Name: Lupus Eğilimli Farelerde Fekal Mikrobiyota Dinamiğinin Basit, Uygun Maliyetli Bir DNA İzolasyon Yöntemi Kullanılarak Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Keşfedin, lupus eğilimli fare modellerinde bağırsak mikrobiyota dinamiklerini analiz etmek için basit ve uygun maliyetli bir DNA izolasyon yöntemi. Bu yöntem, otoimmün hastalık araştırmalarında kullanılabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Argonne Ulusal Laboratuvarı'nın ve işbirliği yapan biyoinformatikçilerimizin yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma çeşitli NIH ve dahili hibelerle desteklenmektedir.

B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J farelerinin Cx3cr1 gfp/gfp lokusu, MRL/lpr-CX3CR1 gfp/gfp fareleri üretmek için 10 nesil boyunca MRL/MpJ-Fas lpr/J'ye (MRL/lpr) geri döndürüldü. Tek nükleotid polimorfizmi (SNP) panelleri kullanılarak yapılan genom taraması, yeni üretilen farelerin genetik arka planının MRL / lpr'ninkiyle % 97'den fazla aynı olduğunu doğruladı. Bundan sonra, fareler Virginia Tech'teki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin (IACUC) özel gereksinimlerini takiben belirli bir patojensiz ortamda yetiştirildi ve muhafaza edildi. fareler 13, 14 ve 15 haftalıkken örnekler toplandı.
1. Farelerden mikrobiyota örneklerinin toplanması
<ol><li>Her fareyi ayrı ayrı kafesinden çıkarın. Doğrudan anüsten bir dışkı peleti toplayın ve işlenene kadar -80 ° C'de saklayın. Numuneleri steril ve temiz forseps, tüp ve eldivenlerle işleyin. NOT: Fekal numuneyi beklerken fareyi yerleştirmek için bir kap (örneğin, bir beher) kullanılabilir. Kabı her fareden önce ve sonra etanol ile temizleyin.</li>
	<li>Önceden tartılmış 2 mL vidalı kapak tüpüne dondurulmuş bir pelet ekleyin. Fekal ağırlığı, dışkı peleti başına 0.02-0.05 g arasında olması gereken gram cinsinden kaydedin.</li>
	<li>Pelet üzerine ince bir 0,1 mm cam boncuk tabakası, 500 μL lizis tamponu (50 mM NaCl, 5 mM Tris ve 50 mM EDTA) ve 200 μL% 20 SDS ekleyin.</li>
	<li>Boncukla tüpü bir homojenizatörde (maksimum güçte) 4 dakika çırpın, ardından 3-5 dakika girdap yapın.</li>
	<li>Kabarcıkları ve köpüğü gidermek için kısa bir süre döndürün (santrifüj üzerindeki düğmeye 1.000-1.200 x g'ye ulaşana kadar basın ve ardından serbest bırakın).</li>
</ol>2. DNA ekstraksiyonu
<ol><li>Adım 1.5'te elde edilen 350 μL süpernatantı (herhangi bir döküntü taşımamak için) yeni bir 1.5 mL çıtçıtlı kapak tüpüne aktarın. 500 μL fenol-kloroform-izoamil alkol (PCI; 25:24:1, v/v) karışımı ve vorteksini 1 dakika boyunca ekleyin. NOT: Şu andan itibaren, numunelerin kimyasal bir başlık içinde işlenmesi gerekmektedir. PCI toksiktir.</li>
	<li>4 ° C'de 3 dakika boyunca 6.000 x g'de döndürün. Sulu fazın 180 μL'sini (üst tabaka) yeni bir 1,5 mL çıtçıtlı kapak tüpüne aktarın. 180 μL (1:1) kloroform ekleyin, ters çevirin ve karıştırın. NOT: Üst katmanı aktarırken alt katmandan kaynaklanan kontaminasyonu en aza indirin.</li>
	<li>4 ° C'de 3 dakika boyunca 18.400 x g'de döndürün. Sulu fazın 180 μL'sini yeni bir çıtçıtlı kapak tüpüne aktarın. NOT: PCI ve kloroform atıldıktan sonra, aşağıdaki adımlar biyolojik bir güvenlik kabininde gerçekleştirilebilir.</li>
	<li>180 μL soğuk izopropanol ve 36 μL 5M NH4Ac. Karıştırmak için birkaç kez ters çevirin ve tüpü 20 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.</li>
	<li>4 ° C'de 20 dakika boyunca 18.400 x g'de döndürün. Süper natantı atmak için dökün. Ters çevirirken peleti birkaç kez 500 μL soğuk% 70 etanol ile yıkayın. NOT: Etanol, çift deiyonize steril su ile seyreltilmelidir.</li>
	<li>4 ° C'de 3 dakika boyunca 18.400 x g'de döndürün. Artık etanol çıkarmak için süpernatantı atın.</li>
	<li>Pelet berraklaşana kadar tüpü kağıt mendil üzerinde 20 dakika boyunca baş aşağı kurutun. Peleti 50 μL moleküler sınıf suya askıya alın. Büyük DNA peletlerini tamamen çözmek için sıvıyı 37 ° C'de 10 dakika ısıtın.</li>
	<li>Kapaktaki yoğuşma damlacıklarını geri kazanmak için ısıtmadan sonra tüpleri döndürün (1 dakika boyunca 3.400 x g).</li>
	<li>Konsantrasyonu ölçün ve bir spektrofotometre kullanarak 260/280 oranını elde edin. Moleküler sınıf suyu boş olarak kullanın. Kaliteli DNA, 1.8 ile 2 arasında değişen 260/280 oranlarına sahip olmalıdır. NOT: Beklenen DNA verimi dışkı peleti başına en az 0.03 g'dır.</li>
</ol>3. 16S rRNA gen dizilimi için numune hazırlama
<ol><li>DNA örneklerini kütüphane hazırlığından geçirildikleri ve Illumina Miseq'te sıralandıkları Argonne Ulusal Laboratuvarı'na gönderin.<ol><li>Numuneleri tam etekli 96 delikli plakalarda, numuneler sıralar halinde düzenlenmiş (A1-A12, B1-B12, vb.) ve folyo plaka contalarıyla kapatılmış olarak gönderin.</li>
		<li>Kuyucuk başına numune başına 1-50 ng/μL arasında değişen konsantrasyonda 20 μL'lik bir son hacim gönderin. NOT: Dillendirmeler moleküler sınıf su ile yapılmalıdır.</li>
		<li>Numuneleri hazırladıktan sonra, numuneleri 24 saat boyunca -80 °C'de dondurmadan önce oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 600 x g'da döndürün.</li>
