Mezenkimal Kök Hücrelerin Keçi Stifle Ekleminin İnfrapatellar Yağ Pedinden İzolasyonu, Genleşmesi ve Farklılaşması

İnfrapatellar Yağ Pedi kaynaklı Mezenkimal Kök Hücreler veya kısaca IFP-MSC'ler, nispeten daha az çalışılmış bir kök hücre türüdür. Bu protokol, IFP-MSC'lerin keçi boğucu ekleminden izolasyonunu gösteren basit, güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntemdir. Tekniğin temel avantajı, çok sayıda yüksek kaliteli IFP-MSC'nin elde edilebilmesidir.

İzole IFP-MSC'ler birden fazla soya farklılaşabilir ve geniş rejeneratif potansiyele sahiptir. Anatomik konumları nedeniyle, IFP-MSC'ler osteoartritte kıkırdak defektlerini onarmaya ve kıkırdak yıkımını hafifletmeye ilgi duymuşlardır. Yöntemin doku mühendisliği ve rejeneratif tıp alanında hücre bazlı tedavi için etkileri vardır.

IFP-MSC'lerin izolasyonu, genişletilmesi ve farklılaştırılması prosedürü Dr. Sugata Hazra ve Bay Aman Mahajan tarafından gösterilecektir. Infrapatellar Yağ Pedi Mezenkimal Kök Hücrelerinin veya IFP-MSC'lerin izolasyonuna başlamak için, sterilize edilmiş bir toplama numune kutusunda arka bacakların femoral ve tibial bölgelerinin yaklaşık 15 santimetresini kapsayan keçi femorotibial eklemlerini toplayın. Daha fazla işlem için laboratuvara nakledilmek üzere numuneyi dört santigrat derecede saklayın.

Numuneyi 150 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin ve numunenin aseptik olarak ve prosedür boyunca bir biyo-güvenlik kabini olarak işlendiğinden emin olun. Antibiyotiklerle desteklenmiş otoklavlanmış PBS ile iyice durulayın. PBS kullanarak numuneyi hidratlı tutun.

Numunenin anatomik bölgelerini dikkatlice inceleyin. Kolay erişim için, femur kemiğinin uç yüzeyini bir elinizle tutarak ve keskin makas kullanarak eklem yönünde uzunlamasına keserek her iki uzun kemikten ekstra dokuları tamamen çıkarın. Daha sonra, eklem kapsülünü çevreleyen dokuyu rahatsız etmeden, kasları ve yağ dokusunu kemikten çıkarın.

Benzer şekilde, numunenin tibial ucunda başka bir kesi yapın ve kasları ve yağ dokusunu tibial kemikten çıkarın. Hem uzun kemiklerin tamamen açığa çıktığından hem de eklem kapsülünün görünür olduğundan emin olun. Daha sonra, eklemli eklemi kesmek için sinovyal zarın her iki tarafından bir kesi yapın.

Patellayı sinovyal membrandan ve patellar bağlardan taze sterilize edilmiş makas ve forseps kullanarak kesin. Ayrılmış patellayı hemen PBS içeren bir Petri kabına yerleştirin. Ayrılmış patelladan, makas ve forseps kullanarak iç yüzeyde bulunan tüm yağ yastığını çıkarın.

Başka bir taze Petri kabında toplayın ve bir neşter kullanarak kıyın. Yaklaşık iki ila üç milimetrelik küçük yağ segmentlerini elde etmek için diğer cerrahi aletleri dahil edin. Kıyılmış dokuyu 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarmak için bir spatula kullanın ve bir test tüpü karıştırıcısı kullanarak oda sıcaklığında 15 dakika boyunca antibiyotiklerle desteklenmiş PBS ile üç kez yıkayın.

Enzimatik sindirim için, kıyılmış dokunun yaklaşık beş gramını Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında veya DMEM'de, mililitre başına 1.5 miligram Tip II kollajenaz ve% 2 FBS'yi 12 ila 16 saat boyunca 37 santigrat derecede %2 FBS içeren düşük glikozlu ortamlarda inkübe edin. Sindirilmiş dokuyu dikkatlice aspire edin ve sindirilmemiş herhangi bir parçayı çıkarmak için 70 mikronluk bir hücre süzgecinden süzün. Filtrazı 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde beş dakika boyunca 150 kez g'de santrifüj yapın.

Hücre peletini DMEM düşük glikoz ile iki kez yıkamadan önce süpernatantı çıkarın. Pelet, genleşme ortamı olarak da bilinen tam DMEM'de yeniden askıya alın. Hücreleri 150 milimetrelik bir Petri kabına tohumlayın ve mililitre başına beş nanogram Temel Fibroblast Büyüme Faktörü veya BFGF ve mililitre başına 50 mikrogram 2-Fosfo-L-askorbik asit trisodyum tuzu ile desteklenen genleşme ortamında kültürleyin.

Hücrelerin yapışmasını ve çoğalmasını sağlamak için% 5'lik bir karbondioksit inkübatöründe hücreleri 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücrelerin günlük olarak bağlanmasını ve büyümesini izleyin. IFP-MSC'lerin uygun bakımı ve genişletilmesi için, ortamı her üç günde bir değiştirin.

