Periferik Nöromühendislik için Grafen Bazlı 3D Biyohibrid Hidrojel Biyomürekkebin Hazırlanması ve Karakterizasyonu

Kök hücre sistemi, önemli bileşenlerinin etkisi altındadır. Kök hücrenin korunması ve farklılaşması, mikro çevrelerinin varlığı olmadan düşünülemez. Kök hücre nişi olarak adlandırılan bu mikro çevre, hücre ve iskelelerden oluşur.

Periferik nöropati bazen brakii pleksus yaralanması, çeşitli travmalar, tümör, otonomik anomaliler, immün tanım ve metabolik hastalık gibi olabilir. Kök hücreler için daha iyi ve daha doğal bir niş sağlamak için çeşitli 3D kültür yöntemleri geliştirilmiştir. Küresel oluşum ve 3D biyobaskı, 3D kültürler için nispeten yeni ve umut verici yöntemlerdir.

3D biyobaskı, nöromühendislik çalışmalarında da kullanılabilir. Sonuç olarak, bu çalışmada, grafen bazlı ve aljinat / jelatin bazlı biyomürekkepler geliştirilmiş ve rejeneratif özellikleri için çalışılmıştır. Başlamak için, kültür Wharton'un jöle mezenkimal kök hücreleri veya DMEM F12 ortamındaki WJMSC'ler,% 10 fetal buzağı serumu veya FBS,% 1 kalem / strep ve% 1 L-glutamin içerir. oda sıcaklığında steril laminer akış altında.

Kültürlenmiş hücreler şişede% 80 birleştiğinde, ortamı dökün ve hücreleri beş mililitre PBS ile yıkayın. Daha sonra beş mililitre% 0.25 tripsin ve 2.21 milimolar sodyum EDTA ekleyin ve 37 santigrat derecede inkübe edin. Beş dakika sonra, hücrelere% 10 FBS içeren 10 mililitre DMEM F12 ortamı ekleyin.

Hücreleri askıya alın, ortamı toplayın ve bir santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra, hücreleri% 10 FBS içeren taze bir besin maddesi ortamı ile yeni bir şişede yeniden tohumlamadan önce hücreleri santrifüj edin ve süpernatantı atın. Kontrol grubunun biyomürekkebini grafen olmadan hazırlamak için, 4.5 miligram aljinat ve 1.5 miligram jelatin tartın ve bunları bir santrifüj tüpüne aktarın.

Daha sonra tüpe% 10 FBS içeren 50 mililitre DMEM F12 ortamı ekleyin. Yine, 4.5 miligram aljinat ve 1.5 miligram jelatin tartın ve bunları bir santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra tüpe 50 mikrolitre% 0.1 grafen ekleyin ve% 10 FBS içeren DMEM F12 ortamı ile hacmi 50 mililitre yapın.

1,5 santigrat derecenin altında 121 santigrat derecede otoklavlamadan önce biyomürekkepleri pipetleme ve vorteksleme ile karıştırın. 20 dakika boyunca atmosferik basınç. Otoklavlamadan sonra, oluşan kabarcıkları çıkarmak için çözeltiyi santrifüj edin ve hücreler hazırlanana kadar biyomürekkepleri 37 santigrat dereceye yerleştirin.

Hücre biyomürekkep etkileşimi için, biyomürekkep gruplarını oluşturun. Birinci grup, biyobaskı için biyomürekkeple basılmış 3D-B ve 3D-G'yi içerir. İkinci grup, biyobaskıdan sonra sferoidlerin oluştuğu 3D-BS ve 3D-GS biyomürekkeplerini içerir.

Birinci grup için, hücreleri 0.5 mililitre ortamdaki yedinci hücrelere 10'a kadar sayın. Sonra 4,5 mililitre biyomürekkep ekleyin. Şırıngaları kullanarak karışımı steril kabindeki kartuşlara aktarın.

Kartuşları biyoyazıcının ilgili ekstrüder bölümüne takın. İkinci grup için, biyomürekkep gruplarının her birinden beş mililitre biyomürekkep alın ve bunları bir enjektör yardımıyla steril kartuşlara aktarın. İki koaksiyel yazıcı kafasına ve pnömatik tahrikli ekstrüzyon teknolojisine sahip biyoyazıcıyı kullanın.