		<li>Gece boyunca kuru buz üzerinde gönderin.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Lee, Y. K., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Has+the+microbiota+played+a+critical+role+in+the+evolution+of+the+adaptive+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Has the microbiota played a critical role in the evolution of the adaptive immune system.</a> Science. 330 (6012), 1768-1773 (2010).</li>
<li>Lee, Y. K., Menezes, J. S., Umesaki, Y., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinflammatory+T-cell+responses+to+gut+microbiota+promote+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Proinflammatory T-cell responses to gut microbiota promote experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, Suppl 1 4615-4622 (2011).</li>
<li>Yeoh, N., Burton, J. P., Suppiah, P., Reid, G., Stebbings, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+microbiome+in+rheumatic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Rheumatology+Reports%22%5BJournal%5D)">The role of the microbiome in rheumatic diseases.</a> Current Rheumatology Reports. 15 (3), 314(2013).</li>
<li>Larsen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota+in+human+adults+with+type+2+diabetes+differs+from+non-diabetic+adults%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota in human adults with type 2 diabetes differs from non-diabetic adults.</a> PLoS One. 5 (2), 9085(2010).</li>
<li>Alam, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+imbalance+in+inflammatory+bowel+disease+patients+at+different+taxonomic+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Microbial imbalance in inflammatory bowel disease patients at different taxonomic levels.</a> Gut Pathogens. 12 (1), (2020).</li>
<li>Vieira, S. M., Pagovich, O. E., Kriegel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet%2C+microbiota+and+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Lupus%22%5BJournal%5D)">Diet, microbiota and autoimmune diseases.</a> Lupus. 23 (6), 518-526 (2014).</li>
<li>Mu, Q., Zhang, H., Luo, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLE%3A+another+autoimmune+disorder+influenced+by+microbes+and+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">SLE: another autoimmune disorder influenced by microbes and diet.</a> Frontiers of Immunology. 6, 608(2015).</li>
<li>Tektonidou, M. G., Wang, Z., Dasgupta, A., Ward, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+serious+infections+in+adults+with+systemic+lupus+erythematosus%3A+a+national+population-based+study%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Care+%26+Research%22%5BJournal%5D)">Burden of serious infections in adults with systemic lupus erythematosus: a national population-based study.</a> Arthritis Care & Research. 67 (8), 1078-1085 (2015).</li>
<li>Mu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+lupus+nephritis+by+changes+of+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota.</a> Microbiome. 5 (1), 73(2017).</li>
<li>Panek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodology+challenges+in+studying+human+gut+microbiota+-+effects+of+collection%2C+storage%2C+DNA+extraction+and+next+generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Methodology challenges in studying human gut microbiota - effects of collection, storage, DNA extraction and next generation sequencing technologies.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5143(2018).</li>
<li>Fiedorová, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+dna+extraction+methods+on+stool+bacterial+and+fungal+microbiota+community+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The impact of dna extraction methods on stool bacterial and fungal microbiota community recovery.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 821(2019).</li>
<li>Gerasimidis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+DNA+extraction+methodology+on+gut+microbiota+research+applications%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">The effect of DNA extraction methodology on gut microbiota research applications.</a> BMC Research Notes. 9, 365(2016).</li>
<li>Bukin, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+16S+rRNA+region+choice+on+bacterial+community+metabarcoding+results%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results.</a> Scientific Data. 6 (1), 190007(2019).</li>
<li>Galloway-Peña, J., Hanson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+analysis+of+the+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Diseases+and+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tools for analysis of the microbiome.</a> Digestive Diseases and Sciences. 65 (3), 674-685 (2020).</li>
<li>Sharpton, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+the+analysis+of+shotgun+metagenomic+data%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 209(2014).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Dengeli bağırsak mikrobiyotası insan vücudunu hastalıklardan koruyabilir. Bu denge dış veya iç tetikleyiciler tarafından bozulduğunda, sonuçlar yıkıcı olabilir. Bu yöntem, murin modellerinde bağırsak mikrobiyotasının dinamiklerini analiz etmenin bir yolunu sunar. Yöntem sadece gruplar arasındaki karşılaştırmalar için değil, aynı zamanda bağırsak mikrobiyotasını bozan zamana bağlı faktörleri daha iyi tanımlamak için bağırsak mikrobiyotasını zaman içinde izlemek için de uygundur.
Deneydeki tüm f...

