekleyin, RT'de 10 dakika boyunca bir çalkalayıcıda rotasyonla inkübe edin ve boncukları toplamak için 2dakika boyunca 1.500 x g'de santrifüj yapın. Bunu bir kez daha tekrarlayın.</li>
	<li>Boncuklara 1 mL PBS ekleyin, RT'de 10 dakika boyunca bir çalkalayıcıda rotasyonla inkübe edin ve boncukları toplamak için RT'de 2 dakika boyunca 1.500 x g'de santrifüj yapın. Bunu bir kez daha tekrarlayın.</li>
	<li>Boncukları RT'de 1 saat boyunca 0.5 M'lik son konsantrasyonda 40 μL imidazol ile inkübe ederek bağlı proteinler.</li>
	<li>Süpernatantı temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın, 10 μL 5x SDS yükleme tamponu ekleyin, 5 dakika boyunca 98 ° C'de kaynatın, 2 dakika boyunca buz üzerinde soğutun ve Batı lekelenmesi için -20 ° C'de saklayın. Alternatif olarak, işlenmemiş elüatı diğer aşağı akış deneyleri için -80 ° C'de saklayın.</li>
</ol>6. Batı lekelenmesi ile saflaştırılmış ubikitinlenmiş proteinlerin tespiti
<ol><li>4.11 ve 5.12. basamaklardaki numuneleri sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile çözün ve daha sonra tarif edildiği gibi karşılık gelen antikorları kullanarak hedef proteinleri tespit etmek için Western blotting ile bir nitroselüloz membrana aktarın18.</li>
	<li>Kısacası, TBST tamponunda (15 mM Tris-HCI; pH = 7.6, 4.6 mM Tris-baz, 150 mM NaCI, kullanımdan önce% 0.1 Tween-20 ile taze olarak desteklenmiş) %5 defat süt tozu içeren 20 mL bloke edici çözeltiye 1 saat daldırarak membranı inkübe edin. Daha sonra, membranı RT'de birincil antikorlarla 2 saat veya 4 ° C'de bir gecede inkübe edin. Her set için aşağıdaki antikorları kullanın. Tüm primer antikorlar 1:1000 seyreltmede kullanıldı.<ol><li>Flag/M2 agaroz boncukları ile immünopresipitasyondan sonra bir anti-p53 monoklonal antikor ile ubikitinlenmiş p53 dahil olmak üzere toplam p53 proteinini tespit edin.</li>
		<li>Flag/M2 agaroz boncukları ile immünopresipitasyondan sonra anti-HA antikoru veya anti-ubikitin antikoru ile ubikitinlenmiş p53 proteinlerini tespit edin.</li>
		<li>Nikel yüklü reçine pulldown'dan sonra bir anti-p53 monoklonal antikoru ile ubikitinlenmiş p53 proteinlerini tespit edin.</li>
		<li>Nikel yüklü reçine pulldown'dan sonra bir anti-HA antikoru veya anti-ubikitin antikoru ile toplam ubikitinlenmiş proteini tespit edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Her biri 5 dakika boyunca TBST tamponu ile 3x yıkadıktan sonra membranı RT'de yaban turpu peroksidaz (HRP) konjuge sekonjuge sekonder antikorlarla 1 saat boyunca inkübe edin. Tüm sekonder antikorlar 1:3000 seyreltmede kullanıldı. Ardından, membranı TBST tamponu 3x ile her biri 5 dakika boyunca nazik bir ajitasyonla yıkayın.</li>
	<li>Batı lekelenmesinden gelen sinyalleri tespit etmek için kemilüminesans görüntüleme sistemini başlatın. A ve B çözeltilerini 1:1 oranında karıştırarak HRP için substrat çözeltisini hazırlayın.</li>
	<li>Nitroselüloz membranı kamera obscura'ya yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve bir pipetleme tabancası kullanarak substrat çözeltisini membran üzerine eşit şekilde kaplayın. Kemilüminesan sinyalleri yakalamak için otomatik pozlama prosedürünü seçin ve ideal bir sinyal elde edilene kadar pozlama süresini manuel olarak ayarlayın.</li>
</ol>