Ortamı değiştirirken, mililitre BFGF başına taze beş nanogram ve milimetre başına 50 mikrogram 2-Fosfo-L-askorbik asit trisodyum tuzunu doğrudan Petri kabına ekleyin. Hücreler% 80 ila% 90 oranında birleştiğinde, Petri kabından genleşme ortamını çıkararak ve hücreleri 1X PBS ile yıkayarak onları alt kültüre alın. Daha sonra yemeğe dört mililitre% 0.25 Tripsin-EDTA ekleyin ve% 5'lik bir karbondioksit inkübatöründe hücreleri 37 santigrat derecede inkübe edin.

Dört dakika sonra, hücreleri yerinden çıkarmak için yan tarafındaki plakaya dokunun. Tüm hücrelerin mikroskop altında tamamen ayrıldığını onaylayın. Onaylandıktan sonra, tripsini nötralize etmek için eşit miktarda genişletme ortamı ekleyin.

Bu ayrışmış hücreleri taze bir 15 mililitrelik polipropilen tüpte toplamak için bir pipet kullanın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 150 kez g'de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve peleti istenen genleşme ortamı hacminde yeniden askıya alın. Standart hücre sayma yöntemini kullanarak hücreleri sayın ve 150 mililitrelik bir Petri kabında santimetre kare başına 10.000 hücrelik bir tohumlama yoğunluğunda daha fazla genişleme için alt kültüre alın.

Tüm tahliller için, P2 ila P5 geçiş numarasına sahip hücrelerin birleştirilmiş bir tek katmanını kullanın. Genişlemiş hücreler% 80 ila% 90 akıcılığa ulaştığında, hücreleri beş dakika boyunca 150 kez g'de 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde peletlemeden önce Tripsin-EDTA çözeltisini kullanarak ayrıştırın. Daha sonra peleti keçi plazmasında 50 mikrolitre başına 2 milyon hücre yoğunluğunda yeniden askıya alın. Hücreleri içeren 50 mikrolitre plazmayı sterilize edilmiş 90 milimetrelik bir Petri kabına ekleyin, ardından% 0.3'lük son konsantrasyonda kalsiyum klorür ilavesi Çapraz bağlı plazma hidrojeli üretmek için iyice karıştırın.

Fabrikasyon hidrojeli 40 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe ettikten sonra, hidrojelleri kondrojenik ortam içeren 24 delikli doku kültürü plakalarına aktarın. Medyayı 14 gün boyunca her üç günde bir değiştirin. TGF-beta 1 olmadan tam DMEM ortamında kültürlenen hidrojeller, indüklenmemiş kontroller olarak kabul edilir.

Plazma hidrojelindeki hücrelerin 14 günlük kondrojenik farklılaşmasından sonra, hidrojelleri PBS ile her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın ve numuneleri üç saat boyunca nötr tamponlu formalin içinde sabitleyin. İzole IFP-MSC'ler homojen olarak yapışıktı ve in vitro kültürden sonraki 24 saat içinde uzatılmış morfolojiye ulaştı. Hücreler, genişlemeden sonraki altı gün içinde% 80 ila% 90 oranında etkili bir şekilde çoğaldı ve etkili proliferatif ve kendini yenileme yeteneklerini gösteren klonojenik kapasite gösterdi.

Adipojenik soya farklılaşmak için tedavi edildiğinde, izole hücreler, 14. ve 21. günlerde Yağ Kırmızı O boyaması ile doğrulanan lipit damlacıkları üretti. Bu tür yağ damlacıkları, adipojenik indükleyici faktörler olmadan hücrelerde görülmüyordu. Plazma hidrojeli içinde kapsüllenen izole hücreler, indüklenen grupta 14 gün sonra beyaz ve parlak neo-doku oluşumunu gösterdi ve kondrojenik potansiyeli gösterdi.

İndüklenmemiş grup, parlaklığı azalmış soluk beyaz dokuya sahipti. Ek olarak, indüklenen gruptaki Alcian Blue ve Safranin O için pozitif histolojik boyama, hücrelerin kıkırdak matrisinin ana bileşenlerinden biri olan sülfatlanmış glikozaminoglikanları salgılayabileceğini göstermiştir. Buna karşılık, indüklenmemiş gruplardan gelen hidrojel kesitleri Safranin O ve Alcian Blue boyama için negatifti ve mezenkimal kök hücrelerin kondrojenik farklılaşma potansiyelini sadece kondrojenik uyaranların varlığında doğruladı.

Osteojenik medya ile indüklenen izole hücreler, alkali fosfataz için pozitif boyanma gösterdi ve 14 günün sonunda mineralizasyonu doğruladı. 28 günlük osteojenik indüksiyondan sonra, Alizarin Red S boyaması ile kalsifiye birikimler gözlendi. Sonuçlar, indüklenen hücrelerin adipojenik, kondrojenik ve osteojenik soylara farklılaşma potansiyelinin altını çizdi.

Kontaminasyonu önlemek için numunenin aseptik koşullar altında işlenmesi esastır. Patellanın doğru yerini belirlemek de önemlidir. Bu prosedür, eklem kondrositleri, ligament fibroblastları ve kök hücreler gibi çeşitli hücre tiplerini sinovyum ve sinovyal sıvıdan izole etmek için yolu açar ve rejeneratif tıpta geniş uygulamalara sahiptir.

IFP-MSC'lerin bu teknik kullanılarak izole edilmesinden sonra, etkinliği özellikle kıkırdak, kemik ve ligament gibi kas-iskelet sistemi dokularının iskele ve iskelesiz yaklaşımlar kullanılarak yenilenmesi için araştırılmıştır.