Name: Eksozom Tabanlı Dopamin Taşıyıcı Sistemin Formüle Edilmesi ve Karakterize Edilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Keşfedin, Wharton jelinden izole edilen mezenkimal kök hücrelerden elde edilen eksozomlara dopamin yükleyerek nörolojik hastalıklar için ilaç taşıyıcı sistemleri geliştirme yöntemini. Bu protokol sitotoksisite değerlendirmesi içerir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Çalışma, öncelikle Yıldız Teknik Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri (TSA-2021-4713) tarafından sağlanan araştırma fonu ile desteklenmiştir.

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm malzeme ve ekipmanlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
1. Wharton'un jöle mezenkimal kök hücrelerinin kültürlenmesi ve dondurularak saklanması
<ol><li>WJ-MSC'leri (ATCC'den) -80 °C dondurucudan çıkarın. Hücreleri,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş DMEM-F12 ortamı içeren bir şişeye tohumlayın. % 5 CO2 içeren bir inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>Kültür ortamını 2 günde bir değiştirin. Hücreleri% 80 birleşmeye ulaştıklarında geçirin. Geçirilecek hücreleri 5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. NOT: Tripsin eklemeden önce PBS ile yıkamak, hücrelerin şişe yüzeyinden kolayca ayrılmasını sağlar.</li>
	<li>PBS'yi çıkarın ve şişeye 5 mL tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin. Şişeyi% 5 CO2 içeren bir inkübatörde 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Süpernatanı tüpe toplayın ve 5 dakika boyunca 1.500 x g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı çıkarın ve pipetleme ile tüpe 1 mL DMEM-F12 +% 10 FBS ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri daha büyük bir şişeye aktarın ve yeterli eksozom elde edilene kadar DMEM-F12 +% 10 FBS ekleyerek kültüre devam edin35. NOT: Kültürlenmiş hücreler, dimetil sülfoksit (DMSO) ile 1 milyon/mL yoğunlukta dondurulur ve -80 °C'de saklanır.</li>
</ol>2. Wharton Jelly mezenkimal kök hücrelerinden eksozom üretimi
NOT: Eksozomlar, kültürlenmiş WJ-MSC'lerden izole edilir. Eksozom izolasyonu, hücreler şişe yüzeyini kapladığında ve yaklaşık% 80 yoğunluğa ulaştığında gerçekleştirilir.
<ol><li>% 10 FBS içeren süpernatan ortamı şişeden çıkarın ve hücreleri 5 mL PBS ile yıkayın. PBS ile duruladıktan sonra hücrelere serumsuz DMEM-F12 besiyeri ekleyin. Şişeleri %5 CO2 inkübatörde 37 °C'de 48 saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, serumsuz ortamı tüpte toplayın ve -20 ° C'de saklayın. NOT: Adım 2.1'de, 180 mL serumsuz ortam toplanır ve -20 °C'de saklanır. Çözüldükten sonra, aşağıda açıklandığı gibi bir toplu santrifüj işlemi başlatılır.</li>
	<li>Eksozomların izolasyonu<ol><li>Toplanan serumsuz ortamı 300 x g'da +4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice geri çekin ve başka bir tüpe aktarın.</li>
		<li>Toplanan süpernatanı 2.000 × g'da +4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice geri çekin ve başka bir tüpe aktarın.</li>
		<li>Toplanan süpernatanı +4 °C'de 30 dakika boyunca 10.000 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice geri çekin ve başka bir tüpe aktarın.</li>
		<li>Toplanan süpernatanı ultrasantrifüj tüplerine aktarın ve 130 dakika boyunca 110.000 × g'da ultrasantrifüje aktarın. Süpernatanı yavaşça çıkarın ve pelete 1 mL PBS ekleyin.</li>
		<li>Pelet ve ultrasantrifüjü 110.000 × g'da +4 °C'de 70 dakika vorteksleyin36 (Şekil 1). Süpernatanı yavaşça çıkarın ve pelete 1 mL PBS ekleyin. NOT: Ultrasantrifüj adımları tamamlandıktan sonra elde edilen eksozomlar -80 °C'de saklanabilir. Elde edilen pelet artık karakterizasyona hazırdır.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63624/63624fig01.jpg"> Şekil 1: Eksozom izolasyonu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63624/63624fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
3. Eksozomların karakterizasyonu
