Kırmızı Kan Hücrelerinin Viskoelastik Özelliklerinin Optik Cımbız ve Bulanıklaştırma Mikroskobu Kullanılarak Kantitatif Analizi
25 Mart 2022
Burada, hücrelerin reolojik özelliklerini ölçmek için optik cımbız ve defokus mikroskobuna dayanan entegre bir protokol açıklanmaktadır. Bu protokol, değişken fizyo-patolojik koşullar altında eritrositlerin viskoelastik özelliklerinin incelenmesinde geniş uygulanabilirliğe sahiptir.
Bu metodoloji, çeşitli fizyolojik ve patolojik durumlar için viskoelastik parametrelerini ve yumuşak camsı özelliklerini karakterize ederek eritrositlerin mekanik davranışlarını keşfetmeye izin verir. Tek hücreli tabanlı yöntemimiz, kuvvetler ve yer değiştirmeleri, eritrosit yüzeyindeki gerilmeleri ve sıyrıkları ilişkilendiren form faktörü için metal değerlerini kullanarak video referanslarını doğrular. Silikon gresi kauçuk halka yüzeyinin üzerine tüm çevreyi kaplayacak şekilde dökerek başlayın.
Ardından, kauçuk halkayı kapak kapağına yağ tarafı kapak kaymasına bakacak şekilde kapak kapağına yerleştirin. Doğru bağlantı için beş dakika bekleyin ve numune tutucular daha sonra hücre kültürünü almaya hazırdır. Daha sonra, yazılı protokolü takiben daha önce hazırlanan hücrelerin çözeltisiyle, hücreleri numune tutucuya tohumlayın.
Numuneye hacimce% 10'luk bir polistiren küre çözeltisinin 0.2 mikrolitresini ekleyin. İkinci kapak kapağını lastik halkanın üzerine yerleştirin. Kurulumu kapatın ve numune hazırlamayı tamamlayın.
Son olarak, tüm numuneyi mikroskopa taşıyın. Deneyle başlamak için, OT sistemini kullanın, küreyi OT lazerle yakalayın ve ardından hücreye yakın bir kapak parçasına takın. Ardından, başka bir küreyi yakalayın ve küreyi hücre yüzeyine, üst yüzeye yakın ve hücre kenarına yakın bir yere bastırarak aynı ekleme prosedürünü tekrarlayın.
Genlik ve değişen frekansların sinüzoidal bir fonksiyonunu ekleyin. Ardından, piezoelektrik yer değiştirmeye izin vermek için piezoelektrik aşamayı kullanarak başlat düğmesine basın. RBC küresini tuzakta tutun ve numuneyi önceden ayarlanmış sinüzoidal fonksiyonu kullanarak bir hareket döngüsüne gönderin.
Analiz için, ImageJ yazılımını açın ve sinüzoidal hareketler sırasında elde edilen tüm filmi içe aktarın. Ayarla'ya tıklayın ve ardından seçenek eşiğini seçin. Her iki kaydırma çubuğuyla da eşiği ayarlayın ve dosyaya ve ardından dikdörtgene tıklayarak referans küresini seçin.
Ardından analiz sekmesinde, set ölçümlerine tıklayın "ve kütle merkezini seçin"seçeneğini seçin. Analiz sekmesine tekrar tıklayın ve parçacıkları analiz et'i seçin. Kütlenin merkezi için xy koordinatlarına sahip bir tablo içeren yeni bir pencere görünecektir.
RBC yüzeyine bağlı diğer küre için prosedürü tekrarlayın. Analiz yazılımını açın ve daha önce elde edilen txt dosyalarını içe aktarın. Y eksenindeki kütle merkezlerini ve x eksenindeki zamanı içeren bir grafik oluşturun.
K çift asal ile gösterilen kayıp sabiti için x eksenini ve K asal ile gösterilen depolama sabiti için y eksenini kullanarak sonuçları bir grafik üzerinde çizin. İlk olarak, video yakalama için, piezoelektrik aşamayı xy yönünde hareket ettirin, yazılımı kapak fişine bağlı izole bir hücreyi aramak için kullanın. RBC yüzeyine çapı bilinen bir polistiren küreyi yakalayın ve takın.