<ol><li>Kwon, Y. T., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+code+in+the+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).</li>
<li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).</li>
<li>Zheng, N., Shabek, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+ligases%3A+Structure%2C+function%2C+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin ligases: Structure, function, and regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).</li>
<li>Dikic, I., Wakatsuki, S., Walters, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-binding+domains+-+from+structures+to+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-binding domains - from structures to functions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (10), 659-671 (2009).</li>
<li>Oh, E., Akopian, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+ubiquitin-dependent+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Principles of ubiquitin-dependent signaling.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 137-162 (2018).</li>
<li>Clague, M. J., Urbe, S., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+chains%3A+deubiquitylating+enzyme+specificity+begets+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 338-352 (2019).</li>
<li>Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deubiquitylating+enzymes+and+drug+discovery%3A+emerging+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (1), 57-78 (2018).</li>
<li>Vogelstein, B., Lane, D., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfing+the+p53+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Surfing the p53 network.</a> Nature. 408 (6810), 307-310 (2000).</li>
<li>Boutelle, A. M., Attardi, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+and+Tumor+suppression%3A+It+takes+a+network%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+In+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">p53 and Tumor suppression: It takes a network.</a> Trends In Cell Biology. 31 (4), 298-310 (2021).</li>
<li>Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53%3A+800+million+years+of+evolution+and+40+years+of+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery.</a> Nature Reviews Cancer. 20 (8), 471-480 (2020).</li>
<li>Vousden, K. H., Prives, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blinded+by+the+light%3A+The+growing+complexity+of+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Blinded by the light: The growing complexity of p53.</a> Cell. 137 (3), 413-431 (2009).</li>
<li>Brooks, C. L., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+ubiquitination%3A+Mdm2+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond.</a> Molecular Cell. 21 (3), 307-315 (2006).</li>
<li>Liu, Y., Tavana, O., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+modifications%3A+exquisite+decorations+of+the+powerful+guardian%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">p53 modifications: exquisite decorations of the powerful guardian.</a> Journal Of Molecular Cell Biology. 11 (7), 564-577 (2019).</li>
<li>Dobbelstein, M., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdm2%3A+Open+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Mdm2: Open questions.</a> Cancer Science. 111 (7), 2203-2211 (2020).</li>
<li>Kulikov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdm2+facilitates+the+association+of+p53+with+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mdm2 facilitates the association of p53 with the proteasome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10038-10043 (2010).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mono-+versus+polyubiquitination%3A+differential+control+of+p53+fate+by+Mdm2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2.</a> Science. 302 (5652), 1972-1975 (2003).</li>
<li>Tomlinson, E., Palaniyappan, N., Tooth, D., Layfield, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+purification+of+ubiquitinated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Methods for the purification of ubiquitinated proteins.</a> Proteomics. 7 (7), 1016-1022 (2007).</li>
<li>Green, M., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+M+%22Molecular+Cloning+A+Laboratory+Manual.+%28Fourth+Edition%29%22">Molecular Cloning A Laboratory Manual. (Fourth Edition)</a>. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA. 28(2012).</li>
</ol>

Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Ubikitinasyon hemen hemen tüm fizyolojik ve patolojik hücresel süreçlerde kritik bir rol oynar2. Son yıllarda, ubikitinin sinyal yolaklarındaki moleküler rolünü ve ubikitin sistemindeki değişikliklerin farklı insan hastalıklarına nasıl yol açtığını anlamada büyük ilerleme kaydedilmiştir2. Ubikitinlenmiş proteinlerin saflaştırılması, bu süreçlerde ubikitinasyonun kesin rolleri hakkında fikir vermeye katkıda bulunur. Ubikitin konjuge proteinlerin karışımları, denatüre olmayan...