<ol><li>Nanopartikül İzleme Analizi (NTA) NOT: İzole edilen eksozomların boyutunu ve konsantrasyonunu belirlemek için nanopartikül izleme analizi yapılır. 1x PBS çözeltisi için kullanılan tabletler pH 7.3-7.5 aralığında olmalıdır. 1x PBS Çözeltisi 10 mM fosfat tamponu, 137 mM sodyum klorür ve 2.7 mM potasyum klorür içerir. Çözelti, 100 mL damıtılmış suya 1 PBS tablet eklenerek hazırlanır. Hazırlanan bu çözelti otoklavlama ile sterilize edilir.<ol><li>10 μL eksozoma 990 μL PBS ekleyerek eksozomları 100 kat seyreltin. Seyreltilmiş süspansiyonu tek kullanımlık bir şırıngaya alın.</li>
		<li>NTA aygıtını açın ve bilgisayarı bağlayın. Yazılımı açın.</li>
		<li>Şırıngadaki numuneyi cihazın kaset bölümündeki tüpe enjekte edin. Cihazın kaset kapağını kapatın.</li>
		<li>Açılan yazılımda, Analizi Başlat düğmesine tıklayın. Kaydet düğmesine basarak elde edilen sonuçları kaydedin.</li>
	</ol></li>
	<li>Dinamik ışık saçılımı analizi NOT: Zeta potansiyeli ve boyut ölçümü için izole edilen eksozomlar da NTA analizi ile aynı şekilde seyreltilir.<ol><li>20 μL eksozomlara 980 μL PBS ekleyin.</li>
		<li>Zeta boyutlandırma cihazını ve bağlı bilgisayarı açın. Yazılımı açın.</li>
		<li>Adım 3.2.1'deki süspansiyonu tek kullanımlık küvete ekleyin. Cihazın kapağını açın, küveti kasete yerleştirin ve kapağı kapatın.</li>
		<li>Cihazın yazılımında küvet tipini seçin. Zeta potansiyeli ve boyutsal analiz için Analizi Başlat butonuna tıklayınız. NOT: Analizler boyutsal analiz ve zeta potansiyeli için ayrı ayrı yapılır.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Eksozomlara dopamin yüklenmesi
NOT: WJ-MSC'lerin eksozomlarının karakterizasyonu tamamlandıktan sonra, ilaç salım sistemi olarak dopamin yüklü eksozomlar elde edildi. Eksozomlara ilaç yüklemesi inkübasyon yöntemi kullanılarak gerçekleştirilir.
<ol><li>Adım 2.2.5'ten eksozom süspansiyonuna 3 mL PBS ekleyin. Seyreltilmiş süspansiyonu 0.22 μm filtreler kullanarak filtreleyerek sterilize edin. 500 μL sterilize edilmiş eksozom süspansiyonunu başka bir tüpe aktarın.</li>
	<li>Damıtılmış su ile dopamin çözeltisi (0.5 mg / mL) hazırlayın. Eksozomları içeren tüplere 500 μL dopamin çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>Adım 4.2'de süspansiyona saponin ekleyin. Hazırlanan eksozom-dopamin süspansiyonunu 37 °C'de 24 saat inkübe edin. NOT: Saponin konsantrasyonu toplam çözeltinin% 0.002'sini geçmemelidir.</li>
	<li>Serbest dopamin ve saponini ortamdan uzaklaştırmak için süspansiyonu 70 dakika boyunca 90.000 × g'da ultrasantrifüjleyin. İzole edilmiş eksozomları daha fazla analiz için kullanılana kadar -20 °C'de saklayın37. NOT: Hazırlanan dopamin çözeltisinin stabilitesi için% 0.02 askorbik asit ekleyin.</li>
</ol>5. Dopamin yüklü eksozomların karakterizasyonu
<ol><li>Nanopartikül izleme analizi (NTA) NOT: İzole eksozomların boyutunu ve konsantrasyonunu belirlemek için nanopartikül izleme analizi yapılır.<ol><li>Eksozomları seyreltmek ve NTA gerçekleştirmek için 3.1.1-3.1.4 adımlarını izleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Dinamik ışık saçılımı analizi NOT: Zeta potansiyeli ve boyut ölçümü için izole edilen eksozomlar da NTA analizine benzer şekilde seyreltilir.<ol><li>Eksozomları seyreltmek ve dinamik ışık saçılımı analizi yapmak için 3.2.1-3.2.4 adımlarını izleyin. NOT: Her çözelti (saponin, dopamin, eksozom-dopamin) için boyut ve zeta potansiyelleri ayrı ayrı analiz edilir.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC)
NOT: Eksozomlara yüklenen dopamin miktarları, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) yöntemi ile ölçülür. Elde edilen formülasyonda dopamin varlığını tespit etmek için eksozomlar özel bir işlemle patlatılır.
<ol><li>Formülasyonu buharlaşması için 75 °C'lik bir ısıtıcıya koyun. Süspansiyona asetonitril (50:50 oranı) ekleyin ve girdap yapın. Çözeltiyi 10 dakika boyunca sonikleştirin.</li>
	<li>Çözeltiyi 10.000 × g'da 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı 0,22 μm'lik bir filtreden süzün.</li>
	<li>30 °C'de 1 mL/dk akış hızında (mobil faz H 2 O / asetonitril) birC18kolonu kullanarak tüm analitleri analiz edin. Absorbansı 230 nm38'de ölçün.</li>