İnsanlar ve bakteriler uzun süredir bir arada var olmuşlardır. Konakçı immün yanıtlarını nicel ve nitel yollarla etkileyen karşılıklı yararlı etkilerle birlikte bağımlı bir ilişki kurmuşlardır1. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, bağırsak mikrobiyota bileşimi ile multipl skleroz 2, romatoid artrit3, tip2 diyabet4, İnflamatuar bağırsak hastalığı5 ve sistemik lupus eritematozus (SLE)6'yı içeren otoimmün hastalıkların patogenezi arasında bir ilişki olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, bağırsak mikrobiyotasının bu otoimmün hastalıkların ana nedeni mi yoksa ikincil bir etkisi mi olduğu hala belirsizdir7. Potansiyel olarak, bağırsak mikrobiyotası, otoimmün bozuklukların efektör fazı sırasında hastalığı şiddetlendirebilir veya bu hastalıkların indüksiyonunu düzenlemede rol oynayabilir8.
Lupus eğilimli dişi MRL/Mp-Faslpr (MRL/lpr) farelerde intestinal dysbiosis bildirilmiştir ve Lactobacilli'nin belirgin bir şekilde tükenmesiyle bağırsak mikrobiyota değişiklikleri gözlenmiştir9. Beş Lactobacillus suşunun bir karışımı oral yoldan uygulandığında, bu farelerde lupus benzeri semptomlar büyük ölçüde azaldı ve bu da SLE patogenezini düzenlemede mikrobiyotanın önemli bir rol oynadığını düşündürdü.
Aşağıdaki DNA ekstraksiyon tekniği, lupus eğilimli farelerde murin SLE benzeri hastalığın seyri sırasında mikrobiyota dalgalanmalarını takip etmeyi ve bunları kalitatif ve kantitatif olarak analiz etmeyi sağlar. Sağlıklı bağırsak mikrobiyotasını incelemek veya dysbiosis'i tanımlamak olsun, verilerin nasıl toplandığını ve doğru ve tekrarlanabilir olup olmadığını eleştirel olarak incelemek önemlidir10. Bu süreçte atılan her adım kritik öneme sahiptir. Mikrobiyal DNA'yı çıkarmak için uygun bir metodoloji kullanılmalıdır, çünkü DNA ekstraksiyon işlemi sırasında önyargılara neden olan olası herhangi bir sorun, yanlış mikrobiyal temsile neden olabilir. Fenol-kloroform yöntemi burada tarif edilirken, belirli durumlarda iyi çalışan bakterilerden DNA çıkarmak için ticari olarak temin edilebilen kitler vardır11. Bununla birlikte, kullanılabilirlikleri maliyet ve gerekli numune miktarı ile sınırlıdır.
Burada sunulan protokol uygun maliyetlidir ve sadece az miktarda örnek gerektirir. Her türlü dışkı örneği ile iyi çalışır ve zaman içinde bağırsak mikrobiyotasının dinamiklerini ve gruplar arasındaki karşılaştırmaları incelemede yararlıdır. DNA, fenol, kloroform ve izoamil alkol kullanan bir alkol saflaştırma yöntemi ile izole edilir. Alkol bazlı ekstraksiyon, DNA'nın son adımda çökeldiği protein ve lipit örneğinin temizlenmesine ve çıkarılmasına yardımcı olur. Önerilen yöntem önemli ölçüde yüksek verimlilik ve kaliteye sahiptir ve bakteri popülasyonlarının tanımlanmasında doğru olduğu kanıtlanmıştır. İşlem sırasında kritik bir not, DNA kontaminasyonunun meydana gelebileceği ve bu nedenle uygun numune elleçlemesinin gerekli olduğudur12.
DNA daha sonra Illumina MiSeq gibi 16S rRNA geni için Yeni Nesil Dizileme platformları tarafından analiz edilir. Özellikle, V4 hiper değişken bölgesi, yüksek dereceli taksonlar13 için daha iyi bir niceleme sağlamak üzere analiz edilir. Sonraki biyoinformatik analizler dış kaynaklı olup, bunu standart istatistiksel yöntemler kullanılarak kurum içi analiz izlemektedir. Aşağı akış dizilimi için çok sayıda açık kaynaklı biyoinformatik yazılım programı mevcuttur ve yapılan analizlerin türü büyük ölçüde ilgilenilen spesifik biyolojik soruya bağlıdır14. Bu protokol özellikle dizilemeden önceki deneysel adımlara odaklanır ve dışkı örneklerinden DNA elde etmek için daha çok yönlü, uygun maliyetli, karşılaştırılabilir ve verimli bir yöntem sağlar.