Ubikitin, 76 amino asit 1,2,3'ün evrimsel olarak korunmuş bir proteinidir. Ubikitin, hedef proteinler üzerindeki lizin kalıntılarını, aktive edici (E1), konjuge edici (E2) ve ligaz (E3) enzimlerini içeren kaskadlar yoluyla kovalent olarak bağlar. Ubikitin ilk önce E1 enzimi tarafından aktive edilir ve daha sonra E2 konjuge edici enzimlere aktarılır. Daha sonra, E3 ubikitin ligazları hem ubikitin yüklü E2 enzimleri hem de substrat proteinleri ile etkileşime girer ve ubikitinin C-terminali ile substrat 1,2,3,4,5'teki bir lizin kalıntısı arasında bir izopeptit bağının oluşumuna aracılık eder. Ubikitinasyon, ubikitin moieties substrat proteinleri üzerindeki lizin kalıntılarına veya kendisine bağlanmasını içerir ve bu da protein monoubikitinasyonuna veya poliubikitinasyona yol açar. Bu ubikitinasyon süreci ökaryotlarda hücre içi olarak gerçekleşir ve çok çeşitli biyolojik süreçleri düzenler. Ubikitinasyon, substrat proteinlerinin ubikitin-proteazom sistemi 1,2,3,4,5 yoluyla parçalanmasıyla sonuçlanır. Ek olarak, ubikitinasyon protein hücre altı lokalizasyonunu, protein kompleks oluşumunu ve hücrelerdeki protein kaçakçılığını modüle eder 3,5. Substrat proteinlerine bağlı ubikitin moieties deubikitinating enzimler (DUB'ler) tarafından uzaklaştırılabilir6,7. Özellikle, ubikitin zincirlerinin bir araya getirildiği farklı yollar, çeşitli biyolojik süreçleri düzenlemek için sayısız araç sağlar 1,5. Substrat protein fonksiyonunun düzenlenmesinde ubikitinasyonun kesin rolü şimdiye kadar tam olarak anlaşılamamıştır. Ubikitinlenmiş proteinlerin saflaştırılması, protein ubikitinasyonunun çeşitli hücresel süreçler üzerindeki etkilerinin aydınlatılmasına katkıda bulunur.
P53 proteini en önemli tümör baskılayıcı proteinlerden biridir ve hemen hemen tüm insan kanserlerinde genetik mutasyonlar veya inaktivasyon sergiler 8,9,10,11. p53 stabilitesi ve aktivitesi, ubikitinasyon, fosforilasyon, asetilasyon ve metilasyon12,13 dahil olmak üzere posttranslasyonel modifikasyonlarla in vivo olarak hassas bir şekilde düzenlenir. P53 proteini, çeşitli hücrelerde 6 dakika ila 40 dakika arasında değişen kısa bir yarı ömre sahiptir, bu da esas olarak poliubikitinasyonu ve ardından proteazomal bozunması 10,12'den kaynaklanır. Fare çift dakika 2 (Mdm2), transkripsiyonel aktivitesini inhibe etmek için p53'ün N-terminusuna bağlanan bir E3 ubikitin ligazıdır12,14,15. Mdm2, stabilitesini kontrol etmek için p53'ün poliubikitinasyonunu ve proteazomal bozunmasını teşvik eder ve nükleer ihracatını kolaylaştırmak için p53'ün monoubikitinasyonunu indükler12,14,15,16. Burada, Mdm2 aracılı p53 ubikitinasyonu, memeli hücrelerinden ubikitinlenmiş proteinlerin saflaştırılması için ayrıntılı olarak bir yöntem tanıtmak için örnek olarak kullanılmıştır. Hedef proteinlerin ubikitinasyon durumunu etkileyen düzenleyiciler, memeli hücrelerinde aşırı eksprese edildiklerinde veya yıkıldıklarında / nakavt edildiklerinde bu in vivo ubikitinasyon testi kullanılarak tanımlanabilir. Ek olarak, ubikitinlenmiş proteinler in vitro deubikitinasyon testi için substrat olarak kullanılabilir. Her yerde bulunan substratları bireysel DUB'lerle inkübe ederek hedef proteinler için spesifik DUB'leri tanımlamak için yüksek verimli bir tarama yapılabilir. Ubikitinlenmiş proteinler, hücrelerde aşağı akış sinyal proteinlerini işe almak için bir iskele görevi görebilir. Her yerde bulunan bir hedef protein kompleksi, doğal saflaştırma koşulları altında sıralı immünopresipitasyon ile saflaştırılabilir ve kütle spektrometrisi ile tanımlanabilir. Mevcut protokol, ubikitinasyon tarafından düzenlenen hücresel proteinleri araştırmak için yaygın olarak kullanılabilir.
Ubikitinlenmiş proteinleri saflaştırmak için, afinite etiketli ubikitin, ubikitin antikorları, ubikitin bağlayıcı proteinler ve izole ubikitin bağlayıcı alanların (UBD'ler) kullanımını içeren çeşitli yöntemler oluşturulmuştur17. Burada, memeli hücrelerinde ubikitinlenmiş proteinleri saflaştırmak için bir aracı olarak afinite etiketli ubikitini kullanan bir protokol sunuyoruz. Poli-His-etiketli ubikitin kullanımı diğer yöntemlere göre avantajlar sunar. Ubikitinlenmiş proteinler, hücresel proteinleri doğrusallaştırarak ve protein-protein etkileşimlerini bozarak nikel yüklü reçineye spesifik olmayan bağlanmayı azaltan güçlü denatürantların varlığında saflaştırılır. Buna karşılık, ubikitin antikorlarının, ubikitin bağlayıcı proteinlerin ve izole UBD'lerin aracılar olarak kullanılması, bağlanma ortaklarını hedef proteinden etkili bir şekilde dışlayamaz, çünkü saflaştırmanın daha az katı koşullar altında yapılması gerekir. Dahası, saflaştırma, bu aracıları kullanarak ilgisiz proteinlerin bağlanmasının artmasına da yol açabilir. Ek olarak, çeşitli ubikitin bağlantı tiplerinin yanı sıra ubikitin bağlayıcı proteinler veya izole UBD'ler tarafından mono- ve poli-ubikitinasyon için bağlanma eğilimi vardır17. Poli-His-etiketli ubikitin kullanımı, tüm hücresel ubikitinlenmiş proteinlerin aşağı çekilmesine katkıda bulunur. Alternatif olarak, ticari olarak temin edilebilen anti-Flag veya anti-HA antikor konjuge agarozun kullanılması, büyük ölçekli Bayrak veya HA etiketli hedef proteinlerin denatüre olmayan koşullar altında immünopreçökeltiyi kolaylaştırır. Örneğin, poli-His-etiketli ubikitini hedefleyen nikel yüklü reçine ile ikinci bir saflaştırma adımı, aşağı akış deneyleri için yüksek saflıkta ubikitinlenmiş hedef proteinleri elde etmek için kullanılabilir. Özellikle, bir epitop etiketleme saflaştırma stratejisi, hedef proteinleri etkili bir şekilde immünopreçökite etmek için spesifik bir antikor elde edilemediğinde uyarlanabilir. Son olarak, memeli hücrelerinde ubikitinlenmiş proteinlerin saflaştırılması, in vitro saflaştırma ile karşılaştırıldığında, hedef proteinlerin ubikitin bağlantı modunu daha fizyolojik koşullar altında korur.