</ol>7. İlaç yükleme kapasitesi (DL) ölçümü ve in vitro ilaç salım kinetiği
<ol><li>İlaç yükleme kapasitesi (DL) NOT: Eksozomlara yüklenen dopamin miktarı, UV-Vis spektroskopisi kullanılarak ölçülür. Absorbans 280 nm'de okunur. Sentez sırasında toplanan süpernatanlar, boşaltılmış ilaç miktarını ölçmek için kullanılır. Süpernatanttaki dopamin konsantrasyonu, dopamin için standart bir kalibrasyon eğrisi ile belirlenir.<ol><li>1 mg / mL dopamin içeren bir stok çözeltisi hazırlayın. Damıtılmış su kullanarak stok çözeltisinden 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 ve 0.5 mg / mL konsantrasyonları hazırlayın. NOT: Hazırlanan dopamin çözeltisinin stabilitesi için% 0.02 askorbik asit ekleyin.</li>
		<li>Bir UV-Spektrofotometrede 280 nm'de her bir dopamin dilüsyonunun absorbansını ölçerek standart bir kalibrasyon eğrisi oluşturun.</li>
		<li>Süpernatantın absorbansını 280 nm'de ölçün.</li>
		<li>Eq (1)39 kullanarak dopamin için ilaç yükleme kapasitesini hesaplayın. DL (%) = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63624/63624eq01.jpg" style="margin: auto;"> 100 (1) NOT: Analiz üç nüsha halinde gerçekleştirilir.</li>
	</ol></li>
	<li>İn vitro ilaç salım kinetiği NOT: Dopamin yüklü eksozomların ilaç salım kinetiği, bir diyaliz membranı kullanılarak gerçekleştirilir. PBS, pH 7.4, fizyolojik bir mikro ortamı simüle etmek için salım ortamı olarak kullanılır.<ol><li>Diyaliz membranına 1 mL dopamin yüklü eksozom ekleyin. Membranı bir behere yerleştirin. Behere 15 mL PBS ekleyin.</li>
		<li>0.5, 1, 2, 4, 6 ve 8 saatte bir beherde 1 mL salım ortamı örnekleyin. Her zaman noktasında, numunenin hacmini taze PBS ile değiştirin. Bir UV-Vis spektrometresi kullanarak 280 nm'de belirli aralıklarla alınan numuneleri analiz edin.</li>
		<li>Denklem (2)40 kullanarak sonuçları hesaplayın. Serbest bırakma (%) = <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63624/63624eq02.jpg" style="margin: auto;"> 100 (2) NOT: İn vitro ilaç salım kinetiğinin belirlenmesi için bir kalibrasyon eğrisi hazırlanır. Dopamin çözeltisi 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 ve 5.0 mg / mL konsantrasyonlarında hazırlanır. Her konsantrasyonun UV absorbans değeri, bir UV-Vis spektrofotometresi ile 280 nm'de belirlenir.</li>
	</ol></li>
</ol>8. İn vitro sitotoksisite testi
<ol><li>Fibroblastların canlandırılması ve kültürü<ol><li>Fibroblastları -80 °C dondurucudan çıkarın. Hücreleri DMEM-F12 +% 10 FBS içeren bir şişeye tohumlayın.</li>
		<li>Hücreleri% 5 CO2 içeren bir inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin. Kültür ortamını 2 günde bir değiştirin.</li>
		<li>Hücreleri% 80 birleşmeye ulaşana kadar geçirin. 1.3-1.5 adımlarını izleyin. 5 dakika boyunca 1.500 × g'da santrifüjlemeden sonra, süpernatanı çıkarın, 1 mL DMEM-F12 +% 10 FBS ekleyin ve 96 oyuklu bir plakada oyuk başına 10.000 hücre tohumlayın.<ol><li>DMEM-F12 ortamı +% 10 FBS ekleyin ve% 5 CO2 içeren bir inkübatörde hücreleri 18 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Kuluçka sonunda kuyuların ortamını değiştirin.</li>
		</ol></li>
		<li>Dopamin yüklü eksozom süspansiyonu stoğunu hazırlayın. 100 μL/mL, 250 μL/mL, 500 μL/mL ve 1.000 μL/mL konsantrasyonları elde etmek için dopamin yüklü eksozom formülasyonunu ortamla seyreltin.</li>
		<li>Hazırlanan konsantrasyonları 96 oyuklu plakanın her bir oyuğundaki hücrelere ekleyin. Plakaları 37 °C'de 18 saat boyunca %5 CO241 içeren bir inkübatörde inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>MTT hücre canlılık testi NOT: İnkübasyon sonunda MTT testi ile hücrelerin canlılık oranları belirlenir.<ol><li>MTT çözeltisini (5 mg / mL) PBS ile hazırlayın. Her kuyucuğa 10 μL MTT çözeltisi ekleyin. 37 °C'de 4 saat inkübe edin.</li>
		<li>İnkübasyonun sonunda, her bir oyuğa 100 μL DMSO ekleyin. Plakaları karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. ELISA okuyucusundaki absorbans değerlerini 570 nm42,43'te ölçün. NOT: MTT canlılık testi üç kopya halinde gerçekleştirilir.</li>
	</ol></li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