<table><tbody><tr><td>0,1 mm cam boncuklar</td><td>BioSpec Ürünler</td><td>11079101</td><td></td></tr><tr><td>2 mL vidalı kapaklı tüpler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3488</td><td></td></tr><tr><td>%20 SDS</td><td>FisherScientific</td><td>BP1311-1</td><td>SDS %20</td></tr> <tr><td>%96 Etanol, Moleküler Biyoloji Sınıfı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T032021000CS</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum Asetat (5 M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9071</td><td>NH4AC 5M</td></tr><tr><td>B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J</td><td>Jackson Laboratuvar</td><td>005582</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender fırtınası 24</td><td>Sonraki İlerleme</td><td>4116-BBY24M</td><td>Homojenizatör</td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>FisherScientific</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>DEPC ile Arıtılmış Su</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9916</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamin Tetraasetik Asit</td><td>FisherScientific</td><td>BP118-500</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>Folyo plaka contası</td><td>FisherScientific</td><td>NC0302491</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes-Kimtech 34256</td><td>FisherScientific</td><td>06-666C</td><td></td></tr><tr><td>MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) fareler</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>000485</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000 spektrofotomer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND2000CLAPTOP</td><td></td></tr><tr><td>Fenol: kloroform: izoamilalkohol (25:24:1)</td><td>FisherScientific</td><td>BP1752I-400</td><td>4</td></tr><tr><td>ondalık basamaklı</td> PCI Ölçeği <td>Mettler Toledo</td><td>MS205DU</td><td></td></tr><tr><td>Etekli 96 oyuklu plakalar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-0800</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>FisherScientific</td><td>15528154</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Tris Hidroklorür</td><td>FisherScientific</td><td>BP1757-100</td><td></td></tr><tr><td>Vorteks</td><td>Bilimsel Endüstriler</td><td>SI-0236</td><td></td></tr></tbody></table>