<table><tbody><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Sangon Biotech</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Amersham ECL Fare IgG, HRP'ye bağlı bütün Ab (koyundan)</td><td>GE healthcare</td><td>NA931</td><td>İkincil antibdoy</td></tr><tr><td>Amersham ECL Sıçan IgG, HRP'ye bağlı bütün Ab (eşekten elde edilen)</td><td>GE healthcare</td><td>NA935</td><td>İkincil antibdoy</td></tr><tr><td>Anti-Flag M2 Afinite Jeli</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td>BAYRAK/M2 boncuklar</td></tr><tr><td>Anti-GFP monokolonal antikor</td><td>Santa cruz</td><td>sc-9996</td><td>Birincil antikor</td></tr><tr><td>Anti-HA Yüksek Afiniteli</td><td>Roche</td><td>11867423001</td><td>Birincil antikor</td></tr><tr><td>Anti-Mdm2 monokolonal antikor (SMP14)</td><td>Santa cruz</td><td>sc-965</td><td>Birincil antikor</td></tr><tr><td>Anti-p53 monokolonal antikor (DO-1)</td><td>Santa cruz</td><td>sc-126</td><td>Birincil antikor</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Alddich</td><td>E5134</td><td>çözücü</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>VivaCell</td><td>C04001-500</td><td>FBS</td></tr><tr><td>BAYRAK Peptit</td><td>Sigma-Alddich</td><td>F3290</td><td>Elüsyon tamponu hazırlayın</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>takviyesi</td></tr><tr><td>Guanidin-HCI</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100287-0500</td><td>çözücü</td></tr><tr><td>H1299</td><td>Kök Hücre Bankası, Çin Akademisi Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Lab</td><td>Bio-rad</td><td></td><td>yazılımı</td></tr><tr><td>Immidazole</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500529-0100</td><td>çözücü</td></tr><tr><td>Immobilon Western Kemilüminesan HRP Substrat</td><td>Millipore</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin 2000 reaktifleri</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>Transfeksiyon reaktifi</td></tr><tr><td>MG132</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-13259</td><td>Proteazom inhibitörü</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501727-0500</td><td>çözücü</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610476-0005</td><td>çözücü</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma-Alddich</td><td>201154</td><td>çözücü</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501726-0500</td><td>çözücü</td></tr><tr><td>Ni-NTA Agaroz</td><td>QIAGEN</td><td>30230</td><td>nikel yüklü reçine</td></tr><tr><td>Nitroselüloz Kurutma membranı</td><td>GE healthcare</td><td>10600002</td><td>0.45 & m gözenek boyutu</td></tr><tr><td>Opti-MEM azaltılmış serum ortamı</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>Transfeksiyon ortamı</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-cv</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin Çözeltisi</td><td>Sangon Biotech</td><td>E607011-0100</td><td>antibiyotik</td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü kokteyli</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Biyolojik Endüstriler</td><td>01-100-1ACS</td><td>orta</td></tr><tr><td>Sarkosyl</td><td>Sigma-Alddich</td><td>L5777</td><td>çözücü</td></tr><tr><td>SDS Yükleme Tamponu</td><td>Beyotime</td><td>P0015L</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Piruvat</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>takviyesi</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501492-0005</td><td>çözücü</td></tr><tr><td>Tris-HCI</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610103-0250</td><td>çözücü</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sangon Biotech</td><td>A110694-0500</td><td>reaktif</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100777-0500</td><td>takviyesi</td></tr><tr><td>Ultra Yüksek Hassasiyetli Kemilüminesans Görüntüleme Sistemi</td><td>Bio-rad</td><td></td><td>ChemiDoc XRS +</td></tr> <tr><td>Üre</td><td>Sangon Biotech</td><td>A510907-0500</td><td>çözücü</td></tr></tbody></table>