Mikro adım başına XYZ çözünürlüğünü 1,25 mikrometreye, ekstrüzyon genişliğini 400 mikrometreye ve ekstrüzyon yüksekliğini 200 mikrometreye ayarlayın. 3B modeller oluşturmak için 20x20x5 milimetrelik bir ızgara kullanın. Açık kaynaklı web tabanlı CAD programlarını kullanarak 3B modeller oluşturun.

3B biyobaskı işlemi için, yazıcının ortalama basıncını 7,5 psi'ye ayarlayın. Ardından kartuşu ve yatak sıcaklığını 37 santigrat dereceye ve hızı% 60'a ayarlayınYazma aşamasında sistemi ev konumuna getirin. Eksenleri otomatik olarak konumlandırın ve biyobaskı işlemine başlamadan önce ekstrüderi seçin ve ayarlayın.

Baskıdan sonra, numuneyi çıkarın ve laminer akış dolabının altına yerleştirin. Daha sonra, biyomürekkepleri 0.1 normal kalsiyum klorür çözeltisi ile püskürtün veya oda sıcaklığında bir pipet ile bir mililitrelik çözelti ekleyin ve 10 ila 20 saniye bekleyin. Daha sonra basılı desenleri kalsiyum ve magnezyum içeren PBS ile iki kez yıkayın.

Biyomürekkep grubu içeren her hücrenin üzerine% 10 FBS ile iki mililitre DMEM F12 ortamı ekleyin ve plakaları 30 dakika boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, her gruba altıncı hücrelere bir ila 10 içeren iki mililitre süspansiyon ortamı ekleyin ve plakaları inkübe edin. 24 saat sonra, WJMSC'lerin kontrol grubu hariç nöron benzeri hücrelere farklılaşması için ters çevrilmiş bir mikroskop altında küresel oluşum için tüm biyomürekkep partilerini gözlemleyin ve fotoğraflayın.

Kuyu başına iki mililitre nörojenik farklılaşma ortamı ekleyin ve her iki günde bir yenileyin. Nöral farklılaşmayı gözlemlemek için yedi gün boyunca takip edin. Daha sonra, hızlandırılmış görüntüleme kullanarak, grafenin kök hücreler üzerindeki etkilerini inceleyin ve biyomürekkep içindeki hücre etkileşimlerini izleyin.

Grafen konsantrasyonunun hücre proliferasyonu üzerindeki etkisi burada gösterilmiştir. Kontrol ile karşılaştırıldığında,% 0.001 grafen konsantrasyonu için anlamlı azalma gözlendi. Diğer gruplar ile kontrol arasında anlamlı fark yoktu.

Hücre grafen etkileşimleri, grafenin 2D sistemde tolere edildiğini ve hücreler tarafından endositoz yoluyla alındığını gösterdi. Timelapse görüntüleme, 3D grafen ortamında hayatta kalan hücrelerin, inkübasyonun sonuna kadar GFP parlaklığı ile canlılıklarını koruduğunu gösterdi. SEM görüntüleri ve 3D-B ve 3D-G biyomürekkep gruplarının FIIR analizi burada gösterilmektedir.

Biyomürekkep hücre etkileşimleri hem yüzeyde hem de dahili olarak gösterilmiştir. Hücreler morfolojik olarak yuvarlaktı ve malzemeye bağlıydı. 3D nöronal farklılaşmada, her iki gruptaki sferoid hücrelerin sınırlarının saydam ve canlı olduğu ve grafen grubundaki sferoidlerin nispeten daha büyük olduğu ve grafeni hücre içinde hapsettiği düşünülmüştür.

2D ve 3D hücrelerin immün boyama burada gösterilmiştir. Yeşil görüntüler nöron benzeri yapıları temsil eder. 2D pozitif kontrol örneği, 3D örneklerden daha az nöron benzeri yapı belirteci ifade etti.

Grafen bazlı biyomürekkeplerin, kök hücrelerin nöron benzeri hücrelere farklılaşması açısından daha başarılı olduğunu keşfettik. Grafen bazlı biyomürekkeplerin daha ileri çalışmalarda periferik sinir bozukluklarının tedavisi için mükemmel araçlar olacağını öneriyoruz. Günümüzde kök hücre sistemi, doğal ve sentetik biyomalzemelerle doku mühendisliği ile oluşturulabilmektedir. Bu dokuların yenilenmesinde, hasarın giderilmesinde ve fonksiyonun sağlanmasında kullanılabilecek canlı dokuların yerini alabilecek yapay dokuların oluşturulması doku mühendisliği ile sağlanmaktadır.