Eksozom Tabanlı Dopamin Taşıyıcı Sistemin Formüle Edilmesi ve Karakterize Edilmesi
4 Nisan 2022
Bu çalışmada, Wharton'un jöle mezenkimal kök hücrelerinden izole edilen kök hücrelerin eksozomlarının dopamin yüklemesi ile bir formülasyon elde etmeyi amaçladık. Eksozom izolasyonu ve karakterizasyonu, elde edilen eksozomlara ilaç yüklemesi ve geliştirilen formülasyonun sitotoksik aktivitesi bu protokolde tanımlanmıştır.
Eksozomlar, 14 ila 200 nanometre büyüklüğündeki bir hücre tarafından salgılanan veziküllere reaksiyona girebilir ve hücre dışı veziküllerin en küçük alt grubuna gelen hücre içi kargo ve iletişimden ayrılabilir. Endozomun farklılaşması sonucu oluşan eksozomlar hücre zarından köken alırlar. Kök hücreler, kemik iliği veya yağ dokuları gibi farklı kaynaklardan izole edilebilir.
ancak yetişkin dokusunda kurutulmuş kök hücrelerin immünojenik potansiyelinin daha yüksek olduğu Eksozomların büyüklüğü nedeniyle, kan beyin bariyerine geçebildiği için merkezi sinir sistemi hastalıklarında önemli bir rol oynadığı söyleniyor. Başlamak için, tohumlanmış Wharton'un jöle mezenkimal kök hücrelerini beş mililitre PBS ile yıkayın. Ardından, şişeyi bir inkübatöre yerleştirmeden önce beş mililitre tripsin EDTA çözeltisi ekleyin.
İnkübasyondan sonra, hücreleri toplayın ve beş dakika boyunca 1.500 G'de santrifüjleyin. Daha sonra süpernatanı çıkarın ve% 10 FBS içeren bir mililitre DMEM-F12 tüpe ekleyin. Kültürlenmiş hücreleri PBS ile yıkayın.
Yıkadıktan sonra, hücrelere serum içermeyen DMEM-F12 besiyeri ekleyin ve inkübatöre yerleştirin. Eksozomları izole etmek için, serum içermeyen ortamı toplayın ve 10 dakika boyunca dört santigrat derecede 300 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı başka bir tüpe aktarın ve daha yüksek hızlarda seri santrifüjleme ile işleyin.
Son santrifüjlemeden sonra, süpernatanı yavaşça çıkarın ve peleti bir mililitre PBS'de çözün. Vorteksleme ile karıştırın ve dört santigrat derecede 70 dakika boyunca 110.000 G'de ultrasantrifüjlemeye devam edin. Daha önce ultrasantrifüjleme ile toplanan eksozom süspansiyonuna üç mililitre PBS ekleyin ve seyreltilmiş süspansiyonu 0.22 mikronluk bir filtre kullanarak filtreleyerek sterilize edin.
Daha sonra 500 mikrolitre sterilize edilmiş eksozom süspansiyonunu başka bir tüpe aktarın. Daha sonra sırayla, sterilize edilmiş süspansiyona mililitre dopamin çözeltisi ve saponin başına 500 mikrolitre 0.5 miligram ekleyin. İnkübasyondan sonra süspansiyonu ultrasantrifüjleyin.
Numune, dopamin yüklü eksozomları karakterize etmek için NTA ve DLS analizi için kullanılabilir veya daha fazla kullanıma kadar eksi 20 santigrat derecede saklanabilir. NTA analizinde Wharton jöle türevi eksozomların ortalama büyüklüğü 98 nanometre, dopamin yüklü eksozomların ise 110 nanometre olduğu belirlenmiştir. NTA ve DLS analizleri ile ortaya çıkan nanopartikül sayıları birbirleri ile tutarlıydı.
Wharton jöle türevi eksozomların zeta potansiyeli eksi 15.7, dopamin yüklü eksozomların ise eksi 17.6 milivolt olarak ölçülmüştür. Dopamin yüklü eksozomların HPLC analizi, dopamin için zirveyi 6.45 dakikada tespit etti. Kümülatif ilaç salım profili, kapsüllenmiş dopaminin% 74.8'inin ilk sekiz saat içinde eksozomlardan salındığını ortaya koydu.
Fibroblastlar üzerindeki dopamin yüklü ve serbest eksozomların sitotoksisitesi araştırıldı. Dopamin yüklü eksozomlar herhangi bir sitotoksik etki göstermese de, saponin fibroblast canlılığını azalttı. MTT testi, fibroblastlar dopamin yüklü eksozomlarla tedavi edildiğinde hücre canlılığının arttığını gösterdi.
Sonuçların istatistiksel anlamlılığı tek yönlü varyans analizi yapılarak değerlendirildi. Ek olarak, farklı konsantrasyonlarda serbest eksozomların fibroblastlar üzerindeki sitotoksik etkileri araştırıldı. Fibroblast canlılığı, mililitre başına 25 mikrolitre konsantrasyonda serbest eksozomlarla daha yüksekti.