lupus eğilimli farelerde fekal mikrobiyota dinamiğinin basit, uygun maliyetli bir dna İzolasyon yöntemi kullanılarak analizi

Analysis of Fecal Microbiota Dynamics in Lupus-Prone Mice Using a Simple, Cost-Effective DNA Isolation Method

Bağırsak mikrobiyotası bağışıklık sisteminin eğitiminde önemli bir role sahiptir. Bu ilişki, sadece genetik faktörler tarafından yönlendirilen otoimmün hastalıkları değil, aynı zamanda hastalığın başlangıcını tetikleyebilecek ve / veya hastalığın seyrini kötüleştirebilecek çevresel faktörleri anlamak için son derece önemlidir. Lupus eğilimli MRL / lpr dişi farelerde bağırsak mikrobiyotasının dinamikleri üzerine daha önce yayınlanmış bir çalışma, bağırsak mikrobiyotasındaki değişikliklerin hastalığın ilerlemesini nasıl değiştirebileceğini göstermiştir. Burada, otoimmünite çalışmaları için bağırsak mikrobiyotasından temsili örneklerin çıkarılması için bir protokol açıklanmaktadır. Mikrobiyota örnekleri anüsten toplanır ve DNA'nın bir fenol-kloroform yöntemi kullanılarak ekstrakte edildiği ve alkol çökeltmesi ile saflaştırıldığı işlenir. PCR yapıldıktan sonra, saflaştırılmış amplikler Argonne Ulusal Laboratuvarı'nda Yeni Nesil Dizileme platformu kullanılarak sıralanır. Son olarak, 16S ribozomal RNA gen dizileme verileri analiz edilir. Örnek olarak, CX3CR1 olan veya olmayan MRL / lpr farelerinin bağırsak mikrobiyota karşılaştırmalarından elde edilen veriler gösterilmiştir. Sonuçlar, filum Proteobakteriler gibi patojenik bakteriler içeren cinslerde ve sağlıklı kommensal mikrobiyotanın bir parçası olarak kabul edilen Bifidobacterium cinsinde önemli farklılıklar göstermiştir. Özetle, bu basit, uygun maliyetli DNA izolasyon yöntemi güvenilirdir ve otoimmün hastalıklarla ilişkili bağırsak mikrobiyota değişikliklerinin araştırılmasına yardımcı olabilir.