memeli hücrelerinden ubikitinlenmiş p53 proteinlerinin saflaştırılması

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Ubikitinasyon, bir substrat proteininin sadece stabilitesini değil, aynı zamanda lokalizasyonunu ve işlevini de düzenleyen bir tür posttranslasyonel modifikasyondur. Ubikitinasyon süreci ökaryotlarda hücre içi olarak gerçekleşir ve neredeyse tüm temel hücresel biyolojik süreçleri düzenler. Ubikitinlenmiş proteinlerin saflaştırılması, substrat proteinlerinin işlevini kontrol etmede ubikitinasyonun rolünün araştırılmasına yardımcı olur. Burada, memeli hücrelerinde ubikitinlenmiş proteinleri saflaştırmak için adım adım bir prosedür, örnek olarak p53 tümör baskılayıcı protein ile tanımlanmıştır. Ubikitinlenmiş p53 proteinleri, sıkı denatüre olmayan ve denatüre edici koşullar altında saflaştırıldı. Total hücresel Bayrak etiketli p53 proteini, denatüre olmayan koşullar altında anti-Flag antikor konjuge agaroz ile saflaştırıldı. Alternatif olarak, toplam hücresel His etiketli ubikitinlenmiş protein, denatüre edici koşullar altında nikel yüklü reçine kullanılarak saflaştırıldı. Elatlardaki ubikitinlenmiş p53 proteinleri, spesifik antikorlarla başarılı bir şekilde tespit edildi. Bu prosedürü kullanarak, belirli bir proteinin ubikitinlenmiş formları, memeli hücrelerinden verimli bir şekilde saflaştırılabilir ve bu da protein fonksiyonunun düzenlenmesinde ubikitinasyonun rolleri üzerine çalışmaları kolaylaştırır.

Şematik diyagram Bayrak etiketli p53 (Bayrak-p53) ve Onun / HA çift etiketli ubikitin (HH-Ub) proteinlerini göstermektedir (Şekil 1A). Ubikitinlenmiş proteinleri saflaştırmak için kullanılan prosedürler Şekil 1B'de özetlenmiştir. Poli-His-etiketli ubikitin, memeli hücrelerindeki hedef proteinlere bağlanabilir. Ubikitinlenmiş proteinler, denatüre olmayan koşullar altında Flag/M2 boncukları ile veya denatüre koşullar altında immobilize metal iyonu afinite kromatog...

Protokol, örnek olarak p53 tümör baskılayıcı proteini kullanarak memeli hücrelerinden ubikitinlenmiş proteinleri saflaştırmak için adım adım bir yöntemi açıklar. Ubikitinlenmiş p53 proteinleri, sıkı denatüre olmayan ve denatüre edici koşullar altında hücrelerden saflaştırıldı.