Eksozomlar, çoğu hücre tipi, örneğin MSC'ler1 tarafından salgılanan 40-200 nm boyutlarında küçük zar vezikülleridir. Hücreler arasındaki iletişimi sağlayabilen eksozomlar, hücrelere endositoz, fagositoz, mikropinositoz, lipid aracılı içselleştirme ve füzyon gibi farklı yollarla girebilirler33,44. Diğer nanotaşıyıcı sistemlerle karşılaştırıldığında, eksozom yüzeyinde bulunan lipitler ve kolesterol, hem hidrofilik hem de hidrofobik molekülle...

Eksozomlar, önemli özelliklere sahip biyoaktif veziküller, boyutları 40 nm ila 200 nm arasında değişir. Eksozomlar hücre zarından kaynaklanır ve endozomlarınsalınması nedeniyle oluşur 1. Bu yapılar hücreden hücreye iletişimciler olarak görev yapar ve aktif moleküllerin transferini kolaylaştırmak için komşu hücrelerle etkileşime girer. Eksozomlar birçok farklı kaynaktan izole edilebilir. Bunlar, plazma, idrar, beyin omurilik sıvısı, tükürük gibi vücut sıvılarının yanı sıra in vitro koşullar altında kültürlenen hücre dizilerini içerir. Eksozomlar, içerdikleri lipitler, proteinler ve nükleik asitler gibi biyomakromoleküller sayesinde sinir hasarının giderilmesinde önemli bir role sahiptir2. Sinir sisteminin3 destek hücreleri olan glia, proteinleri ve mikro RNA'ları eksozomlar4 aracılığıyla nöronların aksonlarına aktarır.
Sinir iletiminde karakteristik bir özellik olan miyelin kılıfını oluşturan lipitler de eksozomlar 4,5 aracılığıyla oligodendrositlerden salınır. Eksozomlar ayrıca sinaptik plastisite, nöronal stres tepkisi, hücre-hücre iletişimi ve beyindeki nörojenez gibi süreçlerde de rol oynar 6,7. Eksozomların nano boyutlara sahip olması, BBB'den geçmelerini sağlar. Bu zara nüfuz ettikten sonra interstisyel sıvıdan beyin omurilik sıvısına özel bir geçiş yolu vardır8. Eksozomlar, yüzey özellikleri sayesinde bir ilaç dağıtım sistemi olarak hedef hücrelerle verimli bir şekilde etkileşime girebilir ve yüklenen ilaçları aktif olarak iletebilir.
Eksozomların yüzeyindeki çeşitli yapışkan proteinlerin (tetraspaninler ve integrinler) ekspresyonu nedeniyle, bu hücre dışı veziküller, konakçı hücre zarları ile kolayca etkileşime girebilir ve kaynaşabilir9. Eksozomların BBB'ye nüfuz edebilme yetenekleri ve yüzey özellikleri nedeniyle özellikle merkezi sinir sistemi hastalıklarının tedavisinde ilaç taşıyıcı sistem olarak kullanılabileceği düşünülmektedir. Mezenkimal kök hücre (MSC) kaynaklı eksozomlar, allojenik hücresel tedavilere kıyasla daha düşük immün reddi riskine sahiptir ve bu açıdan hücresiz tedavi uygulamalarının önemli bir bileşeni olabilirler10.
Dopamin, beyindeki eksikliği Parkinson hastalığının (PH) karakteristik özelliği olan ve her geçen gün kötüleşen bir moleküldür11,12,13. PH'nin mezensefalonun substantia nigra'sındaki dopaminerjik nöronların dejenerasyonu ve motor nöron fonksiyonlarının kaybı ile ilişkili olduğu bilinmektedir14,15. Dopaminerjik nöronların ölümü, nörotransmitter dopaminin beyin striatumuna beslenmesini engeller. Bu da PH'ye özgü semptomların ortaya çıkmasına neden olur16. PH'nin bu semptomları bradikinezi, postüral instabilite, rijidite ve özellikle istirahat tremorudur12,13. PH ilk kez iki yüzyıldan daha uzun bir süre önce tanımlanmış olmasına rağmen, hastalığın patolojisini ve etiyolojisini anlamaya yönelik çalışmalar halen devam etmektedir ve günümüzde PH'nin kompleks bir sistemik hastalık olduğu kabul edilmektedir17. Dopamin eksikliğinin ortaya çıktığı ve nöronların %80'inden fazlasının dejenere olduğu klinik PD semptomlarının gözlendiği öngörülmektedir18. Hastalığın tedavisinde motor semptomları azaltmak için eksik dopamin takviyesi tercih edilir. İn vivo çalışmalar, dopaminin beyne doğrudan infüzyonunun hayvanlarda semptomları önemli ölçüde azalttığını göstermiştir19. Klinikte L-DOPA (L-3,4-dihidroksifenilalanin) gibi dopamin öncülleri ve dopamin reseptör ilaçları kullanılmaktadır çünkü insanlarda dopaminin beyne doğrudan infüzyonu mümkün değildir ve sisteme giren dopamin BBB20'yi geçemez. Bu tür ilaçlar zamanla etkinliğini yitirir. Bununla birlikte, PH için hala küratif bir tedavi yaklaşımı yoktur. Bu nedenle, hastalığın patofizyolojisini ortaya koymak ve PH'nin hastalar üzerindeki etkisini azaltmak için yeni terapötik stratejiler ve tedavi modaliteleri geliştirmeye büyük ihtiyaç vardır.
Eksozom temelli çalışmalar son zamanlarda sinir sistemi hastalıklarının hem terapötik yaklaşımları hem de patolojileri hakkında bilgi toplamak açısından dikkat çekmektedir. MSC kaynaklı eksozomların sinir hasarında inflamasyonu azalttığı ve nöronal rejenerasyona katkıda bulunduğu gösterilmiştir21,22,23. Ayrıca MSC kaynaklı eksozom sekretomlarının özellikle dopaminerjik nöronlar üzerinde nörotrofik ve nöroprotektif etkiler göstererek apoptozu azalttığı bildirilmiştir24,25. Eksozomların terapötik ilaç taşıyıcı sistem olarak kullanıldığı platformlar üzerine yapılan araştırmalar son yıllarda yoğun bir şekilde hızlanmıştır. Çok sayıda çalışmada, ilgili ilaçların eksozomlara kolayca kapsüllenebildiği ve hedef hücrelere, dokulara ve organlara güvenli bir şekilde verilebildiği gözlemlenmiştir26,27. Eksozomlara ilaç yüklemesi için inkübasyon, donma/çözülme döngüleri, sonikasyon ve ekstrüzyon gibi farklı yöntemlerkullanılabilir 28.
Eksozomlar veya eksozom benzeri veziküllerle çakışma, lipofilik küçük moleküllerin bu dağıtım sistemlerine pasif olarak kapsüllenmesine izin verir28,29,30. Özellikle, kurkumin 31, katalaz30, doksorubisin32 ve paklitaksel33 gibi çeşitli moleküller eksozomlara etkili bir şekilde yüklendi. Antioksidan aktiviteye sahip olan katalaz içeren eksozomların beyindeki nöronlarda ve mikroglial hücrelerde verimli bir şekilde biriktiği ve güçlü nöroprotektif aktiviteler sergilediği gözlemlenmiştir30. Aynı çalışmada, yükleme verimliliğini artırmak için kompleks içine eklenen saponinin, inkübasyon sırasında ilaç yükleme yüzdesini arttırdığı bulunmuştur30,34. Bununla birlikte, eksozomlara ilaç yüklemesi için standartları oluşturmak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.
Bu makale, dopaminin WJ-MSC'lerden izole edilen eksozomlara kapsüllenmesiyle bir nanotaşıyıcı sistemin geliştirilmesini açıklamaktadır. WJ-MSC'lerin kültivasyonu, eksozomların izolasyonu ve karakterizasyonu, ilaç yükleme deneyleri, dopamin yüklü eksozomların çeşitli tekniklerle karakterizasyonu ve in vitro sitotoksisite analizi dahil olmak üzere tüm adımlar ayrıntılı olarak anlatılmaktadır.