Argonne Ulusal Laboratuvarı'ndan elde edilen sonuçlar, nitelikli bir biyoinformatikçi tarafından analiz edilir ve ardından standart istatistiksel yöntemler kullanılarak verilerin kurum içi analizi yapılır. Tipik mikrobiyom analizleri, benzer dizilerin bir numunedeki farklı mikroorganizmalar için bir vekil olarak operasyonel taksonomik birimlere (OTU'lar) veya amplikon dizisi varyantlarına (ASV'ler) kümelenmesini içerir. Numuneler arasındaki OTU'ların veya ASV'lerin sayıları daha sonra numune içi (alfa) çeşitlilikteki ve ...

Bu protokol, otoimmün hastalığın gelişimi sırasında murin bağırsak mikrobiyota değişikliklerinin analizi için basit, uygun maliyetli bir DNA izolasyon yöntemi sağlar.

Lupus Eğilimli Farelerde Fekal Mikrobiyota Dinamiğinin Basit, Uygun Maliyetli Bir DNA İzolasyon Yöntemi Kullanılarak Analizi

Gut microbiota has an important role in educating the immune system. This relationship is extremely important for understanding autoimmune diseases that ...

Önerilen DNA izolasyon yöntemi, otoimmün hastalıklar fare modellerinde bağırsak mikrobiyota dinamiklerini incelemeye hizmet edebilir. Ticari olarak temin edilebilen kitlerle karşılaştırılabilir dışkı örneklerinden DNA elde etmek için daha çok yönlü, uygun maliyetli ve verimli bir yöntem önerilmektedir. Başlamak için, her fareyi ayrı ayrı kafesinden çıkarın, doğrudan anüsten bir dışkı topağı toplayın ve işlenene kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.Numuneleri steril ve temiz forseps, tüp ve eldivenlerle işleyin. Önceden tartılmış, iki mililitrelik vidalı kapak tüpüne dondurulmuş bir pelet ekleyin ve dışkı ağırlığını gram cinsinden kaydedin, bu da dışkı peleti başına 0,02 ila 0,05 gram arasında olmalıdır. Pelet üzerine ince bir 0.1 milimetre cam boncuk tabakası, 500 mikrolitre lizis tamponu ve 200 mikrolitre% 20 sodyum dodesil sülfat ekleyin.Boncuk, tüpü bir homojenizatörde dört dakika boyunca dövdü, ardından üç ila beş dakika girdap yaptı. Kabarcıkları ve köpüğü gidermek için tüpleri kısa bir süre santrifüj yapın. Mikrobiyota örneklerinden DNA çıkarmak için, 350 mikrolitre numune süpernatanı, herhangi bir enkaz olmadan, yeni, 1.5 mililitrelik bir çıtçıtlı kapak tüpüne aktarın.500 mikrolitre fenol:kloroform:izoamil alkol, 25:24:1 oranında ve bir dakika boyunca vorteks ekleyin. Santrifüjlemeden sonra, üst sulu fazın 180 mikrolitresini yeni, 1,5 mililitrelik bir çıtçıtlı kapak tüpüne aktarın. 180 mikrolitre kloroform ekleyin, ters çevirin ve karıştırın.Bundan, sulu fazın 180 mikrolitresini yeni bir çıtçıtlı kapak tüpüne aktarın. Bir biyogüvenlik kabininde, 180 mikrolitre soğuk izopropanol ve 36 mikrolitre beş molar amonyum asetat ekleyin. Karıştırmak için birkaç kez ters çevirin ve tüpü 20 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.Süper natantı atın, ardından peletleri 500 mikrolitre soğuk% 70 etanol ile birkaç kez yıkayın. Süper natantı atın ve pelet netleşene kadar tüpü kağıt mendil üzerinde 20 dakika boyunca baş aşağı kurutun. Peleti 50 mikrolitre moleküler sınıf suda askıya alın ve büyük DNA peletlerini tamamen çözmek için sıvıyı 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede ısıtın.Isıtmadan sonra, kapaktaki yoğuşma damlacıklarını geri kazanmak için bu tüpleri bir dakika boyunca 3.400 kez G'de santrifüj yapın. Konsantrasyonu ölçün ve bir spektrofotometre kullanarak 260/280 oranını elde edin. Kaliteli DNA için bir oran genellikle 1.8 ila iki arasındadır.Hazırlanan numuneleri oda sıcaklığında bir dakika boyunca 600 kez G'de santrifüjleyin, 24 saat boyunca eksi 80 santigrat derecede dondurmadan önce. Daha sonra, mikrolitre başına bir ila 50 nanogram arasında değişen konsantrasyonlara sahip 20 mikrolitre numuneyi, sıralama için Argonne Ulusal Laboratuvarı'na gönderin. CX3CR1 reseptöründen yoksun fare suşu, vahşi tip MRL / lpr, MRL / lpr-CX3CR1 GFP / GFP farelere kıyasla farklı bir bağırsak mikrobiyota bileşimine sahiptir, filum Proteobakteriler gibi potansiyel olarak patojenik bakterilerle ilgili olarak belirli cinslerde önemli farklılıklar gösterir.Numuneyi kirletmeye dikkat edin. Steril olması gerekiyor. Ayrıca, süpernatantı yeni bir tüpe aktarırken doğru pipetleme önemlidir.Bu yöntem PCR, restriksiyon enzim sindirimi veya genomik kütüphane yapımı gibi moleküler analizler için uygundur. Lupusta, bağırsak mikrobiyotası ile lupus progresyonu arasında güçlü bir ilişki olduğunu kanıtladık.