Memeli Hücrelerinden Ubikitinlenmiş p53 Proteinlerinin Saflaştırılması

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

Bu protokolü kullanarak, belirli bir proteinin ubikitinlenmiş formları, memeli hücrelerinden verimli bir şekilde saflaştırılabilir ve bu da protein fonksiyonunun düzenlenmesinde ubikitinasyonun rolleri üzerine çalışmaları kolaylaştırır. Memeli hücrelerinde ubikitinlenmiş proteinlerin in vitro saflaştırılmasına kıyasla saflaştırılması, hedef proteinlerin ubikitin bağlantı modunu daha radyolojik koşullar altında tutar. Üç adet 15 mililitrelik santrifüj tüpüne 1,5 mililitre azaltılmış serum ortamı ekleyerek başlayın.Her tüpe transfeksiyona hazır plazmid DNA'sı ekleyin ve transfeksiyon verimliliğini izlemek için 0.2 mikrogram yeşil floresan protein plazmidi ekleyin. Lipozomları seyreltmek için başka bir santrifüj tüpünde 4.5 mililitre azaltılmış serum ortamına 78 mikrolitre lipozom transfeksiyon reaktifi ekleyin. Tüpü hafifçe vurarak iyice karıştırın ve ardından oda sıcaklığında beş dakika bekletin.Seyreltilmiş DNA çözeltisinin 1.5 mililitresini içeren her tüpe 1.5 mililitre seyreltilmiş lipozom çözeltisi ekleyin. İyice karıştırın ve plazmidleri oda sıcaklığında en az 20 dakika boyunca lipozomlarla çapraz bağlayın. Orijinal ortamı Petri kaplarından atın ve her bir kaba dokuz mililitre azaltılmış serum ortamı ekleyin.Üç mililitre lipozom DNA karışımı ekleyin ve karışımın plaka üzerinde eşit dağılımı için plakayı üç kez ileri geri hafifçe sallayarak ve daha sonra üç kez sola ve sağa sallayarak çözeltiyi karıştırın. Nemlendirilmiş inkübatördeki hücreleri% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede kültürleyin. Dört ila altı saat sonra ortamı değiştirin ve hücreleri 24 ila 36 saat boyunca kültürlemeye devam edin.24 ila 36 saat sonra, hücreleri MG132 ile dört ila altı saat boyunca 10 mikromolar nihai konsantrasyonda tedavi edin. Ortamı atın ve hücreleri buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkayın. Yemeğe bir mililitre PBS ekleyin.Hücreleri temiz bir kazıyıcı ile kazıyarak çıkarın ve hücre süspansiyonunu mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Hücre peletlerini toplamak için beş dakika boyunca 700 G'de santrifüj yapın. Her tüpteki hücrelere proteaz inhibitörü kokteyli ile desteklenmiş 800 mikrolitre buz gibi soğuk FLAG lizis tamponu ekleyin.Hücreleri bir vorteks osilatör veya pipet tabancası kullanarak karıştırın ve ardından karışımı 30 dakika boyunca dört santigrat derecede bir rotatörde inkübe edin. Karışımı buz üzerinde her nabız bir saniye sürerek ultrasonikleştirin ve karışımı beş ila 10 kısa darbeye maruz bırakın. Karışımı 40 RPM'de bir rotatörde dört santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edin.Daha sonra ultrasonize edilmiş örnekleri dört santigrat derecede 20 ila 30 dakika boyunca 8, 000 G'de santrifüj edin. Süpernatantı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Aliquot 80 mikrolitre hücre ekstresi ve 20 mikrolitre 5X SDS yükleme tamponu ile karıştırın.Örnekleri beş dakika boyunca 98 santigrat derecede kaynatın. İki dakika buz üzerinde soğutun ve kullanana kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın. Bu örnekleri, protein ekspresyonunu izlemek için giriş grubu olarak kullanın.Daha sonra, kalan hücre ekstraktlarına 30 mikrolitre anti-FLAG M2 antikoru konjuge boncuk ekleyin ve en az dört saat veya bir gecede dört santigrat derecede bir rotatörde inkübe edin. Boncukları toplamak için dört santigrat derecede iki dakika boyunca 1.500 G'de santrifüj yapın. Boncuklara bir mililitre buz gibi soğuk FLAG lizis tamponu ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın.Bu adımı dört ila altı kez tekrarlayın, ardından boncuklara mikrolitre başına 200 nanogramlık son konsantrasyonda 40 mikrolitre FLAG peptit ekleyin. Daha önce gösterildiği gibi iki saat boyunca bir rotatör üzerinde inkübe edin ve ardından aynı sıcaklıkta santrifüj yapın. Süpernatantı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 10 mikrolitre 5X SDS yükleme tamponu ekleyin.Karışımı beş dakika boyunca 98 santigrat derecede kaynatın ve ardından iki dakika boyunca buz üzerinde soğutun. Hücre peletlerine bir mililitre buz gibi soğuk PBS ekleyin ve eşit şekilde karıştırın. Aliquot 100 mikrolitre hücre süspansiyonu bir mikrosantrifüj tüpüne giriş numunesi olarak girer ve hücre peletlerini toplamak için dört santigrat derecede beş dakika boyunca 700 G'de santrifüj yapar.Giriş numunesine 80 mikrolitre FLAG lizis tamponu ekleyin ve daha önce gösterildiği gibi bir vorteks osilatör kullanarak hücreleri karıştırın. Hücreleri bir saat boyunca