<table><tbody><tr><td>0.22 ve mikro; m membran filtre</td><td>Aisimo</td><td></td><td>Sterilizasyon işlemi için kullanılan</td></tr><tr><td>0.45 & m şırınga filtresi</td><td>Aisimo</td><td></td><td>Sterilizasyon işlemi için kullanılır</td></tr><tr><td>15 mL Falcon tüp</td><td>Yuvası</td><td></td><td>Hücre kültürü adımında kullanılır</td></tr><tr><td>25 cm2 hücre kültürü şişeleri (Falcon, TPP doku kültürü şişeleri</td><td>Nest</td><td></td><td>Hücre kültürü adımında kullanılır</td></tr><tr><td>50 mL Falcon tüp</td><td>Yuvası</td><td></td><td>Hücre kültürü adımında kullanılır</td></tr><tr><td>75 cm2 hücre kültürü şişeleri (Falcon, TPP doku kültürü şişeleri</td><td>Yuva</td><td></td><td>Hücre kültürü adımında kullanılan</td></tr><tr><td>96 kuyulu plakalar (Falcon, TPP mikroplakalar)</td><td>Merck Millipore</td><td></td><td>Hücre kültürü adımında kullanılır</td></tr><tr><td>Asetonitril</td><td>Sigma</td><td>271004-1L</td><td>HPLC analizi için kullanılır</td></tr><tr><td>Otoklav</td><td>NUVE-OT 90L</td><td></td><td>Sterilizasyon işlemi için kullanılır</td></tr><tr><td>Hücre Kültür Kabini</td><td>Hera Safe KS</td><td></td><td>Hücre kültürü işlemi için kullanılır</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Hitachi</td><td>CF16RN</td> Safe Cell UV <td></td></tr><tr><td></td><td></td> Panasonic ile eksozom izolasyon adımında<td>CO2 inkübatörde</td> kullanılır <td>Hücre kültürü işlemi için kullanılır</td></tr><tr><td>Dopamin hidroklorür H8502-10G</td><td>Sigma</td><td>H8502-10G</td><td>Eksozom dopamin yüklemesinde kullanılır</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium/Nutrient Mix-F12</td><td>Sigma</td><td>RNBJ7249</td><td>Hücre kültürü ortamı olarak kullanılan</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu-FBS</td><td>Capricorn</td><td>FBS-16A</td><td>hücre kültürü ortamına eklenerek kullanılmıştır.</td></tr><tr><td>Dondurucu -80 ° C; C</td><td>Panasonic</td><td>MDF-U5386S-PE</td><td>Hücreleri ve elde edilen eksozomları depolamak için</td></tr><tr><td>Buzdolabı</td><td>Panasonic</td><td>MPR-215-PE</td><td>Hücre kültürü ve diğer malzemeleri depolamak için kullanılır</td></tr><tr><td>Yüksek performanslı sıvı kromatografisi-HPLC</td><td>Agilent Teknolojileri</td><td></td><td>Elde edilen formülasyonun içeriğinden dopamin varlığı araştırıldı.</td></tr><tr><td>Mikroskop- Primovert</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Hücre kültüründeki hücreleri gözlemlemek için kullanılır.</td></tr><tr><td>MTT Testi</td><td>Biomatik</td><td></td><td>Hücre canlılığını ölçmek için kullanılır</td></tr><tr><td>NanoSight NS300</td><td>Malvern panalitik</td><td>Malvern panalitik</td><td>Eksozom karakterizasyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>Optima XPN-100 Ultrasantrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Eksozom izolasyon adımında kullanılır</td></tr><tr><td>PBS tablet</td><td>Biomatik</td><td>43602</td><td>PBS çözeltisinin hazırlanmasında</td></tr><tr><td>Penicilin/ Streptomisin Çözeltisi</td><td>Capricorn</td><td>PB-S</td><td>hücre kültüründe kontaminasyonu önlemek için besiyerine ilave edildi.</td></tr><tr><td>Pipet Yardımı</td><td>Isolab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hassas terazi-Kern</td><td>Kern-ABJ220-4NM</td><td></td><td>Çözeltilerin hazırlanmasında kullanılan</td></tr><tr><td>Q500 Sonicator</td><td>Qsonica, LLC</td><td></td><td>HPLC analizinde eksozomları sindirmek için kullanılan</td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma</td><td>47036-50G-F</td><td>eksozom dopamin yükleme işleminde toplam çözeltiye eklenerek kullanılmıştır.</td></tr><tr><td>Spektrostar-Nano-Spektrofotometri</td><td>BMG LABTECH</td><td></td><td>MTT ve ilaç salım analizleri için kullanılır</td></tr><tr><td>SPSS 22</td><td></td><td></td><td>istatistik paket programı</td></tr><tr><td>Vorteks-FinePCR</td><td>FinePCR-FineVortex</td><td></td><td>Çözeltileri homojen bir şekilde karıştırmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Su Banyosu 37 ve derece; C-Senova</td><td>Senova</td><td></td><td>Hücre kültürü basamağında kullanılan</td></tr><tr><td>Wharton' s jöle mezenkimal kök hücreler</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZetaSizer</td><td>Malvern Nano ZS</td><td>Malvern Nano ZS</td><td>Eksozom karakterizasyonu için kullanılır</td></tr></tbody></table>