analysis-fecal-microbiota-dynamics-lupus-prone-mice-using-simple-cost

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu videoda, kolon tümörü taşıyan farelerin dışkı örneklerinden alınan DNA izolasyon protokolü açıklanmaktadır. Ekstrakte edilen DNA, PCR kullanılarak amplifiye edilir ve ürün, manyetik boncuk bazlı bir yaklaşım kullanılarak daha da temizlenir. Bu yöntem, çevresel zenginleştirmenin kolon mikrobiyotası ve hayvan ölümleri üzerindeki etkisini belirlemek için kullanılabilir.

Dışkı Mikrobiyal DNA İzolasyonu: Murin Tümör Modelinde Çevresel Zenginleştirmenin Mikrobiyom Çeşitliliği Üzerine Etkisinin İncelenmesi

BM12 lenfositlerinin bir C57BL/6 alıcısına transferi, sistemik lupus eritematozusun yerleşik bir modelidir. Burada, bu modeli kullanarak hastalığın nasıl başlatılacağını ve T foliküler yardımcı hücrelerin, germinal merkez B hücrelerinin ve plazma hücrelerinin akış sitometrisi ile nasıl karakterize edileceğini açıklıyoruz.

C57BL / 6 FARELERDE SLE bm12 İndüklenebilir Modeli (SLE)

Bağırsak lenfositlerinin kantitatif karakterizasyonuna, bu hücrelerin çeşitli bağırsak ve sistemik hastalıklarda kritik bir rol oynadığının giderek daha fazla tanınması nedeniyle artan bir ilgi vardır. Bu protokolde, sonraki akış sitometrik karakterizasyonu için tek hücreli popülasyonların farklı ince bağırsak bölmelerinden nasıl izole edileceğini açıklıyoruz.

Fare Küçük Bağırsak Lenfositler izolasyonu ve Akım Sitometrisi Karakterizasyonu

Çevre zenginleştirme (EE) yaşam tarzı, stres ve hastalık arasındaki bağlantıları altında yatan mekanizmaları ortaya çıkarmak için kullanılan bir hayvan konut ortamdır. Bu iletişim kuralı özellikle hayvan mortalite etkisi olabilir microbiota biyolojik çeşitlilik değişiklikleri tanımlamak için iki nokta üst üste tumorigenesis ve EE bir fare modelini kullanan bir yordam açıklanır.