Daha sonra, piezoelektrik aşamayı kullanarak, hücreyi deforme etmek için RBC yüzeyine tutturulmuş sıkışmış boncuğu hareket ettirin ve ardından boncuğu örtü dudağına takın. Şimdi, odaklanmış görüntüyü bulmak için z ekseni konumunu değiştirin. Konumu sabitledikten sonra, tüm hücrenin bir filmini oluşturmak için kamera yazılımını kullanın.
Ardından, seçilen hücre için bulanıklaştırılmış bir görüntü elde etmek üzere z ekseni konumunu iki mikrometre aşağı veya yukarı hareket ettirin. Son olarak, z ekseni konumunu değiştirmeden, aynı prosedürü tekrarlamak için hücreler olmadan bir bölge arayın ve görüntü arka planının bir filmini oluşturun. Kontrast görüntü yakalama için, önce N sıfır değerini bulun, çokgen seçim simgesine tıklayın, ardından analiz sekmesine tıklayın ve ölçüyü seçin.
Ardından, N görüntü eksi N sıfırı belirlemek için kontrast denklemini kullanın ve bunu işlem altında "matematik" i seçerek ve ardından çıkararak yürütün. Daha sonra, sonucu N sıfır eksi B'ye bölün.Son olarak, odaklanmış ve bulanıklaştırılmış görüntülerin kontrastını bulun. Şimdi, RBC kalınlığını elde etmek için Hartley dönüşümünü kullanın.
ImageJ'de işleme tıklayın, ardından FFT"ve FFT seçeneklerini belirleyin ve ardından FHT'yi seçin. Ardından, işlemi seçerek ters dönüşüm FHT'sini gerçekleştirin, ardından FFT" ve FFT. Yükseklik profilini elde etmek için elde edilen görüntüyü kullanın.
RBC yükseklik profilini içeren görüntüyü bulduktan sonra, ImageJ'de iki görüntü kümesi oluşturmak için iki mikrometre bulanıklaştırılmış kontrastı kullanın. Form faktörünü bulmak için, yığını çözümlemek üzere bir ImageJ özelleştirilmiş makrosu kullanın. Makro, kenarın konumunu, çevresini, çevrenin tersini ve analiz edilen hücrenin görüntüsünü içeren bir tablo sunar.
Bu görüntünün kenarlarının referans şeklin kenarlarına benzer olup olmadığını kontrol edin. Aksi takdirde, yordamı tekrarlayın ve form faktörünü bulmak için çevrenin tersinin toplamını kullanın. Deneysel verileri bir tabloda düzenleyerek başlayın.
Dosya sekmesine tıklayarak analiz yazılımında yeni bir tablo oluşturun. Parametreler için 10 farklı sütun belirleyin. Analiz yazılımında G prime ve G double prime eğrisini çizmek için, önceki tablodaki verileri kullanın ve grafik" düğmesine tıklayın.
Gama ve GM parametrelerini elde etmek için, eğri sığdırma sekmesine tıklayın ve yeni bir pencere açmak için fit1"i seçin. Kareyi seçin, tanımla düğmesine tıklayın ve denklemi yazın. Her iki pencerede de tamam "düğmesine tıklayın, bağlantı parçası görünecektir.
Ardından, omega'nın bir fonksiyonu olarak G prime ve G double prime olmak üzere iki başka arsa oluşturun. Hata çubuklarını daha önce gösterildiği gibi yalnızca y eksenine yerleştirin. Eğri uydurma prosedürünü tekrarlayın, G" seçeneğini seçin.
Genel sığdırma altında "eğri tanımı"nı tıklatın ve ardından ilgili denklemi yazın. Son olarak, Tamam'a tıklayın ve Alpha ve G sıfır değerleriyle birlikte bir eğri uydurma görünecektir. Yine, başka bir eğri uydurma prosedürü uygulayın.
G"seçeneğini seçin, genel sığdırma altında eğri tanımı"na tıklayın ve ardından ilgili denklemi yazın. Son olarak, Tamam'a tıklayın ve bir eğri uydurma görünecektir. Şekil, depolama elastik sabitini, kayıp elastik sabitinin bir fonksiyonu olarak göstermektedir.