buz üzerinde lize edin ve ardından 20 ila 30 dakika boyunca tekrar santrifüj yapın. Santrifüzyondan sonra, süpernatantın 80 mikrolitresini yeni bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve süpernatana 20 mikrolitre 5X SDS yükleme tamponu ekleyin.Karışımı beş ila 10 dakika boyunca 98 santigrat derecede kaynatın ve ardından iki dakika boyunca buz üzerinde soğutun. Hücre peletini toplamak için hücre süspansiyonunun kalan 900 mikrolitresini 700 G'de dört santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüj edin. Hücre peletlerine bir mililitre ubikitin tamponu 1 ekleyin ve hücreleri eşit olarak dağıtmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.Hücre, çözelti artık viskoz olmayana kadar buz üzerinde ultrasonikasyonun 10 ila 20 turuna lizatlar yapın ve daha sonra çözeltiyi santrifüj edin. Süpernatantı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve süpernatana 30 mikrolitre nikel yüklü reçine ekleyin. 15 RPM'de bir rotatörde dört saat veya gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin ve ardından iki dakika boyunca santrifüj yapın.Santrifüzyondan sonra, boncukları toplayın ve bir mililitre ubikitin tamponu 1 ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca bir çalkalayıcıda rotasyonla inkübe edin ve daha sonra daha önce gösterildiği gibi iki dakika boyunca 1.500 G'de tekrar santrifüj yapın. Boncuklara bir mililitre ubikitin tamponu 2 ekleyin ve boncukları toplamak için daha önce gösterildiği gibi inkübasyon ve ardından santrifüjleme yapın.Bu adımı bir kez tekrarlayın. Ardından, boncuklara bir mililitre PBS ekleyin ve boncukları toplamak için inkübasyon ve santrifüjleme için aynı prosedürü izleyin. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın.Boncukları oda sıcaklığında bir saat boyunca 0.5 molar nihai konsantrasyonda 40 mikrolitre imidazol ile inkübe ederek bağlı proteinleri inkübe edin. Kuluçkadan sonra, iki dakika boyunca tekrar 1.500 G'de santrifüj yapın. Süpernatantı temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 10 mikrolitre 5X SDS yükleme tamponu ekleyin.Çözeltiyi beş dakika boyunca 98 santigrat derecede kaynatın ve ardından iki dakika boyunca buz üzerinde soğutun. Numuneleri SDS-PAGE ile çözün ve daha sonra karşılık gelen antikorları kullanarak hedef proteinleri tespit etmek için batı lekeleme yoluyla bir nitroselüloz membranına aktarın. Batı lekelenmesinden gelen sinyalleri tespit etmek için kemilüminesans görüntüleme sistemini başlatın.Nitroselüloz membranı kamera obscura'ya yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Bir pipet tabancası kullanarak substrat çözeltisini membran üzerinde eşit şekilde kodlayın. Son olarak, kemilüminesan sinyalleri yakalamak için otomatik pozlama prosedürünü seçin ve ideal bir sinyal elde edilene kadar pozlama süresini manuel olarak ayarlayın.Ubikitinlenmiş p53 de dahil olmak üzere toplam p53 proteini, denatüre olmayan koşullar altında H1299 hücrelerinden FLAG M2 boncukları ile immünoçökeltildi. Elüat, anti p53 ve anti hemaglutinin veya anti p53 ve monoklonal antikorlarla batı lekelenmesine maruz kaldı. Burada, ham hücre ekstraktları veya girdileri, anti p53 ve anti MDM2 monoklonal antikorları ile batı lekelenmesine tabi tutuldu.Düşük molekül ağırlığından yüksek molekül ağırlığına kadar bulaşmış bir bant olarak görünen ubikitinlenmiş p53 proteininden gelen sinyal, MDM2 bu hücrelerde ektopik olarak eksprese edildiğinde belirgin şekilde artmıştır. Bu sonuç, ubikitinlenmiş p53 proteininin hücrelerden etkili bir şekilde saflaştırıldığını göstermektedir. Daha sonra, hücreler denatüre edici koşullar altında lize edildi.Toplam hücresel ubikitinlenmiş proteinler nikel yüklü reçine ile aşağı çekildi ve daha sonra anti p53 ve anti hemaglutinin monoklonal antikorları ile batı lekelenmesine tabi tutuldu. Ubikitine p53 proteini, bir anti p53 antikoru ve bir anti hemaglutinin antikoru kullanılarak tespit edildi. Burada ham hücre ekstraktları veya girdileri, anti p53 ve anti MDM2 monoklonal antikorları ile batı lekelenmesine tabi tutuldu.Sonuçlar, toplam ubikitinlenmiş protein seviyesinin değişmediğini, ancak MDM2 bu hücrelerde aşırı eksprese edildikten sonra ubikitinlenmiş p53 protein seviyesinin çarpıcı bir şekilde arttığını göstermiştir. Bu, ubikitinlenmiş p53 içeren toplam ubikitin proteinlerinin, denatüre edici koşullar altında hücre lizatlarından etkili bir şekilde aşağı çekildiğini göstermektedir. Bu prosedürü denerken, hücre toplamadan önce hücreleri MG132 ile tedavi etmeyi ve ubikitinlenmiş proteinlerin saflaştırılması için hücreleri buz üzerinde düzgün bir şekilde ultrasonize etmeyi unutmayın.