Çevre zenginleştirme etkileri kolon Microbiome biyolojik çeşitliliğin bir fare kolon tümörü modeli tanımlamak için bir yöntem

Burada biz lenfositler gut ilişkili lenfoid doku Peyer's yamalar ve boşaltma Mezenterik lenf düğümleri de dahil olmak üzere İndüktif sitelerinden ve lamina propria dahil efektör mekanları ekran koruyucu yalıtım için detaylı bir protokol tanımlamak ve bağırsak epitel küçük bağırsak bağışıklık sisteminin.

Lenfositler fare küçük bağırsak bağışıklık sistemi yalıtma

Burada biz ayrıntılı iletişim kuralları antibiyotik sözlü yönetimi için fareler, dışkı örnekleri, DNA ekstraksiyon ve miktar dışkı bakteri topluluğu tarafından qPCR sağlar.

Oral antibiyotik tedavisinden sonra fare bağırsak Microbiota nicel polimeraz zincir reaksiyonu tabanlı analiz

Burada açıklanan serbestçe kullanılabilir araçları kullanarak 16S rRNA metagenomik sıralama ve analiz kullanarak mikrobiyom profilleme için basitleştirilmiş bir standart işletim prosedürüdür. Bu protokol mikrobiyom alanında yeni araştırmacılar yanı sıra daha yüksek bir çözünürlükte bakteriyel profilleme elde etmek için yöntemler güncellemeleri gerektiren yardımcı olacaktır.

İki adımlı PCR ve Yeni Nesil 16S rRNA Gen Sıralaması Kullanarak Mikrobiyota Analizi

Mevcut protokol, farelerde lupus ilerlemesini izlemek için bir yöntem açıklamaktadır. Böbreklerde hücre infiltrasyonu ve protein birikimine bağlı lupus nefritini karakterize etmek için iki ek prosedür sunulmuştur.

Lupus Eğilimli MRL/lpr Farelerde Proteinüri, Lökositlerin Renal İnfiltrasyonu ve Proteinlerin Renal Birikimi Analizleri

Buradaki amaç, kardiyovasküler hastalıklarda dysbiosis mekanizmalarını araştırmak için bir protokolün ana hatlarını çizmektir. Bu yazıda, murin dışkı örneklerinin aseptik olarak nasıl toplanacağı ve nakledileceği, bağırsakların nasıl izole edileceği ve "Swiss-roll" yönteminin nasıl kullanılacağı, ardından gastrointestinal sistemdeki değişiklikleri sorgulamak için immün boyama teknikleri tartışılmaktadır.

Murin Fekal İzolasyonu ve Mikrobiyota Transplantasyonu

Bu protokol, steril koşulları korurken deneysel tek kafesli izolatörlere (izokafesler) mikropsuz fare transferi ve muhafazası için en iyi uygulamaları açıklar. Mikropsuz farelere dışkı nakli yöntemleri ve daha ileri uygulamalar için bu bağırsak "insanlaştırılmış" farelerden canlı bakterilerin toplanması tartışılmaktadır.

Mikropsuz Farelere İnsan Dışkı Nakli için Biyodışlama İzoPozitif Kafes Deneyinin Hazırlanması ve Sürdürülmesi

Keşfedin, lupus eğilimli fare modellerinde bağırsak mikrobiyota dinamiklerini analiz etmek için basit ve uygun maliyetli bir DNA izolasyon yöntemi. Bu yöntem, otoimmün hastalık araştırmalarında kullanılabilir.

Lupus Eğilimli Farelerde Fekal Mikrobiyota Dinamiğinin Basit, Uygun Maliyetli Bir DNA İzolasyon Yöntemi Kullanılarak Analizi

Daha fazla video keşfet