Gözlemlenen doğrusal bağımlılık, RBC yüzeyinin yumuşak camsı bir malzeme olarak kabul edilebileceğini göstermektedir. Genel hücre form faktörü ve RBC yüzey kalınlığı için değerler uygulanarak, üs Alfa değerleri belirlenebilir. Bu teknik, eritrositlerin viskoelastik özelliklerindeki değişiklikleri farklı patolojilere sahip bireylerin kan akışındaki değişikliklerle ilişkilendiren yeni tanı yöntemlerinin temelini oluşturabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, eritrositlerin reolojik özelliklerini araştırmak için optik pinsetler ve defokus mikroskobisini kullanan entegre bir protokol sunar. Yöntem, değişken fizyolojik ve patolojik koşullar altında kırmızı kan hücrelerinin viskoelastik özelliklerini ölçmek üzere tasarlanmıştır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Hücrelerin reolojisi
- Viskoelastik özellikler
- Patofizyolojik koşullar
Arka Plan
- Eritrosit mekaniği
- Yumuşak camsı malzemeler
- Tek hücre analizinin önemi
Kullanılan Yöntemler
- Hücreleri yakalamak ve manipüle etmek için optik pinsetler
- Görüntüleme için defokus mikroskobu
- Veri işleme için analiz yazılımı
Ana Sonuçlar
- Eritrositlerin viskoelastik parametrelerinin karakterizasyonu
- Kırmızı kan hücrelerinde yumuşak camsı davranış gösterildi
- Video referansları ve form faktörü analizi ile doğrulandı
Sonuçlar
- Protokol, eritrositlerin mekanik özelliklerini etkili bir şekilde ölçer.
- Bu çalışma, farklı koşullar altında kırmızı kan hücrelerinin karmaşık davranışı hakkında bilgiler sağlar.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantitative viscoelastic profiling of red blood cells using optical tweezers and defocusing microscopy enables precise mechanical characterization under defined conditions. This approach supports predictive confidence in early-stage target validation and mechanistic de-risking for blood-related pathologies. Integrating rheological measurements into discovery workflows enhances portfolio decision-making for disease-relevant model systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables hypothesis-driven interrogation of erythrocyte mechanical properties across physiological and pathological states.
- Supports functional target validation by quantifying cell surface viscoelasticity and soft glassy behavior.
- Facilitates mechanistic de-risking through direct measurement of storage and loss moduli.
- Improves predictive confidence for blood flow and cell deformability models.
Screening & Assay Development
- Establishes standardized, reproducible protocols for single-cell mechanical assays.
- Delivers quantitative outputs such as elastic constants, shear modulus, and scaling exponents.
- Prepares validated systems for downstream compound screening targeting erythrocyte mechanics.
- Enables platform reuse for comparative studies across disease models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns viscoelastic parameters with disease-relevant biomarkers for translational studies.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation in hematological disorders.
- Provides risk-adjusted data for advancing candidates affecting red blood cell mechanics.
- Offers predictive de-risking for interventions modulating cell deformability.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing robust mechanical phenotyping of erythrocytes.
- Discovery Biology: Quantitative hypothesis testing of cell mechanics and pathway involvement in disease.
- Screening: Standardized assay outputs enable reproducible comparison of mechanical interventions.
- Analytics: Delivers storage and loss moduli, form factor, and scaling exponents for statistical analysis.
- Translational Research: Connects mechanical phenotypes to disease biomarkers and preclinical endpoints.
- Enterprise Reuse: Protocol can be adapted for other cell types or disease models requiring viscoelastic profiling.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in erythrocyte-targeted programs.
- Operational Value: Promotes assay standardization, reproducibility, and scalability for high-throughput studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and capital allocation by providing robust mechanical data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates affecting red blood cell mechanics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical tweezers, defocusing microscopy, and single-cell analysis.
- Demands access to advanced imaging and piezoelectric instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of data analysis workflows using ImageJ and custom macros.
- Adaptation to other cell types may require protocol optimization for cell-specific properties.
- Practical limitations include throughput constraints and the need for precise environmental control.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:43
Preparation of Sample Holders and Cell Cultures
1:30
OT‐Based Rheology Experiment and Analysis
3:12
Video and Contrast Image Acquisition
5:40
Soft Glassy Rheology Model and Experimental Analysis
7:03
Results: Characterizing RBC Surface from Values of K' (ω), K'' (ω), G', and G''
7:30
Conclusion