eksozom tabanlı dopamin taşıyıcı sistemin formüle edilmesi ve karakterize edilmesi

Formulating and Characterizing an Exosome-based Dopamine Carrier System

Boyutları 40 ila 200 nm arasındaki eksozomlar, hücre dışı veziküllerin en küçük alt grubunu oluşturur. Hücreler tarafından salgılanan bu biyoaktif kesecikler, hücreler arası kargo ve iletişimde etkin rol oynar. Eksozomlar çoğunlukla plazma, beyin omurilik sıvısı, idrar, tükürük, amniyon sıvısı, kolostrum, anne sütü, eklem sıvısı, meni ve plevral asit gibi vücut sıvılarında bulunur. Eksozomların büyüklükleri göz önüne alındığında, kan-beyin bariyerini (BBB) geçebildikleri için merkezi sinir sistemi hastalıklarında önemli rol oynayabilecekleri düşünülmektedir. Bu nedenle, bu çalışma, dopamini Wharton'un jöle mezenkimal kök hücrelerinden (WJ-MSC'ler) izole edilen eksozomlara kapsülleyerek eksozom tabanlı bir nanotaşıyıcı sistem geliştirmeyi amaçladı. Karakterizasyon sürecinden geçen eksozomlar dopamin ile inkübe edildi. Dopamin yüklü eksozomlar, inkübasyonun sonunda yeniden karakterize edildi. Dopamin yüklü eksozomlar, ilaç salınımı ve sitotoksisite deneylerinde araştırıldı. Sonuçlar, dopaminin eksozomlar içinde başarılı bir şekilde kapsüllenebildiğini ve dopamin yüklü eksozomların fibroblast canlılığını etkilemediğini gösterdi.

Eksozom izolasyonu ve karakterizasyonu Wharton jöle kök hücreleri kültürlenir ve kültür yeterli yoğunluğa ulaştığında 48 saat boyunca serumsuz bir ortamda inkübe edilir. İnkübasyonun bitiminden sonra, süpernatan -20 ° C'de saklanır. Toplanan süpernatanlar PBS ile seyreltilir ve ultrasantrifüjlemeye tabi tutulur (Şekil 1). Elde edilen çözelti NTA ve DLS analizleri ile analiz edilmiştir. Eksozomlar 0.22 μm'lik bir filtreden geçirilerek sterilize edilir. Elde edilen eksozom...

Bu çalışmada, Wharton'un jöle mezenkimal kök hücrelerinden izole edilen kök hücrelerin eksozomlarının dopamin yüklemesi ile bir formülasyon elde etmeyi amaçladık. Eksozom izolasyonu ve karakterizasyonu, elde edilen eksozomlara ilaç yüklemesi ve geliştirilen formülasyonun sitotoksik aktivitesi bu protokolde tanımlanmıştır.

Eksozom Tabanlı Dopamin Taşıyıcı Sistemin Formüle Edilmesi ve Karakterize Edilmesi

Exosomes between 40 and 200 nm in size constitute the smallest subgroup of extracellular vesicles. These bioactive vesicles secreted by cells play an ...

