Lupus Eğilimli Farelerde Fekal Mikrobiyota Dinamiğinin Basit, Uygun Maliyetli Bir DNA İzolasyon Yöntemi Kullanılarak Analizi
2 Mayıs 2022
Bu protokol, otoimmün hastalığın gelişimi sırasında murin bağırsak mikrobiyota değişikliklerinin analizi için basit, uygun maliyetli bir DNA izolasyon yöntemi sağlar.
Önerilen DNA izolasyon yöntemi, otoimmün hastalıklar fare modellerinde bağırsak mikrobiyota dinamiklerini incelemeye hizmet edebilir. Ticari olarak temin edilebilen kitlerle karşılaştırılabilir dışkı örneklerinden DNA elde etmek için daha çok yönlü, uygun maliyetli ve verimli bir yöntem önerilmektedir. Başlamak için, her fareyi ayrı ayrı kafesinden çıkarın, doğrudan anüsten bir dışkı topağı toplayın ve işlenene kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.
Numuneleri steril ve temiz forseps, tüp ve eldivenlerle işleyin. Önceden tartılmış, iki mililitrelik vidalı kapak tüpüne dondurulmuş bir pelet ekleyin ve dışkı ağırlığını gram cinsinden kaydedin, bu da dışkı peleti başına 0,02 ila 0,05 gram arasında olmalıdır. Pelet üzerine ince bir 0.1 milimetre cam boncuk tabakası, 500 mikrolitre lizis tamponu ve 200 mikrolitre% 20 sodyum dodesil sülfat ekleyin.
Boncuk, tüpü bir homojenizatörde dört dakika boyunca dövdü, ardından üç ila beş dakika girdap yaptı. Kabarcıkları ve köpüğü gidermek için tüpleri kısa bir süre santrifüj yapın. Mikrobiyota örneklerinden DNA çıkarmak için, 350 mikrolitre numune süpernatanı, herhangi bir enkaz olmadan, yeni, 1.5 mililitrelik bir çıtçıtlı kapak tüpüne aktarın.
500 mikrolitre fenol:kloroform:izoamil alkol, 25:24:1 oranında ve bir dakika boyunca vorteks ekleyin. Santrifüjlemeden sonra, üst sulu fazın 180 mikrolitresini yeni, 1,5 mililitrelik bir çıtçıtlı kapak tüpüne aktarın. 180 mikrolitre kloroform ekleyin, ters çevirin ve karıştırın.
Bundan, sulu fazın 180 mikrolitresini yeni bir çıtçıtlı kapak tüpüne aktarın. Bir biyogüvenlik kabininde, 180 mikrolitre soğuk izopropanol ve 36 mikrolitre beş molar amonyum asetat ekleyin. Karıştırmak için birkaç kez ters çevirin ve tüpü 20 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.
Süper natantı atın, ardından peletleri 500 mikrolitre soğuk% 70 etanol ile birkaç kez yıkayın. Süper natantı atın ve pelet netleşene kadar tüpü kağıt mendil üzerinde 20 dakika boyunca baş aşağı kurutun. Peleti 50 mikrolitre moleküler sınıf suda askıya alın ve büyük DNA peletlerini tamamen çözmek için sıvıyı 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede ısıtın.
Isıtmadan sonra, kapaktaki yoğuşma damlacıklarını geri kazanmak için bu tüpleri bir dakika boyunca 3.400 kez G'de santrifüj yapın. Konsantrasyonu ölçün ve bir spektrofotometre kullanarak 260/280 oranını elde edin. Kaliteli DNA için bir oran genellikle 1.8 ila iki arasındadır.
Hazırlanan numuneleri oda sıcaklığında bir dakika boyunca 600 kez G'de santrifüjleyin, 24 saat boyunca eksi 80 santigrat derecede dondurmadan önce. Daha sonra, mikrolitre başına bir ila 50 nanogram arasında değişen konsantrasyonlara sahip 20 mikrolitre numuneyi, sıralama için Argonne Ulusal Laboratuvarı'na gönderin. CX3CR1 reseptöründen yoksun fare suşu, vahşi tip MRL / lpr, MRL / lpr-CX3CR1 GFP / GFP farelere kıyasla farklı bir bağırsak mikrobiyota bileşimine sahiptir, filum Proteobakteriler gibi potansiyel olarak patojenik bakterilerle ilgili olarak belirli cinslerde önemli farklılıklar gösterir.
Numuneyi kirletmeye dikkat edin. Steril olması gerekiyor. Ayrıca, süpernatantı yeni bir tüpe aktarırken doğru pipetleme önemlidir.
Bu yöntem PCR, restriksiyon enzim sindirimi veya genomik kütüphane yapımı gibi moleküler analizler için uygundur. Lupusta, bağırsak mikrobiyotası ile lupus progresyonu arasında güçlü bir ilişki olduğunu kanıtladık.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, otoimmün hastalık gelişimi sırasında fare bağırsak mikrobiyota değişikliklerinin analizi için basit ve maliyet etkin bir DNA izolasyon yöntemi sunmaktadır. Bu yöntem, otoimmün hastalıkların fare modellerinde bağırsak mikrobiyota dinamiklerini incelemek üzere tasarlanmıştır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Mikrobiyoloji
- Otoimmünite
Arka Plan
- Bağırsak mikrobiyotasını anlamak, otoimmün hastalık araştırmalarında kritik öneme sahiptir.
- Güncel DNA izolasyon yöntemleri pahalı ve karmaşık olabilir.
- Bu çalışma, daha verimli ve maliyet etkin bir alternatif önermektedir.