purification-of-ubiquitinated-p53-proteins-from-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Ubikitinasyon üç enzimlerin kümesi tarafından yürütülen bir anahtar posttranslasyonel modifikasyonu. Bu değişiklik ilgili genler Mutasyonlar birçok farklı insan hastalıkları ile ilişkilidir. Burada, kültür hücrelerinde protein ubikuitinasyon tespit protokolleri...

Protein Ubikitinasyon Tespiti

Bu videoda, karmaşık bir peptit karışımından kalan di-glisin peptitleri içeren ubikitinile peptitlerin ekstrakte edilmesi ve saflaştırılması için bir yöntem açıklanmaktadır. Sunulan yöntem, proteindeki orijinal ubikitinasyon bölgelerinin belirlenmesine yardımcı olabilir.

Ubikitinillenmiş Peptitlerin İmmünoaffinite Temelli Ekstraksiyonu: Ubikitin Etiketli Peptitleri Saflaştırılmış Peptit Fraksiyonlarından Seçici Olarak Ekstrakte Etmek İçin Bir Teknik

Burada açıklanan nerede eksojen antijenleri endoplazmik retikulum ilişkili düşmesine çapraz-sunum tarafından işlenen hücresel kompartmanlarda arıtma için izin verir yeni bir vezikül yalıtım Protokolü yöntemidir.

Membran yuvası arıtma için çapraz-sunudaki eksojen antijenleri endoplazmik retikulum ilişkili bozulma

Ubikuitin ligazlar, birkaç E3 SUMO ligazlar tespit edilmiştir. Bu değiştirilmiş vitro SUMOylation Protokolü roman SUMO E3 ligazlar bir vitro sulandırma tahlil tarafından tespit edebilmek.

Vitro SUMOylation SUMO E3 ligaz etkinlik eğitim için tahlil

Kompleks biyolojik örneklerden her yerde bulunan proteinlerden kaynaklanan diGly peptidlerin arıtılmı, saptanması ve tanımlanması için bir yöntem salıyoruz. Sunulan yöntem çoğaltılabilir, sağlam ve ubiquitinome analizinin derinliği düzeyine göre yayınlanmış yöntemleri geride bırakır.

Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması

Ubiquitination hücresel süreçlerde önemli roller oynar ve sıkıca deubiquitination tarafından koordine edilen bir post-translational modifikasyon olduğunu. Her iki reaksiyon kusurları insan patolojileri altında yatan. Biz arıtılmış bileşenleri kullanarak in vitro mayası ve deubiquitination reaksiyonu yürütmek için protokoller sunuyoruz.

Nükliosomal Histones in vitro Ubiquitination ve Deubiquitination bulguları

Bu protokol, bu tür çeviri sonrası modifikasyonların (PtM'ler) bir tedavi veya fenotip gibi belirli bir durumla ilişkili değişikliklerini belirlemek için ubiquitin (Ub) ve ubiquitin benzeri (Ubls) spesifik proteomların oluşturulmasını amaçlamaktadır.

Ubiquitin ve Ubiquitin benzeri Bağımlı Post-translational Modifikasyonlar ve Önemli Değişikliklerin Belirlenmesi Profilleme

Bu yöntem, ubiquitin zincir topolojislerindeki küresel değişikliklerin değerlendirilmesini açıklar. Değerlendirme, kütle spektrometresi tabanlı hedefli proteomik yaklaşımın uygulanmasıyla gerçekleştirilir.

Paralel Reaksiyon İzleme ile Ubiquitin Zincir Analizi

Memeli hücrelerinde belirli bir substratın ubikitilasyon testi ve bir E3 ubikitin-ligazının ubikitilasyon testi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. HEK293T hücre hatları protein aşırı ekspresyonu için kullanıldı, poliubikitillenmiş substrat immünopresipitasyon ile hücre lizatlarından arındırıldı ve SDS-PAGE'de çözüldü. Bu post-translasyonel modifikasyonu görselleştirmek için immünoblotlama kullanıldı.

Memeli Hücre Lisatlarında E3 Ubikitin-ligaz ile Substrat Ubikitilasyonunun Değerlendirilmesi

Ubiquitinasyon, hücre içi protein fonksiyonlarının kritik bir düzenleyicisidir. Burada, memeli hücrelerinde substrat protein ubiquitinasyon seviyelerini tespit etmek için iki hücre lizisi yöntemini tanımlıyor ve ubiquitinasyon seviyelerini analiz etme etkinliklerini karşılaştırıyoruz. HEK293T hücrede protein aşırı ekspresyonu, geçici transfeksiyonla indüklenmiş ve ubiquitinated proteinler western blot analiziyle tespit edilmiştir.

SMAD2/SMURF2 modeli kullanılarak memeli hücre lizatlarında ubiquitinasyon tespiti için karşılaştırmalı stratejiler

Bu protokol, Streptococcus pneumoniae'nin memeli hücre lizat veya saf ubiquitin enzim kompleksi kullanılarak ubiquitinasyon yöntemini tanımlar; ardından arıtılmış VCP/p97-UFD1-NPLOC4 protein kompleksiyle tedavi edilip, bakteriyolitik aktivitesini değerlendirir; böylece ubiquitin bağımlı bağışıklık efektörlerinin incelenmesi mümkün olur.

In vitro Bakteriyel Ubiquitinasyonun Yeniden Yapılandırılması ve VCP/p97 aracılı Eliminasyonun Yeniden Yapılması

Öğrenin, memeli hücrelerinden ubikitinlenmiş p53 proteinlerinin saflaştırılması yöntemini. Bu protokol, protein fonksiyon düzenlemesinde ubikitinasyonun rolünü incelemek için güvenilir bir yaklaşım sunar.

Memeli Hücrelerinden Ubikitinlenmiş p53 Proteinlerinin Saflaştırılması

Daha fazla video keşfet