Eksozomlar, 14 ila 200 nanometre büyüklüğündeki bir hücre tarafından salgılanan veziküllere reaksiyona girebilir ve hücre dışı veziküllerin en küçük alt grubuna gelen hücre içi kargo ve iletişimden ayrılabilir. Endozomun farklılaşması sonucu oluşan eksozomlar hücre zarından köken alırlar. Kök hücreler, kemik iliği veya yağ dokuları gibi farklı kaynaklardan izole edilebilir.ancak yetişkin dokusunda kurutulmuş kök hücrelerin immünojenik potansiyelinin daha yüksek olduğu Eksozomların büyüklüğü nedeniyle, kan beyin bariyerine geçebildiği için merkezi sinir sistemi hastalıklarında önemli bir rol oynadığı söyleniyor. Başlamak için, tohumlanmış Wharton'un jöle mezenkimal kök hücrelerini beş mililitre PBS ile yıkayın. Ardından, şişeyi bir inkübatöre yerleştirmeden önce beş mililitre tripsin EDTA çözeltisi ekleyin.İnkübasyondan sonra, hücreleri toplayın ve beş dakika boyunca 1.500 G'de santrifüjleyin. Daha sonra süpernatanı çıkarın ve% 10 FBS içeren bir mililitre DMEM-F12 tüpe ekleyin. Kültürlenmiş hücreleri PBS ile yıkayın.Yıkadıktan sonra, hücrelere serum içermeyen DMEM-F12 besiyeri ekleyin ve inkübatöre yerleştirin. Eksozomları izole etmek için, serum içermeyen ortamı toplayın ve 10 dakika boyunca dört santigrat derecede 300 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı başka bir tüpe aktarın ve daha yüksek hızlarda seri santrifüjleme ile işleyin.Son santrifüjlemeden sonra, süpernatanı yavaşça çıkarın ve peleti bir mililitre PBS'de çözün. Vorteksleme ile karıştırın ve dört santigrat derecede 70 dakika boyunca 110.000 G'de ultrasantrifüjlemeye devam edin. Daha önce ultrasantrifüjleme ile toplanan eksozom süspansiyonuna üç mililitre PBS ekleyin ve seyreltilmiş süspansiyonu 0.22 mikronluk bir filtre kullanarak filtreleyerek sterilize edin.Daha sonra 500 mikrolitre sterilize edilmiş eksozom süspansiyonunu başka bir tüpe aktarın. Daha sonra sırayla, sterilize edilmiş süspansiyona mililitre dopamin çözeltisi ve saponin başına 500 mikrolitre 0.5 miligram ekleyin. İnkübasyondan sonra süspansiyonu ultrasantrifüjleyin.Numune, dopamin yüklü eksozomları karakterize etmek için NTA ve DLS analizi için kullanılabilir veya daha fazla kullanıma kadar eksi 20 santigrat derecede saklanabilir. NTA analizinde Wharton jöle türevi eksozomların ortalama büyüklüğü 98 nanometre, dopamin yüklü eksozomların ise 110 nanometre olduğu belirlenmiştir. NTA ve DLS analizleri ile ortaya çıkan nanopartikül sayıları birbirleri ile tutarlıydı.Wharton jöle türevi eksozomların zeta potansiyeli eksi 15.7, dopamin yüklü eksozomların ise eksi 17.6 milivolt olarak ölçülmüştür. Dopamin yüklü eksozomların HPLC analizi, dopamin için zirveyi 6.45 dakikada tespit etti. Kümülatif ilaç salım profili, kapsüllenmiş dopaminin% 74.8'inin ilk sekiz saat içinde eksozomlardan salındığını ortaya koydu.Fibroblastlar üzerindeki dopamin yüklü ve serbest eksozomların sitotoksisitesi araştırıldı. Dopamin yüklü eksozomlar herhangi bir sitotoksik etki göstermese de, saponin fibroblast canlılığını azalttı. MTT testi, fibroblastlar dopamin yüklü eksozomlarla tedavi edildiğinde hücre canlılığının arttığını gösterdi.Sonuçların istatistiksel anlamlılığı tek yönlü varyans analizi yapılarak değerlendirildi. Ek olarak, farklı konsantrasyonlarda serbest eksozomların fibroblastlar üzerindeki sitotoksik etkileri araştırıldı. Fibroblast canlılığı, mililitre başına 25 mikrolitre konsantrasyonda serbest eksozomlarla daha yüksekti.Merkezi sinir sistemi için hasta boyutları, plastisite, nöro yanıt, yan yana iletişim ve beyindeki nörojenez gibi süreçlerde rol oynaması gerçekten önemlidir. Buna ek olarak, eksozomların yüzeyi sayesinde, hedef hücre ilacı ile etkileşime girebildikleri ve ilaç sırasında verilen aktivitenin tamamlandığı gözlemlenmiştir. Çalışmada ilk kez, dopamini kök hücre kaynaklı eksozomlara kapsülleyerek yeni bir ilaç formülasyonu geliştirdik.Bu formülasyonun Parkinson hastalığının tedavisi için çok umut verici olacağını öne sürdü.

formulating-characterizing-an-exosome-based-dopamine-carrier

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Amperometrik tekniği spontan dopamin oksitlenmeye tarafından üretilen oksidatif akımı algılayarak tek bir hücreden dopamin salınımını ölçer. Eşzamanlı gerilim kelepçe ve amperometri metodolojisi dopamin taşıyıcısı ve dopamin ters taşıma Bu faaliyetin düzenleyici rolünün genel "faaliyet" arasındaki mekanistik ilişki bulunmaktadır.