- Mikrobiyota değişikliklerini analiz etmek için fekal örnekler kullanılır.
Çalışmanın Amacı
- Dışkı örneklerinden DNA ekstraksiyonu için güvenilir bir yöntem sağlamak.
- Otoimmün hastalık modellerinde bağırsak mikrobiyotası çalışmalarını kolaylaştırmak.
- Yeni yöntemin verimliliğini ticari olarak mevcut kitlerle karşılaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Farelerden dışkı pelletlerinin bireysel olarak toplanması.
- Numunelerin -80 degrees Celsius'da saklanması.
- Numune işleme için steril aletlerin kullanılması.
- Numunelerin lizis tamponu ve cam boncuklar ile hazırlanması.
Ana Sonuçlar
- Önerilen yöntem, ticari kitlerle kıyaslanabilir DNA kalitesi sağlar.
- Mikrobiyota analizi için maliyet etkin ve verimlidir.
- Otoimmün hastalık mekanizmaları üzerine yapılacak ileri araştırmaları kolaylaştırır.
Sonuçlar
- Bu DNA izolasyon yöntemi, araştırmacılar için değerli bir araçtır.
- Hastalık durumlarında bağırsak mikrobiyotasının incelenmesini destekler.
- Otoimmünite alanında daha erişilebilir araştırmaları teşvik eder.
Sıkça Sorulan Sorular
Endüstriyel Uygulama ve Önemi
Otoimmün hastalık modellerinde bağırsak mikrobiyota dinamiklerinin güvenilir analizi, hastalık progresyonuna çevresel ve genetik katkıların anlaşılması açısından kritik öneme sahiptir. Bu maliyet etkin DNA izolasyon protokolü, fare dışkı örneklerinden mikrobiyal DNA'nın ölçeklenebilir ve tekrarlanabilir şekilde ekstraksiyonuna olanak tanıyarak preklinik araştırmalarda yüksek kapasiteli mikrobiyom çalışmalarını destekler. Bu yöntem, mikrobiyota değişimlerini otoimmün fenotiplerle ilişkilendirmedeki öngörü güvenilirliğini artırarak erken keşif ve translasyonel stratejilere bilgi sağlar.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Hastalıkla ilgili fare modellerinde mikrobiyota-bağışıklık sistemi etkileşimlerinin incelenmesine olanak tanır.
- Bağırsak mikrobiyal kompozisyonundan etkilenen aday yolakların fonksiyonel validasyonunu destekler.
- Mikrobiyal değişimleri otoimmün progresyonla ilişkilendirerek mekanistik risk azaltımını kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Alt sekanslama ve moleküler analizler için standartlaştırılmış, tekrarlanabilir DNA örnekleri sağlar.
- PCR ve yeni nesil sekanslama iş akışları için uygun, kantitatif ve yüksek kaliteli DNA sağlar.
- Deneysel kohortlar arasındaki karşılaştırmalı mikrobiyom çalışmaları için ölçeklenebilir örnek işleme imkanı sunar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Preklinik mikrobiyota profillemesini, hastalık seyri ve biyobelirteç keşif çalışmalarıyla uyumlu hale getirir.
- Keşif aşamasındaki bulgulardan otoimmün modellerdeki translasyonel doğrulamaya kadar sürekliliği destekler.
- Çevresel tetikleyicilerin hastalık fenotipleriyle ilişkilendirilmesindeki biyolojik belirsizliği azaltır.
İş Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu DNA izolasyon protokolü, erken keşiften preklinik sürece kadar olan aşamalara uygundur; lupus eğilimli fare modellerinde sağlam mikrobiyom analizine olanak tanır, aday bileşiklerin belirlenmesini ve mekanistik çalışmaları destekler.
- Keşif Biyolojisi: Otoimmünitede mikrobiyota kaynaklı immün modülasyona yönelik hipotezlerin test edilmesini kolaylaştırır.
- Tarama: Sekanslama tabanlı mikrobiyom profilleme için tekrarlanabilir, kantitatif DNA çıktıları sağlar.
- Analitik: Genotipler veya tedaviler arasındaki mikrobiyal topluluk değişimlerinin istatistiksel karşılaştırması için yüksek kaliteli girdi sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Preklinik mikrobiyom bulgularını, otoimmün hastalıklarda potansiyel biyobelirteç geliştirme süreçlerine bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çeşitli fare modellerine ve deneysel tasarımlara uyarlanabilen, ölçeklenebilir ve maliyet etkin bir protokol sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Mikrobiyota-hastalık ilişkilerindeki öngörü güvenini ve hedef doğrulamasını artırır.
- Operasyonel Değer: DNA ekstraksiyonunu standartlaştırarak çalışmalar genelinde tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği iyileştirir.
- Stratejik Değer: Mikrobiyomun hastalık mekanizmalarına katkılarını netleştirerek bilinçli devam/durdurma kararları alınmasını sağlar.
- Portföy Etkisi: Otoimmün boru hatlarındaki mikrobiyom modüle eden müdahalelerin riskle uyumlu önceliklendirmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Steril örnekleme ve moleküler biyoloji iş akışlarında teknik uzmanlık gerektirir.
- Kalite kontrol için homojenizatörlere, santrifüjlere ve spektrofotometrelere erişim gereklidir.
- Kontaminasyonu ve değişkenliği minimize etmek için ekipler arası titiz bir standardizasyon gerektirir.
- Çeşitli fare modellerine uyarlanabilir ancak farklı örnek türleri için optimizasyon gerektirebilir.
- Veri bütünlüğünü sağlamak için doğru pipetlemeye ve steril tekniğe bağımlıdır.