Merkezi sinir sistemi için hasta boyutları, plastisite, nöro yanıt, yan yana iletişim ve beyindeki nörojenez gibi süreçlerde rol oynaması gerçekten önemlidir. Buna ek olarak, eksozomların yüzeyi sayesinde, hedef hücre ilacı ile etkileşime girebildikleri ve ilaç sırasında verilen aktivitenin tamamlandığı gözlemlenmiştir. Çalışmada ilk kez, dopamini kök hücre kaynaklı eksozomlara kapsülleyerek yeni bir ilaç formülasyonu geliştirdik.
Bu formülasyonun Parkinson hastalığının tedavisi için çok umut verici olacağını öne sürdü.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, Wharton'un jeli mezenkimal kök hücrelerinden türetilmiş dopamin yüklü ekzosomların formülasyonuna odaklanmaktadır. Protokol, ekzosomların izolasyonunu ve karakterizasyonunu, ilaç yüklemesini ve sitotoksik aktivitenin değerlendirilmesini detaylandırmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Kök Hücre Araştırmaları
- İlaç Taşıma Sistemleri
Arka Plan
- Ekzosomlar, hücre içi iletişimde rol oynayan küçük hücre dışı veziküllerdir.
- Merkezi sinir sistemindeki süreçler de dahil olmak üzere çeşitli biyolojik süreçlerde önemli bir rol oynamaktadırlar.
- Wharton'un jeli mezenkimal kök hücreleri, ekzosom izolasyonu için umut verici bir kaynaktır.
- Ekzosomlar kan-beyin bariyerini geçebilirler, bu da onları terapötik uygulamalar için değerli kılar.
Çalışmanın Amacı
- Dopamin yüklü ekzosomlar kullanarak bir formülasyon geliştirmek.
- Geliştirilen formülasyonun sitotoksik etkilerini araştırmak.
- Ekzosom temelli ilaç taşıma sistemlerine olan anlayışı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Wharton'un jeli mezenkimal kök hücrelerinin izolasyonu.
- İzole edilen ekzosomların karakterizasyonu.
- Dopaminin ekzosomlara yüklenmesi.
- Formülasyonun sitotoksik aktivitesinin değerlendirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Ekzosomların başarılı bir şekilde izolasyonu ve karakterizasyonu.
- Ekzosomlara dopaminin etkili bir şekilde yüklenmesi.
- Değerlendirilmesi, formülasyonun potansiyelini gösteren sitotoksik etkiler.
- Bulgular, ilaç taşıma uygulamalarında ekzosom kullanımını desteklemektedir.
Sonuçlar
- Dopamin yüklü ekzosomlar tedavi amaçlı kullanım için umut vaat etmektedir.
- Çalışma, ekzosom temelli ilaç taşıma araştırmaları için bir protokol sunmaktadır.
- Bu yaklaşımın tam potansiyelini keşfetmek için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Exosome-based nanocarriers offer a promising platform for delivering small molecules across the blood-brain barrier, addressing a critical challenge in CNS drug development. The encapsulation and characterization of dopamine within stem cell-derived exosomes demonstrates a reproducible workflow for evaluating drug delivery vehicles in early discovery. This approach supports predictive confidence in translational neuroscience portfolios by enabling quantitative assessment of carrier efficacy and cytotoxicity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of exosome-mediated delivery mechanisms for CNS-targeted therapeutics.
- Supports biological de-risking by quantifying encapsulation efficiency and release kinetics.
- Facilitates functional validation of carrier systems using cytotoxicity and viability assays.
Screening & Assay Development
- Provides standardized protocols for exosome isolation, drug loading, and nanoparticle characterization.
- Delivers quantitative outputs via NTA, DLS, zeta potential, and HPLC analyses.
- Enables reproducible assessment of drug release profiles and cytotoxicity in vitro.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by leveraging exosomes' ability to cross the blood-brain barrier.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation through quantitative release and viability data.
- Reduces mechanistic ambiguity in CNS drug delivery strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This exosome-based carrier system fits within the early discovery to preclinical continuum, enabling iterative optimization before lead identification.
- Discovery Biology: Quantitative encapsulation and release data inform hypothesis testing for CNS delivery.
- Screening: Standardized nanoparticle and cytotoxicity assays support assay readiness and reproducibility.
- Analytics: HPLC and particle analysis provide robust comparative metrics for formulation assessment.
- Translational Research: Exosome-mediated delivery supports biomarker alignment and preclinical model relevance.
- Enterprise Reuse: The workflow is adaptable for other small molecule or biologic payloads in CNS research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in CNS-targeted delivery systems.
- Operational Value: Standardizes exosome isolation, loading, and characterization for scalable workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions for novel carrier platforms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of CNS delivery strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanoparticle isolation, characterization, and analytical chemistry.
- Needs access to ultracentrifugation, NTA, DLS, and HPLC instrumentation.
- Demands cross-team standardization of exosome preparation and assay protocols.
- Adaptable to various stem cell sources and small molecule payloads.
- Release kinetics and cytotoxicity must be validated for each new formulation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:56
Culturing and Cryopreservation of Wharton's Jelly Mesenchymal Stem Cells
1:30
Production of Exosomes from Wharton's Jelly Mesenchymal Stem Cells
2:20
Dopamine Loading into Exosomes and Characterization of Dopamine Loaded Exosomes
3:15
Results: Development of a Nanocarrier System by Encapsulation of Dopamine into Exosomes Isolated from WJ‐MSCs
5:07
Conclusion