Eşzamanlı Gerilim-kelepçe ve Amperometri ile Dopamin Film Tek Hücre Ölçümü

Kaynak: Yavuz, B., et al. Eksozom Bazlı Dopamin Taşıyıcı Sistemin Formüle Edilmesi ve Karakterize Edilmesi. J. Vis. Uzm. (2022)Bu video, eksozomlar içinde dopamin kapsüllemesini geliştirmek için saponin kaynaklı zar geçirgenliğine odaklanan dopamin yüklü eksozomların formülasyonunu göstermektedir.

Dopamin Yüklü Bir Eksozom Taşıyıcı Sisteminin Formüle Edilmesi 

Bu protokolün amacı, amfifilik blok kopolimerlerden oluşan misel ilaç taşıyıcı sistemlerde fiziksel olarak hapsolmuş, suda az çözünür ilaçların hazırlanmasını ve karakterizasyonunu tanımlamaktır.

Hazırlanması ve Bireysel Karakterizasyonu ve Multi-ilaç Fiziksel, polimerik misellerin Entrapped Loaded

Lipofilik doksorubisin ön-ilacın hazırlanması ve tanımlanması için bir protokol, 1,2-distearoil, sn -glisero-3-phosphoethanolamine- N yüklü - [amino (polietilen glikol) -2000] (DSPE-PEG) miseller anlatılmıştır.

Lipofilik Doksorubisin Pro-ilaç misellerin Hazırlanması ve Karakterizasyonu

Bir sıvı kristal nanopartikül (LCNP) nanocarrier canlı hücrelerin plazma zarına bir hidrofobik yük sürekli verilme için uygun bir araç olarak kullanılarak.

Sıvı Kristal Nanopartikül Carrier bir Hidrofobik Kargo Encapsulated, hedeflenen Plazma Zarı Teslimat

Bu makalede falcarindiol lipid kaplı 74 nm nano tanecikleri encapsulation. Nano tanecikleri lipid damlacıkları içine insan kök hücreleri tarafından hücresel alımını floresan ve confocal görüntüleme tarafından izlenir. Nano tanecikleri değişen solvent hızlı enjeksiyon yöntemiyle cihazlarında ve büyüklükleri dinamik ışık saçılma tekniği ile ölçülür.

Falcarindiol tarafından insan mezenkimal kök hücre içeren yeni Lipid kaplı nano tanecikleri alımını

Burada, aynı biyolojik kökeni ve doğal hücre dışı veziküllerin (EV'ler) benzer yapısını, morfolojisini ve protein bileşimini paylaşan yeni bir tür eksozom taklitleri (EM'ler) olarak endozomdan türetilmiş nanoveziküllerin büyük ölçekli üretimi için manyetik ayırma destekli yüksek hızlı bir homojenizasyon yöntemini açıklıyoruz.

Endozom kaynaklı veziküllerin büyük ölçekli üretimi için manyetik ayırma destekli yüksek hızlı homojenizasyon yöntemi

Eksozomlar önemli klinik potansiyele sahiptir, ancak kolay in vivo klerens ve zayıf stabilite nedeniyle pratik uygulamaları sınırlıdır. Mikroiğneler, fizyolojik engelleri delerek ve kuru halde koruma sağlayarak lokalize uygulamayı mümkün kılarak, böylece eksozom uygulamasının sınırlamalarını ele alarak ve klinik faydalarını genişleterek bir çözüm sunar.

Eksozomların yüklenmesi ve teslimi için mikroiğne yamalarının üretimi ve karakterizasyonu

Hücre dışı veziküllerin (EV'ler) terapötik uygulaması, kanser tedavisinde ve ilaç dağıtımında devrim yaratma potansiyeline sahiptir. İyon değişim kromatografisi kullanılarak izole edilen kimerik antijen reseptörü (CAR) hücresinden türetilen EV'ler (CAR-EV'ler), artan kargo kapasitesi sergileyerek fonksiyonel etkinliklerini önemli ölçüde artırır. Bu çalışma ayrıca biyolojik aktivitelerini ve terapötik potansiyellerini aydınlatmak için CAR-EV'leri karakterize etmektedir.

Kimerik Antijen Reseptörü-Hücre Dışı Veziküller (CAR-EV) Teknolojisinin Geliştirilmesi: Kanser Tedavisinin Geleceği

Biyofilmlerin çevreleriyle karmaşık etkileşimleri vardır. Biyofilm-çevre etkileşimlerini kapsamlı bir şekilde araştırmak için, burada biyofilm gelişimi için heterojen kimyasal ortam oluşturmak, yerel akış hızını ölçmek ve biyofilm kolonileri içinde ve çevresinde kütle taşınmasını analiz etmek için bir dizi yöntem sunuyoruz.

Biyofilm ve Habitat Heterojen Eş-geliştirme karakterize Yöntemleri

Keşfedin, Wharton jelinden izole edilen mezenkimal kök hücrelerden elde edilen eksozomlara dopamin yükleyerek nörolojik hastalıklar için ilaç taşıyıcı sistemleri geliştirme yöntemini. Bu protokol sitotoksisite değerlendirmesi içerir.

Eksozom Tabanlı Dopamin Taşıyıcı Sistemin Formüle Edilmesi ve Karakterize Edilmesi

Daha fazla video keşfet